JP4184430B2

JP4184430B2 - Protease activity-reduced Haemophilus Hin47 analog

Info

Publication number: JP4184430B2
Application number: JP50532996A
Authority: JP
Inventors: エム．ルースモア、シーナ; ヤング、ヤン−ピン; チョン、ペレ; ピー．ウーメン、レイモンド; エイチ．クライン、マイケル
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2015-07-21
Also published as: JPH11509401A

Description

発明の分野
本発明は免疫学の分野の、特に、Haemophilus属の菌種から生産される免疫原および抗原に関する。
関連出願のリファレンス
本出願は１９９４年８月２６日申請の米国特許出願番号０８／２９６、１４９の一部継続出願であり、これ自体は１９９４年７月２１日申請の米国特許出願番号０８／２７８、０９１の一部継続出願である。
発明の背景
Haemophilus influenzae（ヘモフィルス属インフルエンザ菌）は、ヒトに、髄膜炎、喉頭蓋炎、肺炎、中耳炎などの種々の病気を発症させる微生物である。H.influenzae菌のｂ型（Ｈｉｂ）は、５才以下の小児における細菌性髄膜炎の主な原因菌である。この病気の防御抗体は微生物の夾膜多糖から誘導して生産するが、その場合、精製した燐酸ポリリボシル・リボトール（ＰＲＰ）を抗原に使って製造したワクチンが開発されている。このワクチンの免疫効果は成人では９０％であり、生後２４カ月の小児では２４％以上であるが、生後２４カ月以下の小児には免疫効果はない（Zangwill et al,1994）。（リファレンスは本申請の最後に示した参考文献リストに示してあり、そのリストの中の各参考文献はそれ自体で完結された形になっており内容が分かるので、それ以上の別の文献を必要としないようになっている。）他の多糖タンパク由来の抗原と同様に、このＰＲＰではＴ−ヘルパ細胞の増殖はなく、再免疫が二次免疫応答や記憶細胞の増加を誘発するようなことはない。ＰＲＰ多糖と蛋白質キャリアーが接合されることで、ワクチンにＴー細胞からの独立特性が付与され、実質的に、ＰＲＰ抗原に対する免疫応答力が強化されることになる。最近では、４種類のＰＲＰーキャリア・接合ワクチンが入手可能である。これらのワクチンはいずれも、Haemophilus influenzae菌のｂ型・夾膜多糖がジフテリア類毒素、破傷風類毒素、または、Neisseria meningtidis（髄膜炎菌）外層膜タンパク質と接合したものをベースにしている。これらのHaemophilus influenzae菌ｂ型接合ワクチンは細菌性髄膜炎の発症を劇的に減少させることに成功している（Schoendorf et al, 1994）。
Haemophilus influenzae菌の血清型はａからｆまでの６種類があり、その夾膜多糖の種類により識別する。最近のHaemophilus菌由来接合型ワクチンは、他の侵襲型のタイプ分けが可能な菌株（ａおよびｃ型）に対し防御力がない。もっと重要なことは、これらのワクチンが、産後の敗血症、新生児の敗血症、肺炎、中耳炎の通常の原因菌であるタイプ分けが不可能な菌株（ＮＴＨｉ）に対しての防御力がないことである。中耳炎は低年齢の小児がかかる最もありふれた病気であり、すべての小児の約７０％が７才までに少なくとも一回はこの病気を経験する。この中耳炎が慢性化すると小児の聴覚障害、言語障害、知覚障害の原因となる。この中耳炎の原因の約５０％はStreptococcus pneumoniae（肺炎連鎖球菌）による感染、約３０％がHaemophilus influenzae（ヘモフィルス属インフルエンザ菌）のタイプ分けが不可能な菌株が原因であり、残り約２０％はMoraxella（Branhamella）catarrhalis菌による感染が原因である。米国だけでも、中耳炎の治療費は年間１０億から２０億ドルに上り、抗生物質、扁桃摘出やアデノイド切除、鼓膜切開手術の費用に使われているのである。H.influenzae菌が関係する病気に対する普遍的な防御法として、特に、２才から６才までの小児、その他のハイリスク群を守る方法として、保存的で、非対応、非夾膜型のH.influenzae菌由来の免疫原の供給が待たれていたところである。H.influenzaeのタイプ分けが不可能な菌株は高齢者や、特に、呼吸器系の感染を受け易いヒトにおける肺炎の重要な病原菌でもある。このように、H.influenzae菌由来の抗原に対する需要があり、それが供給されれば、H.influenzae菌の多くの血清型に対しての防御能のある免疫薬剤の成分として利用できることになるのである。１９９２年７月９日公開のＰＴＣ出願ＷＯ・９２／１０９３６（レファレンスとして当該申請書にも掲載）には、このH.influenzae菌から得られた分子量４７、０００の外層膜タンパク質について触れており、アドヘシンであるとして報告されており、Ｈｉｎ４７と命名され、H.influenzae菌からの単離体で、免疫学的には、このH.influenzaeはタイプ分け不可能な菌とｂ型との中間に位置するとしている。遺伝子コーディングされたＨｉｎ４７におけるアミノ酸の配列とヌクレオチドの塩基配列は、１９９２年５月２６日から３０日まで米国ニューオリンズで開催された全米微生物学会で発表されている。これらの配列については、１９９４年１月６日に公開されたＰＣＴ申請ＷＯ・９４／００１４９にも発表されており、本申請書でもレファレンスとして掲載している。
このＨｉｎ４７タンパク質はHaemophilus influenzae菌株由来のタンパク質のひとつとして分類され、アドヘシンであると報告されているので、Haemophilus influenzae菌が原因で発症した病気やＨｉｎ４７を産生するようなその他の細菌性病原体が原因となっている病気の診断やワクチンとして利用できるし、さらに、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する抗体の産生を誘起できるタンパク質として利用できるのである。
このＨｉｎ４７タンパク質を抗原として、抗ーＨｉｎ４７抗体を産生を誘起させるタンパク質として診断で使用する場合には、デメリットもある。つまり、これは、本申請者が予期せずして偶然に発見したことであるが、このＨｉｎ４７にはプロテアーゼ活性があり、そのために、Ｈｉｎ４７内で自己消化が起こり、その中に混入している他の抗原のタンパク質分解を起こすことである。そこで、抗原として使用できるようにするために、あるいは、ワクチンのような免疫剤や他の免疫原のキャリアーとして、あるいは、診断薬の生産用として使用できるようにするためには、このタンパク質分解活性を減少させたＨｉｎ４７タンパク質類似体を合成し供給することが望まれる（ここでは、このＨｉｎ４７タンパク質類似体を突然変異体または誘導体と呼ぶ場合もある）。
発明の要約
本発明の目的は、プロテアーゼ活性を低下させたHaemophilus菌由来のＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給することである。
本発明の態様の一つは、分離・精製したHaemophilus菌由来のＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給することであり、その類似体のプロテアーゼの活性を自然界に存在する天然のＨｉｎ４７の活性の約１０％にまで低下させたものである。このＨｉｎ４７類似体は、本質的に、天然のＨｉｎ４７タンパク質と同じ免疫原性を持っていることが望ましい。本発明で供給する類似体は、天然のＨｉｎ４７を化学的、生化学的方法または遺伝子修飾を加えることで合成・生産する。
本発明の実施例では、遺伝子修飾により合成させる場合に、そのプロテアーゼ活性を低下させるために、プロテアーゼ活性を起こさせている天然Ｈｉｎ４７の中の少なくとも一個のアミノ酸を除去するか、または、別のアミノ酸で置換する。さらに、このプロテアーゼ活性を低下させるための別の方法として、少なくとも１個のアミノ酸を天然のＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列に挿入する。除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸は、天然Ｈｉｎ４７の中にあるアミノ酸１９５から２０１までの中の一つが選択されるが、特に、セリンー１９７が除去されるか、別のアミノ酸であるアラニン、システイン、トレオニンで置換される。さらに、除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１があり、これは除去するか、アラニン、シンン、アルギニンで置換する。除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸として、Ａｓｐー１２１があり、これは除去するか、アラニンで置換する。さらに、別の方法として、天然Ｈｉｎ４７分子の中の複数のアミノ酸を除去または置換させることでも生産できる。複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１およびセリンー１９７があり、これらを除去するか、Ａｌａー９１およびＡｌａー１９７で置換することによって、Ｈｉｎ４７類似体タンパク質であるＨ９１Ａ／Ｓ１９７Ａを合成・生産できる。さらに、複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１、Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７があり、これらも除去するか、Ａｌａー１２１およびＡｌａー１９７で置換することによって、Ｈｉｎ４７類似体タンパク質であるＨ９１Ａ／Ｄ１２１Ａ／Ｓ１９７Ａを合成・生産できる。この発明で供給されるＨｉｎ４７類似体のうちのいくつかについて、その特性要約を表３に示した。Ｈｉｎ４７の突然変異体であるＤ１２１Ｅだけには、実質的なプロテアーゼ活性が残っていることを示している。
本発明の別の態様として、分離精製した核酸分子を供給する。この核酸分子は、Haemophilus influenza Hin 47タンパク質をコーディングするHaemophilus influenza hin 47の突然変異遺伝子から成っており、そのプロテアーゼ活性は天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％以下に低下したものになっている。この突然変異hin47遺伝子は上記のＨｉｎ４７類似体のいずれの型のタンパク質もコードする。この突然変異遺伝子は野生型hin47遺伝子の部位特異的突然変異誘発により産生されることが望ましい。この核酸分子は、宿主の形質転換に使用される組み換えプラスミドに挿入される。ここで使用されるプラスミドはＤＳー１０１１ー１ー１であり、これは１９９４年７月２７日付けでメリーランドのロックビルにある米国微生物寄託機関に承認番号７５８４５として寄託されている。本発明は、そのような形質転換細胞に組み込まれる組み換えプラスミドも供給するものである。
本発明の別の態様として、プロテアーゼ活性が天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％まで低下した活性低下型のHaemophilus influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体の生産方法を提供する。その方法には、プロテアーゼ活性を起こさせている天然Ｈｉｎ４７タンパク質中の少なくとも一個のアミノ酸残基を同定すること、少なくとも一個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を除去または置換させ、さらに、突然変異体のhin47遺伝子を産生させるために、突然変異遺伝子hin47の部位特異的突然変異誘発を起こさせること、その突然変異遺伝子hin47を細胞に取り込み、細胞に形質転換をおこさせ、それを増殖させることで、目的とするＨｉｎ類似体タンパク質を産生させる方法を含む。ここで選択される少なくとも一個のアミノ酸は、Ｈｉｎ４７類似体に関して上記で同定されたアミノ酸のうちのいずれかである。
突然変異遺伝子hin47の細胞への取り込みにより細胞の形質転換が起こさせることが望ましい。形質転換細胞の中では突然変異遺伝子hin47は、Ｔ７プロモータの制御を受けるが、その形質転換細胞の増殖と、Ｔ７プロモーターによるＨｉｎ４７類似体の発現誘発は、誘発濃度に調製したラクトース培地での培養によることが望ましい。さらに、細胞の形質転換のための突然変異遺伝子hin47の細胞への取り込みは、組み換えプラスミドＤＳー１０１１ー１ー１（ここでは、これをプラスミドpT7／hin47と呼ぶ。）を使用することが望ましい。
さらに、発明の態様として、本発明は分離・精製したＨｉｎ４７類似体を供給する方法を提供する。その方法にはＨｉｎ４７類似体を合成させるための上記の各手順を実施することを含む。その手順として、Ｈｉｎ４７類似体を含む顆粒画分から成る増殖させた形質転換細胞を、その上澄み液とその顆粒画分とを分離するためにその細胞を破壊すること、さらに、Ｈｉｎ４７類似体を含むる顆粒画分を溶解させ、その溶液をクロマトグラフィーを使って溶液部分を細胞砕片部分から分離して、Ｈｉｎ４７を精製すること、さらに精製したそのＨｉｎ４７類似体を分離することが含まれる。
この発明で供給されるタンパク質活性低下型のＨｉｎ４７の類似体は、免疫原性組成における抗原として、別の免疫原のキャリアーとして、あるいは、診断薬の原料として有用である。同様に本発明で供給される核酸分子も、診断用プローブとして、あるいは、広く免疫分野の診断道具として有用である。
発明のさらに別の態様として、本発明は、免疫効果を発揮できるだけの量のＨｉｎ４７類似体、または、Ｈｉｎ４７類似体をコードする遺伝子を含む核酸分子から成る免疫原性組成物質を供給する。この免疫原性組成物質は、ヒトを含む宿主に対するインビボ投与用のワクチンとして調製できる。このワクチンは、Ｈｉｎ４７を産生する、または、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する宿主内抗体の産生を誘起できるタンパク質を産生するような細菌性病原体が原因で発症した病気に対しての防御手段として使える。この細菌性病原体として、Haemophilus influenzae菌のようなHaemophilus菌種がある。本発明の免疫原性組成物質には、アジュバントのような、少なくも一個の別の免疫原性物質または免疫刺激物質から成る。さらに追加の実施例として、本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする遺伝子から成る核酸分子は、ポックスウイルス、Salmonella（サルモネラ）、ポリオウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはＢＣＧのような生存ベクターに含まれている。
本発明には、ヒトを含む宿主に免疫応答を起こさせる方法も含まれる。その方法として、本発明の免疫原性組成物質を、免疫効果の期待できる量をこの宿主に接種することを含む。
上述したように、このＨｉｎ４７類似体は診断領域でも使用可能である。従って、発明の追加態様として、検体中にＨｉｎ４７に特異的に反応する抗体が存在しているかどうかを検査する方法を提供する。その方法には下記の手順を含む。
（ａ）検体を、実質的に天然のＨｉｎ４７タンパク質と同じ免疫原性を持つＨｉｎ４７類似体と接触させ、その結果、Ｈｉｎ４７類似体と、検体中に存在しＨｉｎ４７と特異的に反応する抗体との複合物質を産生させること、および
（ｂ）この複合物質の産生を確認すること。
本発明は検体中にＨｉｎ４７が存在するかどうか検出する方法を含む。その方法は下記の手順から成る。
（ａ）本発明での免疫原性組成物質で被検対象を免疫感作してＨｉｎ４７タンパク質に特異的に反応する抗体を産生させること、
（ｂ）被検対象をこの抗体と接触させる、その結果、被検対象に存在するＨｉｎ４７と抗体に特異的に反応するＨｉｎ４７から成る複合物質を産生させること、
（ｃ）この複合物質の産生を確認すること。
この発明には診断キットの供給を含む。これは検体中に、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する抗体があるかどうかを診断するもので、下記の物質と方法を含む。
（ａ）本発明で供給される天然のＨｉｎ４７タンパク質と本質的に同じ免疫原性を有するＨｉｎ４７類似体であること、
（ｂ）この類似体と検体中に含まれる抗体との複合物質を産生できるように、この類似体を被検対象と接触させる方法、および、
（ｃ）その複合物質の産生を確認する方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドであるＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図と塩基配列分析のための構造図である。
図２は、H.influenzae菌株由来ＳＢ３３から生産したＨｉｎ４７の完全なヌクレオチド塩基配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）とアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）および、部分的ヌクレトチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）と部分的アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）である。後者はＡＳＭ会議で発表された資料を本発明者がコピーしたものである。
図３は、H.influenzae Hin47（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、E.coli（大腸菌）株のhtrA（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、Salmonella typhimurium（ネズミチフス菌）株のhtrA（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）のアミノ酸配列を比較したものである。
図４は、既知のプロテアーゼを有するＨｉｎ４７のアミノ酸残基の５７から２５６までの配列（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：７から１６）である。コードは下記の通り。ＴＯＮ：ラットのトニン、ＰＫＡＡＢ：カリクレイン、ＰＴＮ：トリプシン、ＣＨＡＡ：キモトリプシン、ＥＳＴ：エラスターゼ、ＲＰ２Ａ：ラットのマスト細胞プロテアーゼ、ＳＧＴ：Streptomyces griseus（ストレプトミセス・グリセウス）トリプトシン、ＳＧＢＥ：Streptomyces griseusプロテナーゼＡ、ＳＧＡ：Streptomyces girseusプロテナーゼＢ、ＡＬＰ：L.enzymogenesアルファー・リシン・プロテナーゼ、hin47：Ｈｉｎ４７の５７ー２５６。アスタリスク（＊）は、構造上の保存部位を示す。触媒三つ組残基はそで章マーク（≠）で示す。’ｃｏｎ’は哺乳類プロテアーゼの共通配列部位を示す。
図５はプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１およびＤＳー１０４８ー２の制限酵素地図で、これは、E.coli（大腸菌）から生産したＨｉｎ４７類似体であり、プラスミド・ＤＳー１０１１ー１ー１（プラスミド pT7/Hin47*）のための構成スキームである。
図６は、E.coliから生産したＨｉｎ４７類似体の精製工程を示したもので、本発明の実施例の一つであり、精製品のゲル分析でもある。
図７は、天然Ｈｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体のベータ・カゼインに対するプロテアーゼ活性を示したものである。
図８は、天然Ｈｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体の温度を変化させた場合の安定性を比較したものである。
図９は、天然のＨｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体による、H.influenzae由来組み換えタンパク質の酵素分解を示したものである。
図１０は、マウスにおける、天然のＨｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体の免疫原性を比較したものである。
図１１は、H.influenzae菌株由来ＳＢ３３から生産されたＨｉｎ４７タンパク質とＳＢ１２から生産されたＨｉｎ４７タンパク質の、それぞれのアミノ酸配列の比較である。
図１２はE.coliから生産されたＨｉｎ４７類似体であるＨ９１Ａの精製工程を示したものである。
発明の一般的説明
Ｈｉｎ４７遺伝子を持つすべてのHaemophilus菌株は、精製・分離した核酸分子（ＤＮＡ分子の形）の供給に利用されており、この分子は、本発明の典型的な実施例で示したように、Ｈｉｎ４７をコードする部分を含んだ遺伝子である。このような菌株は、臨床現場や米国微生物寄託機関のような細菌収集機関から入手可能である。このような菌として、H.influenzae菌やＨｉｎ４７・フラグメントやその類似体と特異的に反応する抗体を作り出すことのできるタンパク質を産生するその他の細菌株がある。
Haemophilus菌のうち使える菌株は次の通りである。
Haemophilus菌ｂ型株ＭｉｎｎＡ
Haemophilus菌ｂ型株Ｅａｇａｎ
Haemophilus菌非定型株ＳＢ３３
Haemophilus菌非定型株ＳＢ１２
Haemophilus菌非定型株ＰＡＫ１２０８５
図１には、プラスミドであるＪＢー１０３１ー１ー１４、および、ＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図を示してあるが、これらのプラスミドには、Haemophilus菌非定型株ＳＢ３３から生産されるＨｉｎ４７蛋白質をコードする部分が挿入される。Ｈｉｎ４７遺伝子のヌクレトチド配列はすでに決定されており、図２には、Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を示している。図３には、H.influenzae菌由来のＨｉｎ４７のアミノ酸配列とE.coli（大腸菌）株由来のhtrAタンパク質のセリン・プロテアーゼ・htrA、Salmonella typhimurium（ネズミチフス菌）株由来のhtrAタンパク質のアミノ酸配列を示してある。本発明者が予期せず発見したことであるが、このアミノ配列が存在することで、天然Ｈｉｎ４７では細菌性セリンプロテアーゼとして作用し、これがプロテアーゼ活性を起こしているのである。この天然Ｈｉｎ４７は、以前にはアドヒシンであると報告されていたものである。このプロテアーゼ活性があるために、天然Ｈｉｎ４７を予防接種用の免疫原、あるいは、診断用の抗原として使用しようとする場合に大きな障害となるのである。図３のアミノ酸配列の分析から、htrAタンパク質と天然Ｈｉｎ４７には、成熟タンパク質のアミノ酸残基１９５と２０１の間にＧＮＳＧＧＡＬの配列が含まれることが判明した。セリン・プロテアーゼの活性部位のコンセンサス配列はＧＤＳＧＧＰＫ（ＳＥＤＩＤＮＯ：１８）（Brenner,1988）であり、活性残基はセリンである。このように、Ｈｉｎ４７のセリンー１９７に突然変異を誘起させると、プロテアーゼ活性が低下したＨｉｎ４７類似体が合成される。これは、本発明の実施例として示してある。別の実施例ではセリンー１９７をアラニンで置換した。Ｈｉｎ４７のアミノ酸残基５７から２５６は既知のプロテアーゼであり、これは触媒三つ組残基を取り巻いている先端の相同体からは識別された活性中心残基と一列に並んでいるのである。セリンプロテアーゼには標準ナンバリング・システムが確立されており、それによれば、触媒三つ組残基はそれぞれＨｉｓー５７、Ａｓｐー１０２、Ｓｅｒー１９５と番号付けがなされる。これらがそれぞれ、残基Ｈｉｓー９１、残基Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７に対応している。図４には、１０個の構造がすでに決定されているセリンプロテアーゼ（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：７から１６）の構造配列が示されているが、図の通り、相同残基が３次元的に同じ位置に列をなしている。Ｈｉｎ４７の疎水性コア内にある多数残基は、活性中心の廻りの残基と同様に、Ｈｉｎ４７のプロテアーゼの機能アミノ酸を識別できるような位置で合理的に列をなしているのである。天然Ｈｉｎ４７内でタンパク質のプロテアーゼ活性を起こさせているその他のアミノ酸残基としては、Ｈｉｓー９１とＡｓｐー１２１がある。実施例では、活性を低下させるために、このＨｉｓー９１をアラニン、リスニンまたはアルギニンで置換する。別の実施例では、同様に、Ａｓｐー１２１をアラニンまたはグルタミン酸で置換する。さらに、追加の実施例では、セリンー１９７をアラニン、セリン、またはトレオニンで置換する。ここでは、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７の類似体を供給する方法として、Ｈｉｎ４７のタンパク質内の特別なアミノ酸を置換することを例示しているが、本発明で示したプロテアーゼ活性の発見、Ｈｉｎ４７の発現方法、その精製方法を応用することにより、少なくとも一個のアミノ酸を除去または置換した別のＨｉｎ４７類似体、あるいは、少なくとも一個の追加アミノ酸をＨｉｎ４７タンパク質に取り込んだ別の類似体の生産も可能であることは明かである。本申請および実施例において、プロテアーゼ活性を特に低下させるためには、Ｈｉｎ４７タンパク質内の数個のアミノ酸を同時に変換することが望ましいことも示している。数個のアミノ酸としては、Ｈｉｓー９１とＳｅｒー１９７があり、これらを除去するかアラニンで置換して活性を低下させる。別の実施例では、これらの複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１、Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７があり、これらは除去するかアラニンで置換することを示している。従って、本発明では、一個または複数のアミノ酸を除去または別のアミノ酸で置換する方法、あるいは追加のアミノ酸を導入する方法で、プロテアーゼ活性を低下させたＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給できることを示している。
上記で述べた通り、Ｈｉｎ４７には、大腸菌由来のhtrAタンパク質またはS.typhimurium由来のhtrAタンパク質との相同性があり、これらのタンパク質は両方ともストレス応答タンパク質であり、共にセリンプロテアーゼ活性を持つ。大腸菌由来のhtrAタンパク質は、大腸菌を４３．５℃で増殖させることで産生誘導が可能である（レファレンス１３参照）。本発明では、この大腸菌由来のhtrAタンパク質は、６％のエタノール溶液内での増殖でも産生誘導が可能であることを示した。Ｈｉｎ４７も、６％のエタノール溶液内での増殖で産生の誘導可能であり、さらに、誘導される産生量は減少するが、温度を４３．５℃まで低下させて増殖させても産生誘導可能であり、そのことは以下で詳述する。このＨｉｎ４７タンパク質の発現の分析を進める中で、このタンパク質とＬｔｒＡとの間には関係があるという証拠が明確になってきた。hin47遺伝子は、タイプ分けできないH.influenzae菌株ＳＢ１２をＰＣＲ増殖することでそのクローンが得られる。図１１では、H.influenzae菌株ＳＢ１２由来のＨｉｎ４７タンパク質とH.influenzae菌株ＳＢ３３由来のＨｉｎ４７タンパク質におけるアミノ酸配列の比較をしている。この比較で分かることは、この両方のタンパク質のアミノ酸配列がほとんど同じであるということである。
図５にはプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１とＤＳー１０４８ー２を示してあり、これらを使用して、大腸菌内でセリンー１９７をアラニンで置換するとＨｉｎ４７類似体が発現する。
図６は、Ｈｉｎ４７類似体を大腸菌の顆粒画分から精製する方法を示した流れ図である。
図７は、セリンー１９７をアラニンで置換して得られたＨｉｎ４７類似体の、ベータカゼインに対するプロテアーゼ活性の低下の状態を示したもので、これにより、この類似体のプレテアーゼ活性は、天然のＨｉｎ４７タンパク質の１０％以下であることが分かる。このように、本発明の実施例では、本発明が、プロテアーゼ活性が天然のＨｉｎ４７タンパク質の１０％以下であるＨｉｎ４７類似体を供給し、このようなＨｉｎ４７類似体は、アミノ酸のセリンー１９７をアラニンで置換して生産できることを示している。
図８には、本発明で供給されるＨｉｎ４７類似体の熱安定性の向上に関する分析が図示されている。本発明の実施例として、熱安定性が向上したＨｉｎ４７類似体が供給されており、そのようなＨｉｎ４７類似体はアミノ酸であるセリンー１９７をアラニンで置換して生産したものである。
図９は、非Hin47のHaemophilus菌由来抗原が、Ｈｉｎ４７およびＨｉｎ４７類似体によってタンパク分解される状態を図示している。本発明の別の実施例には、このＨｉｎ４７によるタンパク質分解を起こさない別のＨｉｎ４７類似体を示し、これは、そのアミノ酸セリンー１９７がアラニンで置換されたものである。
図１０と表１には、マウスにおける、修飾を加えてない天然のＨｉｎ４７と本発明にかかるプロテアーゼ活性低下型Ｈｉｎ４７類似体との免疫原性比較が図示されている。天然Ｈｉｎ４７タンパク質と本発明のＨｉｎ４７類似体Ｓ１９７Ａの免疫原性は似ている。実施例では、プロテアーゼ活性低下型で、しかも、その免疫原性が天然のＨｉｎ４７と実質的に同じであるＨｉｎ４７類似体が示されている。このＨｉｎ４７類似体では、アミノ酸であるセリンー１９７がアラニンで置換されたものである。
表２と表３には、幼少ラットの菌血症モデルおよび免疫感作させたチンチラネコの中耳炎モデルにおける、プロテアーゼ活性低下型Ｈｉｎ４７類似体のＨｉｂに対する免疫防御能が示されている。このＨｉｎ４７類似体では、アミノ酸Ｈｉｓー９１が除去されるかアラニン、リシン、アルジニンで置換され、Ａｓｐー１２１が除去されるかアラニンまたはグルタミン酸で置換され、セリンー１９７がアラニン、システイン、トレオニンで置換されるか、あるいは、これらの組み合わせの置換で合成されたものである。
本発明の別の態様として、Haemophilus菌、または、その他の細菌性病原菌に対する防御用のワクチンを供給する。ここで言う病原体は、Ｈｉｎ４７タンパク質、または、Ｈｉｎ４７を認識できる抗体を誘発するようなタンパク質を産生する細菌のことである。ここでのワクチンは、免疫・防御能力のあるＨｉｎ４７類似体を使ったもので、免疫原性的効果の期待できる量を使用し、または、Ｈｉｎ４７をコードする塩基配列を持つ核酸分子、および、生理的に受け入れ可能な、これらの物質のキャリアーから構成されるワクチンである。本発明で供給されるこの類似体は、Ｈｉｎ４７に関係のない抗原決定基に対する接合ワクチンを作る際には、ハプテン、多糖類、または、ペプチドのキャリア・タンパクとして使用できる。
後述する申請内容からも明かなように、本発明はプラスミドおよびＨｉｎ４７類似体合成用の細菌の新規株も提供する。
Haemophilus influenzae菌由来で、しかも、天然のものに較べてそのプロテアーゼ活性の低いタンパク質Ｈｉｎ４７をコードする精製・分離ＤＮＡは、核酸プローブとして、Haemophilus菌株のインビトロまたはインビボでの同定手段として有用である。本発明により供給される遺伝子ＤＮＡ分子によりコードされたＨｉｎ４７類似体は、それを抗原に使うことで診断薬として、あるいは、抗Ｈｉｎ４７抗体を産生させる抗原として有用である。さらに、Haemophilus菌株やＨｉｎ４７と特異的に認識する抗体の産生を誘起できるタンパク質を産生するその他の細菌性病原菌が原因で発症する病気に対するワクチン生産用の抗原としても使えるし、Haemophilus菌あるいはそれに類するその他の細菌の感染症の診断に使用可能である。
本発明の追加実施例では、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体が、被包性菌などの病原菌防御用のキメラ分子や接合ワクチン（複合糖質を含む）を合成する際のキャリア分子として使用できることを示している。例えば、本発明で供給される複合型糖質は、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）やＰＲＰのような多糖類抗原を持つ細菌が原因となる病気や感染症の防御用の免疫感作に使用できる。これらの細菌性病原菌としては、Haemophilus influenza、Streptococcus pneumonia、Escherichia coli、Neisseria meningitidis、Salmonella typhi（チフス菌）、Streptococcus mutans、Cryptococcus neoformans、Klebsiella、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）がある。特殊抗原をＨｉｎ４７類似体に接合させることが可能であり、そのような接合の方法は、本発明の申請者が作製したＰＴＣ申請書・ＷＯ・９４／１２６４１にすでに記載しているが、ここではレファレンスとして掲載している。
別の実施例では、このＨｉｎ４７類似体は、ガン細胞の異常多糖類に対する免疫感作をする場合や、化学療法剤または生体活性剤に接合可能な抗ガン抗体を作製する際に、キャリアとして利用できることを示している。
本発明で供給されるＨｉｎ４７類似体は、H.influenzae菌由来のタンパク質であるので、これを調合した薬剤では、H.influenzae菌が原因で発症する病気の予防と診断に使える。本発明者は、このＨｉｎ４７類似体が、生きたH.influenzae菌ｂ型株に対する防御免疫応答を引き出すことができることを発見した。従って、本発明はワクチンにも利用可能であることが明かである。さらに、本発明には、Ｈｉｎ４７類似体をコードする遺伝子のヌクレトチド配列を示している。これらのＤＮＡセグメントは、組み換えＤＮＡ技術を利用することで、ＰＲＰやリポオリゴ多糖類（ＬＯＳ）のような、H.influenzae抗原とは本質的に関連のない免疫原を供給する際にも使用できる。Ｈｉｎ４７類似体タンパク質は、E.coli、Haemophilus、Bacillus（バシラス）、Bordetella（ボルデテラ）菌、酵母、バキュロウイルス、ポックッスウイルス、ワクシニアウイルスの増殖媒体を適当な発現システムとして使用することでその産生を誘起させることが可能である。本発明は、実質的には、分離・精製された純粋なＨｉｎ４７類似体を合成する新規技術を提供するものである。
本発明での実施例が、Haemophilus菌の感染症や、Ｈｉｎ４７と特異的に反応する抗体の産生を誘発できるタンパク質を産生するその他の細菌性病原菌の感染症の治療や診断、予防接種に適用できることは、本分野の技術に熟練した者には明白なことである。そのような使用法に関して下記に詳述する。
１．ワクチンおよびその使用法
ワクチン生産用の免疫原性誘発物質として上記のＨｉｎ４７類似体を使用できる。ワクチンは接種対象者の免疫応答を引き出し、抗Ｈｉｎ４７抗体を含む、食菌性または殺菌性の抗体を産生させるためのものである。ワクチンを投与された者が、H.Haemophilus菌や、Ｈｉｎ４７と特異的に反応する抗体の産生を誘起するタンパク質を産生するようなその他の細菌の攻撃を受けた時には、この抗体が侵入細菌に結合してそれを不活性化させる。食菌性または殺菌性の抗Ｈｉｎ４７抗体は別の機序でも防御作用を発揮する。
ワクチンを含むこれらの免疫感作物質は、注射液や液体溶液として、あるいはエマルションとして調製が可能である。Ｈｉｎ４７類似体に、薬学的な意味で許容できる限度内で賦形剤を混ぜて使うことも可能である。そのような賦形剤としては、水、食塩、デキストローズ、グリセロール、エタノール、および、それらを組み合わせてものがある。この免疫原性物質やワクチンには、その効果を強化するために湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または、アジュバントのような付帯物質を添加してもよい。アジュバント効果を完全なものするために、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを使用できるが、通常の場合には０．０５から０．１％のリン酸緩衝食塩溶液を使用する。免疫原性物質およびワクチンは、非経口で、皮下注射または、筋肉注射で投与する。本発明にかかる免疫原性物質は、投与した粘膜表面で免疫応答が起こるように調製することも可能である。この免疫原性物質は、経鼻または経口（胃内）ルートで粘膜表面への投与が可能である。坐薬や経口薬剤の方法でこれを投与することが望ましい。坐薬の場合には、そのバインダーおよびキャリアーとしてはポリアルカリン・グリコールまたはトリグリセリドが使用できる。経口薬剤として使う場合には、賦形剤を使用するが、この賦形剤としては、サッカリン、炭酸セルロース、炭酸マグネシウムを使用する。この免疫原性物質の剤形としては、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性調剤、粉末のいずれに可能であり、このＨｉｎ４７類似体の含有濃度も１から９５％まで調節できる。この免疫原性物質製剤およびワクチンは、その投与量を調節して、治療用、予防・防御用、免疫原としての使い分けが可能である。その投与量は投与対象者の個人状況により異なり、抗体の産生を誘起する個人の免疫機能の状態、必要な場合には、細胞性免疫応答の能力によって調製する。投与の際の有効成分の期待される正確な量については医者の判断に委ねられている。しかし、適切な投与量については、この分野の熟練専門家が決定する必要があり、Ｈｉｎ４７類似体の投与量としては、マイクログラムのオーダーとなるであろう。適切な初回投与量もその後の投与予定量により変動し、追加免疫抗原量も多様である。さらに、どの経路で投与するかによっても投与量は変わるし、宿主の大きさによってもその量は変動する。
本発明にかかる免疫原物質製剤に含む抗原の濃度は一般的には１から９５％である。ワクチンが、一種類のみの病原菌由来の抗原を含む場合には、そのワクチンは１価ワクチンと呼ばれる。他方、数種類の病原菌由来の抗原を含むワクチンは混合ワクチンと呼ばれ、それも本発明に供給するワクチンである。混合ワクチンの場合には、種々の病原菌由来の抗原、同じ病原菌であってもその菌株が異種のものから生産した抗原あるいは種々の病原菌の組み合わされた菌からの抗原を含む。
本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする核酸分子は、直接に免疫感作に使える。例えば、この遺伝子ＤＮＡを直接に免疫感作対象に投与するか、遺伝子免疫感作の場合にはＤＮＡを直接に注射する方法もある。さらに、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスのような生きたベクターに遺伝子を運搬させることで免疫感作させる方法もある。異種抗原を免疫システムに運ぶのに使用する生きたベクターに関しては、O’Hagan（1992）の報告があり、遺伝子感作の目的で検体にＤＮＡを直接に挿入する方法についてはUlmerらが報告している（1993）。
２．イムノアッセイ（免疫検定法）
本発明のＨｉｎ４７類似体は、抗Ｈｉｎ４７抗体の産生を誘起するための免疫原として、さらに、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ：エリザ、ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ、その他の非酵素連結抗原結合検定または抗Haemophilus抗体、抗Ｈｉｎ４７抗体の探知技術として知られている方法を含む）における抗原としても有用である。エリザ法では、Ｈｉｎ４７類似体を、特別に選別された表面、例えば、ポリスチレン製のマイクロティタ板の壁面のようなタンパク質を付着させることのできる表面に固定する。不完全に吸収されたＨｉｎ４７類似体を除去するために洗浄をした後、検体に対して抗原抗体反応的には中立であることで知られるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液のような非特異的タンパク質をその選択表面に結合させる。こうすることで、固定表面に非特異的吸収部位をブロックできることになり、表面に抗血清の非特異的に結合する原因と背景を少なくすることができる。
次に、この固定表面に、臨床的意味のある、または生物学的意味のある物質から成るサンプルを接触させ、免疫複合物質（抗原／抗体）の形成を促進させる方法で検体を試験する方法もある。この方法には、ＢＳＡ溶液、ウシ・ガンマ・グロブリン（ＢＧＧ）、リン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）／トウイーンのような希釈剤でサンプルを希釈することも含まれる。その後、このサンプルを温度２５℃から３７℃で２ー４時間培養する。培養の後、サンプルが付着している表面を洗浄して非免疫複合物質を除去する。この洗浄には、ＰＢＳ／トウイーンまたはホウ酸バッファーのような溶液で洗浄することも含む。試験サンプルと結合したＨｉｎ４７類似体との間に特異的免疫複合物質を生成させた後、洗浄して、その免疫複合物質を、最初の抗体に対する特異性をもつ二番目の抗体に接触させることで、免疫複合物質の産生の時期、量を決定することができる。仮に試験サンプルがヒト由来のものであれば、二番目の抗体はヒト免疫グロビリン（一般には、ＩｇＧ）に対して特異性を持つ抗体である。検出方法として、この二番目の抗体には、適当な色素産生物質と一緒に培養した時に色を発生する酵素活性のような活性を持たせることができる。ここで発生した色の度合いをスペクトル分光光度計を使用して測定することで定量分析が可能となる。
３．ハイブリッド形成プローブとして塩基配列を使用
本発明の核酸分子はhin47類似体遺伝子としての塩基配列を持っており、そのために、Haemophilus菌株およぼその他のＨｉｎ４７を特異的に認識する抗体を産生することのできるタンパク質を作り出す細菌からhin47類似体遺伝子をクローニングすることも可能である。
この核酸分子は、本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする塩基配列を持つので、別のhin47遺伝子と相補的な長さの複合分子を選択的に形成させるのに使用できる。
別のhin遺伝子を探索するためにプローブの選択性に幅を持たせたい場合には、ハイブリッド形成条件の設定を多様に変化させることが可能である。この選択性を高めたい場合には、複合物質を形成させる場合に、比較的に厳しい条件を採用する、例えば、塩化ナトリウムの量を低くし、かつ、高温の状態にする、具体的には、Ｎａｃｌ量を０．０２Ｍから０．１５Ｍにして、温度を５０から７０℃のような高温条件にする。場合によっては、ハイブリッド形成条件をもっと緩やかなもの、例えば、塩化ナトリウム量を０．１５から０．９Ｍにして、温度を２０から５５℃の条件にする必要があるような場合もある。ハイブリッド複合物質を不安定化させる場合には、ホルムアルデヒドの添加量を増量してハイブリッド形成条件をもっと厳しいものにすることも可能である。このように、ハイブリッド形成条件を自由に調節でき、望む結果に合わせて広く条件選択ができるというメリットがある。
臨床診断用の実施例では、本発明のhin47遺伝子をコードする核酸分子は、ハイブリッド形成の際に、ラベリング法のような適当な方法と組み合わせて使えることを示している。例えば、放射線、酵素、アビジンやビオチンのようなリガンドなどの多様なレベル指示法が知られており、これらはいずれも探知信号を発生させることができるものである。本発明の別の診断用実施例は、放射線標識に代わりに、ウレアーゼ、リン酸アルカリン、ペルオキシダーゼのような酵素標識が使用できることを示している。酵素標識の場合には、hin47遺伝子の塩基配列が含有されているサンプルの特別なハイブリッド形成を確認する際に、人間の目で見える方法として、または、分光光度計で見たような方法を提供するものとして、比色指示物質が知られている。
本発明のhin47遺伝子から成る核酸分子は、溶液ハイブリッド形成を行う場合や個体相を使う実施例において、そのプローブとして有用である。個体相を使用した実施例には、浸出液、体液（例えば、血清、羊水、中耳浸出液、唾液、気管支肺胞洗浄液）または、組織のような臨床サンプルから取ったテストＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、選択マトリックスや表面に吸収され付着することが示されている。その後、固定された一本鎖核酸は、本発明のhin47遺伝子の核酸配列から成る選択プローブで、望む条件下で、特別なハイブリッド形成を起こすことになる。この選択条件というのは、Ｇ＋Ｃの内容、目標核酸の型、核酸の起源、ハイブリッド形成プローブなどに応じて要求される特別な基準に基礎を置いた特別な環境に依存する。非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためのハイブリッド形成の表面の洗浄に続いて起こる特別のハイブリッド形成は、標識を使用することで検出できるし、その形成量の定量でさえも可能である。
４．プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７の類似体をコードする遺伝子の発現
宿主との適合性のある菌株から生産された、レプリコン配列と制御配列を含んでいるベクターが、Ｈｉｎ４７類似体遺伝子の発現に使用できる（本発明では発現システムを使用する）。元来、ベクターというのは、形質転換細胞内で表現型選択をさせる標識配列部分と複製部分を細胞内に運搬するものである。例えば、大腸菌は、アンピシリンとテトラサイクリンに耐性のある遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ３２２を使用して、細胞の形質転換が可能で、ｐＢＲ３２２は形質転換細胞の同定の簡便な手段でもある。プラスミドｐＢＲ３２２、その他の細菌性プラスミド、ファージはプロモータを含むか、含むように修飾されており、このプロモーターは、宿主が自らのタンパク質を産生する場合にも使用される。
さらに、宿主との適合性があり、レプリコン配列と制御配列を含んでいるファージ・ベクターは、宿主との関係では形質転換ベクターとしても使用できる。例えば、ラムダＧＥＭー１１ファージは、組み換えファージベクターを作製する際に使用でき、この組み換えファージベクター（例えば、E.coli LE392）は、宿主の形質転換用にも使える。
組み換えＤＮＡ技術で普通に使用されているプロモーターとしては、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース・プロモータ・システム（Chang et al,1979;Goedel et al,1980）、Ｔ７・プロモータ・システム（米国特許４、９５２、４９６）のような細菌性プロモーターなどがある。これらの核酸の塩基配列は詳しく解明されており、この分野の熟練技術者であれば、これらを機能的にプラスミドベクターに結合可能である。
どのようなプロモータを選択するかは、どのような結果を希望しているかに依る。Ｈｉｎ４７類似体の発現に適した宿主としては、E.coli Bacillus菌株，Haemophilus Bordetella菌株，酵母、哺乳類の細胞などがあり、この類似体発現にはバキュロウイルス発現システムも使用できる。
本発明では、Ｈｉｎ４７類似体の生産には組み換え法が望ましいとしている。このタンパク質の発現のために特に好ましい宿主としては、ＬＰＳを持ってない、つまり、エンドトキシンのないグラム陽性菌が挙げられる。例として、Bacillus菌株があり、これは特に、非発熱性のＨｉｎ４７類似体の作製に有用である。
生物寄託
Ｈｉｎ４７類似体をコードするタンパク質を含むプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１（pT7/Hin47*）は、この一部継続出願に先だって、ブダペスト条約により、承認番号７５８４５として、１９９４年７月２７日に米国、メリーランド、ロックビルにある米国微生物寄託機関に寄託されている。このに寄託されたプラスミドのサンプルは、当該米国特許申請に基づく特許付与があり次第、一般に公開されることになっている。本発明およびクレームは、この寄託されているプラスミドに限定されるのでなく、それは発明の例示のひとつにすぎない。この申請の中で記載している類似体または同等の抗原をコードする遺伝子が挿入される同等または類似の如何なるプラスミドも本発明の範囲内に入るものである。
実施例
一般的に記述された上記の開示は本発明を説明するものである。下記に示す実施例を参照することでより完全な理解が得られる。ここで示す実施例は単に例示であって、本発明がそれらに限定されるものではない。周囲の状況で適当と判断された場合には、形態を変更したり、同等物で置き換える場合もある。特別な用語が使用される場合があるが、それは本発明を記載するために使用されたもので、限定的な意味合いを付与するものではない。
この開示の中で使用されているが、明示的には記載されてない分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学分野の方法も、それらは関連文献で十分に説明され明白であり、本発明に関連する分野の熟練者の技術の範囲内にあるものである。
実施例１
この実施例は、タイプ分けできないH.influenzae菌株ＳＢ３３から作製したhin47遺伝子のクローンを示したものである。
染色体ＤＮＡをH.influenzae菌株ＳＢ３３から調製して、ＥＭＢＬ３ライブラリを作製し、hin47遺伝子の５’末端に特異的に反応する標識オリゴヌクレオチド・プローブでスクリーニングしている。ハークニス（Harkness et al, 1992））らの方法に従って、タイプ分け出来ないH.influenzae菌株ＳＢ３３をムーラーヒントン（Mueller-Hinton）寒天で、または、流体培養基で増殖させた。染色体ＤＮＡは、次のような方法で作製した。即ち、５０ml培養液から細胞をペレットで取り、ソルバール（Sorvall）型ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を使用して、５０００rpmの回転速度で１５分から２０分間、温度４℃で遠心分離を行った。分離した細胞をＴＥ溶液１０ml中で再懸濁させた後、プロナーゼを加えて５００μｇｍｌ^-1とし、さらに１％ＳＤＳを加えた。透明な溶解産物が得られるまでサンプルを３７℃で培養した。この溶解産物を、静かに一回、トリス飽和フェノール（ｐＨ７．４）で抽出させ、さらに、もう一回、トリス飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）で抽出し、さらにもう一度クロロフォルムで抽出した。最終の液体相を１Ｍ塩化ナトリウムを使用して２４時間、４℃で分離透析し、其の後、ＴＥで２４時間分離透析した。
ＥＭＢＬ３ライブラリのＳａｕ３Ａを使用して、ＳＢ３３染色体ＤＮＡの部分消化させて調製し、其の後、ＴＮＥ（20Mmトリス／塩酸，5mM塩化ナトリウム，1mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸，pH8.0）の中で１０から３０％スクロース勾配でサイズ分別するか、または、分離用ゲル電気泳動を行った。長さが５KD以上のＤＮＡフラグメントを含む画分については、それをプールさせ沈澱させ、ＥＭＢＬ３（プロメガ）のＢａｍＨと連結させた。この連結混合物質は包装キットであるギガパックＩＩを使用して包装してE.coli ＬＥ３９２細胞の上に置いた。このライブラリは、増幅させた後、クロロフォルム存在下４℃で保存した。プラークはニトロセルロースで濾過し、³²p標識のオリゴヌクレオチド・プローブ（３０２６．ＳＬ）でハイブリダイゼーションを実施した。オリゴヌクレオチドの塩基配列はＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）であり、これはＮ末端アミノ酸配列ＭＫＫＴＲＦＶＬＮＳＩＡＬＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）と対応している。ファージＤＮＡをプラークから調製し、挿入ＤＮＡをSal Iで酵素消化で切断して、Sal Iで酵素消化されたＰＵＣＢ−ＢｇＸｂのクローンを作製した。プラスミドＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２（図１）をさらに分析するために選択した。
実施例２
この実施例は、hin47遺伝子およびＮＴＨｉ株ＳＢ３３から生産したＨｉｎ４７タンパク質のキャラクタリゼーションおよび塩基配列分析を示したものである。
クローンＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図での分析およびサザンブロット法によれは、4.7kb BamH I/BamH Iまたは2.7kb BamH I/Pst I ＤＮＡフラグメント上にhin47遺伝子があることになる。クローンＪＢー１０６８ー２ー２から得られた4.7kb BamH I/BamH IフラグメントはプラスミドＤＳー７５５ー１を産生するｐＵＣＢ／ＢｇＸｂにクローン化される。ＤＳー７５５ー１の3.1kb BamH IからXba IフラグメントはプラスミドＪＢー１１６５ー１ー１を産生するｐＵＣ１８にクローン化され、このｐＵＣ１８には制限部位があり、Erase-a-base（Promega）手順に利用できるようになっている（図１）。この技術によれば、挿入ＤＮＡの切断を増やすことで連続的にクローンを生産できる。この結果、生産されたクローンはプライマーを使用して急速にその塩基配列が決定されることになる。
プラスミドＪＢー１１６５ー１由来のＤＮＡは、BamH IおよびSac Iで消化され、次に、Erase-a-baseキットでexoII消化される。切断されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分析し、代表的プラスミドを塩基配列分析のために選択する。
配列決定のためのプラスミドＤＮＡを、ホルムス／クイグレー法（Holmes and Quigley, 1981）による修飾法で調製した。その修飾法を簡単に述べれば、５０ｍｌ培養液から取った細胞を１０ｍｌのＳＴＥＴ（８％スクロース、５％トリトンＸー１００、５０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ８．０）中で再懸濁させ、リゾチームを添加し、その混合液を２分間沸騰させる。そのサンプルを遠心分離機ソルバルＲＣ５Ｂで、１４、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する、其の後、その上澄み液を同量のイソプロパノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、純粋のエタノールで洗浄して、風乾した。細胞ペレットを０．９ｍｌのＴＥ中で再懸濁させ、５ｍｇ・ｍｌ^-1ＲＮＡｓｅＡを２０μｌを添加した。その後、この混合物質を３７℃で１５分培養した。１．５Ｍ・ＮａＣＬ／３０％ＰＥＣを５００μｌ添加した後、その混合物質を３０分間氷上培養し、エッペンドルフ（Eppendorf）遠心分離機で１０分間遠心分離をしてＤＮＡをペレットで取り出した。この細胞ペレットを４００μｌのＴＥ中で懸濁させ、トリス飽和フェノール（ｐＨ７．４）で３回、トリス飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）で２回、クロロフォルムで２回抽出を行った。３Ｍ・酢酸アセトンを４０μｌおよび１ｍｌのエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させ、その後、７０％エタノールで洗浄し、蒸留水中で再懸濁をさせた。
ＤＮＡサンプルの塩基配列は、ＡＢＩ・モデル３７０Ａ・ＤＮＡシークエンサー、および、ダイ・ターミネーター化学法で行った。hin47遺伝子コーディング鎖の塩基配列の決定のために、クローンの集合セットと共に、ユニバーサル逆プライマーを使用した。約２５塩基のオリゴヌクレオチド・プライマーを非コーディング鎖の塩基配列を確認する目的で使用した。ＳＢ３３・hin47遺伝子のヌクレオチド塩基配列とＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を図２に示した。このＨｉｎ４７タンパク質のヌクレオチド塩基配列とＮ末端アミノ酸配列については、１９９２年５月２６日から３０日までニューオリンズで開催された米国微生物学会で発表したが、これを図２の下方に示した。ＳＢ３３・Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸末端配列と、本発明にかかるタンパク質の配列は同一であり、このクローン遺伝子がhin47としての同一性を示している。
実施例３
この実施例ではＨｉｎ４７タンパク質のセリンプロテアーゼ活性の発見について示している。
上記の実施例で決定されたＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を、遺伝子バンクに登録されているすべてのタンパク質と比較した。上述した通り、Ｈｉｎ４７タンパク質はＰＣＴ申請書ＷＯ９４／００１４９、ＷＯ９２／１１３６７、ＷＯ９２／１０９３６に記載されており、Haemophilusのアドヘシン分子であることが示されている。本発明における驚くべき、かつ、予期せぬ発見は、Ｈｉｎ４７タンパク質は、セリンプロテアーゼ・E.coli htrA、S.typhimurium htrA、および、その他のプロテアーゼとの相同性（５５％）のある重要なアミノ酸を持っているということである。このようなアミノ酸配列相同性については図３と図４に示している。
さらに、Ｈｉｎ４７タンパク質は、ペファブロック（Pefablock）のような、セリン・プロテアーゼ阻害剤の存在がなければ自己消化を起こすことも発見した。
実施例４
本実施例は、部位特異的突然変異誘発による突然変異体hin47遺伝子の産生経過を示したものである。上記で述べた通り、H.influenzae Hin47、E.coli htrA、S.Typhimuriumはいずれもセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼの活性中心のコンセンサス配列はＧＤＳＧＧＰＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）であり、セリンが活性残基である。htrAタンパク質はいずれもＧＮＳＧＧＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）の配列であり、H.influenzae Hin47には、成熟タンパク質の残基１９５と２０１の間には同一の配列がある。このように、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体が産生される場合には、このセリン残基１９７が部位特異的突然変異誘発の位置として選ばれることになる。
オリゴヌクレトチド・ＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）が産生され、これは１９７位置のセリン残基をアラニンに変換されたものである。hin47遺伝子をクローニングしてＭ１３ｍｐ１８とし、これにクローンＤＳー９８１ー３を産生させ、アメリカ・インビトロ・部位特異的突然変異誘発キットを用いて突然変異を誘発させた。塩基配列分析により、クローンＤＳー９９１ー８が確認され、セリンー１９７からアラニンへの突然変異が起こっていた。この突然変異体hin47遺伝子を「hin47*」と呼ぶことにした。適当なオリゴヌクレオチドを使用して、１９７位置のセリン残基はシステイン（突然変異体Ｓ１９７Ｃ）とトレオニン（突然変異体Ｓ１９７Ｔ）に変換させた。
さらに、図４で示した通り、Ｈｉｎ４７のアミノ酸配列と他のプロテアーゼを比較したところ、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体を産生するには、アミノ酸Ｈｉｓ−９１とＡｓｐー１２１の突然変異誘発が適当であることが判明した。上記で述べたと同様の突然変異誘発法により、これらのアミノ酸Ｈｉｓ−９１とＡｓｐー１２１を除去するか、または、別のアミノ酸で置換させた。このようなアミノ酸の置換としては、アミン酸Ｈｉｓー９１をアラニン（突然変異体Ｈ９１Ａ）とアルギニン（突然変異体Ｄ１２１Ａ）で、アミノ酸Ａｓｐー１２１をアラニン（突然変異体Ｈ９１Ａ）とグルタミン酸（突然変異体Ｄ１２１Ｅ）で置換した。このような、突然変異誘発のオリゴヌクレオチドは下記の通り。

別の突然変異を誘発するために対応するオリゴヌクレトチドを使用した。多数の突然変異体が誘発され、Ｈｉｓー９１とセリンー１９７がアラニンで置換され（突然変異体Ｈ９１Ａ／Ｓ１９７Ａ）、Ｈｉｓー９１、Ａｌｐー１２１、Ｓｅｒー１９７はすべてアラニンで置換された（突然変異体Ｈ９１Ａ／Ｄ１２１Ａ／Ｓ１９７Ａ）。Hin47*原料に関する前述の実施例で述べたように、プロテアーゼ活性の減退を確認するために、これらの追加で生産した突然変異体の抽出・精製・試験を行った。
多くのセリンプロテアーゼは不活性（チモーゲンのように）の状態で分泌されており、活性中心を見るのに切開が必要であった。成熟天然Ｈｉｎ４７タンパク質のＮ末端の塩基配列を分析した結果、ＫＦＦＦＧＤＲＦＡＷＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）の位置でプレタンパク質の細胞分裂が起こっていることが判明した。活性プロテアーゼ分子を産生する分子の細胞分裂を阻止するアミノ酸を修飾することにより、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体を発現させることができるのである。
実施例５
本実施例は、Ｓｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現させるのに使用する大腸菌プラスミドの構造を示したものである。
プラスミドであるＤＳー９９１ー８由来の突然変異体hin47*遺伝子のｐＴー７発現ベクターのクローニングを行いプラスミドＤＳー１０１１ー１ー１を産生させた（図５）。大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３を形質転換させて大腸菌株ＤＳー１０１８ー３ー１を作製するが、これによりＳｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現された。
テトラサイクリン・セレクションを利用するために、hin47*遺伝子をクローニングしてｐＢＲ３２８とした。BglII/BamH Iフラグメントの作製のために、プラスミドＤＳー１０１１ー１ー１由来のBgl II/Cla IT7/hin47遺伝子フラグメントをクローニングすることでpEVvrf1（Young and Davis, 1985）を生産するが、これは、さらにBamH Iで消化されるpUC-4K（Pharamacia）にクローン化できる。産生されたクローンＤＳー１０３４ー３を酵素EcoR Iで消化させ、T7/hin47*遺伝子フラグメントをクローニングしてpBR328とし、プラスミドＤＳー１０４８とＤＳー１０６７ー２を作製する。プラスミドＤＮＡを大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に導入すると、ＤＳー１０７１ー１ー１とＤＳー１０７１ー３ー１が生成され、これがＳｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現させる。
実施例６
この実施例では、Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の発現状態について示している。
ＤＳー１０１８ー３ー１、ＤＳー１０７１ー１ー１、ＤＳー１０７１ー３ー１をＮＺＣＹＭ＋３％デキストロース＋抗生物質（２５μｇ・ｍｌ^-1のアムピシリンまたは１０μｇ・ｍｌ^-1）の混合培養基で、３７℃で振り混ぜながら１昼夜培養して増殖させた。この一昼夜培養液を１：４０に希釈し、音波処理を行った後、同じ培養基に入れ、振り混ぜながら、吸光度が約０．３になるまで培養した。Ｔ７プロモーターからの発現を誘起させるために、１０％ラクトースの１０分の１容積分を添加した。ソルバル（Sorvall）ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を用いて、培養液を５０００ｒｐｍ回転で、１０分間、温度４℃で遠心分離した後、４時間して細胞サンプルを取り出した。
実施例７
この実施例ではＨｉｎ４７タンパク質の抽出、精製を示している。Ｈｉｎ４７は大腸菌において溶解性タンパク質として発現される。実施例６で調製した２５０ｍｌ培養液から取り出した細胞ペレットを、５０ｍＭトリス塩酸４０ｍｌ（ｐＨ８．０）内で再懸濁させ、音波処理で破壊した。この抽出物を２０、０００ｘｇで遠心分離した。ここで取り出した上澄み液の９５％以上が溶解性のＨｉｎ４７タンパク質であり、これは保管した。ここで発生した分画を「Ｈｉｎ４７・抽出液」と呼ぶことにした。
さらに、このＨｉｎ４７・抽出液をＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（Sephacel column）を使用して精製した。４０ｍｌのＨｉｎ４７・抽出液を２０ｍｌ型ＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）に注入した。Ｈｉｎ４７はこの条件下でカラムに付着した。さらに、このカラムを、１００ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８・０）、２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で順次洗浄した。Ｈｉｎ４７を４０ｍＭ塩化ナトリウム含有の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で希釈した。ＢＣＡタンパク質検定法で分画内のＨｉｎ４７を定量した。達成されたＨｉｎ４７の純度をＳＤＳ−ＰＡＧ分析法で測定した。Ｈｉｎ４７を含む分画を組み合わせた状態で、−２０℃で保管した。
顆粒分画として生産された突然変異体の殆どを占める野生型Ｈｉｎ４７タンパク質と同程度の溶解性があるタンパク質は、突然変異体であるＨ９１Ａだけであった。
実施例８
この実施例は、Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７の抽出と精製プロセスを示している。
Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７は大腸菌の顆粒分画中に発現された。２５０ｍｌ培養液から取り出した細胞ペレット（実施例６で調製したもの）を４０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で再懸濁し、音波処理（３ｘ１０分、７０％効率サイクル）で破壊した。抽出液を２０、０００ｘｇで遠心分離し、取り出した細胞ペレットを保管した。その細胞ペレットを４０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、０．５％トリトン・Ｘー１００、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で再抽出した。懸濁液を音波処理（１０分、７０％効率サイクル）を行った。抽出液を３００ｘｇで５分間遠心分離を行った。ここで取り出した上澄み液を２０、０００ｘｇで３０分間遠心分離をして、発生した細胞ペレットを保管した。その細胞ペレットを５０ｍＭトリス塩酸、０．５％トリトン・Ｘー１００、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で再抽出した。懸濁液を８Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）と混合した。５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を使用して、混合液内の尿素の濃度を２Ｍに調製した。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７はこの条件で完全に溶解した。この溶液の最終量は２０ｍｌであった。この分画を「Ｈｉｎ４７類似体ー抽出液」と呼んだ。Ｈｉｎ４７類似体ー抽出液をＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラムで精製した。２０ｍｌのＨｉｎ４７・類似体ー抽出液を１０ｍｌ型ＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）に注入した。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体は、この条件でカラムに付着した。さらに、このカラムを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８・０）で洗浄し、Ｈｉｎ４７類似体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で希釈した。この分画中にあるＨｉｎ４７類似体の量をＢＣＡタンパク質検定法で測定した。Ｈｉｎ４７類似体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧ分析法で測定した（図６）。Ｈｉｎ４７を含む分画を組み合わせて−２０℃で保管した。
実施例９
この実施例では、Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換して合成されたＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性を示している。
Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の酵素活性を、基質としてベータ・カゼインを使用して分析した（図７）。この反応混合物には、５μｇのベータ・カゼインと、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを含む。反応を３７℃で２時間進行させ、その後、ＳＤＳーサンプル緩衝液を添加し、直ちに１００℃で５分間熱することで停止した。アリクオット（部分サンプル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図７で示されているように、Ｈｉｎ４７によるベーター・カゼインの消化は、２時間後には明白であり（パネルＡ、行１）、その消化の程度はＨｉｎ４７類似体を含む画分よりも強く（パネルＡ、行２）、しかも、外因性のタンパク質は関与してない（パネルＡ、行３）。これらの混合物の中のＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の存在は、Ｈｉｎ４７に対するモノクローナル抗体を使用したイムノブロット法により確認された（図７、パネルＣ、行１、２）。
４℃および−２０℃という条件下での、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の自己消化の分析を通して、Ｈｉｎ４７およびＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体での活性を比較した。そのために、精製したＨｉｎ４７またはその類似体を４℃か−２０℃のいずれかの温度で２０日間保存した。保存後、ゼロ日目、１０日目、２０日目にアリクオットを取り出し、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の熱安定性を、Ｈｉｎ４７モノクローナル抗体を使用したイムノブロット法で分析した（図８）。４℃か−２０℃のいずれかの温度で２０日間保存した場合に、Ｈｉｎ４７よりもＨｉｎ４７類似体のほうが熱的に安定であった。
Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性をさらに詳しく試験するために、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の８０ーｋＤａ・H.influenzae組み換え抗原を崩壊させる能力を測定した。Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の、他の抗原に対する酵素分解作用を測定するために混合抗原試験を行った。本試験では、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体（４７ｋＤａ）と区別するため、８０ーｋＤａ・H.influenzae組み換え抗原（ＴＢＰ１）を選択した。５種類の混合物質は下記のように調製した。８０ーｋＤａタンパク質のみ、８０ーｋＤａタンパク質＋Ｈｉｎ４７、８０ーｋＤａタンパク質＋Ｈｉｎ４７類似体、Ｈｉｎ４７のみ、Ｈｉｎ４７類似体のみ。混合物質における各タンパク質の量はいずれも５μｇであった。混合物質は４℃で４週間保存した。保存後、ゼロ日目、７日目、１４日目、２８日目ににアリクオットを取り出しＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図９）。１週間後に、この８０ーｋＤａタンパク質とＨｉｎ４７の両方が大きく崩壊した（２、４行）。これとは対照的に、８０ーｋＤａタンパク質とＨｉｎ４７類似体を組み合わせた混合物では、１週間後にも元のままであり、４週間後に僅かに崩壊を示しただけであった（行３）。
他のＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性について、リプンシカら（Lipinska et al）が提唱した方法で、ベータ・カゼインの酵素消化反応を利用して評価を行い、その結果を表３に示した。一個の突然変異体（Ｄ１２１Ｅ）だけにセリンプロテアーゼ活性を保持していることが観察された。
実施例１０
この実施例は、マウスにおけるＨｉｎ４７とＨｉｎ４７類似体の免疫原性の比較を示している。
図１０は、Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫原性に関する比較試験結果を示してある。１群あたり５匹のBalb/cマウスで構成される群を５群用意して、１回あたり１μｇのＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを、ＡＬＰＯ₄（１投与量あたり１．５ｍｇ）の存在下で、１日目、２９日目、４３日目に１日３回皮下に注射した。注射後、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目に採血をして（これは、それぞれ、血液標本１、２、３、４として表示されている）、ＥＩＡ法により、抗Ｈｉｎ４７・抗体の力価を分析した。マウス血清における抗Ｈｉｎ４７・抗体は、パネツティ（Panezutti et al, 1993）らの方法で測定した。マイクロタイター・ウエルに１μｇのＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを、コーテングして室温で１６時間放置した。プレートはＰＢＳ内で０．１％ウシ血清アルブミンを入れブロックした。マウス血清を段階希釈してウエルに添加した後、室温で１時間培養した。ペルオキシダーゼと接合したヤギ・抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体をアフィニテー精製したＦ（ａｂ’）₂フラグメントを第二の抗体として使用した。テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ・Ｈ₂Ｏ₂）を使用して反応を進行させ、フロー・マルテスカン（Mutiskan）・ＭＣＣ・マイクロプレート・リーダーで、波長４５０ｎｍ（基準の波長は５４０ｎｍを使用）での吸光度を測定した。抗血清の反応力価を希釈度の相関として定義したが、これは注射をしてない血清サンプルの２倍の吸光度を示した。図１０から分かるように、マウスでは、Ｈｉｎ４７とＨｉｎ４７類似体の両方とも、Ｈｉｎ４７または突然変異体がＥＩＡ法での抗原として使用できるかどうかとは関係なく、相当なＩｇＧ力価を示した。
Ｈ９１ＡＨｉｎ４７類似体を使用した免疫原性研究も行った。この類似体はＳ１９７ＡＨｉｎ４７類似体と同等の免疫応答を示すことが分かった。
Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体に対する免疫応答をさらに試験するために、マウス血清での抗Ｈｉｎ４７・ＩｇＧのサブクラスを測定した。マイクロタイター・ウエルに１μｇの精製したＨｉｎ４７または類似体のいずれかをコーテングした。免疫原性比較研究のために用意したマウス血清最終サンプルをプールして、ＥＩＡ法により試験した。このＥＩＡ試験では、抗原として、ペルオキシダーゼと結合させたラット・抗マウス・ＩｇＧ、ＩｇＧ_2a、ＩｇＧ_2b、およびペルオキシダーゼと結合させたウサギ・抗マウスＩｇＧ3を使用した。交差反応を避けるために、精製した抗体サブクラスを使用して、各抱合体の希釈液を測定した。上記で述べた方法で、反応力価を測定した。表１で示したように、マウスにおいて、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかにより誘導されたＩｇＧサブクラスは、同一であり、このことはＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体が個体抗原としてＥＩＡ法に使えるかどうかとは関係がない。マウス血清の両グループのうち、顕著なＩｇＧ応答を示したのはＩｇＧ１・イソタイプであった。従って、Ｈｉｎ４７類似体は、実質的に天然タンパク質と同じ免疫原性を示したことになる。
実施例１１
本実施例は、Ｈｉｎ４７またＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫防御能を示している。
幼若ラットの菌血症モデルにおける、Ｈｉｎ４７・特異的抗血清の、H.influenzae菌ｂ株由来ＭｉｎｎＡに対する防御能から、Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫防御能を分析した。表２にはこの結果を示してある。０．１ｍｌのウサギ・抗Ｈｉｎ４７類似体・抗血清または同等の採血前血清のいずれかを、日齢６日のウイスター幼若ラット群の頚部に近い背部皮下に接種した。さらに、これらの群に、２４時間後に７００cfuの増殖させたばかりの新鮮なＨｉｂ株ＭｉｎｎＡを腹腔内投与した。２０時間後に、腹腔内投与されたラットから採血をして、チョコレート寒天プレートに移し培養した。２４時間後には細菌コロニーのカウントができた。表２に示したように、抗Ｈｉｎ４７類似体・抗血清を接種した群の９匹のうち３匹には、その血液中に菌血症は認められなかった。Ｈｉｎ４７類似体・抗血清（１１％）を接種した群の中で、採血前血清を接種したマウスに較べて、血液からの菌の回収量が高かったのは１匹だけであった。これとは対照的に、採血前血清を接種された９匹のマウス全部において菌が回収された。採血前血清を接種した９匹のうち４匹（４４％）において、血液中の細菌の数（５００ー１０００）のレベルが高かった。
幼若ラットの菌血症モデルを、抗Ｈｉｎ４７・血清または抗Ｈｉｎ４７・突然変異体・抗血清の、H.influenzae・タイプｂ株感染が原因で発症した菌血症に対する防御能を評価するために使用した。この幼若ラット１０匹のうち６匹において、これらの血清は野生型Ｈｉｎ４７、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７類似体に対する防御能を示した。
実施例１２
本実施例は、ストレス負荷の条件下でのＨｉｎ４７合成の誘導を示している。
H.influenzae株Eaganをヘミン（２μｇ・ｍｌ^-1）とＮＡＤ（２μｇ・ｍｌ^-1）を含んだＢＨＩ液体培養基内で３７℃で、Ａ₅₉₀=0.3の条件で増殖させた。このサンプル・アリクオットを取り出して、３７℃、４２℃、４３．５℃で、または、６％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、または、０．３塩化ナトリウムの存在下で増殖させた。大腸菌株ＪＭ１０９を、ＹＴ培養基内で３７℃で、Ａ₅₉₀=0.3の条件下で増殖させ、上記と同じ方法でアリクオットを取り出した。サンプルを０分、２０分、４０分、６０分、９０分後に収集して、ＯＤ法およびＳＤＳ−ＰＧＥ／ウエスタンブロット法で分析した。H.influenzae・Hin47とE.coli・htrAを認識するモルモット抗血清を、ウエスタンブロット法分析に使った。４３．５℃で増殖させた時に、大量のE.coli・htrA・タンパク質が合成され、H.influenzae・Hin47・タンパク質は少量しか認められなかった。６％エタノールを含む培地で増殖させることで、E.coli・htrA・タンパク質とH.influenzae・Hin47・タンパク質の両方の合成が誘導された。塩の含有が多いと、このタンパク質のいずれか一方の合成が弱くなった。これらの結果は、Ｈｉｎ４７がストレス応答タンパク質であり、類似の条件で、E.coli・htrA・タンパク質の合成が誘導されることを示している。
実施例１３
本実施例は、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質の精製を示している。
この溶解性のＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質を、実施例７での野生型Ｈｉｎ４７タンパク質の場合と同じ方法に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラムを追加した方法で精製した。ＨＡＰカラムには１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を入れ、ＤＥＡＥカラムをセットした。Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質がＨＡＰカラムに付着した。汚濁タンパク質は１７５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄して除去した。３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質を−２０℃で保存した。
実施例１４
本実施例はチンチラネコの中耳炎モデルにおけるＨｉｎ４７およびＨｉｎ４７突然変異体の防御能を示したものである。
野生型のＨｉｎ４７、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７による能動免疫化が引き起こす防御能の評価のために、チンチラネコの中耳炎モデルを使用した。
ＡＩＰＯ４と抱合しているＨｉｎ４７（Ｈ９１Ａ）またはＨｉｎ４７突然変異体（Ｓ１９７Ａ）を、一回投与量で３０μｇ、１日目、２８日目、４２日目にチンチラネコの筋肉内に１日３回接種した。５６日目にこのチンチラネコに、５０ー１０００ＣＦＵ（コロニー形成単位）の細菌・ビルレントＮＴＨｉ株ＳＢ１２を接種した。鼓膜切開と耳鏡検査でモニターした後、接種後４日目に中耳浸出液を取り出しチョコレート寒天培地で培養した。２４時間後に細菌コロニーをカウントした。野生型のＨｉｎ４７およびＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質はこの実験動物の５０％に防御能を与えるが、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７には防御能はない。
開示内容の要約
本発明は、プロテアーゼ活性を天然のＨｉｎ４７タンパク質の約１０％まで低下させた新規のH.influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体および、このＨｉｎ４７タンパク質をコーデングする分離・精製ＤＮＡを供給するものである。本発明の範囲内でのタンパク質修飾が可能である。

配列表
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２８９４個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｉｉ）分子の型
（xi）配列の名称：配列番号１

（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：４６３アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（xi）配列の名称：配列番号２

（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対４１個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号３

（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸３７個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号４

（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸４７２個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号５

（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸４７５個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号６

（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２８個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号７

（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２３２個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号８

（２）配列番号９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２３個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号９

（２）配列番号１０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２８個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１０

（２）配列番号１１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２４０個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１１

（２）配列番号１２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２４個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１２

（２）配列番号１３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２３個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線

（２）配列番号１４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１８５個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１４

（２）配列番号１５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１８１個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１５

（２）配列番号１６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１９８個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１６

（２）配列番号１７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸７個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１７

（２）配列番号１８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸７個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１８

（２）配列番号１９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１４個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１９

（２）配列番号２０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２２個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２０

（２）配列番号２１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２１個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２１

（２）配列番号２２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２１個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２２

（２）配列番号２３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１１個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２３

Field of Invention
The present invention relates to the field of immunology, in particular to immunogens and antigens produced from species of the genus Haemophilus.
Related Application Reference
This application is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 08 / 296,149 filed Aug. 26, 1994, which is itself a part of US Patent Application No. 08 / 278,091 filed Jul. 21, 1994. This is a continuous continuation application.
Background of the Invention
Haemophilus influenzae (Hemophilus influenzae) is a microorganism that causes various diseases such as meningitis, epiglottis, pneumonia, and otitis media in humans. H. influenzae type b (Hib) is the main causative agent of bacterial meningitis in children under 5 years of age. Protective antibodies against this disease are produced by derivatizing from capsular polysaccharides of microorganisms. In that case, vaccines have been developed using purified polyribosyl phosphate (PRP) as an antigen. The immune effect of this vaccine is 90% in adults and more than 24% in children 24 months of age, but there is no immune effect in children younger than 24 months (Zangwill et al, 1994). (References are listed in the reference list shown at the end of this application, and each reference in the list is self-contained. As with other polysaccharide protein-derived antigens, there is no proliferation of T-helper cells in this PRP, and reimmunity induces a secondary immune response or an increase in memory cells. There is nothing. By joining the PRP polysaccharide and the protein carrier, the vaccine is given independent characteristics from T-cells, and the immune response to the PRP antigen is substantially enhanced. Recently, four types of PRP-carrier-conjugated vaccines are available. All of these vaccines are based on Haemophilus influenzae b-type capsular polysaccharide conjugated to diphtheria toxin, tetanus toxin, or Neisseria meningtidis outer membrane protein. These Haemophilus influenzae b-type conjugate vaccines have succeeded in dramatically reducing the onset of bacterial meningitis (Schoendorf et al, 1994).
There are six serotypes of Haemophilus influenzae from a to f, and they are identified by the type of capsular polysaccharide. Recent Haemophilus-derived conjugated vaccines are not protective against other invasive types that can be typed (types a and c). More importantly, these vaccines are not protective against non-typable strains (NTHi), which are common causative organisms for postpartum sepsis, neonatal sepsis, pneumonia, otitis media . Otitis media is the most common disease that affects younger children, and about 70% of all children experience this disease at least once by age 7. Chronic otitis media causes children's hearing impairment, speech impairment, and sensory impairment. About 50% of the causes of otitis media are caused by Streptococcus pneumoniae infection, about 30% are caused by strains that are unable to type Haemophilus influenzae, and the remaining 20% are Moraxella. (Branhamella) Caused by infection with catarrhalis. In the United States alone, the cost of treating otitis media ranges from $ 1 billion to $ 2 billion annually and is used to pay for antibiotics, tonsillectomy, adenoidectomy, and tympanotomy. As a universal defense against diseases related to H. influenzae, especially conservative, non-compliant, non-capsular H as a way to protect children 2 to 6 years of age and other high-risk groups The supply of immunogens derived from .influenzae has been awaited. Strains that cannot be typed for H. influenzae are also important pathogens of pneumonia in the elderly and especially in people who are susceptible to respiratory infections. Thus, there is a demand for an antigen derived from H. influenzae, and if supplied, it can be used as a component of an immunopharmaceutical that is capable of protecting against many serotypes of H. influenzae. is there. The PTC application WO / 92/10936 (published in the application as a reference) published on July 9, 1992 mentions the outer membrane protein with a molecular weight of 47,000 obtained from this H. influenzae, It is reported as an adhesin, named Hin47, and is an isolate from H. influenzae, which is immunologically located between the non-typeable bacteria and type b. If so. The amino acid sequence and nucleotide base sequence of gene-coded Hin47 were published at the American Microbiological Society held in New Orleans, USA from May 26 to 30, 1992. These sequences have also been published in PCT application WO 94/00149 published on January 6, 1994, and are also included in this application as a reference.
This Hin47 protein is classified as one of the proteins derived from Haemophilus influenzae strain and is reported to be adhesin. Therefore, it is caused by diseases caused by Haemophilus influenzae and other bacterial pathogens that produce Hin47. It can be used as a diagnosis or vaccine for a disease, or as a protein that can induce production of an antibody that specifically reacts with Hin47.
When this Hin47 protein is used as an antigen and a protein that induces production of an anti-Hin47 antibody is used in diagnosis, there are also disadvantages. In other words, this is something that the applicant unexpectedly and accidentally discovered, but this Hin47 has protease activity, and therefore self-digestion occurs in Hin47 and is mixed in it. It causes proteolysis of other antigens. Therefore, in order to be able to be used as an antigen, or to be used as a carrier for immunizing agents such as vaccines and other immunogens, or for the production of diagnostic agents, this proteolytic activity It is desirable to synthesize and supply a Hin47 protein analog with reduced levels (sometimes referred to herein as a mutant or derivative).
Summary of invention
The object of the present invention is to provide a Hin47 protein analogue from Haemophilus with reduced protease activity.
One aspect of the present invention is to provide a Hin47 protein analog derived from Haemophilus that has been separated and purified, and the activity of the protease of the analog is reduced to about 10% of the activity of naturally occurring Hin47. It has been reduced to. It is desirable that this Hin47 analog has essentially the same immunogenicity as the native Hin47 protein. The analog provided in the present invention is synthesized and produced by adding natural Hin47 by chemical, biochemical methods or genetic modification.
In an embodiment of the present invention, when synthesizing by genetic modification, in order to reduce the protease activity, at least one amino acid in natural Hin47 causing protease activity is removed or another amino acid is removed. Replace with. Furthermore, as another method for reducing this protease activity, at least one amino acid is inserted into the amino acid sequence of the native Hin47 protein. The at least one amino acid to be removed or substituted is selected from one of amino acids 195 to 201 in natural Hin47, in particular serine-197 is removed or another amino acid Is substituted with alanine, cysteine, or threonine. In addition, at least one amino acid that is removed or replaced is His-91, which is removed or replaced with alanine, cinn, arginine. At least one amino acid that is removed or replaced is Asp-121, which is removed or replaced with alanine. Furthermore, as another method, it can be produced by removing or substituting a plurality of amino acids in the natural Hin47 molecule. As a plurality of amino acids, there are His-91 and Serine-197. By removing these or replacing them with Ala-91 and Ala-197, a Hin47 analog protein H91A / S197A can be synthesized and produced. Furthermore, as a plurality of amino acids, there are His-91, Asp-121, Ser-197, and these are also removed or substituted with Ala-121 and Ala-197, thereby allowing the H47A analog protein H91A / D121A / S197A can be synthesized and produced. A summary of the properties of some of the Hin47 analogs supplied in this invention is shown in Table 3. Only D121E, a Hin47 mutant, shows that substantial protease activity remains.
In another embodiment of the present invention, a separated and purified nucleic acid molecule is provided. This nucleic acid molecule consists of a mutated gene of Haemophilus influenza hin 47 encoding Haemophilus influenza Hin 47 protein, and its protease activity is reduced to 10% or less of that of native Hin47 protein. This mutant hin47 gene encodes any type of protein of the Hin47 analog described above. This mutant gene is preferably produced by site-directed mutagenesis of the wild type hin47 gene. This nucleic acid molecule is inserted into a recombinant plasmid used for host transformation. The plasmid used here is DS-1011-1-1-1, which was deposited with the United States Microorganism Depositary in Rockville, Maryland under the approval number 75845 dated July 27, 1994. The present invention also provides a recombinant plasmid that is integrated into such transformed cells.
As another embodiment of the present invention, there is provided a method for producing an activity-reduced Hin47 protein analog derived from Haemophilus influenzae having reduced protease activity to 10% of the native Hin47 protein. The method includes identifying at least one amino acid residue in a native Hin47 protein causing protease activity, removing or substituting a nucleotide sequence encoding at least one amino acid, In order to produce a gene, site-directed mutagenesis of the mutated gene hin47 is induced, the mutated gene hin47 is introduced into the cell, the cell is transformed, and it is proliferated. A method of producing a Hin analog protein. The at least one amino acid selected here is any of the amino acids identified above for the Hin47 analog.
It is desirable to cause cell transformation by incorporation of the mutated gene hin47 into the cell. Among the transformed cells, the mutated gene hin47 is controlled by the T7 promoter, but the growth of the transformed cells and the induction of expression of the Hin47 analog by the T7 promoter are caused by culturing in the lactose medium prepared to the inducing concentration. It is desirable. Furthermore, it is desirable to use the recombinant plasmid DS-1011-1-1-1 (herein referred to as plasmid pT7 / hin47) for the incorporation of the mutated gene hin47 into the cells for cell transformation.
Furthermore, as an aspect of the invention, the present invention provides a method for supplying a separated and purified Hin47 analog. The method includes performing each of the above procedures to synthesize a Hin47 analog. The procedure includes disrupting the grown transformed cells consisting of a granule fraction containing the Hin47 analog to separate its supernatant and the granule fraction, and further including the Hin47 analog. It involves dissolving the granule fraction and using chromatographic separation of the solution portion from the cell debris portion to purify Hin47 and further separation of the purified Hin47 analog.
The protein activity-reduced analog of Hin47 supplied in this invention is useful as an antigen in an immunogenic composition, as a carrier for another immunogen, or as a raw material for a diagnostic agent. Similarly, the nucleic acid molecules supplied in the present invention are also useful as diagnostic probes or widely as diagnostic tools in the field of immunity.
In yet another aspect of the invention, the present invention provides an immunogenic composition comprising a quantity of a Hin47 analog or a nucleic acid molecule comprising a gene encoding the Hin47 analog in an amount sufficient to exert an immune effect. This immunogenic composition can be prepared as a vaccine for in vivo administration to a host, including humans. This vaccine can be used as a defense against diseases caused by bacterial pathogens that produce Hin47 or produce proteins that can induce the production of antibodies in the host that specifically react with Hin47. Examples of this bacterial pathogen include Haemophilus species such as Haemophilus influenzae. The immunogenic composition of the invention consists of at least one other immunogenic or immunostimulatory substance, such as an adjuvant. As a further additional example, a nucleic acid molecule comprising a gene encoding a Hin47 analog of the present invention is included in a survival vector such as poxvirus, Salmonella, poliovirus, adenovirus, vaccinia virus or BCG. Yes.
The invention also includes a method of raising an immune response in a host, including a human. The method comprises inoculating the host with an immunogenic composition of the invention in an amount that can be expected to have an immune effect.
As mentioned above, this Hin47 analog can also be used in the diagnostic area. Therefore, as an additional aspect of the invention, there is provided a method for examining whether or not an antibody that specifically reacts with Hin47 exists in a specimen. The method includes the following procedures.
(A) contacting a specimen with a Hin47 analog having substantially the same immunogenicity as a native Hin47 protein, so that the Hin47 analog and an antibody that is present in the specimen and reacts specifically with Hin47 Producing a complex substance; and
(B) Confirm the production of this complex substance.
The present invention includes a method for detecting whether Hin47 is present in a sample. The method consists of the following procedures.
(A) immunizing a test subject with the immunogenic composition of the present invention to produce an antibody that specifically reacts with the Hin47 protein;
(B) contacting the test subject with this antibody, thereby producing a composite material comprising Hin47 present in the test subject and Hin47 that reacts specifically with the antibody;
(C) Confirm the production of this complex substance.
This invention includes the provision of a diagnostic kit. This diagnoses whether there is an antibody specifically reacting with Hin47 in the specimen, and includes the following substances and methods.
(A) a Hin47 analog having essentially the same immunogenicity as the native Hin47 protein supplied in the present invention;
(B) a method of bringing the analog into contact with a test subject so that a complex substance of the analog and an antibody contained in the specimen can be produced; and
(C) A method for confirming the production of the complex substance.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a restriction map of plasmids JB-1031-1-14 and JB-1068-2-2, and a structural diagram for base sequence analysis.
FIG. 2 shows the complete nucleotide base sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and partial nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of Hin47 produced from SB33 derived from H. influenzae strain. And a partial amino acid sequence (SEQ ID NO: 4). The latter is a copy of the material presented at the ASM conference by the present inventors.
FIG. 3 shows the results for H. influenzae Hin47 (SEQ ID NO: 2), E. coli (E. coli) strain htrA (SEQ ID NO: 5), and Salmonella typhimurium strain htrA (SEQ ID NO: 6). A comparison of amino acid sequences.
FIG. 4 is a sequence of 57 to 256 amino acid residues of Hin47 with known protease (SEQ ID NOS: 7 to 16). The code is as follows. TON: rat tonin, PKAAB: kallikrein, PTN: trypsin, CHAA: chymotrypsin, EST: elastase, RP2A: rat mast cell protease, SGT: Streptomyces griseus trypticin, SGBE: Streptomyces griseus proteinase A, SGA : Streptomyces girseus proteinase B, ALP: L.enzymogenes alpha-lysine proteinase, hin47: Hin47 57-256. An asterisk (*) indicates a structural conservation site. The catalyst triad residue is indicated by a chapter mark (≠). 'Con' indicates the consensus sequence site of mammalian protease.
FIG. 5 is a restriction map of the plasmids DS-1011-1-1-1 and DS-1048-2, which are Hin47 analogs produced from E. coli (E. coli), and plasmid DS-1011-1 This is a construction scheme for -1 (plasmid pT7 / Hin47 *).
FIG. 6 shows the purification process of the Hin47 analog produced from E. coli, which is one example of the present invention and is also a gel analysis of a purified product.
FIG. 7 shows the protease activity of natural Hin47 and the Hin47 analog of the present invention against beta casein.
FIG. 8 compares the stability of natural Hin47 and the Hin47 analog of the present invention when the temperature is changed.
FIG. 9 shows enzymatic degradation of recombinant protein derived from H. influenzae by natural Hin47 and the Hin47 analog of the present invention.
FIG. 10 compares the immunogenicity of native Hin47 and the Hin47 analog of the present invention in mice.
FIG. 11 is a comparison of amino acid sequences of Hin47 protein produced from SB33 derived from H. influenzae strain and Hin47 protein produced from SB12.
FIG. 12 shows the purification process of H91A, which is a Hin47 analog produced from E. coli.
General description of the invention
All Haemophilus strains with the Hin47 gene have been used to supply purified and isolated nucleic acid molecules (in the form of DNA molecules) which, as shown in the exemplary embodiment of the present invention, A gene containing a coding part. Such strains are available from clinical sites and from bacterial collection agencies such as the US Microorganism Depositary. Such bacteria include H. influenzae and other bacterial strains that produce proteins capable of producing antibodies that specifically react with Hin47 fragments and analogs thereof.
The following strains can be used among Haemophilus.
Haemophilus b-type strain MinnA
Haemophilus b-type strain Eagan
Haemophilus atypical strain SB33
Haemophilus atypical strain SB12
Haemophilus atypical strain PAK12085
FIG. 1 shows restriction enzyme maps of plasmids JB-1031-1-14 and JB-1068-2-2, and these plasmids are produced from Haemophilus atypical strain SB33. A portion encoding Hin47 protein is inserted. The nucleotide sequence of the Hin47 gene has already been determined, and FIG. 2 shows the amino acid sequence of the Hin47 protein. Fig. 3 shows the amino acid sequence of Hin47 derived from H. influenzae and the amino acid sequence of the htrA protein from the E. coli strain and the htrA protein from the Salmonella typhimurium strain. It is. As the present inventors have unexpectedly discovered, the presence of this amino sequence causes natural Hin47 to act as a bacterial serine protease, which causes protease activity. This natural Hin47 was previously reported to be an adhesin. This protease activity is a major obstacle when natural Hin47 is used as an immunogen for vaccination or as an antigen for diagnosis. Analysis of the amino acid sequence of FIG. 3 revealed that the htrA protein and native Hin47 contain a GNSGGAL sequence between amino acid residues 195 and 201 of the mature protein. The consensus sequence of the active site of serine protease is GDSGGPK (SED ID NO: 18) (Brenner, 1988), and the active residue is serine. Thus, when a mutation is induced in the serine-197 of Hin47, a Hin47 analog with reduced protease activity is synthesized. This is shown as an example of the present invention. In another example, serine-197 was replaced with alanine. The amino acid residues 57 to 256 of Hin47 are known proteases, which are aligned with the active center residues identified from the homologues at the tip surrounding the catalytic triad residues. A standard numbering system has been established for serine proteases, according to which the catalytic triad residues are numbered His-57, Asp-102 and Ser-195, respectively. These correspond to the residues His-91, Asp-121, and Ser-197, respectively. FIG. 4 shows the structural sequence of serine protease (SEQ ID NOS: 7 to 16) whose 10 structures have already been determined. As shown in the figure, homologous residues are arranged in the same position three-dimensionally. I am doing. The multiple residues within the hydrophobic core of Hin47 are reasonably lined up at positions where the functional amino acids of the Hin47 protease can be identified, as well as residues around the active center. Other amino acid residues that cause protein protease activity in native Hin47 include His-91 and Asp-121. In the examples, this His-91 is replaced with alanine, risnin or arginine to reduce activity. In another example, Asp-121 is similarly substituted with alanine or glutamic acid. Further, in additional examples, serine-197 is replaced with alanine, serine, or threonine. Here, as an example of a method for supplying an analog of Hin47 with reduced protease activity, substitution of a specific amino acid in the protein of Hin47 is exemplified. However, discovery of protease activity and expression of Hin47 shown in the present invention are exemplified. By applying the method and its purification method, it is possible to produce another Hin47 analog in which at least one amino acid is removed or substituted, or another analog in which at least one additional amino acid is incorporated into the Hin47 protein. Is clear. The present application and examples also indicate that it is desirable to convert several amino acids in the Hin47 protein simultaneously to reduce protease activity in particular. Several amino acids include His-91 and Ser-197, which are removed or substituted with alanine to reduce activity. In another example, these multiple amino acids include His-91, Asp-121, Ser-197, which have been shown to be removed or substituted with alanine. Thus, the present invention shows that Hin47 protein analogs with reduced protease activity can be supplied by methods that remove or replace one or more amino acids with other amino acids, or methods that introduce additional amino acids.
As described above, Hin47 has homology to htrA protein derived from E. coli or htrA protein derived from S. typhimurium, both of which are stress response proteins and have serine protease activity. The production of htrA protein derived from E. coli can be induced by growing E. coli at 43.5 ° C. (see Reference 13). In the present invention, the htrA protein derived from Escherichia coli was shown to be capable of inducing production even when grown in a 6% ethanol solution. Hin47 can also be induced to grow by growth in a 6% ethanol solution. Furthermore, although the amount of production induced is reduced, it can also be induced to grow by lowering the temperature to 43.5 ° C. Yes, that is detailed below. As the analysis of the expression of this Hin47 protein proceeds, evidence that there is a relationship between this protein and LtrA has become clear. The hin47 gene can be obtained by PCR propagation of H. influenzae strain SB12 that cannot be typed. In FIG. 11, the amino acid sequences of the Hin47 protein derived from H. influenzae strain SB12 and the Hin47 protein derived from H. influenzae strain SB33 are compared. What can be seen in this comparison is that the amino acid sequences of both proteins are almost identical.
FIG. 5 shows the plasmids DS-1011-1-1-1 and DS-1048-2, which are used to express the Hin47 analog when serine-197 is replaced with alanine in E. coli.
FIG. 6 is a flow diagram showing a method for purifying a Hin47 analog from a granular fraction of E. coli.
FIG. 7 shows that the Hin47 analog obtained by substituting Serine-197 with alanine shows a state of reduced protease activity against beta casein, whereby the pretease activity of this analog is reduced to the native Hin47 protein. It can be seen that it is 10% or less. Thus, in an example of the present invention, the present invention provides a Hin47 analog that has a protease activity that is 10% or less of the native Hin47 protein, such a Hin47 analog that converts the amino acid serine-197 with alanine. It shows that it can be produced by replacement.
FIG. 8 illustrates an analysis of the improved thermal stability of the Hin47 analog supplied in the present invention. As an example of the present invention, a Hin47 analog having improved thermal stability is provided, and such a Hin47 analog is produced by substituting the amino acid serine-197 with alanine.
FIG. 9 illustrates a state in which a non-Hin47 Haemophilus-derived antigen is proteolyzed by Hin47 and Hin47 analogs. Another embodiment of the present invention shows another Hin47 analog that does not undergo proteolysis by Hin47, in which the amino acid serine-197 is replaced with alanine.
FIG. 10 and Table 1 illustrate the immunogenicity comparison of unmodified natural Hin47 and reduced protease activity Hin47 analogs according to the present invention in mice. The immunogenicity of the native Hin47 protein and the Hin47 analog S197A of the present invention are similar. The examples show Hin47 analogs that are of reduced protease activity and that are substantially the same in immunogenicity as natural Hin47. In this Hin47 analog, the amino acid serine-197 is substituted with alanine.
Tables 2 and 3 show the immunoprotective ability of protease-reduced Hin47 analogs against Hib in a young rat bacteremia model and an immunized chinchilla cat otitis media model. In this Hin47 analog, the amino acid His-91 is removed or replaced with alanine, lysine, arginine, Asp-121 is removed or replaced with alanine or glutamic acid, and serine-197 is replaced with alanine, cysteine, threonine. Or synthesized by substitution of these combinations.
In another embodiment of the present invention, a vaccine for protection against Haemophilus or other bacterial pathogens is provided. The pathogen here refers to a bacterium that produces a Hin47 protein or a protein that induces an antibody capable of recognizing Hin47. The vaccine here uses a Hin47 analog having immunity / protection ability, uses an amount that can be expected to have an immunogenic effect, or has a nucleic acid molecule having a base sequence encoding Hin47, and physiological It is a vaccine composed of carriers of these substances, which are acceptable to the environment. This analog supplied in the present invention can be used as a hapten, polysaccharide, or peptide carrier protein in making a conjugate vaccine against an antigenic determinant unrelated to Hin47.
As will be apparent from the contents of the application described below, the present invention also provides a novel strain of bacteria for synthesizing plasmids and Hin47 analogs.
A purified / isolated DNA derived from Haemophilus influenzae and encoding a protein Hin47 having a protease activity lower than that of the natural one is useful as a nucleic acid probe as a means for identifying Haemophilus strains in vitro or in vivo. The Hin47 analog encoded by the genetic DNA molecule supplied by the present invention is useful as a diagnostic agent by using it as an antigen or as an antigen for producing an anti-Hin47 antibody. Furthermore, it can also be used as an antigen for vaccine production against diseases caused by Haemophilus strains and other bacterial pathogens that produce proteins that can induce the production of antibodies that specifically recognize Hin47, and Haemophilus or similar It can be used to diagnose bacterial infections.
In an additional embodiment of the present invention, a protease activity-reduced Hin47 analog can be used as a carrier molecule when synthesizing chimeric molecules or conjugate vaccines (including complex carbohydrates) for the prevention of pathogenic bacteria such as encapsulated bacteria. Is shown. For example, the glycoconjugate supplied in the present invention can be used for immunization for protection of diseases and infections caused by bacteria having polysaccharide antigens such as lipooligosaccharide (LOS) and PRP. These bacterial pathogens include Haemophilus influenza, Streptococcus pneumonia, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella, Staphylococcus aureus (Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas aeruginosa There is. Special antigens can be conjugated to Hin47 analogs, and such linking methods have already been described in the PTC application WO 94/12641 produced by the applicant of the present invention. It is posted as a reference.
In another example, the Hin47 analog is used as a carrier in immunizing cancer cells against abnormal polysaccharides or in making anti-cancer antibodies that can be conjugated to chemotherapeutic or bioactive agents. It shows what you can do.
Since the Hin47 analog supplied in the present invention is a protein derived from H. influenzae, a drug formulated with it can be used for prevention and diagnosis of diseases caused by H. influenzae. The inventors have discovered that this Hin47 analog can elicit a protective immune response against live H. influenzae type b strains. Therefore, it is clear that the present invention can be used for vaccines. Furthermore, the present invention shows the nucleotide sequence of the gene encoding the Hin47 analog. These DNA segments can also be used to supply immunogens that are essentially unrelated to the H. influenzae antigen, such as PRP and lipooligopolysaccharide (LOS), using recombinant DNA technology. Hin47 analog protein can be produced by using E. coli, Haemophilus, Bacillus, Bordetella, yeast, baculovirus, poxvirus, and vaccinia virus as a suitable expression system. It can be induced. The present invention substantially provides a novel technique for synthesizing isolated and purified pure Hin47 analogs.
Examples of the present invention can be applied to the treatment, diagnosis and vaccination of Haemophilus infections and infections of other bacterial pathogens producing proteins capable of inducing the production of antibodies that specifically react with Hin47 Is obvious to those skilled in the art. Such usage is described in detail below.
1. Vaccines and their use
The above Hin47 analogs can be used as immunogenic inducers for vaccine production. The vaccine is for eliciting the immune response of the subject to be inoculated and producing phagocytic or bactericidal antibodies, including anti-Hin47 antibodies. When a vaccine recipient is attacked by H. Haemophilus or other bacteria that produce a protein that induces the production of antibodies that specifically react with Hin47, these antibodies bind to the invading bacteria. And inactivate it. Phagocytic or bactericidal anti-Hin47 antibodies also exert protective effects in other mechanisms.
These immunizing substances including vaccines can be prepared as injection solutions, liquid solutions, or emulsions. It is also possible to mix Hin47 analogues with excipients within the pharmaceutically acceptable limits. Such excipients include water, salt, dextrose, glycerol, ethanol, and combinations thereof. To this immunogenic substance or vaccine, an auxiliary substance such as a wetting agent, an emulsifying agent, a pH buffering agent, or an adjuvant may be added in order to enhance the effect. Aluminum hydroxide or aluminum phosphate can be used to complete the adjuvant effect, but usually 0.05 to 0.1% phosphate buffered saline is used. Immunogenic substances and vaccines are administered parenterally, subcutaneously or intramuscularly. The immunogenic substance according to the present invention can also be prepared so that an immune response occurs on the administered mucosal surface. This immunogenic substance can be administered to the mucosal surface by the nasal or oral (intragastric) route. It is desirable to administer this by the method of suppositories or oral drugs. In the case of suppositories, polyalkalene glycols or triglycerides can be used as binders and carriers. When used as an oral drug, an excipient is used, and as this excipient, saccharin, cellulose carbonate, and magnesium carbonate are used. The immunogenic substance can be in any form of solution, suspension, tablet, pill, capsule, sustained-release preparation, and powder. The concentration of the Hin47 analog is 1 to 95%. Can be adjusted. These immunogenic substance preparations and vaccines can be selectively used as therapeutic, prophylactic / protective, or immunogens by adjusting their dosage. The dosage varies depending on the individual circumstances of the administration subject, and is adjusted according to the state of the individual's immune function that induces the production of antibodies, and if necessary, the ability of the cellular immune response. The exact amount expected of the active ingredient at the time of administration is left to the judgment of the physician. However, the appropriate dosage must be determined by a skilled expert in this field, and the Hin47 analog dosage will be on the order of micrograms. The appropriate initial dose varies depending on the subsequent dose, and the amount of booster antigen varies. Furthermore, the dose varies depending on the route of administration, and the amount varies depending on the size of the host.
The concentration of the antigen contained in the immunogenic preparation according to the present invention is generally 1 to 95%. If the vaccine contains antigens from only one type of pathogen, the vaccine is called a monovalent vaccine. On the other hand, a vaccine containing antigens derived from several types of pathogenic bacteria is called a mixed vaccine, which is also a vaccine supplied to the present invention. In the case of a mixed vaccine, it includes antigens derived from various pathogens, antigens produced from different strains of the same pathogen, or antigens from a combination of various pathogens.
Nucleic acid molecules encoding the Hin47 analogs of the invention can be used directly for immunization. For example, there is a method in which the gene DNA is directly administered to the immunization subject, or in the case of gene immunization, the DNA is directly injected. Furthermore, there is also a method of immunization by transferring a gene to a living vector such as Salmonella, BCG, adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, poliovirus. There is a report of O'Hagan (1992) on live vectors used to carry heterologous antigens to the immune system, and Ulmer et al. Reported on how to insert DNA directly into a specimen for the purpose of gene sensitization. (1993).
2. Immunoassay (immunoassay)
The Hin47 analogs of the present invention are further used as immunogens to induce the production of anti-Hin47 antibodies, as well as immunoassays (ELISA: Elisa, RIA: radioimmunoassay, other non-enzyme linked antigen binding assays or anti-Haemophilus antibodies, anti-Hin47 It is also useful as an antigen in a method known as antibody detection technology). In the Eliza method, the Hin47 analog is immobilized on a specially selected surface, such as a surface to which proteins can be attached, such as the wall of a polystyrene microtiter plate. Non-specific proteins such as bovine serum albumin (BSA) solution known to be neutral in antigen-antibody reaction to the specimen after washing to remove incompletely absorbed Hin47 analogs To the selected surface. By doing so, nonspecific absorption sites can be blocked on the fixed surface, and the cause and background of nonspecific binding of antiserum to the surface can be reduced.
Next, there is a method in which a specimen made of a substance having clinical significance or biological meaning is brought into contact with this fixed surface, and the specimen is tested by a method for promoting the formation of an immune complex substance (antigen / antibody). is there. The method also includes diluting the sample with diluents such as BSA solution, bovine gamma globulin (BGG), phosphate buffered saline (PBS) / Tween. The sample is then incubated at a temperature of 25 ° C. to 37 ° C. for 2-4 hours. After incubation, the surface to which the sample is attached is washed to remove nonimmune complex material. This washing also includes washing with a solution such as PBS / Tween or borate buffer. A specific immune complex is generated between the test sample and the bound Hin47 analog, then washed and the immune complex is contacted with a second antibody having specificity for the first antibody. The timing and amount of production of the immune complex can be determined. If the test sample is derived from a human, the second antibody is an antibody having specificity for human immunoglobulin (generally IgG). As a detection method, the second antibody can have an activity such as an enzyme activity that generates color when cultured with a suitable chromogenic substance. Quantitative analysis is possible by measuring the degree of color generated here using a spectral spectrophotometer.
3. Using nucleotide sequences as hybridization probes
The nucleic acid molecule of the present invention has a base sequence as a hin47 analog gene, and therefore, a hin47 analog from Haemophilus strains and other bacteria that produce proteins capable of producing antibodies that specifically recognize Hin47. It is also possible to clone the gene.
Since this nucleic acid molecule has a base sequence encoding the Hin47 analog of the present invention, it can be used to selectively form a complex molecule having a length complementary to another hin47 gene.
When it is desired to have a wide range of probe selectivity in order to search for another hin gene, it is possible to variously change the setting of hybridization conditions. When it is desired to increase the selectivity, a relatively severe condition is adopted when forming the composite material. For example, the amount of sodium chloride is lowered and the temperature is increased. The amount of Nacl is changed from 0.02M to 0.15M, and the temperature is set to a high temperature condition such as 50 to 70 ° C. In some cases, the hybridization conditions may be more moderate, for example, the amount of sodium chloride should be 0.15 to 0.9 M and the temperature 20 to 55 ° C. When destabilizing the hybrid composite material, it is possible to increase the amount of formaldehyde added to make the hybridization conditions more severe. Thus, there is an advantage that the hybrid formation conditions can be freely adjusted and the conditions can be widely selected according to the desired result.
In the examples for clinical diagnosis, it is shown that the nucleic acid molecule encoding the hin47 gene of the present invention can be used in combination with an appropriate method such as a labeling method at the time of hybridization. For example, various level indicating methods such as radiation, enzymes, ligands such as avidin and biotin are known, and any of them can generate a detection signal. Another diagnostic embodiment of the present invention shows that enzyme labels such as urease, alkali phosphates and peroxidase can be used instead of radiolabels. In the case of enzyme labeling, we provide a method that can be seen by the human eye or seen with a spectrophotometer when confirming the special hybridization of a sample containing the nucleotide sequence of the hin47 gene. As such, colorimetric indicators are known.
The nucleic acid molecule comprising the hin47 gene of the present invention is useful as a probe in solution hybridization or in an embodiment using an individual phase. Examples using the solid phase include test DNA (or RNA) taken from exudates, body fluids (eg, serum, amniotic fluid, middle ear exudates, saliva, bronchoalveolar lavage fluid) or clinical samples such as tissue, It has been shown to be absorbed and adhered to selected matrices and surfaces. Thereafter, the immobilized single-stranded nucleic acid will undergo special hybridization under the desired conditions with a selection probe consisting of the nucleic acid sequence of the hin47 gene of the present invention. This selection condition depends on the specific environment based on the specific criteria required depending on the content of G + C, the target nucleic acid type, the origin of the nucleic acid, the hybridization probe, etc. Special hybridization that occurs following washing of the hybridization surface to remove non-specifically bound probe molecules can be detected using a label or even quantified. It is.
4). Expression of a gene encoding an analog of Hin47 with reduced protease activity
A vector containing a replicon sequence and a control sequence, produced from a strain compatible with the host, can be used for expression of the Hin47 analog gene (the present invention uses an expression system). Originally, a vector carries a labeling sequence portion and a replication portion that allow phenotypic selection in transformed cells. For example, Escherichia coli can transform cells using plasmid pBR322 containing a gene resistant to ampicillin and tetracycline, and pBR322 is also a simple means of identifying transformed cells. Plasmid pBR322, other bacterial plasmids, phages contain or have been modified to contain a promoter, and this promoter is also used when the host produces its own protein.
In addition, phage vectors that are compatible with the host and contain replicon and control sequences can be used as transformation vectors in the context of the host. For example, lambda GEM-11 phage can be used in preparing a recombinant phage vector, and this recombinant phage vector (eg, E. coli LE392) can also be used for host transformation.
Commonly used promoters in recombinant DNA technology include beta-lactamase (penicillinase), lactose promoter system (Chang et al, 1979; Goedel et al, 1980), T7 promoter system (US Pat. No. 4,952). 496). The base sequences of these nucleic acids have been elucidated in detail, and those skilled in the art can functionally bind them to a plasmid vector.
Which promoter is selected depends on what result is desired. Suitable hosts for the expression of Hin47 analogs include E. coli Bacillus strains, Haemophilus Bordetella strains, yeast, mammalian cells, and the like, and baculovirus expression systems can also be used.
In the present invention, recombinant methods are desirable for the production of Hin47 analogs. Particularly preferred hosts for expression of this protein include gram positive bacteria that do not have LPS, ie, no endotoxin. An example is the Bacillus strain, which is particularly useful for making nonpyrogenic Hin47 analogs.
Biological deposit
Prior to this partial continuation application, DS-1011-1-1-1 (pT7 / Hin47 *), a plasmid containing a protein encoding a Hin47 analog, was approved by the Budapest Treaty as approval number 75845 on July 27, 1994. In the United States, Maryland, and Rockville. The plasmid samples deposited there will be made public as soon as a patent is granted based on the US patent application. The present invention and claims are not limited to this deposited plasmid, it is only one example of the invention. Any equivalent or similar plasmid into which the gene encoding the analog or equivalent antigen described in this application is inserted is within the scope of the present invention.
Example
The above generally described disclosure is illustrative of the present invention. A more complete understanding can be obtained by reference to the following examples. The examples shown here are merely examples, and the present invention is not limited thereto. If it is judged appropriate in the surrounding situation, the form may be changed or replaced with an equivalent. Although special terms may be used, they are used to describe the present invention and are not meant to be limiting.
Methods in the fields of molecular genetics, protein biochemistry, and immunology that are used in this disclosure but are not explicitly described are also well-explained and obvious in the relevant literature. It is within the skill of a skilled person in the related field.
Example 1
This example shows a clone of the hin47 gene prepared from H. influenzae strain SB33 that cannot be typed.
Chromosomal DNA is prepared from H. influenzae strain SB33 to create an EMBL3 library and screened with a labeled oligonucleotide probe that reacts specifically with the 5 'end of the hin47 gene. H. influenzae strain SB33, which cannot be typed, was grown on Mueller-Hinton agar or in fluid culture medium according to the method of Harkness et al, 1992). Chromosomal DNA was prepared by the following method. That is, cells were pelleted from a 50 ml culture and centrifuged at a temperature of 4 ° C. for 15 to 20 minutes at a rotational speed of 5000 rpm using a Sorvall RC-3B centrifuge. After resuspending the separated cells in 10 ml of TE solution, 500 μg ml was added with pronase.^-1In addition, 1% SDS was added. Samples were incubated at 37 ° C. until a clear lysate was obtained. The lysate was gently extracted once with tris-saturated phenol (pH 7.4), once more with tris-saturated phenol / chloroform (1: 1), and again with chloroform. The final liquid phase was separated and dialyzed using 1M sodium chloride for 24 hours at 4 ° C. and then separated and dialyzed with TE for 24 hours.
Prepared by partial digestion of SB33 chromosomal DNA using Sau3A from the EMBL3 library, followed by 10 in TNE (20 mM Tris / HCl, 5 mM sodium chloride, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0)). The fractions containing DNA fragments with a length of 5 KD or more were pooled and precipitated, and EMBL3 (Promega) BamH. This ligation mixture was packaged using the packaging kit Gigapack II and placed on E. coli LE392 cells, which were amplified and stored at 4 ° C. in the presence of chloroform. The plaque was filtered through nitrocellulose,³²Hybridization was performed with a p-labeled oligonucleotide probe (3026.SL). The base sequence of the oligonucleotide is ATGAAAAAAACACGTTTTGTTATAAAATAGTATTGCACTTG (SEQ ID NO: 3), which corresponds to the N-terminal amino acid sequence MKKTRVVLNSIALG (SEQ ID NO: 19). Phage DNA was prepared from plaques, and the inserted DNA was digested with Sal I by enzymatic digestion to produce a PUCB-BgXb clone digested with Sal I. Plasmids JB-1031-1-14 and JB-1068-2-2 (FIG. 1) were selected for further analysis.
Example 2
This example shows the characterization and base sequence analysis of Hin47 protein produced from hin47 gene and NTHi strain SB33.
Analysis of the clones JB-1031-1-14 and JB-1068-2-2 with restriction enzyme maps and Southern blotting showed that on the 4.7 kb BamH I / BamH I or 2.7 kb BamH I / Pst I DNA fragment There will be a hin47 gene. The 4.7 kb BamH I / BamH I fragment obtained from clone JB-10682-2 is cloned into pUCB / BgXb producing plasmid DS-755-1. The 3.1 kb BamH I to Xba I fragment of DS-755-1 was cloned into pUC18, which produces plasmid JB-1165-1-1, which has a restriction site and the Erase-a-base (Promega) procedure. (Figure 1). According to this technique, clones can be continuously produced by increasing the number of cuts of the inserted DNA. As a result, the base sequence of the produced clone is rapidly determined using a primer.
DNA from plasmid JB-1165-1 is digested with BamHI and SacI and then exoII with the Erase-a-base kit. The cleaved plasmid is analyzed by agarose gel electrophoresis and a representative plasmid is selected for sequence analysis.
Plasmid DNA for sequencing was prepared by a modification by the Holmes / Quigley method (Holmes and Quigley, 1981). To briefly describe the modification, cells taken from a 50 ml culture are resuspended in 10 ml STET (8% sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris / HCl, pH 8.0). Lysozyme is added and the mixture is boiled for 2 minutes. The sample is centrifuged in a centrifuge Sorvall RC5B for 20 minutes at 14,000 rpm, after which the supernatant is precipitated with the same amount of isopropanol, washed with 70% ethanol and washed with pure ethanol. Air dried. Resuspend the cell pellet in 0.9 ml TE, 5 mg ml^-120 μl of RNAse A was added. Thereafter, this mixed substance was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After adding 500 μl of 1.5 M NaCL / 30% PEC, the mixed substance was incubated on ice for 30 minutes, centrifuged for 10 minutes in an Eppendorf centrifuge, and the DNA was removed as a pellet. The cell pellet was suspended in 400 μl of TE and extracted three times with tris-saturated phenol (pH 7.4), twice with tris-saturated phenol / chloroform (1: 1), and twice with chloroform. DNA was precipitated by adding 40 μl of 3M acetone acetate and 1 ml of ethanol, then washed with 70% ethanol and resuspended in distilled water.
The base sequence of the DNA sample was determined by the ABI model 370A DNA sequencer and dye terminator chemistry. A universal reverse primer was used with a set of clones to determine the base sequence of the hin47 gene coding strand. An oligonucleotide primer of about 25 bases was used for the purpose of confirming the base sequence of the non-coding strand. The nucleotide base sequence of the SB33 / hin47 gene and the amino acid sequence of the Hin47 protein are shown in FIG. The nucleotide base sequence and N-terminal amino acid sequence of this Hin47 protein was announced at the American Microbiological Society held in New Orleans from May 26 to 30, 1992, and this is shown in the lower part of FIG. The amino acid terminal sequence of the SB33 / Hin47 protein and the sequence of the protein according to the present invention are the same, and this clone gene shows the identity as hin47.
Example 3
This example shows the discovery of the serine protease activity of Hin47 protein.
The amino acid sequence of the Hin47 protein determined in the above example was compared with all proteins registered in the gene bank. As described above, the Hin47 protein is described in PCT applications WO94 / 00149, WO92 / 11367, and WO92 / 10936, and is indicated to be an adhesin molecule of Haemophilus. The surprising and unexpected discovery of the present invention is that the Hin47 protein contains an important amino acid with homology (55%) to serine proteases E. coli htrA, S. typhimurium htrA, and other proteases. It is to have. Such amino acid sequence homology is shown in FIGS.
Furthermore, it has also been found that Hin47 protein undergoes autolysis in the absence of serine protease inhibitors such as Pefablock.
Example 4
This example shows the production process of mutant hin47 gene by site-directed mutagenesis. As described above, H. influenzae Hin47, E. coli htrA, and S. Typhimurium are all serine proteases. The consensus sequence of the active center of serine protease is GDSGGPK (SEQ ID NO: 18), and serine is the active residue. Both htrA proteins have the sequence GNSGGAL (SEQ ID NO: 17), and H. influenzae Hin47 has the same sequence between residues 195 and 201 of the mature protein. Thus, when a protease activity-reduced Hin47 analog is produced, this serine residue 197 will be selected as the site for site-directed mutagenesis.
Oligonucleotide CGCTCCACCAGCATTACCGCGGG (SEQ ID NO: 20) is produced, which is the serine residue at position 197 converted to alanine. The hin47 gene was cloned into M13mp18, which produced clone DS-981-3, and was mutagenized using an American in vitro site-directed mutagenesis kit. Clone DS-991-8 was confirmed by nucleotide sequence analysis, and a mutation from serine-197 to alanine had occurred. We decided to call this mutant hin47 gene “hin47 *”. Using the appropriate oligonucleotide, the serine residue at position 197 was converted to cysteine (mutant S197C) and threonine (mutant S197T).
Furthermore, as shown in FIG. 4, when the amino acid sequence of Hin47 was compared with other proteases, mutagenesis of amino acids His-91 and Asp-121 was appropriate for producing a protease activity-reduced Hin47 analog. It turned out to be. These amino acids His-91 and Asp-121 were removed or replaced with another amino acid by mutagenesis as described above. Such amino acid substitutions include amino acid His-91 with alanine (mutant H91A) and arginine (mutant D121A), and amino acid Asp-121 with alanine (mutant H91A) and glutamic acid (mutant). D121E). Such mutagenic oligonucleotides are:

The corresponding oligonucleotide was used to induce another mutation. Numerous mutants were induced, His-91 and Serine-197 were replaced with alanine (mutant H91A / S197A), and His-91, Alp-121, Ser-197 were all replaced with alanine (mutation) Body H91A / D121A / S197A). These additional produced mutants were extracted, purified, and tested to confirm the reduction in protease activity, as described in the previous examples for Hin47 * raw materials.
Many serine proteases are secreted in an inactive state (like zymogen) and an incision was required to see the active center. As a result of analyzing the N-terminal nucleotide sequence of the mature natural Hin47 protein, it was found that cell division of the preprotein occurred at the position of KFFFG DRFAWQ (SEQ ID NO: 23). By modifying an amino acid that prevents cell division of a molecule that produces an active protease molecule, a protease activity-reduced Hin47 analog can be expressed.
Example 5
This example shows the structure of the E. coli plasmid used to express a Hin47 analog in which Ser-197 is replaced with alanine.
The plasmid DS-1011-1-1-1 was produced by cloning the pT-7 expression vector of the mutant hin47 * gene derived from the plasmid DS-991-8 (FIG. 5). E. coli strain BL21 / DE3 was transformed to produce E. coli strain DS-1018-3-1, which expressed a Hin47 analog in which Ser-197 was replaced with alanine.
In order to use tetracycline selection, the hin47 * gene was cloned into pBR328. For the production of the BglII / BamHI fragment, pEVvrf1 (Young and Davis, 1985) is produced by cloning the BglII / Cla IT7 / hin47 gene fragment from plasmid DS-101-11-1. Further, it can be cloned into pUC-4K (Pharamacia) digested with BamHI. The produced clone DS-1034-3 is digested with the enzyme EcoR I, and the T7 / hin47 * gene fragment is cloned into pBR328 to produce plasmids DS-1048 and DS-1067-2. When plasmid DNA is introduced into E. coli strain BL21 / DE3, DS-1071-1-1 and DS-1071-3-1 are produced, which express a Hin47 analog in which Ser-197 is replaced with alanine.
Example 6
In this example, the expression state of a Hin47 analog in which Ser-197 is replaced with alanine is shown.
DS-1018-3-1, DS-1071-1-1, DS-1071-1-3-1 are NZCYM + 3% dextrose + antibiotics (25 μg · ml^-1Ampicillin or 10 μg · ml^-1) And cultured for one day and night with shaking at 37 ° C. This whole day and night culture solution was diluted 1:40, subjected to sonication, put into the same culture medium, and cultured while shaking until the absorbance was about 0.3. To induce expression from the T7 promoter, 1 / 10th volume of 10% lactose was added. Using a Sorvall RC-3B centrifuge, the culture solution was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C., and then a cell sample was taken out after 4 hours.
Example 7
This example shows the extraction and purification of Hin47 protein. Hin47 is expressed as a soluble protein in E. coli. The cell pellet removed from the 250 ml culture prepared in Example 6 was resuspended in 40 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and disrupted by sonication. This extract was centrifuged at 20,000 × g. More than 95% of the supernatant taken out here was soluble Hin47 protein, which was stored. The fraction generated here was called “Hin47 / extract”.
Further, the Hin47 extract was purified using a DEAE model Sephacel column. 40 ml of Hin47 extract was injected into a 20 ml DEAE model Sephacel column (50 mM Tris-HCl, pH 8.0). Hin47 adhered to the column under these conditions. Further, this column was washed successively with 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 20 mM sodium chloride. Hin47 was diluted with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 40 mM sodium chloride. Hin47 in the fraction was quantified by BCA protein assay. The achieved purity of Hin47 was measured by SDS-PAG analysis. The fractions containing Hin47 were combined and stored at -20 ° C.
The only protein with the same degree of solubility as the wild-type Hin47 protein, which accounts for most of the mutants produced as granule fractions, was the mutant H91A.
Example 8
This example illustrates the extraction and purification process of Hin47 with Ser-197 replaced with alanine.
Hin47 in which Ser-197 was replaced with alanine was expressed in the granule fraction of E. coli. The cell pellet removed from the 250 ml culture (prepared in Example 6) was resuspended in 40 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and disrupted by sonication (3 × 10 minutes, 70% efficiency cycle). The extract was centrifuged at 20,000 × g and the removed cell pellet was stored. The cell pellet was re-extracted with 40 ml of 50 mM Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 10 mM EDTA (pH 8.0). The suspension was sonicated (10 minutes, 70% efficiency cycle). The extract was centrifuged at 300 xg for 5 minutes. The supernatant liquid taken out here was centrifuged at 20,000 × g for 30 minutes, and the generated cell pellet was stored. The cell pellet was re-extracted with 50 mM Tris-HCl, 0.5% Triton · X-100, 10 mM · EDTA (pH 8.0). The suspension was mixed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 8 M urea. Using 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), the concentration of urea in the mixture was adjusted to 2M. Hin47 in which Ser-197 was replaced with alanine was completely dissolved under these conditions. The final volume of this solution was 20 ml. This fraction was called “Hin47 analog-extract”. The Hin47 analog-extract was purified on a DEAE model Sephacel column. 20 ml of Hin47 analog-extract was injected into a 10 ml DEAE model Sephacel column (50 mM Tris-HCl, pH 8.0). A Hin47 analog in which Ser-197 was replaced with alanine attached to the column under these conditions. Further, this column was washed with 50 mM Tris hydrochloric acid (pH 8.0), and the Hin47 analog was diluted with 50 mM Tris hydrochloric acid (pH 8.0) containing 30 mM sodium chloride. The amount of Hin47 analog in this fraction was measured by BCA protein assay. The purity of the Hin47 analog was determined by SDS-PAG analysis (FIG. 6). Fractions containing Hin47 were combined and stored at -20 ° C.
Example 9
This example shows the protease activity of a Hin47 analog synthesized by substituting Hin47 and Ser-197 with alanine.
The enzymatic activity of Hin47 analogs in which Hin47 and Ser-197 were replaced with alanine was analyzed using beta casein as a substrate (FIG. 7). The reaction mixture contains 5 μg beta casein and either Hin47 or Hin47 analog. The reaction was allowed to proceed for 2 hours at 37 ° C., after which SDS-sample buffer was added and stopped immediately by heating at 100 ° C. for 5 minutes. Aliquots (partial samples) were analyzed by SDS-PAGE. As shown in FIG. 7, the digestion of beta casein by Hin47 is evident after 2 hours (panel A, row 1), the extent of the digestion being stronger than the fraction containing the Hin47 analog ( Panel A, row 2) and exogenous proteins are not involved (panel A, row 3). The presence of Hin47 or Hin47 analogs in these mixtures was confirmed by immunoblotting using a monoclonal antibody against Hin47 (Figure 7, Panel C, rows 1, 2).
Through analysis of Hin47 or Hin47 analog autolysis under conditions of 4 ° C. and −20 ° C., the activity of Hin47 analogs in which Hin47 and Ser-197 were replaced with alanine was compared. To that end, purified Hin47 or an analog thereof was stored for 20 days at either 4 ° C or -20 ° C. After storage, aliquots were removed on

day

0, 10 and 20 and the thermal stability of Hin47 or Hin47 analogs was analyzed by immunoblotting using a Hin47 monoclonal antibody (FIG. 8). The Hin47 analog was more thermally stable than Hin47 when stored at either 4 ° C. or −20 ° C. for 20 days.
To further examine the protease activity of the Hin47 analog with Ser-197 replaced with alanine, the ability of Hin47 or Hin47 analog to disrupt the 80-kDa H. influenzae recombinant antigen was measured. A mixed antigen test was performed to determine the enzymatic degradation effect of Hin47 or Hin47 analogs on other antigens. In this study, 80-kDa H. influenzae recombinant antigen (TBP1) was selected to distinguish it from Hin47 or Hin47 analog (47 kDa). Five kinds of mixed substances were prepared as follows. 80-kDa protein only, 80-kDa protein + Hin47, 80-kDa protein + Hin47 analog, Hin47 only, Hin47 analog only. The amount of each protein in the mixed substance was 5 μg. The mixed material was stored at 4 ° C. for 4 weeks. After storage, aliquots were taken out on the 0th, 7th, 14th, and 28th days and subjected to SDS-PAGE analysis (FIG. 9). One week later, both the 80-kDa protein and Hin47 were greatly disrupted (lines 2, 4). In contrast, the combination of the 80-kDa protein and the Hin47 analog remained intact after 1 week and showed only a slight decay after 4 weeks (line 3).
The protease activity of other Hin47 analogs was evaluated by the method proposed by Lipinska et al using the enzymatic digestion reaction of beta casein, and the results are shown in Table 3. Only one mutant (D121E) was observed to retain serine protease activity.
Example 10
This example shows a comparison of the immunogenicity of Hin47 and Hin47 analogs in mice.
FIG. 10 shows the results of a comparative test on the immunogenicity of Hin47 analogs in which Hin47 and Ser-197 are substituted with alanine. Prepare 5 groups of 5 Balb / c mice per group, and add 1 μg of either Hin47 or Hin47 analogs to ALPO_FourIn the presence of (1.5 mg per dose), subcutaneous injection was performed 3 times a day on the 1st, 29th and 43rd days. After injection, blood was collected on days 14, 28, 42, and 56 (represented as

blood samples

1, 2, 3, and 4, respectively) and anti- The titer of Hin47 antibody was analyzed. Anti-Hin47 • antibody in mouse serum was measured by the method of Panezutti et al, 1993. One microgram of either Hin47 or Hin47 analogs were coated in microtiter wells and left at room temperature for 16 hours. Plates were blocked with 0.1% bovine serum albumin in PBS. Mouse serum was serially diluted and added to the wells, followed by incubation at room temperature for 1 hour. F (ab ') obtained by affinity purifying goat anti-mouse IgG (Fc specific) antibody conjugated with peroxidase₂The fragment was used as the second antibody. Tetramethylbenzidene (TMB ・ H₂O₂), And the absorbance at a wavelength of 450 nm (reference wavelength is 540 nm) was measured with a Flow-Mutiskan MCC microplate reader. Antiserum response titers were defined as the dilution correlation, which showed twice the absorbance of uninjected serum samples. As can be seen from FIG. 10, in mice, both Hin47 and Hin47 analogs showed considerable IgG titers regardless of whether Hin47 or mutants could be used as antigens in the EIA method.
Immunogenicity studies using H91AHin47 analogs were also performed. This analog was found to show an immune response equivalent to the S197AHin47 analog.
To further test the immune response to Hin47 analogs with Hin47 or Ser-197 substituted with alanine, the anti-Hin47 • IgG subclass in mouse serum was measured. A microtiter well was coated with 1 μg of either purified Hin47 or an analog. Mouse serum final samples prepared for comparative immunogenicity studies were pooled and tested by the EIA method. In this EIA test, rat, anti-mouse, IgG and IgG conjugated with peroxidase were used as antigens._2a, IgG_2bAnd rabbit anti-mouse IgG3 conjugated with peroxidase. To avoid cross-reaction, dilutions of each conjugate were measured using the purified antibody subclass. The reaction titer was measured by the method described above. As shown in Table 1, in mice, the IgG subclass induced by either Hin47 or Hin47 analogs is identical, which indicates whether Hin47 or Hin47 analogs can be used for EIA as an individual antigen. Is not relevant. Of both groups of mouse sera, the IgG1 isotype showed a significant IgG response. Thus, the Hin47 analog showed substantially the same immunogenicity as the natural protein.
Example 11
This example demonstrates the immunoprotective ability of Hin47 or a Hin47 analog in which Ser-197 is replaced with alanine.
Analysis of the immunoprotective ability of Hin47 analogs with Hin47 or Ser-197 substituted with alanine from the protective ability of Hin47-specific antiserum against MinnA derived from H. influenzae b strain in a model of bacteremia in young rats did. Table 2 shows the results. Either 0.1 ml of rabbit, anti-Hin47 analog, antiserum or equivalent pre-bleed serum was inoculated subcutaneously on the back near the neck of a 6-day-old Wistar young rat group. In addition, these groups received intraperitoneal injection of 700 cfu of freshly grown Hib strain MinnA 24 hours later. After 20 hours, blood was collected from the intraperitoneally administered rat, transferred to a chocolate agar plate and cultured. After 24 hours, bacterial colonies were counted. As shown in Table 2, no bacteremia was observed in 3 of 9 animals in the group inoculated with the anti-Hin47 analog / antiserum. In the group inoculated with the Hin47 analog / antiserum (11%), only one animal recovered a higher amount of bacteria from the blood than the mice inoculated with the pre-blood serum. In contrast, fungi were recovered in all nine mice inoculated with pre-bleed serum. In 4 out of 9 animals (44%) inoculated with pre-bleed serum, the level of bacteria in the blood (500-1000) was high.
To evaluate the protective ability of anti-Hin47 • serum or anti-Hin47 • mutant / antiserum against bacteremia caused by infection with H. influenzae type b strain used. In 6 out of 10 young rats, these sera showed protection against wild-type Hin47, H91A / Hin47, and S197A / Hin47 analogs.
Example 12
This example shows the induction of Hin47 synthesis under stressed conditions.
H.influenzae strain Eagan with hemin (2μg · ml^-1) And NAD (2 μg · ml^-1At 37 ° C. in a BHI liquid culture medium containing₅₉₀The cells were grown under the condition of = 0.3. The sample aliquot was removed and grown at 37 ° C., 42 ° C., 43.5 ° C., or in the presence of 6% ethanol, 0.2M sodium chloride, or 0.3 sodium chloride. E. coli strain JM109 is₅₉₀The aliquot was grown in the same manner as described above. Samples were collected after 0, 20, 40, 60, and 90 minutes and analyzed by OD and SDS-PGE / Western blotting. Guinea pig antisera recognizing H. influenzae Hin47 and E. coli htrA were used for Western blot analysis. When grown at 43.5 ° C., a large amount of E. coli / htrA / protein was synthesized, and only a small amount of H. influenzae / Hin47 / protein was observed. Growth in medium containing 6% ethanol induced the synthesis of both E. coli htrA protein and H. influenzae Hin47 protein. High salt content weakened the synthesis of either of these proteins. These results indicate that Hin47 is a stress response protein and that E. coli / htrA / protein synthesis is induced under similar conditions.
Example 13
This example shows the purification of H91A / Hin47 protein.
This soluble H91A / Hin47 protein was purified by the same method as in the case of the wild-type Hin47 protein in Example 7 with the addition of a hydroxyapatite (HAP) column. A 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) was placed in the HAP column, and a DEAE column was set. H91A / Hin47 protein was attached to the HAP column. The contaminating protein was removed by washing the column with 175 mM sodium phosphate buffer. H91A / Hin47 protein eluted with 300 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) was stored at -20 ° C.
Example 14
This example shows the protective ability of Hin47 and Hin47 mutants in a chinchilla cat otitis media model.
A chinchilla cat otitis media model was used to assess the protective ability caused by active immunization with wild-type Hin47, H91A / Hin47, and S197A / Hin47.
Hin47 (H91A) or Hin47 mutant (S197A) conjugated with AIPO4 is inoculated into the muscle of a chinchilla cat three times a day at 30 μg, the first day, the 28th day and the 42nd day at a single dose. did. On the 56th day, this chinchilla cat was inoculated with 50-1000 CFU (colony forming units) of the bacterial virulent NTHi strain SB12. After monitoring by tympanic incision and otoscopy, middle ear exudate was taken out 4 days after inoculation and cultured on chocolate agar medium. Bacterial colonies were counted after 24 hours. Wild-type Hin47 and H91A.Hin47 proteins provide protection in 50% of the experimental animals, but S197A.Hin47 has no protection.
Summary of disclosure
The present invention provides a novel Hin47 protein analogue derived from H. influenzae having reduced protease activity to about 10% of the native Hin47 protein, and isolated / purified DNA that codes this Hin47 protein. Protein modifications within the scope of the present invention are possible.

Sequence listing
(2) Information of SEQ ID NO: 1
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 2894 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Ii) Molecular type
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 1

(2) Information of SEQ ID NO: 2
(I) Characteristics of the array
(A) Sequence length: 463 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 2

(2) Information of SEQ ID NO: 3
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 41 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 3

(2) Information of SEQ ID NO: 4
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 37 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 4

(2) Information of SEQ ID NO: 5
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 472 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 5

(2) Information of SEQ ID NO: 6
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 475 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Name of sequence: SEQ ID NO: 6

(2) Information of SEQ ID NO: 7
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 228 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 7

(2) Information of SEQ ID NO: 8
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 232 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Name of sequence: SEQ ID NO: 8

(2) Information of SEQ ID NO: 9
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 223 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 9

(2) Information of SEQ ID NO: 10
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 228 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 10

(2) Information of SEQ ID NO: 11
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 240 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Name of sequence: SEQ ID NO: 11

(2) Information of SEQ ID NO: 12
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 224 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 12

(2) Information of SEQ ID NO: 13
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 223 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight

(2) Information of SEQ ID NO: 14
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 185 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Name of sequence: SEQ ID NO: 14

(2) Information of SEQ ID NO: 15
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 181 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 15

(2) Information of SEQ ID NO: 16
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 198 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 16

(2) Information of SEQ ID NO: 17
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 7 amino acids
(B) Type: amino acid
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(D) Form: Straight
(Xi) Name of sequence: SEQ ID NO: 17

(2) Information of SEQ ID NO: 18
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 7 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Name of sequence: SEQ ID NO: 18

(2) Information of SEQ ID NO: 19
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 14 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 19

(2) Information of SEQ ID NO: 20
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 22 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 20

(2) Information of SEQ ID NO: 21
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 21 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 21

(2) Information of SEQ ID NO: 22
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 21 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 22

(2) Information of SEQ ID NO: 23
(I) Characteristics of the array
(A) Length: 11 amino acids
(B) Type: amino acid
(C) Chain state: single chain
(D) Form: Straight
(Xi) Sequence name: SEQ ID NO: 23

Claims

An analog protein to the native Hin47 protein from an atypical strain of Haemophilus influenzae,
(1) The natural Hin47 protein is a mature protein having a molecular weight of about 47 kDa, in which the signal peptide portion is removed from the translated preprotein in each Haemophilus influenzae atypical strain, and the molecular weight is about 47 kDa. The amino acid sequence of the 47 kDa mature protein comprises a partial amino acid sequence at positions 27 to 463 in the full-length amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 derived from Haemophilus influenzae atypical strain SB33. ,
(2) The analog protein is
(A) in the numbering in which the amino acid corresponding to the 27th position at the N-terminus of the partial amino acid sequence at positions 27 to 463 in the full-length amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is the first position,
Three amino acids involved in the serine protease type protease activity retained by the natural Hin47 protein; at the Ser-197, His-91 or Asp-121 site,
Replacing Ser-197 with Ala, Cys, or Thr;
Replacing His-91 with Ala or Arg;
Replacing Asp-121 with Ala;
Having a mutation due to substitution of one or more amino acids selected from the group of amino acid substitutions consisting of;
Or
(B) In addition to the mutation at the Ser-197, His-91 or Asp-121 site,
In the numbering in which the amino acid corresponding to position 27 at the N-terminus of the partial amino acid sequence at positions 27 to 463 in the full-length amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is the first position
In the following 7 sites of Glu at position 95, Leu at position 119, Gly at position 245, Ala at position 299, Ser at position 346, Glu at position 415, or Asp at position 429,
Replacing Glu at position 95 with Gly;
Replacing Leu at position 119 with Gln;
Replacing Gly at position 245 with Cys;
Replacing Ala at position 299 with Gly;
Replace Ser at position 346 with Gly;
Replace Glu at position 415 with Lys;
Replace Asp at position 429 with Asn;
Having a mutation due to substitution of no more than 7 amino acids selected from the group of amino acid substitutions consisting of;
And,
The protease activity of the analog protein is at least about the protease activity of the native Hin47 protein having a partial amino acid sequence at positions 27 to 463 in the full-length amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Down to 10%, and
The analog protein has the immunogenicity retained by the original native Hin47 protein
Hin47 protein analog, wherein.

In the full-length amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of the mature Hin47 protein corresponding to the partial amino acid sequence at positions 27 to 463 is represented by the amino acid sequence of the mature Hin47 protein at position 27 at the N- terminus. In the numbering
The analogue according to claim 1 , wherein the at least one amino acid to be substituted is selected from Ser-197, His-91 or Asp-121 in the amino acid sequence of the native Hin47 protein.

3. The analog of claim 2 , wherein the at least one amino acid substituted is Ser-197 , wherein Ser-197 is substituted with Ala, Cys, or Thr .

4. The analog of claim 3 , wherein Ser-197 is substituted with Ala .

At least one amino acid is said substitutions are His-91, it said His-91 is analog of claim 2 which is substituted with Ala or Arg.

The analog of claim 2 , wherein the at least one amino acid to be substituted is Asp-121, wherein Asp-121 is substituted with Ala .

The analog according to any one of claims 1 to 6 , wherein a plurality of amino acids are substituted in the three amino acids involved in the protease activity ; Ser-197, His-91 or Asp-121 .

The plurality of amino acids to be substituted are His-91 and Ser-197, or His-91, Asp-121 and Ser-197;
8. Analogue according to claim 7 , which is individually substituted by Ala .

A chimeric molecule wherein the analogue according to any one of claims 1 to 8 is linked to a polypeptide, protein or polysaccharide.

Separation / purification comprising a mutant for a wild-type hin47 gene derived from an atypical strain of Haemophilus influenzae, comprising the base sequence encoding the Hin47 protein analog according to any one of claims 1 to 8. Nucleic acid molecules.

The wild-type hin47 gene, encoding the amino acids involved in protease activity, replacing at least one codon, by performing site-directed mutagenesis, according to claim 10 which is to the mutant hin47 gene Nucleic acid molecules.

The nucleic acid molecule according to claim 10 or 11 , wherein the mutant hin47 gene is prepared by site-directed mutagenesis of the wild-type hin47 gene derived from an atypical strain of Haemophilus influenzae.

A recombinant plasmid used for transformation of a host, comprising a plasmid vector into which the nucleic acid molecule according to any one of claims 10 to 12 is inserted.

In the numbering in which the amino acid corresponding to position 27 at the N-terminus of the partial amino acid sequence at positions 27 to 463 in the full-length amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is the first position,
A plasmid vector into which a nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding a mutant amino acid sequence obtained by substituting Ser-197 for Ala in the partial amino acid sequence is inserted;
The recombinant plasmid vector is the plasmid DS-1011-1-1 (pT7 / Hin47 *) deposited under the Budapest Treaty with an approval number of 75845 with the US Microorganism Depositary (ATCC).

A transformed cell comprising the recombinant plasmid according to claim 13 or 14 .

A method for producing the isolated and purified Hin47 protein analog according to any one of claims 1 to 8 , wherein the protease activity of the Hin47 protein analog is at least the complete sequence described in SEQ ID NO: 2. A method comprising the following steps, wherein the protease activity of the natural Hin47 protein having a partial amino acid sequence of positions 27 to 463 in the long amino acid sequence is reduced to about 10%:
Identifying at least one amino acid residue involved in the protease activity from the amino acid sequence of the native Hin47 protein;
In order to produce a mutant hin47 gene obtained by substituting a codon encoding the specified at least one amino acid, the site-specificity that causes substitution of the codon in the hin47 gene encoding the amino acid sequence of the natural Hin47 protein Performing dynamic mutagenesis,
Introducing the mutant hin47 gene into the cell to produce a transformed cell, and culturing the transformed cell to produce the Hin47 protein analog.

By introducing the mutant hin47 gene, a transformed cell in which the mutant hin47 gene is controlled by a T7 promoter is prepared. The method according to claim 16 , which is carried out by culturing in an inducing concentration of lactose.

Plasmid DS-1011-1-1 (pT7 / Hin47 *) that has been deposited under the Budapest Treaty with the approval number 75845 of the mutant hin47 gene introduced into the US Microorganism Depository Organization (ATCC) according to claim 14 . The method according to claim 17, which is performed by transformation of a cell according to ().

In addition to the culturing step of preparing a grown transformed cell that retains the granule fraction containing the Hin47 protein analog,
Disrupting the cultured transformed cells to produce the granule fraction and supernatant,
Solubilizing the granule fraction to obtain a solution containing the Hin47 protein analog;
19. The method of any one of claims 16 to 18 , comprising removing cellular debris, purifying the Hin47 protein analog from the solution using chromatography, and separating the purified Hin47 protein analog. The method described.

An immunogenic composition comprising an amount of an immunological effect of the Hin47 protein analog according to any one of claims 1 to 8 , or the nucleic acid molecule according to any one of claims 10 to 12 .

To protect against diseases caused by bacterial pathogens that produce natural Hin47 proteins from atypical strains of Haemophilus influenzae or proteins that induce the production of antibodies that specifically react with the natural Hin47 proteins in the host, Prepared as a vaccine for in vivo administration to a host,
21. The immunogenic composition of claim 20 , comprising a Hin47 protein analog modified to replace His-91 or Ser-197 with Ala as an immunogen.

The immunogenic composition according to claim 21 , wherein the bacterial pathogen is a Haemophilus species.

23. The immunogenic composition of claim 22 , wherein the Haemophilus species is Haemophilus influenzae.

24. The immunogenic composition according to any one of claims 20 to 23 , further comprising at least one other immunogenic or immunostimulatory substance.

The Hin47 protein according to any one of claims 1 to 8 , in order to form a complex comprising (a) the Hin47 protein analog and any antibody present in a specimen that reacts specifically with the Hin47 protein analog. Contacting the analyte with an analog, and (b) identifying the formation of the complex;
A method for assaying the presence of an antibody that specifically reacts with a Hin47 protein in a specimen, comprising the above procedure.

(A) immunizing a non-human subject with the immunogenic composition of any one of claims 20 to 24 to produce an antibody that specifically reacts with the Hin47 protein,
(B) contacting the specimen with the antibody to form a complex comprising an antibody specific for the Hin47 protein and any Hin47 protein present in the specimen; and (c) Identifying the formation,
A method for assaying the presence of Hin47 protein in a specimen comprising the above procedure.

(A) the Hin47 protein analog according to any one of claims 1 to 8 ,
(B) means for bringing the analog into contact with the specimen in order to form a complex consisting of the antibody present in the specimen and the analog, and (c) for identifying the formation of the complex means,
A diagnostic kit for assaying for the presence of an antibody in a sample that specifically reacts with Hin47 protein, comprising the above means.