JP4191482B2 - コエンザイムｑ１０の製造法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、医薬品等として用いられているコエンザイムＱ_１０の製造に関する。より詳細には、コエンザイムＱ_１０の生合成に関するキー酵素であるコエンザイムＱ_１０側鎖合成酵素、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する真菌より単離し、これを宿主微生物に導入することによりコエンザイムＱ_１０を生成させる方法に関する。
背景技術
従来のコエンザイムＱ_１０の製造法は、タバコなどの植物由来のコエンザイムＱを単離して、その側鎖長を合成法により調整する等によって工業的には生産されている。
また、コエンザイムＱ_１０は細菌や酵母などの微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物により生産されることが知られているが、微生物を培養してその菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いられている。しかしながら、これらの方法では、生成量が少なかったり操作が煩雑であったりする等、その生産性は良好とは言い難い。
また、コエンザイムＱ_１０ではないが、鎖長の異なる類縁体（例えば、コエンザイムＱ_８など）においては、その生合成に関わる遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術により当該遺伝子を増幅し生産増強に利用する試みもなされている。
生体内において、コエンザイムＱ_１０は、多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成されている。その生合成経路は、原核生物と真核生物では一部異なっているが、いずれも基本的には大きく３つのステップ、すなわち、コエンザイムＱ_１０のプレニル側鎖のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコエンザイムＱ_１０を完成させるステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ_１０の側鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられる。
従って、コエンザイムＱ_１０を効率よく生産させる為には、生合成のキー遺伝子であるデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用することが有効であると考えられ、その遺伝子源としてはコエンザイムＱ_１０を比較的多量に生産している真菌類が有力な候補となる。
これまでに、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（特開平９−１７３０７６）やＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（特開平１０−５７０７２）などいくつかの種類の微生物よりデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子が分離されているが、本来これらの微生物ではコエンザイムＱ_１０の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこで、さらにコエンザイムＱ_１０を高生産する微生物由来の本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。
発明の要約
本発明は、上記の生産性に関する問題を解決するべく、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する真菌由来のコエンザイムＱ_１０の側鎖合成遺伝子を単離してこれを利用することにより、微生物によってコエンザイムＱ_１０を効率よく生産することを目的とする。
上記目的を達成する為に、本発明者らは、コエンザイムＱ_１０を比較的多量に生産しているＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する真菌から、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を単離するための検討を重ね、該遺伝子を単離することに成功した。さらに、該遺伝子の高発現化の検討を重ね、コエンザイムＱ_１０をより多量に発現する遺伝子に改良することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）塩基配列が配列番号１に記載のものであるＤＮＡ：
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたＤＮＡ配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明はまた、原核生物での発現が改良されたＤＮＡ、即ち、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡである：
（ｄ）塩基配列が配列番号３に記載のものであるＤＮＡ：
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたＤＮＡ配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｆ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明はまた、原核生物での発現が改良されたＤＮＡ、即ち、以下の（ｋ）、（ｌ）又は（ｍ）のＤＮＡである：
（ｋ）塩基配列が配列番号５に記載のものであるＤＮＡ：
（ｌ）配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたＤＮＡ配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ｍ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明はまた、以下の（ｇ）又は（ｈ）のタンパク質である：
（ｇ）アミノ酸配列が配列番号２に記載のものであるタンパク質：
（ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。
本発明はまた、以下の（ｉ）又は（ｊ）のタンパク質である：
（ｉ）アミノ酸配列が配列番号４に記載のものであるタンパク質：
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。
本発明はまた、以下の（ｎ）又は（ｏ）のタンパク質である：
（ｎ）アミノ酸配列が配列番号６に記載のものであるタンパク質：
（ｏ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。
本発明はまた、上記（ｇ）〜（ｊ）のタンパク質をコードするＤＮＡである。
本発明はまた、上記ＤＮＡをベクターに組み込んでなる発現ベクターである。
本発明はまた、宿主微生物を上記ＤＮＡ又は発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体である。
本発明はまた、上記（ｎ）又は（ｏ）のタンパク質をコードするＤＮＡである。
本発明はまた、上記ＤＮＡをベクターに組み込んでなる発現ベクターである。
本発明はまた、宿主微生物を上記ＤＮＡ又は発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体である。
本発明はさらに、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱ_１０を生成蓄積し、これを採取することからなる、コエンザイムＱ_１０の製造方法でもある。
発明の詳細な開示
以下に本発明を具体的に詳述する。
本発明者らは、コエンザイムＱ_１０を比較的多量に生産しているＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する真菌から本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、ＰＣＲ法によって該遺伝子の断片を取得することに成功した。
既知のデカプレニル２燐酸合成酵素、及び本酵素と類縁で鎖長の違うコエンザイムＱの長鎖プレニル鎖合成酵素であるポリプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の配列を比較し、その相同性の高い領域についてＰＣＲプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマーを種々組み合わせ、ＰＣＲの条件をいろいろ検討したところ、プライマーＤＰＳ−１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’）及びＤＰＳ−１ １ＡＳ（５’−ＡＲＹＴＧＮＡＤＲＡＡＹＴＣＮＣＣ−３’）を用い（なお、ここで示した配列中の、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、そしてＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。）、ＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返すことにより、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属に属する真菌、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約２２０ｂｐの断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解析することにより明らかにした。
次に本酵素遺伝子の全長を取得するために、Ｒｈｏａｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７の染色体遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ラムダファージベクターに挿入して組換えファージライブラリーを作製した。そのプラークをナイロン膜に転写した後、標識した該ＰＣＲ断片を用いてプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子全長を持つクローンを取得することができた。
得られたクローンに含まれるデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子について塩基配列の決定を行ったところ、配列表の配列番号１に示した配列を持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミノ酸配列（配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列）にはデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子として特徴的な配列がみられた。
真核生物では、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子は、ミトコンドリア内で発現し機能しているため、本遺伝子配列のアミノ酸末端側の配列にはミトコンドリアへ局在性を行わせる配列が存在すると考えられる。従って、この遺伝子を原核生物でより有効に機能させるためには、原核生物で必須でない配列を特定し除く必要があると考えた。該遺伝子配列のアミノ酸末端側の配列について検討を重ねた結果、配列番号３に記載の遺伝子を用いることによりコエンザイムＱ_１０を著量生産する事が可能になった。配列番号３に示したＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に記載した。さらにアミノ酸末端側の配列について検討を重ねた結果、配列番号５に記載の遺伝子を用いることによりコエンザイムＱ_１０を著量生産する事が可能になった。配列番号５に示したＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に記載した。
本発明のＤＮＡは、塩基配列が配列番号１又は配列番号３に記載のものであるＤＮＡであってもよいし、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよいし、配列番号１または配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。なお、多くのアミノ酸は１種以上のコドンで規定される（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１又は配列番号３で示す塩基配列からなるＤＮＡ以外にも多数存在する。従って、本発明のＤＮＡには、配列番号２又は配列番号４で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
本発明のＤＮＡは、塩基配列が配列番号５に記載のものであるＤＮＡであってもよいし、配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよいし、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。なお、多くのアミノ酸は１種以上のコドンで規定される（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号５で示す塩基配列からなるＤＮＡ以外にも多数存在する。従って、本発明のＤＮＡには、配列番号６で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
ここで、「１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素 増刊 遺伝子増幅ＰＣＲ法 ＴＡＫＫＡＪ ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編 加藤郁之進鑑訳 ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度の数の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されてなる塩基配列を意味する。
「配列番号１（又は、配列番号３若しくは配列番号５）に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１（又は、配列番号３若しくは配列番号５）に示す塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、又はサザン・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡのことをいう。当業者であれば、該ハイブリダイゼーションをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に準じて実施して、目的とするＤＮＡを容易に取得できる。
また、「デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質」とは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の収率でデカプレニル２燐酸を合成する能力を持つタンパク質のことをいう。このような測定は、ＦＰＰ（ファルネシル２燐酸）と^１４Ｃ−ＩＰＰ（放射ラベルしたイソペンテニル２燐酸）を用いて対象酵素と反応させ、生成した^１４Ｃ−ＤＰＰ（デカプレニル２燐酸）をホスファターゼにより加水分解後、ＴＬＣにて分離して、各鎖長のスポットへの取り込みによって確定する（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５５，５２−５９）。
本発明のタンパク質は、アミノ酸配列が配列番号２、配列番号４、又は配列番号６に記載のものであるタンパク質であってもよいし、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、アミノ酸を欠失、追加、挿入及び／又は置換することにより取得可能である。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている。
デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによって酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりした後、プロモーターを持つベクターに挿入することにより発現ベクターとすることができる。
本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込む発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み込んだものが挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等が挙げられ、プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター等が挙げられる。また、本発明においては発現用ベクターとして、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ（以上、ファルマシア社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８（東洋紡社製）、ｐＭＡＬＣ２、ｐＥＴ−３Ｔ、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記載）等を用いることもできる。このうち、ｐＵＣＮＴが好適に用いられ、具体的な例としては、発現用ベクターｐＵＣＮＴに配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡを挿入すれば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＲｍ２を作製することができるし、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡを挿入すれば、発現ベクターｐＮＴＲｍ６を作製することができる。また、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡを発現用ベクターｐＵＣ１８に挿入すれば、発現ベクターｐＵＣＲｍ３を作製することができる。
そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適当な微生物に導入することによりコエンザイムＱ_１０の生産に利用することが可能となる。宿主微生物としては特に限定されず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては特に限定されず、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ−２１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ５、ｐＵＣ１８等が挙げられる。このうちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１及びｐＵＣ１８が好適に用いられ、例えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＲｍ２、ｐＮＴＲｍ６又はｐＵＣＲｍ３を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は生産しないコエンザイムＱ_１０を著量生産するように変換できる。ｐＮＴＲｍ２を導入した大腸菌はＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲｍ２）ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３３として、また、ｐＮＴＲｍ６を導入した大腸菌はＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲｍ６）ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３２として、また、ｐＵＣＲｍ３を導入した大腸菌はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣＲｍ３）ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３８として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブタペスト条約に基づき寄託されている。
本遺伝子は単独で用いるほか、他の生合成に関与する遺伝子と同時に微生物に導入して発現させることにより、さらに良い効果が期待できる。
本発明で得られた形質転換体を、常法に従い、培地中で培養し、培養物中からコエンザイムＱ_１０を採取することにより、コエンザイムＱ_１０を製造することができる。宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである場合は、培地として、ＬＢ培地や、グルコースやカザミノ酸を含むＭ９培地を用いることができる。プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピルチオガラクトシドやインドリル−３−アクリル酸のような薬剤を培地に加えてもよい。培養は例えば、３７℃で１７〜２４時間行い、この際必要により通気や攪拌を行ってもよい。本発明において、得られたコエンザイムＱ_１０は精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよく、用途により適宜選択することができる。得られた培養物からコエンザイムＱ_１０を単離するには公知の分離・精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈殿等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及び、（ＳＤＳ−）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
本発明において得られたコエンザイムＱ_１０の用途は特に限定されず、医薬品等に好適に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７の染色体ＤＮＡをＣ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ、５７（１９８７）２６７−２７２）で調製した。既知の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の遺伝子との相同性からＰＣＲに用いるプライマーＤＰＳ−１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’）及びＤＰＳ−１ １ＡＳ（５’−ＡＲＹＴＧＮＡＤＲＡＡＹＴＣＮＣＣ−３’）を設計した。なお、ここで示した配列中の、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、そしてＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。これらを用いてＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返すことにより行い（酵素はＴａｋａｒａ製Ｅｘ Ｔａｑを使用）、１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
そして得られた約２２０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ＲｍＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。その結果、配列表の配列番号１の８２３から１０２９までの塩基配列に示す配列が得られた。この翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル２燐酸合成酵素に特徴的な領域の配列「ＧＤＦＬＬＡＲＡ」が見出せたことにより、得られた配列はデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の一部であることが想定された。
（実施例２）
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と思われる２２０ｂｐのＤＮＡ断片を持つｐＴ７−ＲｍＤＰＳベクターＤＮＡ０．０３μｇを用い、ＰＣＲ用のプライマーＲｍ−１Ｓ（５’−ＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧ−３’の配列を持つ）及びＲｍ−２ＡＳ（５’−ＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＡＧＣＴＣＧＡＣ−３’の配列を持つ）を用いてＰＣＲ（９４℃、３分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）×２５サイクル繰り返し→７２℃、５分→４℃）を行い、１．２％アガロース（宝酒造製）によるゲル電気泳動を行い、約１４５ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。このＤＮＡ断片約１００ｎｇを用い、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリングシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて化学発光標識した。
（実施例３）
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。このゲルをアルカリ（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）で変成させ、中和（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）した後、ハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）をゲルに重ね、２０×ＳＳＣを用いて一晩、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った後、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でサザンハイブリダイゼーションと検出を行った。すなわち、ゴールドハイブリダイゼーション液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて４２℃、１時間プレハイブリダイズした。
化学発光標識したプローブを９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、４２℃で２２時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液を用いて４２℃で２０分２回洗浄後、２×ＳＳＣ溶液を用い室温で５分２回洗浄した。このフィルターをエンハンスドケミルネセンス試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に浸した後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した約５．５ｋｂｐの断片に強くハイブリダイズしていた。
（実施例４）
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースによるゲル電気泳動を行い、約５．５ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片をゲルより切り出して精製することにより、クローン化に用いるＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をλ−ＺＡＰＩＩファージキット（ストラテジーン社製）を用いてそのファージのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、インビトロパッケージングキット（アマシャム社製）でパッケージングを行った。そして、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に感染させてＮＺＹ平板培地（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮＺアミン、１８ｇ／Ｌ 寒天、ｐＨ７．５）上にＮＺＹ軟寒天培地（ＮＺＹ平板培地の寒天のみ８ｇ／Ｌ）とともに重層してプラークとした。これをハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）にトランスファーしアルカリ（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）で変成した後、中和（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）、乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った。
焼き付け後のフィルター６枚を用い、実施例３と同様にプレハイブリダイゼーション、化学発光標識したプローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、このフィルターを洗浄した。このフィルターを乾燥後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したスポットに対応するファージのプラークを分離した。この分離したプラークのファージを上記と同様の方法で大腸菌に感染させてプラークとし、フィルターに写して再びハイブリダイゼーションを行い、確認を行ったところ、７株のファージが選択できた。
このファージの懸濁液をλ−ＺＡＰＩＩファージキット（ストラテジーン社製）中の大腸菌ＳＯＬＲにヘルパーファージとともに感染させてインビトロでファージミドを調製した。上記のファージミドは、約５．５ｋｂｐの挿入断片を含み、プライマーＲｍ−１Ｓ及びＲｍ−２ＡＳを用いＰＣＲを行ったところ、１４５ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。内部プライマーであるＲｍ−１Ｓ及びＲｍ−２ＡＳを用い、ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。シーケンスすることにより明らかになった配列を元にプラーマーを作成してその先をシーケンスすることを重ねることにより、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ ０３８７のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の全配列を明らかにすることができた。約１．６ｋｂｐのＤＮＡについてその塩基配列を決定したが、その結果を配列表の配列番号１に示す。また、このＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
（実施例５）
調製したファージミドＤＮＡよりデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子部分のみを切り出す為、合成ＤＮＡプライマーＲＭ−１（５’−ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＴ−３’の配列を持つ）及びＲｍ−ＣＥ２（５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧ−３’の配列を持つ）を用いて実施例２と同様にＰＣＲを行い、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、発現用ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記載）に挿入してデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＲｍ２を作製した。得られた発現ベクター、ｐＮＴＲｍ２の制限酵素地図を図１に示す。なお、ＤＰＳとは、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子のコード領域を意味する。
（実施例６）
作製したデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＲｍ２を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１．５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ_１０を検出した。結果を図２に示した。図２に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ_１０を、生産するようになったことが分かった。
得られた組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲｍ２）は、ブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１２年１０月１９日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３３）。
（実施例７）
原核生物で多量に発現させるべく、配列番号１から真核生物特有のミトコンドリア移行配列を除くため、合成ＤＮＡプライマーＲｍ−４（５’−ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＴＣＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＡＣＴ−３’の配列を持つ）及びＲｍ−ＣＥ２（５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧ−３’の配列を持つ）を用いて実施例２と同様にＰＣＲを行い１．３Ｋｂｐの断片を増幅させた後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｈｅＩで切断して約６００ｂｐの断片を調製して、ｐＮＴＲｍ２を制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｈｅＩで消化したフラグメントと組み換えてｐＮＴＲｍＳｓｐを作製した。また、合成ＤＮＡプライマーＲＭ−１（５’−ＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＴ−３’の配列を持つ）及びＲＭ−６Ｒ（５’−ＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣ−３’の配列を持つ）を用いて実施例２と同様にＰＣＲを行い、Ｎ部分を欠失させた約１００ｂｐの断片を増幅させた後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｓｐＩで切断した断片を調製して、ｐＮＴＲｍＳｓｐを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｓｐＩで消化したフラグメントと組み換えてｐＮＴＲｍ６を作製した。
（実施例８）
作製したデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＲｍ６を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１．５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ_１０を検出した。結果を図３に示した。図３に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ_１０を、生産するようになり、また、ｐＮＴＲｍ２で形質転換した大腸菌に比べてコエンザイムＱ_１０を著量生産するように変換できた。
得られた組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲｍ６）は、ブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１２年１０月１９日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３２）。
（実施例９）
原核生物で多量に発現させるべく、配列番号１から真核生物特有のミトコンドリア移行配列を除くため、合成ＤＮＡプライマーＲｍＮＥｃｏ（５’−ＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＡＣＴ−３’の配列を持つ）及びＲｍ−ＣＥ２（５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧ−３’の配列を持つ）を用いて実施例２と同様にｐＮＴＲｍ２を鋳型としてＰＣＲを行い１．２Ｋｂｐの断片を増幅させた後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、またｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したフラグメントと組み換えてｐＵＣＲｍ３を作製した。
（実施例１０）
作製したデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＵＣＲｍ３を大腸菌ＤＨ５αに導入し、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１．５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ_１０を検出した。結果を図３に示した。図５に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ_１０を、生産するようになり、また、ｐＮＴＲｍ２及びｐＮＴＲｍ６で形質転換した大腸菌に比べてコエンザイムＱ_１０を著量生産するように変換できた。
得られた組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣＲｍ３）は、ブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１３年６月２２日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３８）。
産業上の利用の可能性
コエンザイムＱ_１０の生合成に関するキー酵素、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の真菌より単離し、配列決定を行った。また、これを大腸菌に導入して発現させることに成功した。さらに遺伝子配列を改良することによりコエンザイムＱ_１０の著量生産に成功した。本発明の方法を用いることにより医薬品等として用いられているコエンザイムＱ_１０を効率的に製造することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、発現ベクターｐＮＴＲｍ２の制限酵素地図である。
図２は、発現ベクターｐＮＴＲｍ６の制限酵素地図である。
図３は、宿主及び形質転換体生産物のＨＰＬＣ分析チャートである。
図４は、発現ベクターｐＵＣＲｍ３の制限酵素地図である。
図５は、発現ベクターｐＵＣＲｍ３の宿主及び形質転換体生産物のＨＰＬＣ分析チャートである。

Claims (24)

1. 塩基配列が配列番号１に記載のものであるＤＮＡ。
2. 塩基配列が配列番号３に記載のものであるＤＮＡ。
3. アミノ酸配列が配列番号２に記載のものであるタンパク質。
4. アミノ酸配列が配列番号４に記載のものであるタンパク質。
5. 請求の範囲第３項記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 請求の範囲第４項記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 発現用ベクターに請求の範囲第１、２、５又は６項記載のＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター。
8. 宿主微生物を請求項１、２、５又は６記載のＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体。
9. 宿主微生物を請求項７記載の発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体。
10. 宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項８又は９記載の形質転換体。
11. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１である請求の範囲第１０項記載の形質転換体。
12. 形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲｍ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３３）である請求項１１記載の形質転換体。
13. 形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲｍ６）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３２）である請求の範囲第１１項記載の形質転換体。
14. 請求項８、９、１０、１１、１２又は１３記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱ_１０を生成蓄積し、これを採取することを特徴とするコエンザイムＱ_１０の製造方法。
15. 塩基配列が配列番号５に記載のものであるＤＮＡ。
16. アミノ酸配列が配列番号６に記載のものであるタンパク質。
17. 請求項１６記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
18. 発現用ベクターに請求項１５又は１７記載のＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター。
19. 宿主微生物を請求項１５又は１７記載のＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体。
20. 宿主微生物を請求項１８記載の発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体。
21. 宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項１９又は２０記載の形質転換体。
22. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αである請求項２１記載の形質転換体。
23. 形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＵＣＲｍ３）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３８）である請求項２２記載の形質転換体。
24. 請求項１９、２０、２１、２２又は２３記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱ_１０を生成蓄積し、これを採取することを特徴とするコエンザイムＱ_１０の製造方法。

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