JP4193039B2 - Double-stranded oligonucleotide array - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイ及び該アレイを用いて相互作用解析を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から遺伝子を検出する方法としてＤＮＡアレイの技術が用いられてきた。ＤＮＡアレイは、一本鎖ＤＮＡを基板上に固定化しておき、そのＤＮＡに相補的な核酸がハイブリダイゼーションしたかどうかを蛍光ラベルや化学発光などを用いて検出するのが一般的である。
【０００３】
近年、核酸同士の相互作用だけでなく、ＤＮＡ−タンパク質相互作用などの異なる生体分子相互作用の観察が注目をあびてきている。その理由として核酸配列に特異的なタンパク質の存在が広く知られるようになったことが挙げられる。中でも結合・解離の相互作用が重要視されている。
【０００４】
従来、ＤＮＡ−タンパク質の結合・解離の相互作用評価として一般的な方法はゲルシフト法であり、ＤＮＡ−タンパク質を相互作用させた状態で、ゲル内の移動速度を観察する方法が行われてきた。しかし、ゲルシフト法はスループットが低く、多量のサンプルを扱うのは非常に困難である。また、平衡状態を測定するため、結合・解離速度の評価は不可能である。
【０００５】
そこで、ＤＮＡアレイの技術を応用して、二本鎖ＤＮＡのアレイを作製し、タンパク質との相互作用を解析する方法が探索されてきた。例えば同一のプライマー部分を有する一本鎖ＤＮＡをアレイ状に固相に固定化しておき、プライマーをハイブリダイゼーションさせた上で、表面上でのポリメラーゼ操作によって二本鎖とする方法が知られている（例えば特許文献１参照）。この方法は同一のプライマー部分を有する長い一本鎖ＤＮＡを固定化している場合は効果がある。しかし、基板上でのＤＮＡポリメラーゼの反応条件の最適化、反応操作は煩雑である。また、特許文献１では二本鎖ＤＮＡは緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）などによってラベル化されたタンパク質との相互作用が観察されているが、ラベル操作はタンパク質の機能や特性を変える可能性が指摘されており、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を普遍的に測定できる方法とは言えない。
【０００６】
一方、基板上で酵素処理を行わず、二本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせてから、電極基板上に固定化し、酵素との相互作用を観察する方法も報告されている（例えば非特許文献１参照）。ここでは金基板に結合性をもつチオール基をＤＮＡ分子に導入しておき、金基板に直接固定化する方法をとっている。しかし、この方法は電極全体に二本鎖ＤＮＡを固定化するもので、アレイの概念は示されていない。また、この方法では、ＤＮＡ分子は金表面に横たわる形でも存在することが知られており（例えば非特許文献２参照）、ＤＮＡ分子が基板に近すぎてＤＮＡ分子のモビリティが十分に確保できないことから、タンパク質との相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を正確に測定することは困難となる。また、ＤＮＡ分子だけで金表面に自己組織化によって固定化すると密に充填できないため、メルカプトヘキサノールでブロッキングする必要が生じる。メルカプトヘキサノールの方が自己組織化能は強く、先に金に固定化したＤＮＡ分子とメルカプトヘキサノールの交換反応がおこるため、表面に残るＤＮＡ分子の密度は極めて低くなり、タンパク質との相互作用によって得られる信号は非常に小さくなる。
【０００７】
また、アレイ上でＤＮＡ−タンパク質相互作用を観察する報告もされている（例えば非特許文献３参照）。ここでは二種類の一本鎖ＤＮＡを固定化しておき、片方に相補的なＤＮＡをアレイ全体に曝し、片方のみをハイブリダーゼーションさせた後、一本鎖結合型蛋白（ＳＳＢ）との相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング法によって観察している。しかし、この方法では、配列の近いＤＮＡが固定化される場合、ミスマッチでもハイブリダイゼーションしてしまい、配列が似かよった二本鎖ＤＮＡアレイを作成することは困難である。またチップ全体に相補的ＤＮＡを曝すことにも限界がある。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許６３２６４８９
【０００９】
【非特許文献１】
Ｂｏｏｎら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２００２）２８２−２８６．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｔｏｎｙａら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１９（１９９７）８９１６−８９２０．
【００１１】
【非特許文献３】
Ｂｒｏｃｋｍａｎら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２１（１９９９）８０４４−８０５１．
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したアレイ並びに該アレイを用いて生体分子の相互作用を適切に測定する方法を提供することを主な課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として、鋭意検討を重ねた。その結果、金属基板上に二本鎖オリゴヌクレオチド配列が複数固定化されたアレイであって、二本鎖オリゴヌクレオチドにおける第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に固定化されており、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと全体的あるいは部分的に相補的に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いることにより、適切な測定が行い得ることを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、次の事項に関する。
【００１５】
１．金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【００１６】
２．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している項１に記載のアレイ。
【００１７】
３．金属基板が、表層に金薄層が形成された透明基板である項１又は２に記載のアレイ。
【００１８】
４．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、金属基板上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合することによって基板上に結合している項３に記載のアレイ。
【００１９】
５．（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法。
【００２０】
６．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させる項５に記載の方法。
【００２１】
７．金属基板が表層に金薄層が形成された透明基板である項５又は６に記載の方法。
【００２２】
８．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を、金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合させて、金属基板上に結合させる項７に記載の方法。
【００２３】
９．項５〜８のいずれかに記載の方法により作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【００２４】
１０．項１〜５又は９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに固定化されたオリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を測定する工程を有する生体分子相互作用測定方法。
【００２５】
１１．オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法を用いて測定する項１０に記載の方法。
【００２６】
１２．オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する項１０又は１１に記載の方法。
【００２７】
１３．生体分子がタンパク質である項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【００２８】
１４．タンパク質が転写因子である項１３に記載の方法。
【００２９】
本発明は、好ましくは、金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに係る。
【００３０】
より好ましくは、表層に金薄層を有する透明基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが該官能基あるいは結合グループを介して金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合して基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに係る。
【００３１】
また、本発明は、好ましくは、（１）５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法に係る。
【００３２】
より好ましくは、（１）５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合して、表層に金薄層を有する透明基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法に係る。
【００３３】
更に、本発明は、好ましくは、（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む方法で作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法または表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する生体分子相互作用測定方法に関する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ
本発明において、二本鎖オリゴヌクレオチドとは二本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの二重らせん分子のことをいい、本発明においては、アレイ上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化される。本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとが、全体的あるいは部分的に相補的に結合して形成されている。部分的とはどちらかのオリゴヌクレオチドの一部分が一本鎖である状態や、ミスマッチを含む塩基対である状態をいう。
【００３６】
本発明のアレイにおいては、二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する一方の一本鎖オリゴヌクレオチド（第一のオリゴヌクレオチド）のみが、金属基板上に結合しており、もう一方の一本鎖オリゴヌクレオチド（第二のオリゴヌクレオチド）は、第一のオリゴヌクレオチドと相補的にワトソン−クリック対を形成することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの形で、基板上に固定化されている。
【００３７】
相補結合をしている第一と第二のオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）は、測定温度よりも高いように設定する。ＴｍはオリゴヌクレオチドにおけるＧとＣが含まれるパーセンテージにも依存するが、一般的な測定温度（25〜37℃）で、少なくとも9塩基以上の相補的結合が必要である。また、50塩基以上の長い塩基対は合成が困難であったり、自己相補的塩基対を生じたり、目的の部位と異なる部位でハイブリダイゼーションしたりして、目的の二本鎖オリゴヌクレオチドが得られない危険性が生じる。従って、二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、相補的結合をしている長さは、9塩基以上50塩基以下が好ましい。より好ましくは、11塩基以上30塩基以下である。相補結合している塩基は連続していることが好ましい。相補結合していれば、相補的結合部分に一部ミスマッチを有するものも含まれる。
【００３８】
生体分子との相互作用を観察するためには、生体分子が、オリゴヌクレオチドを認識できる状態が必要である。そのためには、二本鎖オリゴヌクレオチド分子が基板上に横たわらないよう、オリゴヌクレオチドの中央部分ではなく、末端で結合させることが重要である。オリゴヌクレオチドを末端で結合するための方法としては、例えば、第一のオリゴヌクレオチドの末端に官能基を導入し、固体表面に存在する官能基もしくは固体表面に導入した官能基と直接、もしくは架橋剤などを用いて間接的に結合する方法などが挙げられる。このように末端で固定化することで、生体分子がオリゴヌクレオチドを適切に認識でき、正しい評価値を得ることができる。
【００３９】
二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法は、特に限定されないが、第一と第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、二本鎖オリゴヌクレオチドとした上で、第一のオリゴヌクレオチドの末端を基板上にアレイ状に固定化する方法が好ましい。
【００４０】
より具体的には、（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む方法が好ましい。
【００４１】
第一のオリゴヌクレオチドを、先に固定化した後で、第二のオリゴヌクレオチドを配置させる場合には、アレイの同一場所にスポットする必要があり、スポット操作が二回必要となるなど、工程が煩雑となる。そのため、第一と第二のオリゴヌクレオチドは基板に配置される前に、ハイブリダイゼーションを行って、二本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好ましい。
【００４２】
第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｘ５ＳＳＣ溶液などの塩濃度の高い溶液に、５’チオール末端ＤＮＡと相補的ＤＮＡがモル比１：１〜１：１０の範囲で混合し、沸騰浴中にて３−１５分、０℃に急冷し５−６０分、その後３７℃で１−２４時間インキュベートするなどのように行う。
【００４３】
第一のオリゴヌクレオチドを金属基板に結合する方法としては、第一のオリゴヌクレオチドの末端に官能基あるいは結合グループが導入し、該官能基あるいは結合グループを介して、基板上に直接的あるいは、介在物質を介して間接的に結合する方法が好ましい。官能基や結合グループの種類は特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、ビオチンなどが挙げられる。
【００４４】
金属基板としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、クロム等を用いた基板が挙げられる。このうち、特に表層に金薄層が形成された透明基板が好ましい。表層に金薄層が形成されている場合には、特定の物質を基板上に密に充填して金表面に官能基を導入し、第一のオリゴヌクレオチドの末端を該物質の官能基に直接的あるいは間接的に結合させて、オリゴヌクレオチドを基板上に密に固定化することが可能である。
【００４５】
金表面に官能基を導入する方法としては、一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される二官能基型アルカン（ここでＸ’は金表面と結合する官能基、Ｙ’は第一オリゴヌクレオチドと結合する官能基を表す。Ｒ’は有機基を表す。）を基板上に密に充填する方法が好ましい。官能基Ｘ'としては、例えば、チオール基、スルフィド基またはジスルフィド基などが挙げられる。Ｙ'としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、エポキシ基、カルボニルジイミダゾール基、イソシアネート基などが挙げられる。またＲ’としては、アルキレン基などが挙げられる。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が5以上18以下であることが好ましい。炭素数が4未満であると、アルカン鎖同士の疎水結合が十分でなく、自己組織化表面の安定性に欠ける。また19以上であると、アルカン鎖の疎水性が強く、親水性物質の反応・固定化が困難となるだけでなく、センサー表面として疎水性が強いために測定中の非特異的吸着が懸念される。
【００４６】
一般式Ｘ'-Ｒ'-Ｙ'で表される化合物としては、具体的には、Ｙ'がアミノ基となる８−アミノ−１−オクタンチオール（8-Amino-1-Octanethiol）、Ｙ'がカルボキシル基となる７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（7-Carboxy-1-Heptanethiol）などが挙げられる。
【００４７】
生体分子相互作用の測定方法
本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドアレイは、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用の測定に、好適に用いることができる。相互作用測定の手段としては、ラベルフリーかつリアルタイム測定が可能な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が好ましい。さらにＳＰＲ法においては、ＳＰＲイメージング法が好ましい。
【００４８】
生体分子の中にはラベル操作によって機能・活性に変化が生じるものがあり、特にタンパク質は、ラベル操作によって、構造が変化したり、活性を失う可能性が高い。ＳＰＲ法は生体分子を標識化（ラベル）する必要のない相互作用解析方法であるため、生体分子の機能や活性を維持したまま適切な測定を行うことができる。また該方法により、リアルタイムな測定が可能であり、平衡状態だけではなく、結合と解離の速度を解析することが可能となるため、これらの結果から生体分子の機能を知るための貴重な情報を得ることができる。
【００４９】
ＳＰＲイメージング法はアレイ全体に偏光平行光を照射し、その反射光をＣＣＤカメラで撮影するため、アレイのある地点における表面プラズモン共鳴角変位を、反射光強度の変化によって知ることが可能である。よって、複数の配列を固定化した二本鎖オリゴヌクレオチドアレイと生体分子の相互作用をラベルフリーかつリアルタイムに測定乃至解析することが可能であり、特に複数の生体分子を固定化したアレイを用いた生体分子相互作用の解析に好適に用いることができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの相互作用の対象となる生体分子は、特に限定されることはないが、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖などが挙げられる。またヘテロ二量体などの生体分子の集合体にも適用できる。中でも、本発明はタンパク質の測定に好適に用いることができる。特に、タンパク質の中でも、二本鎖ＤＮＡと相互作用することが知られている転写因子の測定に好適に用いることができる。転写因子の種類は特に限定されず、例えば、NF1ファミリー、Mafファミリー、GATAファミリーなどを適用することができる。Mafファミリーはホモ二量体だけではなく、ヘテロ二量体を形成することが知られているが、本発明の方法により、さまざまなヘテロ二量体の組み合わせによる結合挙動の違いの評価や、変異の入った二本鎖ＤＮＡと転写因子の相互作用を解析することなどができ、本発明により、生体機能に関する有用な種々の情報を得ることができる。
【００５１】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５２】
実施例１
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００５３】
得られた表面にＧｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社のＨａｎｄ ｓｐｏｔｔｅｒを用いて５’チオール末端のＤＮＡの二種類、ハイブリダーゼーションさせてからスポッティングした。ＤＮＡの配列はＭａｆ認識配列（ＭＡＲＥ２５）と、Ｍａｆ非認識配列（ＭＡＲＥ２３）であり、詳細な配列は図１に示す。５’チオール末端からチミン１５塩基スペーサーを介した後、目的の配列が入るように設計されている。
【００５４】
Ｘ５ＳＳＣ溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に５’チオール末端ＤＮＡが２５μＭ、その相補的ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、沸騰浴中にて５分、０℃に急冷し１５分、その後３７℃で三時間インキュベートし、ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションした二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をスポッティングし、１５時間反応させてｄｓＤＮＡを表面に固定化した。
【００５５】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン、ｐＨ７．９の転写因子測定用緩衝液をフローセル内に流した。
【００５６】
ＳＰＲイメージングによって得られる像を図３に示す。ｄｓＤＮＡを固定化した楕円形の部分は、屈折率の変化のために白く見えている。このようにｄｓＤＮＡを表面に固定化したアレイが形成されている。
【００５７】
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、転写因子ＭａｆＧのホモ二量体を１μｇ／ｍｌの濃度で上記転写因子測定用緩衝液に溶解してセル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、さらに転写因子を含まない緩衝液を流し、結合と解離のＳＰＲシグナルの変化を観察した。
【００５８】
観察はＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３の固定化部位と何もＤＮＡが固定化されていない部分（バックグラウンド部位）の三点で実施した。ＳＰＲシグナルの変化を示すグラフを図４に示す。ＭＡＲＥ２５配列のみにＭａｆＧホモ二量体が結合し、ＭＡＲＥ２３、バックグラウンド部位にはほとんど結合しないのが観察でき、結合速度定数２．２２×１０5（Ｍ-1ｓ-1）、解離速度定数８．８０×１０-4（ｓ-1）、結合平衡定数２．５２×１０8（Ｍ-1）を得た。
【００５９】
参考例１
実施例１と同様に、金蒸着透明基板上に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型親水性高分子ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを固定化した。
【００６０】
次に５’末端にチオールを有するＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３配列の一本鎖ＤＮＡを１ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、アレイ状にスポッティングし１５時間反応させることで基板上に固定化した。
【００６１】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器にセットし、フローセル内を塩濃度の転写因子測定用緩衝液で満たした。次にＭＡＲＥ２５に相補的なＤＮＡを１μＭの濃度で注入し、２０分間放置し、ＭＡＲＥ２５をハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、ＭＡＲＥ２３に相補的なＤＮＡを１μＭの濃度で注入し、２０分間放置し、ＭＡＲＥ２３をハイブリダイゼーションさせた。
【００６２】
実施例と同様の方法でＭａｆＧホモ二量体の相互作用を観察したが、ＭＡＲＥ２５、ＭＡＲＥ２３の両方に吸着し、転写因子ＭａｆＧの特異性は観察できなかった（図５）。ＭＡＲＥ２５の相補的ＤＮＡがＭＡＲＥ２３にも結合しているため、目的の二本鎖ＤＮＡアレイを形成できなかったためと考えられる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いることによって、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を適切に解析することが可能となる。
【００６４】
また、本発明により、生体分子相互作用の観察に適した二本鎖オリゴヌクレオチドを、効率よく、かつ適切に作成することができる。
【００６５】
本発明は、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用の測定において有用性の高い優れた手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＭＡＲＥ２５の塩基配列を示す図面である。
【図２】 図２は、ＭＡＲＥ２３の塩基配列を示す図面である。
【図３】 図３は、ｄｓＤＮＡアレイのＳＰＲ像を示す図面である。
【図４】 図４は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（実施例）を示す図面である。
【図５】 図５は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（参考例）を示す図面である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an array on which double-stranded oligonucleotides are immobilized, and a method for performing an interaction analysis using the array.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, DNA array technology has been used as a method for detecting genes. In a DNA array, single-stranded DNA is generally immobilized on a substrate and whether or not a nucleic acid complementary to the DNA is hybridized is detected using a fluorescent label or chemiluminescence.
[0003]
In recent years, not only the interaction between nucleic acids but also the observation of different biomolecular interactions such as DNA-protein interactions has attracted attention. The reason is that the existence of a protein specific to the nucleic acid sequence has become widely known. In particular, the interaction between binding and dissociation is regarded as important.
[0004]
Conventionally, a general method for evaluating the interaction between DNA-protein binding and dissociation is the gel shift method, and a method of observing the moving speed in the gel in a state where the DNA-protein interacts has been performed. However, the gel shift method has a low throughput and it is very difficult to handle a large amount of samples. In addition, since the equilibrium state is measured, it is impossible to evaluate the binding / dissociation rate.
[0005]
Thus, a method for producing an array of double-stranded DNA by applying the DNA array technology and analyzing the interaction with the protein has been searched. For example, a method is known in which single-stranded DNA having the same primer portion is immobilized on a solid phase in an array form, the primer is hybridized, and then double-stranded by polymerase operation on the surface. (For example, refer to Patent Document 1). This method is effective when a long single-stranded DNA having the same primer portion is immobilized. However, the optimization of the reaction conditions of DNA polymerase on the substrate and the reaction operation are complicated. Further, in
[0006]
On the other hand, a method has also been reported in which double-stranded DNA is hybridized without performing enzyme treatment on the substrate, then immobilized on the electrode substrate, and the interaction with the enzyme is observed (for example, see Non-Patent Document 1). ). Here, a method is adopted in which a thiol group having a binding property to a gold substrate is introduced into a DNA molecule and directly immobilized on the gold substrate. However, in this method, double-stranded DNA is immobilized on the entire electrode, and the concept of the array is not shown. Further, in this method, it is known that DNA molecules also exist in a form lying on the gold surface (see, for example, Non-Patent Document 2), and the DNA molecules are too close to the substrate to ensure sufficient mobility of the DNA molecules. Therefore, it becomes difficult to accurately measure the interaction kinetics (Kinetics) with proteins. In addition, when DNA molecules alone are immobilized on the gold surface by self-assembly, they cannot be packed densely, so that it is necessary to block with mercaptohexanol. Mercaptohexanol has a stronger self-organization ability, and the exchange reaction between the DNA molecule immobilized on gold and mercaptohexanol occurs, resulting in a very low density of DNA molecules remaining on the surface. The resulting signal is very small.
[0007]
In addition, it has been reported that DNA-protein interaction is observed on an array (see, for example, Non-Patent Document 3). Here, two kinds of single-stranded DNA are immobilized, DNA complementary to one side is exposed to the entire array, and only one side is hybridized, and then the interaction with single-stranded binding protein (SSB). Are observed by a surface plasmon resonance (SPR) imaging method. However, in this method, when DNAs with similar sequences are immobilized, hybridization occurs even with mismatches, and it is difficult to prepare a double-stranded DNA array with similar sequences. There is also a limit to exposing complementary DNA to the entire chip.
[0008]
[Patent Document 1]
US Pat. No. 6,326,489
[0009]
[Non-Patent Document 1]
Boon et al. Nature Biotechnology 20 (2002) 282-286.
[0010]
[Non-Patent Document 2]
Tonya et al. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 8916-8920.
[0011]
[Non-Patent Document 3]
Blockman et al. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 8044-8051.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The main object of the present invention is to provide an array on which double-stranded oligonucleotides are immobilized and a method for appropriately measuring the interaction of biomolecules using the array.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made extensive studies with the main purpose of solving the above problems. As a result, an array in which a plurality of double-stranded oligonucleotide sequences are immobilized on a metal substrate, in which only the first single-stranded oligonucleotide in the double-stranded oligonucleotide is immobilized on the substrate, We found that two single-stranded oligonucleotides can be measured appropriately by using a double-stranded oligonucleotide array that is fully or partially complementary bound to the first oligonucleotide. As a result, the present invention has been completed.
[0014]
That is, the present invention relates to the following matters.
[0015]
1. An array in which a plurality of double-stranded oligonucleotides are immobilized on a metal substrate, and the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are bound together in an entirely or partially complementary manner. A double-stranded oligonucleotide array in which a double-stranded oligonucleotide is formed, and only the first single-stranded oligonucleotide is bound to the substrate in the double-stranded oligonucleotide.
[0016]
2. Item 2. The array according to
[0017]
3.
[0018]
4). Item 4. The array according to
[0019]
5. (1) The first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are hybridized with each other so that the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are wholly or partially. Forming a complementary double-stranded oligonucleotide, and then (2) attaching the end of the first single-stranded oligonucleotide onto the metal substrate and forming it on the metal substrate in (1) A method for producing a double-stranded oligonucleotide array, comprising a step of immobilizing a double-stranded oligonucleotide.
[0020]
6). The first single-stranded oligonucleotide has a functional group or a binding group at the 5 ′ end or 3 ′ end, and the end of the first single-stranded oligonucleotide is placed on the metal substrate via the functional group or the binding group. Item 6. The method according to
[0021]
7). Item 7. The method according to
[0022]
8). Item 8. The method according to Item 7, wherein the end of the first single-stranded oligonucleotide is bonded directly or indirectly to a bifunctional alkane closely packed on a thin gold layer and bonded to a metal substrate. .
[0023]
9. Item 9. A double-stranded oligonucleotide array prepared by the method according to any one of
[0024]
10. Item 12. A step of measuring an interaction between an oligonucleotide immobilized on a double-stranded oligonucleotide array and a biomolecule or an assembly thereof using the double-stranded oligonucleotide array according to any one of
[0025]
11. Item 11. The method according to Item 10, wherein the interaction between the oligonucleotide and the biomolecule or the aggregate thereof is measured using a surface plasmon resonance method.
[0026]
12 Item 12. The method according to Item 10 or 11, wherein the interaction between the oligonucleotide and the biomolecule or the aggregate thereof is measured using a surface plasmon resonance imaging method.
[0027]
13. Item 13. The method according to any one of Items 10 to 12, wherein the biomolecule is a protein.
[0028]
14 Item 14. The method according to Item 13, wherein the protein is a transcription factor.
[0029]
The present invention is preferably an array in which a plurality of double-stranded oligonucleotides are immobilized on a metal substrate, and a first single-stranded oligo having a functional group or a binding group on the 5 ′ end or 3 ′ end side. The nucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are bonded together in whole or in part to form a double-stranded oligonucleotide, and in the double-stranded oligonucleotide, the first single-stranded oligonucleotide The present invention relates to a double-stranded oligonucleotide array in which only nucleotides are bound to a substrate via the functional group or binding group.
[0030]
More preferably, it is an array in which a plurality of double-stranded oligonucleotides are immobilized on a transparent substrate having a thin gold layer on the surface layer, the first having a functional group or a binding group at the 5 ′ end or 3 ′ end. The single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are combined together in a complementary manner, in whole or in part, to form a double-stranded oligonucleotide. In the double-stranded oligonucleotide, Two single-stranded oligonucleotides that are directly or indirectly bound to the substrate via the functional group or binding group and bonded directly or indirectly to the bifunctional alkane packed tightly on the gold thin layer. It relates to a strand oligonucleotide array.
[0031]
In the present invention, preferably, (1) a first single-stranded oligonucleotide having a functional group or a binding group on the 5 ′ end or 3 ′ end side and a second single-stranded oligonucleotide are hybridized. Forming a double-stranded oligonucleotide in which the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are joined together in a complementary manner, or (2) the functional group. Two steps comprising the step of immobilizing the double-stranded oligonucleotide formed in (1) on the metal substrate by bonding the end of the first single-stranded oligonucleotide to the metal substrate via a group or a binding group The present invention relates to a method for producing a strand oligonucleotide array.
[0032]
More preferably, (1) a first single-stranded oligonucleotide having a functional group or a binding group at the 5 ′ end or 3 ′ end side is hybridized with a second single-stranded oligonucleotide, Forming a double-stranded oligonucleotide in which one single-stranded oligonucleotide and a second single-stranded oligonucleotide are bound together in whole or in part; and (2) the functional group or binding group On the transparent substrate having the gold thin layer on the surface by directly or indirectly binding the end of the first single-stranded oligonucleotide to the bifunctional alkane closely packed on the gold thin layer. The present invention relates to a method for producing a double-stranded oligonucleotide array comprising a step of immobilizing the double-stranded oligonucleotide formed in (1).
[0033]
In the present invention, it is preferable that (1) the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are hybridized to form the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide. Forming a double-stranded oligonucleotide in which the strand oligonucleotides are bonded together in a complementary or wholly or partially manner, and then (2) binding the ends of the first single-stranded oligonucleotide on a metal substrate to form a metal Using the double-stranded oligonucleotide array prepared by the method comprising the step of immobilizing the double-stranded oligonucleotide formed in (1) on the substrate, the interaction between the oligonucleotide and the biomolecule or the aggregate thereof is measured. The present invention relates to a biomolecular interaction measurement method for measuring using a surface plasmon resonance method or a surface plasmon resonance imaging method.
[0034]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0035]
Double-stranded oligonucleotide array In the present invention, a double-stranded oligonucleotide refers to a double-stranded DNA or a double-helix molecule of DNA and RNA. In the present invention, a plurality of double-stranded oligonucleotide arrays are arranged on the array. The double-stranded oligonucleotide is immobilized. The double-stranded oligonucleotide of the present invention is formed by complementary binding of a first oligonucleotide and a second oligonucleotide in whole or in part. “Partial” refers to a state in which a part of one of the oligonucleotides is a single strand or a base pair including a mismatch.
[0036]
In the array of the present invention, only one single-stranded oligonucleotide (first oligonucleotide) constituting the double-stranded oligonucleotide is bound on the metal substrate, and the other single-stranded oligonucleotide ( The second oligonucleotide) is immobilized on the substrate in the form of a double-stranded oligonucleotide by forming a Watson-Crick pair complementary to the first oligonucleotide.
[0037]
The melting points (Tm) of the first and second oligonucleotides having complementary bonds are set to be higher than the measurement temperature. Tm depends on the percentage of G and C contained in the oligonucleotide, but at the general measurement temperature (25 to 37 ° C.), at least 9 bases or more complementary binding is required. In addition, long base pairs of 50 bases or more are difficult to synthesize, generate self-complementary base pairs, or hybridize at a site different from the target site to obtain the target double-stranded oligonucleotide. There is no danger. Therefore, in the double-stranded oligonucleotide, the length of complementary binding is preferably 9 bases or more and 50 bases or less. More preferably, it is 11 bases or more and 30 bases or less. The complementary bases are preferably continuous. If they are complementary-bonded, those having a partial mismatch in the complementary-binding portion are also included.
[0038]
In order to observe the interaction with the biomolecule, it is necessary that the biomolecule can recognize the oligonucleotide. For this purpose, it is important that the double-stranded oligonucleotide molecules are attached not at the central portion of the oligonucleotide but at the ends so that they do not lie on the substrate. As a method for linking oligonucleotides at the ends, for example, a functional group is introduced at the end of the first oligonucleotide, and the functional group present on the solid surface or directly with the functional group introduced on the solid surface, or a crosslinking agent For example, a method of indirectly binding using a method such as By immobilizing at the terminal in this way, the biomolecule can appropriately recognize the oligonucleotide, and a correct evaluation value can be obtained.
[0039]
Method for producing double-stranded oligonucleotide array The method for producing the double-stranded oligonucleotide array of the present invention is not particularly limited, and the first and second oligonucleotides are hybridized to form a double-stranded oligonucleotide. In addition, a method is preferred in which the ends of the first oligonucleotide are immobilized on the substrate in an array.
[0040]
More specifically, (1) the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are hybridized with the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide. Forming a double-stranded oligonucleotide with fully or partially complementary binding, and (2) binding the ends of the first single-stranded oligonucleotide to the metal substrate on the metal substrate ( A method comprising a step of immobilizing the double-stranded oligonucleotide formed in 1) is preferred.
[0041]
If the first oligonucleotide is first immobilized and then the second oligonucleotide is placed, it must be spotted at the same location on the array, and the spot operation is required twice. It becomes complicated. Therefore, it is preferable that the first and second oligonucleotides are hybridized to be double-stranded oligonucleotides before being placed on the substrate.
[0042]
Hybridization of the first oligonucleotide and the second oligonucleotide can be carried out, for example, in a salt solution such as X5 SSC solution in which the 5 ′ thiol terminal DNA and the complementary DNA are in a molar ratio of 1: 1 to 1:10. Mix in the range, quench for 3-15 minutes in a boiling bath, quench to 0 ° C, 5-60 minutes, then incubate at 37 ° C for 1-24 hours.
[0043]
As a method for bonding the first oligonucleotide to the metal substrate, a functional group or a bonding group is introduced at the end of the first oligonucleotide, and the functional group or the bonding group is directly or intervened on the substrate. A method of binding indirectly via a substance is preferred. The type of functional group or bond group is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, a thiol group, an aldehyde group, a maleimide group, and biotin.
[0044]
Examples of the metal substrate include a substrate using gold, silver, copper, aluminum, chromium, or the like. Among these, a transparent substrate having a thin gold layer formed on the surface layer is particularly preferable. When a gold thin layer is formed on the surface layer, a specific substance is closely packed on the substrate to introduce a functional group on the gold surface, and the end of the first oligonucleotide is directly attached to the functional group of the substance. It is possible to immobilize the oligonucleotide tightly on the substrate by binding it indirectly or indirectly.
[0045]
As a method for introducing a functional group onto the gold surface, a bifunctional alkane represented by the general formula X′—R′—Y ′ (where X ′ is a functional group that binds to the gold surface, Y ′ is the first A method in which a functional group that binds to an oligonucleotide is represented, R ′ represents an organic group, and is densely packed on a substrate is preferable. Examples of the functional group X ′ include a thiol group, a sulfide group, or a disulfide group. Examples of Y ′ include an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, an azide group, an N-hydroxysuccinimide group, an epoxy group, a carbonyldiimidazole group, and an isocyanate group. Examples of R ′ include an alkylene group. The number of carbon atoms of the alkylene group is not particularly limited, but is preferably 5 or more and 18 or less. If the number of carbon atoms is less than 4, the hydrophobic bonds between the alkane chains are not sufficient, and the stability of the self-assembled surface is lacking. On the other hand, if it is 19 or more, the alkane chain is highly hydrophobic, making it difficult to react and immobilize hydrophilic substances, and because of its strong hydrophobicity as the sensor surface, there is concern about nonspecific adsorption during measurement. The
[0046]
Specific examples of the compound represented by the general formula X′-R′-Y ′ include 8-Amino-1-octanethiol and Y ′ in which Y ′ is an amino group. 7-carboxy-1-heptanethiol in which is a carboxyl group.
[0047]
Double-stranded oligonucleotide arrays in the measuring method <br/> invention biomolecular interactions, the measurement of the interaction between the oligonucleotide and the biomolecule or assemblies thereof, can be suitably used. As a means for measuring the interaction, a surface plasmon resonance (SPR) method capable of label-free and real-time measurement is preferable. Further, in the SPR method, the SPR imaging method is preferable.
[0048]
Some biomolecules have a change in function and activity due to the label operation, and in particular, proteins are highly likely to change in structure or lose activity due to the label operation. Since the SPR method is an interaction analysis method that does not require labeling (labeling) a biomolecule, appropriate measurement can be performed while maintaining the function and activity of the biomolecule. In addition, the method enables real-time measurement, and it is possible to analyze not only the equilibrium state but also the binding and dissociation rates. Therefore, valuable information for knowing the functions of biomolecules can be obtained from these results. Obtainable.
[0049]
In the SPR imaging method, the entire array is irradiated with polarized parallel light, and the reflected light is photographed by a CCD camera. Therefore, the surface plasmon resonance angular displacement at a certain point of the array can be known from the change in reflected light intensity. Therefore, it is possible to measure or analyze the interaction between a double-stranded oligonucleotide array with a plurality of sequences immobilized on it and biomolecules in a label-free and real-time manner, particularly using an array with a plurality of biomolecules immobilized thereon. It can be suitably used for analysis of biomolecular interactions.
[0050]
The biomolecule that is the target of the interaction of the oligonucleotide is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids, proteins, peptides, and sugar chains. It can also be applied to an assembly of biomolecules such as heterodimers. Especially, this invention can be used suitably for the measurement of protein. In particular, among proteins, it can be suitably used for measurement of transcription factors known to interact with double-stranded DNA. The type of transcription factor is not particularly limited, and for example, NF1 family, Maf family, GATA family and the like can be applied. The Maf family is known to form not only homodimers but also heterodimers. By the method of the present invention, evaluation of differences in binding behavior by various combinations of heterodimers and mutation It is possible to analyze the interaction between a double-stranded DNA containing DNA and a transcription factor, and according to the present invention, various useful information relating to biological functions can be obtained.
[0051]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples and reference examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0052]
Example 1
After depositing 3 nm of chromium on a transparent glass substrate made of SF10 having a thickness of 1 mm and 18 mm × 18 mm, gold was deposited by 45 nm. The thickness of the deposition was monitored with a crystal oscillator. A substrate with gold deposited on the surface is immersed in a 1 mM ethanol solution of 8-Amino-1-Octanethiol, Hydrochloride (8-AOT, manufactured by Dojindo Laboratories) for 16 hours to form a self-organized surface of 8-AOT. It was. A heterobifunctional polyethylene glycol (NHS-PEG-MAL, manufactured by Sheawater Polymers) having a succinimide (NHS) group and a maleimide (MAL) group at the end of a molecular weight of 3,400 is phosphate buffer (20 mM phosphoric acid, 150 mM NaCl). , PH 7.2) at 10 mg / ml and reacted with 8-AOT on the gold surface for 2 hours. Since the amino group of 8-AOT and the NHS group of NHS-PEG-MAL reacted and the MAL group remained unreacted, a maleimide group could be introduced to the surface via PEG.
[0053]
The resulting surface was spotted after hybridizing two types of 5 ′ thiol-terminal DNA using a Hand spotter from Greiner bio-one. The DNA sequence is a Maf recognition sequence (MARE25) and a Maf non-recognition sequence (MARE23). The detailed sequence is shown in FIG. It is designed so that the target sequence is inserted from the 5 ′ thiol end through a thymine 15-base spacer.
[0054]
Prepare a solution in X5 SSC solution (75 mM sodium citrate, 750 mM NaCl, pH 7.0) so that the 5 ′ thiol-terminated DNA is 25 μM and its complementary DNA is 100 μM, and in a boiling bath for 5 minutes at 0 ° C. Quenched for 15 minutes and then incubated at 37 ° C. for 3 hours to hybridize the DNA. Hybridized double-stranded DNA (dsDNA) was spotted and reacted for 15 hours to immobilize dsDNA on the surface.
[0055]
The surface on which dsDNA was immobilized was washed with a phosphate buffer, and then set on an SPR imaging device (SPRImager: GWC Instruments), 10 mM Hepes, 300 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 , 1 mM EDTA, 100 μg / ml bovine serum albumin PH 7.9 transcription factor measurement buffer was passed through the flow cell.
[0056]
An image obtained by SPR imaging is shown in FIG. The oval portion on which the dsDNA is immobilized appears white due to the change in the refractive index. In this way, an array in which dsDNA is immobilized on the surface is formed.
[0057]
After confirming that the signal from the SPR was stabilized, the transcription factor MafG homodimer was dissolved in the above-mentioned transcription factor measurement buffer at a concentration of 1 μg / ml, and the cell was placed in the cell at a rate of 100 μl / min for 10 minutes. Further, a buffer containing no transcription factor was poured, and changes in SPR signals of binding and dissociation were observed.
[0058]
The observation was carried out at three points: the MARE25 and MARE23 immobilization sites and the portion where no DNA was immobilized (background site). A graph showing changes in the SPR signal is shown in FIG. MARE25 bonded MafG homodimer only sequence, MARE23, be observed that hardly bind to the background region, association rate constant 2.22 × 10 5 (M -1 s -1), dissociation rate constant 8 80 × 10 −4 (s −1 ) and a binding equilibrium constant of 2.52 × 10 8 (M −1 ) were obtained.
[0059]
Reference example 1
Similar to Example 1, a heterobifunctional hydrophilic polymer NHS-PEG- having a succinimide (NHS) group and a maleimide (MAL) group formed by forming a self-assembled surface of 8-AOT on a gold-deposited transparent substrate MAL was immobilized.
[0060]
Next, single-stranded DNAs of MARE25 and MARE23 sequences having a thiol at the 5 ′ end were dissolved in 1 mM phosphate buffer, spotted in an array, and allowed to react for 15 hours to be immobilized on the substrate.
[0061]
The surface on which the dsDNA had been immobilized was washed with a phosphate buffer, and then set on an SPR imaging device, and the flow cell was filled with a buffer solution for measuring a transcription factor having a salt concentration. Next, DNA complementary to MARE25 was injected at a concentration of 1 μM and allowed to stand for 20 minutes to hybridize MARE25. After washing, DNA complementary to MARE23 was injected at a concentration of 1 μM and left for 20 minutes to hybridize MARE23.
[0062]
The interaction of the MafG homodimer was observed in the same manner as in Example, but it was adsorbed to both MARE25 and MARE23, and the specificity of the transcription factor MafG could not be observed (FIG. 5). This is probably because the complementary double-stranded DNA array could not be formed because the complementary DNA of MARE25 was also bound to MARE23.
[0063]
【The invention's effect】
By using the double-stranded oligonucleotide array of the present invention, it is possible to appropriately analyze the interaction between the oligonucleotide and a biomolecule or an assembly thereof.
[0064]
In addition, according to the present invention, a double-stranded oligonucleotide suitable for observing biomolecular interactions can be efficiently and appropriately prepared.
[0065]
The present invention provides an excellent means highly useful in measuring the interaction between an oligonucleotide and a biomolecule or an assembly thereof.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a drawing showing the base sequence of MARE25.
FIG. 2 is a drawing showing the base sequence of MARE23.
FIG. 3 is a drawing showing an SPR image of a dsDNA array.
FIG. 4 is a drawing showing binding dissociation curves (Examples) of MafG homodimers.
FIG. 5 is a drawing showing a bond dissociation curve (reference example) of a MafG homodimer.
Claims (10)
前記アレイは、基板上に一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される二官能基型アルカン（ここでＸ’は金表面と結合する官能基、Ｙ’は第一オリゴヌクレオチドと結合する官能基を表す。Ｒ’は有機基を表し、炭素数が５以上１８以下である。）を密に充填して金表面に官能基が導入されており、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して、前記官能基が導入された表面に、ヘテロ二官能型ポリエチレングリコールを用いて間接的に結合していることを特徴とする方法。 An array in which a plurality of double-stranded oligonucleotides are immobilized on a transparent substrate having a thin gold layer on the surface, and the first single-stranded oligonucleotide and the second single-stranded oligonucleotide are entirely Alternatively, a double-stranded oligonucleotide is formed by partially complementary binding to form a double-stranded oligonucleotide, and only the first single-stranded oligonucleotide is bound on the substrate in the double-stranded oligonucleotide. A biomolecule interaction measurement method comprising a step of measuring an interaction between an oligonucleotide immobilized on a double-stranded oligonucleotide array and a biomolecule or an assembly thereof by a surface plasmon resonance imaging method using the array. ,
The array has a bifunctional alkane represented by the general formula X′—R′—Y ′ on a substrate (where X ′ is a functional group that binds to a gold surface, and Y ′ binds to a first oligonucleotide). R ′ represents an organic group and has a carbon number of 5 or more and 18 or less.) And the functional group is introduced on the gold surface, and the first single-stranded oligonucleotide is It has a functional group or a bonding group on the 5 ′ end or 3 ′ end side, and indirectly through the functional group or the bonding group using a heterobifunctional polyethylene glycol on the surface into which the functional group has been introduced. A method characterized by being bound to
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