JP4193986B2

JP4193986B2 - ガンマグルタミルシステインの生産方法

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Publication number: JP4193986B2
Application number: JP2003376001A
Authority: JP
Inventors: 和久宮本; 收正平田; 直城辻; 昌宏高木; 均宮坂
Original assignee: Kansai Electric Power Co Inc; Osaka University NUC
Current assignee: Kansai Electric Power Co Inc; University of Osaka NUC
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2023-11-05
Also published as: JP2005137235A

Description

本発明はグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素タンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。また、本発明はかかる遺伝子を挿入した組換えベクター、かかる遺伝子を導入した組換え生物、並びにかかる組換え生物を用いたγＥＣの効率的な生産方法に関する。

ガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）はアミノ酸の一種であるグルタミン酸（Ｅ）とシステイン（Ｃ）がガンマ結合したものであり、生活習慣病やアルツハイマー病の治療薬としての利用が期待されているチオール化合物の一つである。

しかしながら、γＥＣは分子内にガンマ結合を有するため、化学的に合成することが困難である。また、γＥＣは高等植物、酵母、真核藻類などの真核生物に広く存在する重金属抱合ペプチドであるファイトケラチン（ＰＣ）の生合成の反応中間体であるが、これらの生物の有するＰＣ合成酵素を用いると、反応中間体であるγＥＣは生産されるとほぼ同時に最終生成物であるＰＣに変換されるため、γＥＣ自体を大量に得ることは不可能である（非特許文献１）。

したがって、生活習慣病やアルツハイマー病の治療薬として有用なγＥＣを簡単に大量生産する方法は未だ知られていない。
Ｇｒｉｌｌ，Ｅ．，Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｓ．，Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，ａｎｄＺｅｎｋ，Ｍ．Ｈ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，６８３８−６８４２．

本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は生活習慣病やアルツハイマー病などの治療薬として有望視されるγＥＣを簡単に大量生産する方法を提供することである。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、原核藻類に属する藍藻の一種であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０のゲノム中にＰＣ合成酵素遺伝子に相同性の高い配列（ａｌｒ０９７５）が存在することを意外にも見出した。そして、この配列によりコードされるタンパク質の機能を調査したところ、このタンパク質はＰＣの生合成反応のうち、出発物質であるグルタチオンからγＥＣを生成させる反応のみを触媒することを見出し、遂に本発明を完成するに到った。

即ち、本発明の第１の態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とするタンパク質が提供される。

また、本発明の第２の態様によれば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とするタンパク質が提供される。

本発明の第３の態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とする遺伝子が提供される。

また、本発明の第４の態様によれば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有することを特徴とする遺伝子が提供される。

本発明の第５の態様によれば、本発明の第３又は第４の態様の遺伝子が挿入されていることを特徴とする組換えベクターが提供される。

本発明の第６の態様によれば、本発明の第３又は第４の態様の遺伝子が導入されていることを特徴とする組換え生物が提供される。本発明の第６の態様による組換え生物の好ましい実施態様においては、遺伝子の導入は本発明の第５の態様の組換えベクターを用いて行われており、組換え生物は大腸菌である。

本発明の第７の態様によれば、本発明の第３又は第４の態様の遺伝子が発現する条件下で本発明の第６の態様の組換え生物を培養し、これにより前記組換え生物の体内にガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を蓄積させ、そして前記組換え生物からガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を回収することを特徴とするガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）の生産方法が提供される。

本発明のタンパク質は本発明の遺伝子を常法に従い適当なホスト生物に導入して発現させ、そこからタンパク質を回収することにより得ることができる。ホスト生物としては組換えタンパク質を生産するのに好適な生物であればいかなる生物をも用いることができ、例えば大腸菌を用いることができる。

本発明の遺伝子（配列番号１）はかずさＤＮＡ研究所のゲノムプロジェクトによりゲノム解読された数種のシアノバクテリアのうち、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０のゲノム中の塩基配列ａｌｒ０９７５に相当する。上記ゲノムプロジェクトはゲノムの全塩基配列を解読することを目的とするものであり、解読された個々の塩基配列の機能までは明らかにしていない。本発明の遺伝子であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０の塩基配列ａｌｒ０９７５の機能（即ち、グルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としての機能）は本発明により初めて明らかにされたものである。なお、本発明の遺伝子の由来生物であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０はフランスのパスツール研究所からＰＣＣ７１２０のカタログ番号で一般に購入することができる。

本発明の遺伝子はシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０の塩基配列ａｌｒ０９７５に相当する配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子をも包含する。また、本発明の遺伝子はシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０の塩基配列ａｌｒ０９７５がコードするアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子のみならず配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子をも包含する。これは遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質を生ずることが多いからである。
これらのいわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は、対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっており、かつデータベースに登録されている場合、かかるデータベースを用いて配列検索することにより得ることができるであろう。
実際、本発明者がＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を用いて配列検索したところ、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ，ＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍｅｒｙｔｈｒａｅｕｍＩＭＳ１０１，及びＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｎｕｓＭＩＴ９３１３においても本発明の遺伝子に類似する遺伝子が存在することが見出された（図６参照）。図６に示す通り、ａｌｒ０９７５タンパク質とこれらの三つの遺伝子によりコードされる推定されるタンパク質は真核生物のＰＣ合成酵素のＮ末端領域と相同性が高く、かつ五つの保存的システインのうち一つしか有していないという共通の性質（後ほど詳細に説明する）を有する。従ってこれらの三つの遺伝子もグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が極めて高く、本発明の遺伝子に包含されうるものである。
対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっていない場合、いわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は以下の手順により得ることができるであろう。

即ち、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子は、配列番号１の塩基配列又はその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。

ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。得られた遺伝子がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。

また、配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いてＤＮＡ塩基配列を置換することにより得ることができる。得られた遺伝子がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。

本発明のタンパク質はグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する。これはグルタチオンからのファイトケラチンの生合成反応の前半部分のみを触媒する酵素に相当する。

ファイトケラチン（ＰＣ）は高等生物、酵母、藻類などの真核生物に広く存在する重金属抱合ペプチドであり、重金属と強く結合することによってこれを無毒化し、細胞内に蓄積する働きを有する。ＰＣの構造は（γＥＣ）_ｎＧ（Ｅ＝グルタミン酸、Ｃ＝システイン、Ｇ＝グリシン、ｎ＝２〜１１）で表され、γＥＣを基本骨格とし、末端にグリシンが結合したペプチドである。

高等植物等においてＰＣはグルタチオン（γＥＣＧ）を基質としてＰＣ合成酵素が触媒する以下の二段階の酵素反応により生合成される。
（１）γＥＣＧ→γＥＣ＋Ｇ
（２）（γＥＣ）_ｎＧ＋γＥＣ→（γＥＣ）_ｎ＋１Ｇ
一段階目の反応は基質であるグルタチオンからグリシンを切り離してγＥＣを生成する反応である。このγＥＣを二段階目の反応においてアクセプターであるＰＣ_ｎと結合させることによってＰＣ_ｎ＋１が合成される。この二つの反応を繰り返すことにより、重合度の高いＰＣが生合成される。

高等植物等において従来分離されているＰＣ合成酵素はこのように一つの酵素タンパク質が二つの反応を触媒するため、一段階目の反応で生成したγＥＣは直ちに二段階目の反応でＰＣ_ｎと結合させるために用いられてしまう。従って、高等植物等において分離されているＰＣ合成酵素を用いると、反応中間体であるγＥＣを単独で取り出すことができない。

これに対し、本発明の酵素タンパク質は以下の実施例で示す通り、ＰＣ生合成反応の二段階の反応のうち、一段階目の反応を触媒する活性は高いが二段階目の反応を触媒する活性は極めて低く、実質的に一段階目の反応のみを触媒する。従って、本発明の酵素タンパク質を用いると、一段階目の反応で生成されるγＥＣはＰＣ合成に用いられることなく蓄積し、本来ＰＣ生合成反応の中間体であるγＥＣを単独で取り出すことができる。

ＰＣ生合成反応の一段階目の反応のみを触媒するという本発明の酵素タンパク質の活性は高等植物等のＰＣ合成酵素タンパク質の活性からは全く予想もしえないことである。そもそも、これまでＰＣ合成酵素は真核生物にのみ存在すると考えられており、原核生物であるシアノバクテリアにＰＣ合成酵素遺伝子と相同性の高い配列が存在するとは予想もされていなかった。また、真核生物のＰＣ合成酵素はいずれも一つの酵素がＰＣ合成の二つの反応を触媒するものであり、本発明の酵素のようにＰＣ合成の一段階目の反応のみを触媒するものは未だ発見されていない。

アミノ配列を比較すると、以下の実施例及び図１に示す通り、本発明の酵素タンパク質はＰＣ合成酵素ファミリーの保存領域であるＮ末端領域とは相同性が高いが、ＰＣ合成酵素ファミリーの可変領域であるＣ末端領域に相当する部分は本発明の酵素タンパク質では完全に欠損している（図１中、Ａｌｒ０９７５は本発明の酵素タンパク質のアミノ酸配列であり、ＡｔＰＣＳ１，ＧｍＰＣＳ，ＳｐＰＣＳ及びＣｅＰＣＳはそれぞれシロイヌナズナ、ダイズ、分裂酵母及び線虫のＰＣ合成酵素のアミノ酸配列である）。従って、本発明の酵素タンパク質はＰＣ合成酵素ファミリーとはアミノ酸レベルの相同性こそ３６％と高いがタンパク質の高次構造においてかなり異なるものと考えられる。

また、反応の依存性を比較すると、以下の実施例で示す通り、高等植物等のＰＣ合成酵素は重金属依存性であり、ＰＣ合成酵素の活性化に重金属の存在が不可欠であるのに対し、本発明の酵素タンパク質は重金属非依存性であり、重金属がなくても活性化される。これは酵素タンパク質中のシステイン残基の数の相違によるものであると考えられる。即ち、図１からわかる通り、ＰＣ合成酵素ファミリーはＮ末端領域に五つの保存的システイン（Ｃ）を有するが、本発明の酵素タンパク質はこれら五つの保存的システインのうち一つしか有していない。タンパク質と重金属との相互作用はタンパク質中のシステイン残基を介して行われる。従って、五つの保存的システインのうち一つしか有さない本発明の酵素タンパク質は重金属との相互作用が極めて弱く、このため本発明の酵素タンパク質は活性化に重金属を必要としないものと考えられる。

以上、本発明の酵素タンパク質はその触媒活性、高次構造、重金属依存性の有無において従来公知のＰＣ合成酵素ファミリーとは全く異なる新規のタンパク質である。特に、本発明の酵素タンパク質が重金属非依存性であることは本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え生物を用いてγＥＣを生産する際に生物にとって有毒な重金属を培地に添加する必要がないことを意味するので、極めて有利である。

本発明の酵素タンパク質を用いてγＥＣを生産するには本発明の酵素タンパク質と基質であるグルタチオンをｉｎｖｉｔｒｏで反応させて化学的に生産する方法も考えられるが、基質として用いるグルタチオン自体が高価であるため、それほど実用的でない。それよりも本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え生物によりｉｎｖｉｖｏでｄｅｎｏｖｏ合成する方法の方がグルチオンを基質として培地に添加する必要がなく、実用的である。

γＥＣを生産させるために本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入する生物としては取扱いが容易である限りいかなる生物をも対象とすることができるが、例えば大腸菌を対象とすることができる。本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子の生物への導入は生物の種類に応じた常法に従って行えばよい。先に挙げた大腸菌の場合、先ず遺伝子をプラスミド等の適当な組換えベクターに挿入し、次にこの組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換すればよい。なお、生物に導入する遺伝子には所望によりプロモーター、ターミネーター等の制御配列を付加することはいうまでもない。また、遺伝子を導入する生物で使用されている遺伝暗号に応じて本発明の酵素タンパク質が適切に発現されるように導入する遺伝子を改変することもできる。

このようにして調製した組換え生物を生物に導入した本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子が発現する条件下で培養すれば前記組換え生物の体内にγＥＣが蓄積するので、そこからγＥＣを回収することによりγＥＣをｉｎｖｉｖｏで生産することができる。この場合、本発明の酵素タンパク質の基質であるグルタチオンは培地中のＳＯ_４ ^２−等から生物により合成されるので、高価なグルタチオンを基質として培地に添加する必要はない。

以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。

材料
使用株
Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０（ＴｈｅＰａｓｔｅｕｒＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎより分与）
Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ＮＯＶＡＧＥＮより購入）

培養方法
Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０は以下に示す条件で培養を行った。
培地：ＢＧ１１培地
光照射条件：白色蛍光灯連続照射（１０Ｗ／ｍ^２）
通気条件：１％ＣＯ_２連続通気（３０ｍｌ／分）
培養温度：３０℃

実施例１：ａｌｒ０９７５タンパク質の配列特性
最近、かずさＤＮＡ研究所のゲノムプロジェクトによりシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０の全ゲノム配列が決定され、公表された。本発明者はこのＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０の配列データベースを検索することにより、真核生物において見出されるＰＣ合成酵素の遺伝子と類似する予想される遺伝子ａｌｒ０９７５（配列表の配列番号１；ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＰ００３５８４）の存在を見出した。この遺伝子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＰＣＳ１遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０８５２３０）に対してアミノ酸レベルで３６％の相同性を有する仮想的なタンパク質をコードする。ａｌｒ０９７５タンパク質は２４２個のアミノ酸残基からなる（配列表の配列番号２）。

ａｌｒ０９７５の配列を真核生物のＰＣ合成酵素ファミリーの配列とアラインメントした結果を図１に示す。図１中、Ａｌｒ０９７５はａｌｒ０９７５のアミノ酸配列であり、ＡｔＰＣＳ１，ＧｍＰＣＳ，ＳｐＰＣＳ及びＣｅＰＣＳはそれぞれシロイヌナズナ、ダイズ、分裂酵母及び線虫のＰＣ合成酵素のアミノ酸配列である。図１からわかる通り、ａｌｒ０９７５のアミノ酸配列はＰＣ合成酵素のＮ末端の保存領域と相同性が高いが、Ｃ末端の可変領域は欠損している。このことはシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．にはＰＣ合成酵素様タンパク質が存在している可能性を示す。ＰＣ合成酵素は今まで原核生物で同定されたことがないので、この発見は実に驚くべきことである。

実施例２：Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．の重金属感受性及びＮｏｓｔｏｃｓｐ．におけるＰＣ生産
ａｌｒ０９７５遺伝子をゲノム中に有するＮｏｓｔｏｃ細胞が重金属によりＰＣを誘導生産するかどうか調べるため、Ｎｏｓｔｏｃ細胞を様々な濃度のＣｄＣｌ_２及びＺｎＣｌ_２で処理して細胞中のＰＣの検出を試みた。

重金属の不在下で２４時間培養したＮｏｓｔｏｃ細胞（コントロール）、５μＭＣｄＣｌ_２の存在下で２４時間培養したＮｏｓｔｏｃ細胞及び１０μＭＺｎＣｌ_２の存在下で２４時間培養したＮｏｓｔｏｃ細胞のそれぞれについてＰＣを含むチオール化合物の含有量を以下の手順でＨＰＬＣシステムを用いて分析した。なお、このシステムはγＥＣ、ＧＳＨ及びＰＣ_ｎ（ｎ＝２〜５）の分離及び測定を可能にするものである。

チオール化合物測定方法
サンプルの調製：藻細胞を遠心分離（１，５００×ｇ，１０分，４℃）により回収し、３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で再懸濁した。細胞懸濁液を凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｏｎｅ１Ｌ，Ｌａｂｃｏｎｃｏ）を用いて２４時間凍結乾燥後、１．０ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬＮａＢＨ_４を含んだ０．５ＮＮａＯＨ溶液に懸濁し、超音波破砕した（ｏｕｔｐｕｔ：４．５，ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ：５０％，４分）。遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分，４℃）により得た上清を０．８ｍＬ回収し、塩酸によりタンパク質除去を行った。タンパク質除去は回収したサンプル０．８ｍＬに０．１６ｍＬの３．６ＮＨＣｌを加え、ボルテックスにより撹拌し、氷上で１５分間放置した後、遠心（１０，０００×ｇ，１０分，４℃）により上清を回収することにより行った。

測定方法：上記の操作によって得たサンプルを０．０２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び５ｍＭのオクタン硫酸で平衡化した逆相カラム（ＨｉｂａｒＨＰＬＣ−ｃａｒｔｒｉｄｇｅ２５０−４ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ−１８（５μＭ））を用いて、グラジエントプログラムによりアセトニトリルの濃度を上昇させて流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで溶出した後、３ｍのサンプルループ中で流速１．５ｍＬ／分でＥｌｌｍａｎ試薬と混合し、５０℃で反応させ、４１２ｎｍでの吸光度を測定した。

結果を図２Ａに示す。図２Ａ中、ａは重金属の不在下で培養したコントロールの細胞のＨＰＬＣプロファイルであり、ｂは５μＭＣｄＣｌ_２の存在下で培養した細胞のＨＰＬＣプロファイル、ｃは１０μＭＺｎＣｌ_２の存在下で培養した細胞のＨＰＬＣプロファイルである。図２Ａからわかる通り、いかなる濃度のＣｄ^２＋又はＺｎ^２＋の存在下で培養されたＮｏｓｔｏｃ細胞においてもＰＣの蓄積は全く観測されなかった。このことはＮｏｓｔｏｃ細胞は高等植物等とは異なり、たとえ重金属の存在下であってもＰＣを合成しないということを示す。ＧＳＨとγＥＣのレベルは両方とも重金属処理により影響を受けなかった。

実施例３：Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．におけるａｌｒ０９７５のノーザン解析
Ｎｏｓｔｏｃ細胞におけるａｌｒ０９７５遺伝子の発現を測定するため、ａｌｒ０９７５ＤＮＡフラグメントをプローブとして以下の手順でノーザン解析を行った。

ノーザン解析
５μＭＣｄＣｌ_２もしくは１０μＭＺｎＣｌ_２に１２時間さらしたＮｏｓｔｏｃ細胞を遠心分離し、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳｒｅａｇｅｎｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡＵＳＡ）とガラスビーズによるボルテックスを用いた撹拌によって抽出した。また、ネガティブコントロールとして重金属で処理していないＮｏｓｔｏｃ細胞から同様に全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ（各２０μｇ）をＡｍｅｒｓｈａｍのｓｔｒｕｃｔｉｏｎｍａｎｕａｌｓに従い、電気泳動による分離、ナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪＵＳＡ）への転写、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブとしては、Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０より抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーを用いて行ったＰＣＲによる増幅産物を用いた。
ＮｓＦ２（５’−ＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣ−３’：配列番号３）
ＮｓＲ２（５’−ＣＴＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＡ−３’：配列番号４）

結果を図２Ｂに示す。図２Ｂ中、レーン１は重金属処理をしなかったネガティブコントロールの細胞であり、レーン２は５μＭＣｄＣｌ_２で処理した細胞、レーン３は１０μＭＺｎＣｌ_２で処理した細胞、レーン４はプローブを変性処理したものをサンプルとして用いたポジティブコントロールである。図２Ｂからわかる通り、非処理のＮｏｓｔｏｃ細胞から得たＲＮＡ（レーン１）及び重金属処理したＮｏｓｔｏｃ細胞から得たＲＮＡ（レーン２，３）の両方においてプローブとのハイブリダイゼーションは検出されなかった。このことは構成的に発現される高等植物等のＰＣ合成酵素遺伝子とは異なり、ａｌｒ０９７５はＮｏｓｔｏｃ細胞中で構成的に発現されておらず、重金属の存在下でも誘導的に発現されないことを示す。実施例２及び３の結果からＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０におけるａｌｒ０９７５遺伝子は偽遺伝子であり、Ｎｏｓｔｏｃ細胞においてＰＣ合成酵素として機能していないと考えられる。

実施例４：組換えａｌｒ０９７５タンパク質の機能解析
（１）ａｌｒ０９７５遺伝子のクローニング及び組換えａｌｒ０９７５タンパク質の精製
ＰＣ合成酵素としてのａｌｒ０９７５タンパク質の機能を調べるため、以下の手順でａｌｒ０９７５遺伝子をクローニングし、組換えａｌｒ０９７５タンパク質を精製した。

ａｌｒ０９７５遺伝子のクローニング
クローニングおよび発現ベクターの構築：Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下に示すプライマーを用いてａｌｒ０９７５遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
ＮｓＦ１（５’−ＣＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣ−３’：配列番号５）
ＮｓＲ１（５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧ−３’：配列番号６）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いて処理し、これをｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎより購入）に挿入し（ｐＥＴ２５ｂ−ａｌｒ０９７５）、シークエンス解析を行い、ａｌｒ０９７５配列であることを確認した。得られたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。

組換えａｌｒ０９７５タンパク質の精製
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢ培地にて液体培養し、対数増殖期に０．１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、タンパク質合成を誘導した。ＩＰＴＧ処理後、６時間培養した細胞を遠心分離により回収し、バッファー（１ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０））に懸濁した。細胞懸濁液を超音波破砕にかけ、可溶性画分を抽出し、これを１ｍＭＥＤＴＡと１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を用いて、一晩かけて透析を行った。その後、サンプルをＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍｘ１５ｃｍ；Ｔｏｓｈｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に供し、素通り画分を回収した。これを１ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、一晩かけて透析を行った。得られたタンパク質画分をＡＥＫＴＡタンパク質精製システムを備え付けたＨｉＴｒａｐＳＰｃｏｌｕｍｎ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に供し、精製を行った。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）中において０から１０ｍＭＮａＣｌのグラジエントプログラムによって精製タンパク質を得た。

得られた精製組換えタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりその純度及び分子量を確認した。その結果を図３に示す。図３中、レーン１はＬＭＷマーカーであり、レーン２はａｌｒ０９７５タンパク質である。図３からわかる通り、レーン２において一本の明確なバンドが得られた。このバンドの分子量は約２６ｋＤａであり、ａｌｒ０９７５によってコードされるタンパク質の予測された分子量に該当する。

（２）組換えａｌｒ０９７５タンパク質のＩｎｖｉｔｒｏでのＰＣ合成酵素活性の調査
組換えａｌｒ０９７５タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏでのＰＣ合成酵素活性は以下の手順で調査した。

ＰＣ合成酵素活性
（１）の操作によって得られた組換えタンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。次に、２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭグルタチオン、０．５ｍＭＣｄＣｌ_２、２μｇ組換えａｌｒ０９７５タンパク質を含む酵素反応溶液（１２５μｌ）を調製し、３５℃で６０分間反応させ、１２５μＬの３．６ＮＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られたサンプルについて実施例２で述べたＨＰＬＣ法により、生成物を分離した。

結果を図４に示す。なお、図４中の各酵素反応生成物の同定はＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた質量分析により行った（マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を含む０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋Ｈ_２Ｏ（１：１）溶液を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＡＳＳのネガティブチャージイオンスペクトルを得た）。図４中、Ａは反応前のサンプルのＨＰＬＣプロファイルであり、Ｂは３５℃で６０分間反応させた後のサンプルのＨＰＬＣプロファイルである。図４からわかる通り、２μｇの精製組換えａｌｒ０９７５タンパク質の存在下、１．２５μｍｏｌのグルタチオン（ＧＳＨ）は６０分でほぼ完全にγＥＣに変換された。なお、ＰＣ_２及びγＥＣ_２の生成も検出されたがこれらの濃度は極めて小さく、変換されたγＥＣの約４．９％に匹敵するのみであった。これらの結果は、ａｌｒ０９７５によってコードされるタンパク質はｉｎｖｉｔｒｏでＰＣ合成酵素として作用するが、ＰＣ合成の二段階目の反応を触媒する活性は一段階目の反応を触媒する活性よりもずっと小さいことを示す。更に、驚くべきことに高等植物等のＰＣ合成酵素は活性化に重金属の存在を必要とするのに対し、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０のａｌｒ０９７５タンパク質は重金属の不在下でもγＥＣ（及びＰＣ_２）を精製する活性を示した（ｉｎｖｉｔｒｏでのデータは示さず。ｉｎｖｉｖｏでのデータについては次の実施例５参照）。更に、β−メルカプトエタノールとＣｄ^２＋の両者の存在下でのγＥＣ生成と比較して７４％のγＥＣが両者の不在下でも生成された（データは示さず）。

実施例５：組換えａｌｒ０９７５タンパク質を用いたｉｎｖｉｖｏでのγＥＣ生産
組換えａｌｒ０９７５タンパク質を用いたｉｎｖｉｖｏでのγＥＣ生産を確認するため、実施例４の（１）で作成した組換え大腸菌（ａｌｒ０９７５遺伝子で形質転換された大腸菌）を１００μＭＣｄＣｌ_２の存在下及び不在下で８．５時間培養し、実施例２と同様の手順でチオール化合物を測定した。コントロールとしてシロイヌナズナのＰＣ合成酵素遺伝子ＡｔＰＣＳ１で形質転換した大腸菌を１００μＭＣｄＣｌ_２の存在下及び不在下で８．５時間培養し、同様にチオール化合物を測定した。また、ブランクとしてａｌｒ０９７５遺伝子を挿入していない空のｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターを導入した大腸菌を１００μＭＣｄＣｌ_２の存在下及び不在下で８．５時間培養し、同様にチオール化合物を測定した。

結果を図５に示す。図５中、ＡはコントロールのＨＰＬＣプロファイルであり、Ｂはａｌｒ０９７５遺伝子で形質転換された大腸菌のＨＰＬＣプロファイルであり、ＣはブランクのＨＰＬＣプロファイルである。Ａ，Ｂ，Ｃとも上段はＣｄＣｌ_２不在下でのＨＰＬＣプロファイルであり、下段はＣｄＣｌ_２の存在下でのＨＰＬＣプロファイルである。また、ＨＰＬＣプロファイル中の数字１はＧＳＨであり、１′はγＥＣ、２はＰＣ_２、３はＰＣ_３、４はＰＣ_４、５はＰＣ_５を意味する。図５Ａ，Ｂ，Ｃの下段同士の比較からわかる通り、空ベクターを導入した細胞（Ｃ）ではＧＳＨはγＥＣ等に変換されることがない。一方、シロイヌナズナのＰＣ合成酵素遺伝子ＡｔＰＣＳ１を発現する細胞（Ａ）ではＧＳＨは様々な重合度のＰＣに変換され、反応中間体であるγＥＣは極く少量しか存在しない。これに対し、ａｌｒ０９７５を発現する細胞（Ｂ）ではＧＳＨはγＥＣに変換されるが、γＥＣからのＰＣ合成はほとんど進行せず、細胞中にγＥＣが高レベルで蓄積される（図５Ｂの下段（及び上段）においては１′のピークは途中で切れており、図に示した範囲より遙かに上にあることに注意されたい）。また、図５Ａ，Ｂそれぞれにおいて上段と下段を比較することにより、シロイヌナズナのＰＣ合成酵素遺伝子ＡｔＰＣＳ１を発現する細胞ではＣｄ^２＋の不在下ではＰＣ合成が起こらないのに対し、ａｌｒ０９７５を発現する細胞ではＣｄ^２＋の不在下でもＣｄ^２＋の存在下と同様にＧＳＨはγＥＣに変換され、細胞中にγＥＣが高レベルで蓄積されることがわかる。

本発明によればグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素タンパク質を提供することができる。かかる酵素タンパク質を利用すれば生活習慣病やアルツハイマー病などの治療薬として有望視されるγＥＣを簡単かつ大量に生産することが可能となる。

ａｌｒ０９７５の配列を真核生物のＰＣ合成酵素ファミリーの配列とアラインメントした結果を示す。図２Ａは様々な条件下で培養したＮｏｓｔｏｃ細胞のＨＰＬＣプロファイルを示す。図２Ｂは様々な条件下で培養したＮｏｓｔｏｃ細胞のノーザン解析の結果を示す。精製組換えａｌｒ０９７５タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。組換えａｌｒ０９７５タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏでのＰＣ合成酵素活性を示すＨＰＬＣプロファイルである。組換えａｌｒ０９７５タンパク質を用いたｉｎｖｉｖｏでのγＥＣ生産を示すＨＰＬＣプロファイルである。ａｌｒ０９７５の配列と他のシアノバクテリアからの３種の遺伝子の配列とのアラインメント結果を示す。

配列番号３〜６はプライマーの配列である。

Claims

（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子、又は（ｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質が、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子、が導入されている組換え生物を、前記遺伝子が発現する条件下で培養し、これにより前記組換え生物の体内にガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を蓄積させ、そして前記組換え生物からガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を回収することを特徴とするガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）の生産方法。