JP4196232B2

JP4196232B2 - Polypeptide purification method and kit reagent

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Publication number: JP4196232B2
Application number: JP26161998A
Authority: JP
Inventors: 北林　　雅夫; 石田　　由和; 小松原　　秀介; 川上　　文清; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1998-09-16
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2008-12-17
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: JP2000083694A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明のポリペプチドの精製方法は、目的ポリペプチドを産生している細胞の破砕液にそのまま特定のリガンドが固定化された磁性担体を添加して該融合蛋白質を吸着させること、あるいは細胞を破砕する工程と目的蛋白質を磁性担体へ吸着させる工程を同時に行う該ポリペプチドの精製方法に関する。より具体的な態様としては、該目的ポリペプチドは、例えば遺伝子組換え技術により特定のリガンドと親和性を持つポリペプチドと生物学的に活性なポリペプチドとの融合蛋白質の形で産生され、該融合蛋白質の宿主細胞の破砕液をそのまま該融合蛋白質の該磁性担体との吸着へ供する精製方法、および細胞破砕と磁性担体への吸着を同時に行う該融合蛋白質の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日では、生物学の資料中の特定蛋白質を他の成分から分離するための多種多様な方法、物質、及びアプローチが存在する。一般的なアプローチの一例としては、担体に対する蛋白質の非特異的親和が挙げられる。例えば、蛋白質は分子の電荷に基づき、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。すなわち、蛋白質混合物が反対の電荷のクロマトグラフィーマトリックスに添加され、可逆的な静電気的相互作用により様々な蛋白質がマトリックスに結合する。該マトリックスに結合した蛋白質はイオン強度を高めることにより、もしくは溶出緩衝液のｐＨを変化させることによって、結合の弱いものから強いものの順に溶出される。
【０００３】
別の一般的なアプローチとしては、分離手段として蛋白質の物理的特性を利用するものが挙げられる。例えば、ゲル濾過を用いて蛋白質の大きさに基づき蛋白質を分離することができる。この方法の場合、所定の大きさの孔を有するクロマトグラフィーのマトリックスを詰めたゲル濾過カラムに蛋白質混合物を添加する。その後、蛋白質は、通常緩衝液を用いて溶出され、個々のクロマトグラフィーフラクションとして収集されて分析される。
【０００４】
第３の一般的なアプローチとしては、精製試薬に対する蛋白質の特異的親和性を利用するものがある。例えば、その蛋白質に対して特異的な抗体を用いて蛋白質を精製することができる。あるいは、逆に抗体をそれに特異的な抗原によって精製してもよい。通常、抗体もしくは抗原はカラム基材に結合され、その特定の抗原もしくは抗体を含んだ溶液がそのカラムに添加されて、免疫複合体を形成することができる。続いて、結合された免疫複合体の要素は、例えば非常にイオン強度が高い又はｐＨの高いもしくは低い緩衝液にさらすことにより、この抗原抗体複合体を不安定化させて溶出される。
【０００５】
上記のように、アフィニティークロマトグラフィーは、精製したい蛋白質と固相に固定化されたリガンドとの間の特異的な相互作用を利用する、非常に効果的な蛋白質の精製方法である。通常、固相リガンドはいくつかの固有の科学的特性を有し、それにより分離対象の蛋白質を選択的に吸着する。他の混入蛋白質（contaminant protein ）は、固相リガンドに結合しないか、もしくは適切な溶液で固相リガンドを洗浄することで除去される。
【０００６】
遺伝子技術による混成遺伝子の調製の可能性は、組み換え蛋白質の製造に当たり新たな道を開いた。所望の蛋白質をコードする遺伝子配列とリガンドに対して高い親和性を有する蛋白質フラグメント（親和性ペプチド）をコードする遺伝子配列とを結合することにより、親和性ペプチドを使用する一工程で所望の組み換え蛋白質を融合蛋白質の形態において精製することが可能である。部位を制限した変異により、親和性ペプチドと所望の組み換え蛋白質との結合点に特定の化学的または酵素的な開裂部位を導入することも可能であり、その結果融合蛋白質を適当な親和性樹脂により精製した後に、所望の組み換え蛋白質を化学的または酵素的開裂により回収することができる。
【０００７】
例えば、特許第２６８６０９０号公報には、遺伝子組み換え蛋白質として目的蛋白質のＮ末端あるいはＣ末端に６つのヒスチジン残基（以下、６×His と表す）を連結して、これに特異的なＮｉリガンドによりアフィニティー精製する方法が記されている。しかしながら、この方法では、親和性ペプチドとリガンドとの特異性が低く、高純度に精製できないことがある。
【０００８】
また、クロストリジウム・ステルコラリウム(Clostridium stercorarium)から得られるキシラナーゼＡのセルロース結合性領域（以下、ＣＢＤと示す）を使用して、目的蛋白質をこのＣＢＤの融合蛋白質として産生させ、アフィニティー精製する方法が、J.Ferment. Bioeng.第８１巻, 第５５３〜５５６頁（１９９６年）に報告されている。しかしながら、この方法は、ＣＢＤが大きく目的蛋白質の特性に影響を及ぼすことがある。
【０００９】
上記以外にも斯かる精製方法は、例えば、Science 第１９８巻，第１０５６〜１０６３頁（１９７７年）(Itakuraらによる）、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.第８０巻，第６８４８〜６８５２頁（１９８３年）(Germinoらによる）、Nucleic Acids Res.第１３巻，第１１５１〜１１６２頁（１９８５年）（Nilsson らによる）、ならびにＧｅｎｅ第３２巻，第３２１〜３２７頁（１９８４年）（Smith らによる）により報告されている。しかしながら、これらの方法においても、ＣＢＤと同様で、親和性ペプチド領域が大きく目的蛋白質の特性に影響を及ぼすことがある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、融合蛋白質を利用したアフィニティークロマトグラフィーは非常に優れた精製方法であるが、主として親水性である可溶性蛋白質の精製に用いられ、比較的疎水性が強い蛋白質では収率が低くなることがある。そこで、疎水性の強い融合蛋白質においても高い収率が得られるような精製方法が切望されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討した結果、細胞破砕懸濁液にそのまま磁性担体を添加して目的ポリペプチドを吸着させることにより、比較的疎水性の強い蛋白質においても、該ポリペプチドが細胞破砕片と非特異的に吸着してロスとなることもなく固定化リガンドとの高い親和力で目的融合蛋白質を吸着することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）目的とするポリペプチドを産生する細胞から該ポリペプチドを精製する方法において、該細胞を破砕した溶液から破砕片を取り除くことなくそのまま該ポリペプチドとの親和性を有するリガンドが結合された磁性担体に該ポリペプチドを吸着させた後、該ポリペプチドを回収することを特徴とするポリペプチドの精製方法。
（２）細胞を破砕する工程とポリペプチドとの親和性を有するリガンドが結合された磁性担体にポリペプチドを吸着させる工程とを同時に行う（１）の精製方法。
（３）ポリペプチドが融合蛋白質である（１）または（２）の精製方法。
（４）ポリペプチドが、リガンドとの親和性を有するポリペプチド領域が該ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシ末端アミノ酸に直接的または間接的に結合してなる融合蛋白質である（１）〜（３）のいずれかの精製方法。
（５）リガンドがニッケルイオンである（１）〜（４）のいずれかの精製方法。
（６）磁性担体が磁性化アガロース担体もしくは磁性化セルロース担体である（１）〜（５）のいずれかの精製方法。
（７）ポリペプチドが、セルロースとの親和性を有するポリペプチド領域が該ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシ末端アミノ酸に直接的または間接的に結合してなる融合蛋白質である（１）〜（３）のいずれかの精製方法。
（８）磁性化セルロース担体もしくはセルロースを結合せしめた磁性担体を用いる（７）の精製方法。
（９）ポリペプチドを産生する細胞が微生物である（１）〜（８）のいずれかの精製方法。
（１０）ポリペプチドを産生する細胞がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である（１）〜（８）のいずれかの精製方法。
（１１）ポリペプチドを産生する細胞を超音波により破砕する（１）〜（１０）のいずれかの精製方法。
（１２）ポリペプチドを産生する細胞を酵素により破砕する（１）〜（１０）のいずれかの精製方法。
（１３）酵素がリゾチームもしくはβ−１，３−グルカンラミナリペンタオヒドロラーゼである（１２）の精製方法。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかの方法で精製して得られたポリペプチドを選択的開裂により除去することを特徴とするポリペプチドの精製方法。
（１５）（１）〜（１３）のいずれかの方法で精製して得られたポリペプチドの選択的開裂にプロテアーゼを用いる（１２）の精製方法。
（１６）プロテアーゼがトロンビン、Factor Xa 、エンテロキナーゼよりなる群から選ばれた少なくとも１種である（１４）または（１５）の精製方法。
（１７）目的とするポリペプチドに結合するリガンドを保有した磁性担体、細胞破砕・吸着液、不要物の除去に用いられる洗浄液、該目的とするポリペプチドを担体から分離するために用いられる溶出液から構成されることを特徴とする（１）〜（１６）のいずれかの精製方法に使用されるキット試薬。
（１８）細胞破砕・吸着液および洗浄液のうちの少なくとも一方のｐＨが６〜８である（１７）のキット試薬。
（１９）細胞破砕・吸着液および洗浄液が同一の組成である請求項（１７）または（１８）のキット試薬。
（２０）溶出液中に目的とするポリペプチドの磁性担体への特異吸着を拮抗阻害する物質を添加されている（１７）〜（１９）のいずれかのキット試薬。
（２１）目的とするポリペプチドの磁性担体への特異吸着を拮抗阻害する物質がイミダゾールである（２０）のキット試薬。
（２２）目的とするポリペプチドの磁性担体への特異吸着を拮抗阻害する物質がセルビオースである（２０）のキット試薬。
（２３）細胞破砕・吸着液、洗浄液および溶出液中にアルカリ金属塩が含有される（１７）〜（２２）のいずれかのキット試薬。
（２４）アルカリ金属塩がＮａＣｌもしくはＫＣｌである（２３）のキット試薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明におけるポリペプチドの精製方法は、該ポリペプチドを産生する細胞を破砕した溶液から破砕片を取り除くことなくそのまま該ポリペプチドとの親和性を有するリガンドが結合された磁性担体に該ポリペプチドを吸着させた後、該ポリペプチドを回収することを特徴とする。この際、細胞を破砕する工程とポリペプチドとの親和性を有するリガンドが結合された磁性担体にポリペプチドを吸着させる工程とを同時に行うことが破砕から吸着への時間的なズレをなくす点から好ましい。また、破砕と吸着を同時に行うと、精製に要する操作時間を短縮することができる。
【００１４】
通常、非磁性担体を用いてバッチ式で例えば融合蛋白質を精製する場合、担体は遠心分離操作により固液分離を行う。この分離方法は重力を利用したものであり、吸着の前に必ず細胞破砕片を除去する必要がある。もし、細胞破砕液をそのまま使用した場合は、二度と非磁性担体と細胞破砕片を分離することができなくなる。
【００１５】
しかしながら、磁性担体を使用した場合、磁性担体のみ磁力により分離することができる。また、細胞破砕と担体への吸着を同時に行なうことも可能となる。斯かる精製方法は従来の非磁性担体を使用した方法と比べて破砕細胞片を遠心分離して除去する工程が必要なく、精製操作時間も短縮できる。
【００１６】
本発明の精製方法は、上記ポリペプチドが融合蛋白質である場合に特に有用であり、該融合蛋白質は、リガンドとの親和性を有するポリペプチド領域（以下、親和性ペプチドという）が該ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシ末端アミノ酸に直接的または間接的に結合してなる融合蛋白質が好ましい。該融合蛋白質を得る方法は特に限定されないが、遺伝子組換え技術により微生物により生産するのが好ましい。
【００１７】
上記融合蛋白質は、ポリペプチドに直接的または間接的に結合され得る。単一の親和性ペプチドを用いる場合には、同親和性ペプチドは該ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸またはカルボキシ末端アミノ酸のいずれかに結合され得る。２個の親和性ペプチドを用いる場合には、それらの１個はポリペプチドのアミノ末端アミノ酸に結合され、他方はポリペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に結合される。
【００１８】
間接的結合の場合には、該親和性ペプチドは適当な選択的開裂部位を含み、それを介して、それらは所望のポリペプチドに結合される。該選択的開裂部位としては、好ましくはアミノ酸配列-(Asp)_n-Lys- （ｎは２、３または４を示す）または-Ile-Glu-Gly-Arg- が考えられる。これはそれぞれプロテアーゼであるエンテロキナーゼおよび凝集Factor Xa により特異的に認識され得る。このような親和性ペプチドは、次にそれ自体公知の方法により酵素的に開裂することができる。
【００１９】
直接的結合の場合には、該親和性ペプチドは、所望のポリペプチドに結合して残る。すなわち、該親和性ペプチドは化学的または酵素的に開裂することができない。したがって、この形態の結合は、所望のポリペプチドの活性が親和性ペプチドの存在により不利な影響を受けない場合に有利なものである。
【００２０】
上記リガンドとしてはニッケルイオン、セルロース、グルタチオン等が、それらの該親和性ペプチドが低分子量であり、特異性が高い点から好ましい。また、磁性担体としては、磁性化アガアロース、磁性化セルロース等が価格、強度、粒径の点から好ましい。
【００２１】
また、本発明における精製方法の別の態様として、セルロースとの親和性を有するポリペプチド領域（ＣＢＤ）が該ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシ末端アミノ酸に直接的または間接的に結合してなる融合蛋白質を用いる精製方法が挙げられる。この場合、磁性担体として磁性化セルロース担体を単独で用いてもよいし、あるいは、磁性化アガロース担体等の磁性担体にセルロースをリガンドとして結合せしめたものを用いてもよい。
【００２２】
上記ポリペプチドを産生する細胞は微生物であることが好ましい。該微生物としては、細菌、酵母等が挙げられるが、なかでもエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が好ましい。
【００２３】
上記ポリペプチドを産生する細胞の破砕は、超音波もしくは酵素を用いて行うのが好ましい。酵素を用いる場合は、リゾチームもしくはザイモリエース（麒麟麦酒製）等のβ−１，３−グルカンラミナリペンタオヒドロラーゼなどの溶菌酵素が特に好ましい。
【００２４】
上記の方法で精製して得られたポリペプチドは選択的開裂により除去されることが好ましい。その際にはプロテアーゼを用いるのが好ましく、なかでも、トロンビン、Factor Xa 、エンテロキナーゼ等が特に好ましい。
【００２５】
上述したような精製方法に際して用いられる本発明におけるキット試薬は、目的とするポリペプチドに結合するリガンドを保有した磁性担体、細胞破砕・吸着液、不要物の除去に用いられる洗浄液、該目的とするポリペプチドを担体から分離するために用いられる溶出液から構成される。該溶出液は、該磁性担体の非特異吸着を回避するために該細胞破砕・吸着液または該洗浄液に添加される溶液の全てもしくは一部によって構成されることが好ましい。
【００２６】
上記細胞破砕・吸着液および洗浄液のうちの少なくとも一方のｐＨが６〜８であることが好ましく、ｐＨ７〜８の範囲がより好ましい。また、細胞破砕・吸着液および洗浄液は同一の組成であることが担体へ吸着した該ポリペプチドの脱離を防ぐ点から、さらに好ましい。
【００２７】
上記溶出液中には、目的とするポリペプチドの磁性担体への特異吸着を拮抗阻害する物質を添加して調製されることが好ましい。上記の目的とするポリペプチドの磁性担体への特異吸着を拮抗阻害する物質がイミダゾール、セルビオース、グルタチオン等が好ましい。
【００２８】
さらに、上記の非特異吸着を回避するために、細胞破砕・吸着液、洗浄液および溶出液中にアルカリ金属塩が添加されることが好ましい。アルカリ金属塩としては、なかでも安全性、価格の点から、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等が特に好ましい。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００３０】
実施例１６×His ／α−グルコシダーゼ融合蛋白質の磁性化Ｎｉ−アガロース担体による精製
まず、pUC119にバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）ATCC12016 由来のα−グルコシダーゼ遺伝子を連結したプラスミドpBST(Appl Microbiol Biotechnol 第４４巻，第６２９〜６３４頁，1996年）を鋳型に、α−グルコシダーゼ遺伝子の５’末端部に相補的な２１個のヌクレオチド配列とその５’末端にEcoRI 認識配列、開始コドン（ＡＴＧ）、６個のヒスチジンコード配列の順につなげたプライマー（５'-CCG GAA TTC ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TTG AAA AAA ACA TGG TGG AAA-３’）およびα−グルコシダーゼ遺伝子の3'末端側に位置するpUC119に由来するプライマー（５'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-３’）にて、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によるＰＣＲを行った。
【００３１】
増幅したＤＮＡ断片（約２．１ｋｂｐ）を制限酵素EcoRＩにて切断し、精製した後、予め用意したpKK ／EcoRI −SmaI（ファルマシア製）に連結した。この連結したプラスミドpKK ／６×His ／α−グルコシダーゼでエシェリヒア・コリ JM109を形質転換して、６×His ／α−グルコシダーゼ融合蛋白質（α−グルコシダーゼのＮ末端部に６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質）を産生する形質転換体を取得した。６×His ／α−グルコシダーゼ融合蛋白質の発現はα−グルコシダーゼ活性の有無により確認した。
【００３２】
次に、上記形質転換体をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと表す；最終濃度０．２ｍＭ）にて誘導培養することにより、６×His ／α−グルコシダーゼ融合蛋白質を大量発現させた。
【００３３】
上記融合蛋白質を磁性化Ｎｉ−アガロース担体（英国Scigen社製）を用いて、（１）細胞破砕後の上清のみ吸着、（２）細胞破砕液をそのまま吸着、（３）細胞破砕と同時に吸着の３方法にて精製した。また、従来の非磁性化担体を用いた一般的な精製法の例として、クローンテック社のＴＡＬＯＮ、キアゲン社のＮｉ−ＮＴＡを用いて同様に（１）の方法で精製した。
【００３４】
（１）〜（３）の精製の操作方法および使用試薬を図１に示す。固液分離は磁性担体は磁性スタンド、ＴＡＬＯＮ、Ｎｉ−ＮＴＡは遠心分離にて行っている。それぞれの精製方法により得られた溶出液のα−グルコシダーゼ活性の回収率および比活性（以下、ＳＡとも表す）を図２、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を図３に示す。
【００３５】
検討の結果、図２のように、クローンテック社のＴＡＬＯＮ、キアゲン社のＮｉ−ＮＴＡならびに磁性化Ｎｉ−アガロース担体を用いて細胞破砕後の上清のみを吸着して精製した場合、活性回収率が約３０％であった。しかしながら、磁性化Ｎｉ−アガロース担体を用いて破砕液をそのまま吸着させた場合、および破砕と同時に吸着して精製した場合、活性回収率がそれぞれ約６５％、約５２％と倍増した。また、ＳＡにおいても回収率と同様な増加傾向が認められた。
【００３６】
また、図３に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果からも破砕液をそのまま用いた場合、および破砕と同時に吸着して精製した場合、６×His ／α−グルコシダーゼ融合蛋白質の回収量が増加していることが明らかである。
【００３７】
実施例２リポプロテインリパーゼ／６×His 融合蛋白質の磁性化Ｎｉ−アガロース担体による精製
まず、pUC18 にシュードモナス・アルギノウサ（Pseudomonas aeruginousa ）由来のリポプロテインリパーゼ遺伝子を連結したプラスミドpUL11 （ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 第２９６巻，第２号，第５０５〜５１３頁，１９９２年）を鋳型に、リポプロテインリパーゼ遺伝子の５’末端側に位置するpUC18 に由来するプライマー（５’-CAC TTT ATG CTT CCG GCT CGT ATG TTG- ３’）およびリポプロテインリパーゼ遺伝子の３’末端部に相補的な２５個のヌクレオチド配列とその５’末端にBglII 認識配列、６個のヒスチジンコード配列、終止コドン（ＴＧＡ）、Eco47I認識配列の順につなげたプライマー（５’-GTC AGG TCC TAG TGA TGG TGA TGG TGA TGA GAT CTC AGG CTG GCG TTC TTC AGG CGG TTG- ３’）にて、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によるＰＣＲを行った。
【００３８】
増幅したＤＮＡ断片（約１．３ｋｂｐ）を制限酵素NcoI／Eco47Iにて二重切断し、精製した後、予め用意したpUL11 ／NcoI-Eco47I に連結した。この連結したプラスミドpUL11 ／リポプロテインリパーゼ／６×His でエシェリヒア・コリ JM109を形質転換して、リポプロテインリパーゼ／６×His 融合蛋白質（リポプロテインリパーゼのＣ末端部に６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質）を産生する形質転換体を取得した。
【００３９】
次に、この形質転換体をＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）にて誘導培養することにより、リポプロテインリパーゼ／６×His 融合蛋白質を発現させた。リポプロテインリパーゼ／６×His 融合蛋白質の発現はＣ末端にある６×His を認識する抗体（インビトロジェン社製）を用いてウエスタンブロットにて確認した。ウエスタンブロットはImaging high -Western-（東洋紡績製）にて、その取扱説明書通りに行った。
【００４０】
実施例１と同様に該融合蛋白質を磁性化Ｎｉ−アガロース担体を用いて、（１）細胞破砕後の上清のみ吸着、（２）細胞破砕と同時に吸着の２方法にて精製した。（１）、（２）の精製の操作方法および使用試薬は図１と同様である。それぞれの精製方法により得られた各精製ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。
【００４１】
図４に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、細胞破砕後の上清のみを吸着して精製した場合、リポプロテインリパーゼ／６×His 融合蛋白質の回収は認められなかった。しかしながら、磁性化Ｎｉ−アガロース担体を用いて破砕と同時に吸着して精製した場合、数本のマイナーバンドも認められるが、目的の融合蛋白質が特異的に精製できることが明らかとなった。
【００４２】
実施例３ α−グルコシダーゼ／Cellose binding domain（ＣＢＤ）融合蛋白質の磁性化セルロース担体による精製
クロストリジウム・ステルコラリウム(Clostrodium stercorarium)由来のキシラナーゼＡ遺伝子をコードしている領域を連結しているプラスミドpXYN（Sakka, K. et al., Biosci.Biotech.Biochem. 第５７巻，第２３７〜２７７頁，１９９３年）を鋳型に、Cellose binding domain（ＣＢＤ）の５’末端に相補的な２７個のヌクレオチド配列とその５’末端にMroI，BglII 認識配列をつなげたプライマー（５’-CCC TCC GGA AGA TCT TCA CCA GTG CCT GCA CCT GGT GAT AAC- ３' ）およびＣＢＤ遺伝子の３’末端に相補的な２０個のヌクレオチド配列とその５’末端に終止コドン（ＴＡＡ），KpnI，EcoRI 認識配列をつなげたプライマー（５’-CCG AAT TCG GTA CCC TTA AGT TCC TGA TTT TGA G- ３’）にて、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によるＰＣＲを行った。
【００４３】
増幅したＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）を制限酵素BglII ／EcoRI にて二重切断し、精製した後、点突然変異にてα−グルコシダーゼ遺伝子の３’末端部に制限酵素BglII 認識配列を挿入したプラスミドpBST（Appl.Microbiol.Biotechnol.第４４巻，第６２９〜６３４頁，１９９６年；実施例１参照）を制限酵素BglII ／EcoRI で二重切断したものに連結した。α−グルコシダーゼとＣＢＤは予め翻訳フレームが合致するように設計してある。この連結したプラスミドpUC18 ／α−グルコシダーゼ／ＣＢＤでエシェリヒア・コリ JM109を形質転換して、α−グルコシダーゼ／ＣＢＤ融合蛋白質（α−グルコシダーゼのＣ末端部にＣＢＤを連結した融合蛋白質）を産生する形質転換体を取得した。α−グルコシダーゼ／ＣＢＤ融合蛋白質の発現はα−グルコシダーゼ活性の有無により確認した。
【００４４】
次に、この形質転換体をＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）にて誘導培養することにより、α−グルコシダーゼ／ＣＢＤ融合蛋白質を大量発現させた。この融合蛋白質を磁性化セルロース担体（米国Cortex社製）を用いて、実施例２と同様に（１）細胞破砕後の上清のみ吸着、（２）細胞破砕と同時に吸着の２方法にて精製した。
【００４５】
（１）、（２）の精製の操作方法および使用試薬を図５に示す。固液分離は磁性担体は磁性スタンドにて行っている。それぞれの精製方法により得られた溶出液のα−グルコシダーゼ活性の回収率および比活性（ＳＡ）を図６に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示す。
【００４６】
図５のように、磁性化セルロース担体を用いて細胞破砕後の上清のみを吸着して精製した場合、活性回収率が１．２％であった。しかしながら、磁性化セルロース担体を用いて破砕と同時に吸着して精製した場合、活性回収率が２０％と著しく上昇した。また、ＳＡにおいても回収率と同様な増加傾向が認められた。
【００４７】
また、図７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果からも破砕と同時に吸着して精製した場合、α−グルコシダーゼ／ＣＢＤ融合蛋白質の回収量が増加していることが明らかである。
【００４８】
上記の様に実施例１と全く同様な傾向が認められており、目的蛋白質の疎水性が比較的強い場合、破砕上清のみをリガンドとの吸着反応に用いる時には、親和性を持つポリペプチド領域が目的蛋白質の内部に潜り込む、融合蛋白質が凝集する、あるいは目的蛋白質が細胞破砕片と非特異吸着する現象により、上清に抽出される目的蛋白質量が減少し、リガンドとの吸着率が低下するものと思われる。そして、目的蛋白質の回収が不十分となり、それがＳＡ差に反映されているものと思われる。
【００４９】
一方、破砕懸濁液にそのまま担体を添加して精製した場合、或いは破砕と同時に担体への吸着を行って精製した場合は、細胞破砕片に非特異吸着したHis-tag 融合蛋白質（蛋白質のＣ末端もしくはＮ末端に６×His が結合したものをいう）まで担体との特異吸着により精製することができ、目的蛋白質の回収率が増加して精製度（ＳＡ）が上昇したものと思われる。
【００５０】
【発明の効果】
上述したように、本発明のポリペプチドの精製方法を利用することにより、従来から行われている方法に比べて、特に比較的疎水性の強い融合蛋白質においても効率よく精製できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および２における、６×His 融合蛋白質の精製フローを示す図である。
【図２】実施例１における、α−グルコシダーゼの回収率（％）および比活性（Ｕ／mg）を示す図である。
【図３】実施例１における、６×His ／α−グルコシダーゼ融合蛋白質の各精製ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図４】実施例２における、６×His ／リポプロテインリパーゼ融合蛋白質の各精製ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図５】実施例３における、α−グルコシダーゼ／ＣＢＤ融合蛋白質の精製フローを示す図である。
【図６】実施例３における、α−グルコシダーゼの回収率（％）および比活性（Ｕ／mg）を示す図である。
【図７】実施例３における、α−グルコシダーゼ／ＣＢＤ融合蛋白質の各精製ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The method for purifying a polypeptide of the present invention comprises adding a magnetic carrier on which a specific ligand is immobilized to a disruption solution of cells producing the target polypeptide to adsorb the fusion protein, or disrupting cells. And a method for purifying the polypeptide, wherein the step of adsorbing the target protein to a magnetic carrier is performed simultaneously. In a more specific embodiment, the target polypeptide is produced in the form of a fusion protein of a polypeptide having affinity for a specific ligand and a biologically active polypeptide by, for example, genetic recombination technology, The present invention relates to a purification method in which a fusion protein host cell disruption solution is directly used for adsorption of the fusion protein to the magnetic carrier, and a method for purifying the fusion protein in which cell disruption and adsorption to the magnetic carrier are simultaneously performed.
[0002]
[Prior art]
Today, there are a wide variety of methods, materials, and approaches for separating specific proteins in biological materials from other components. An example of a common approach is the nonspecific affinity of a protein for a carrier. For example, proteins can be separated by ion exchange chromatography based on molecular charge. That is, the protein mixture is added to the oppositely charged chromatography matrix, and various proteins bind to the matrix by reversible electrostatic interactions. Proteins bound to the matrix are eluted in the order of weak binding to strong binding by increasing the ionic strength or changing the pH of the elution buffer.
[0003]
Another common approach is to use the physical properties of the protein as a separation means. For example, proteins can be separated based on the size of the protein using gel filtration. In this method, the protein mixture is added to a gel filtration column packed with a chromatographic matrix having pores of a predetermined size. The protein is then usually eluted using a buffer, collected as individual chromatographic fractions and analyzed.
[0004]
A third general approach is to take advantage of the specific affinity of the protein for the purification reagent. For example, the protein can be purified using an antibody specific for the protein. Alternatively, the antibody may be purified by its specific antigen. Usually, an antibody or antigen is bound to a column substrate, and a solution containing the specific antigen or antibody can be added to the column to form an immune complex. Subsequently, the elements of the bound immune complex are eluted, destabilizing the antigen-antibody complex, for example by exposure to a buffer of very high ionic strength or high or low pH.
[0005]
As described above, affinity chromatography is a very effective protein purification method that utilizes a specific interaction between a protein to be purified and a ligand immobilized on a solid phase. In general, solid phase ligands have some inherent scientific properties that selectively adsorb proteins to be separated. Other contaminating proteins do not bind to the solid phase ligand or are removed by washing the solid phase ligand with an appropriate solution.
[0006]
The possibility of preparing hybrid genes by genetic technology has opened up new avenues for the production of recombinant proteins. A desired recombinant protein in one step using an affinity peptide by binding a gene sequence encoding the desired protein and a gene sequence encoding a protein fragment (affinity peptide) having high affinity for the ligand Can be purified in the form of a fusion protein. It is also possible to introduce a specific chemical or enzymatic cleavage site at the point of attachment of the affinity peptide and the desired recombinant protein by site-restricted mutation, so that the fusion protein can be introduced with an appropriate affinity resin. After purification, the desired recombinant protein can be recovered by chemical or enzymatic cleavage.
[0007]
For example, in Japanese Patent No. 2668690, six histidine residues (hereinafter referred to as 6 × His) are linked to the N-terminus or C-terminus of a target protein as a genetically modified protein, and a specific Ni ligand is used for this. A method for affinity purification is described. However, in this method, the specificity between the affinity peptide and the ligand is low, and it may not be possible to purify with high purity.
[0008]
Further, there is a method for producing a target protein as a fusion protein of this CBD by using a cellulose binding region (hereinafter referred to as CBD) of xylanase A obtained from Clostridium stercorarium, and performing affinity purification. J. Ferment. Bioeng. 81, 553-556 (1996). However, this method has a large CBD and may affect the properties of the target protein.
[0009]
In addition to the above, such purification methods include, for example, Science 198, 1056-1063 (1977) (according to Itakura et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6848-6852. (1983) (by Germino et al.), Nucleic Acids Res. Vol. 13, 1151-1162 (1985) (by Nilsson et al.), And Gene 32, 321-327 (1984) (Smith). Et al.). However, in these methods as well as CBD, the affinity peptide region may be large and affect the properties of the target protein.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, affinity chromatography using fusion protein is a very good purification method, but it is mainly used for purification of soluble proteins that are hydrophilic, and yield is low for proteins with relatively strong hydrophobicity. Sometimes. Therefore, a purification method that can obtain a high yield even for a highly hydrophobic fusion protein is desired.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above circumstances, the present inventors have added a magnetic carrier as it is to a cell disruption suspension and adsorbed the target polypeptide, thereby allowing the polypeptide to be used even in a relatively hydrophobic protein. Has been found that the target fusion protein can be adsorbed with high affinity with the immobilized ligand without causing loss due to nonspecific adsorption to cell debris, and the present invention has been completed.
[0012]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) In a method for purifying a polypeptide from cells that produce the target polypeptide, a ligand having an affinity for the polypeptide is bound as it is without removing fragments from a solution in which the cells are disrupted. A method for purifying a polypeptide, wherein the polypeptide is recovered after adsorbing the polypeptide to a magnetic carrier.
(2) The purification method according to (1), wherein the step of disrupting cells and the step of adsorbing the polypeptide to a magnetic carrier to which a ligand having affinity for the polypeptide is bound are simultaneously performed.
(3) The purification method of (1) or (2), wherein the polypeptide is a fusion protein.
(4) The polypeptide is a fusion protein in which a polypeptide region having affinity for a ligand is directly or indirectly bound to the amino terminal amino acid or carboxy terminal amino acid of the polypeptide (1) to (3 ) Any purification method.
(5) The purification method according to any one of (1) to (4), wherein the ligand is nickel ion.
(6) The purification method according to any one of (1) to (5), wherein the magnetic carrier is a magnetized agarose carrier or a magnetized cellulose carrier.
(7) The polypeptide is a fusion protein in which a polypeptide region having affinity for cellulose is directly or indirectly bound to the amino terminal amino acid or carboxy terminal amino acid of the polypeptide (1) to (3 ) Any purification method.
(8) The purification method according to (7), wherein a magnetized cellulose carrier or a magnetic carrier to which cellulose is bound is used.
(9) The purification method according to any one of (1) to (8), wherein the cell producing the polypeptide is a microorganism.
(10) The purification method according to any one of (1) to (8), wherein the cell producing the polypeptide is Escherichia coli.
(11) The purification method according to any one of (1) to (10), wherein cells that produce the polypeptide are disrupted by ultrasonic waves.
(12) The purification method according to any one of (1) to (10), wherein a cell producing the polypeptide is disrupted with an enzyme.
(13) The purification method according to (12), wherein the enzyme is lysozyme or β-1,3-glucan laminaripentahydrolase.
(14) A method for purifying a polypeptide, comprising removing the polypeptide obtained by purification by the method according to any one of (1) to (13) by selective cleavage.
(15) The purification method according to (12), wherein a protease is used for selective cleavage of the polypeptide obtained by purification by any one of the methods (1) to (13).
(16) The purification method according to (14) or (15), wherein the protease is at least one selected from the group consisting of thrombin, Factor Xa and enterokinase.
(17) A magnetic carrier having a ligand that binds to the target polypeptide, a cell disruption / adsorption solution, a washing solution used to remove unwanted substances, and an elution solution used to separate the target polypeptide from the carrier A kit reagent used for the purification method according to any one of (1) to (16).
(18) The kit reagent according to (17), wherein the pH of at least one of the cell disrupting / adsorbing solution and the washing solution is 6 to 8.
(19) The kit reagent according to (17) or (18), wherein the cell disruption / adsorption solution and the washing solution have the same composition.
(20) The kit reagent according to any one of (17) to (19), wherein a substance that competitively inhibits specific adsorption of the target polypeptide to the magnetic carrier is added to the eluate.
(21) The kit reagent according to (20), wherein the substance that competitively inhibits specific adsorption of the target polypeptide to the magnetic carrier is imidazole.
(22) The kit reagent according to (20), wherein the substance that competitively inhibits the specific adsorption of the target polypeptide to the magnetic carrier is cellobiose.
(23) The kit reagent according to any one of (17) to (22), wherein an alkali metal salt is contained in the cell disruption / adsorption solution, the washing solution, and the eluate.
(24) The kit reagent according to (23), wherein the alkali metal salt is NaCl or KCl.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the method for purifying a polypeptide in the present invention, the polypeptide is bound to a magnetic carrier to which a ligand having an affinity for the polypeptide is bound as it is without removing fragments from a solution in which cells producing the polypeptide are disrupted. After adsorbing, the polypeptide is recovered. At this time, it is possible to eliminate the time lag from crushing to adsorption by simultaneously performing the step of crushing the cells and the step of adsorbing the polypeptide to the magnetic carrier to which the ligand having affinity for the polypeptide is bound. preferable. Moreover, if crushing and adsorption are performed simultaneously, the operation time required for purification can be shortened.
[0014]
Usually, when purifying, for example, a fusion protein in a batch system using a non-magnetic carrier, the carrier is subjected to solid-liquid separation by centrifugation. This separation method uses gravity, and it is necessary to remove cell debris before adsorption. If the cell disruption solution is used as it is, the non-magnetic carrier and the cell fragment cannot be separated again.
[0015]
However, when a magnetic carrier is used, only the magnetic carrier can be separated by a magnetic force. It is also possible to perform cell disruption and adsorption to the carrier at the same time. Such a purification method does not require a step of removing the disrupted cell debris by centrifuging as compared with the conventional method using a non-magnetic carrier, and the purification operation time can be shortened.
[0016]
The purification method of the present invention is particularly useful when the above polypeptide is a fusion protein, and the fusion protein has a polypeptide region having affinity for a ligand (hereinafter referred to as an affinity peptide) of the polypeptide. A fusion protein formed by directly or indirectly binding to the amino terminal amino acid or carboxy terminal amino acid is preferred. A method for obtaining the fusion protein is not particularly limited, but it is preferably produced by a microorganism by a gene recombination technique.
[0017]
The fusion protein can be bound directly or indirectly to the polypeptide. When a single affinity peptide is used, the affinity peptide can be linked to either the amino terminal amino acid or the carboxy terminal amino acid of the polypeptide. If two affinity peptides are used, one of them is bound to the amino terminal amino acid of the polypeptide and the other is bound to the carboxy terminal amino acid of the polypeptide.
[0018]
In the case of indirect binding, the affinity peptides contain an appropriate selective cleavage site through which they are bound to the desired polypeptide. The selective cleavage site is preferably an amino acid sequence- (Asp) _n -Lys- (n represents 2, 3 or 4) or -Ile-Glu-Gly-Arg- is conceivable. This can be specifically recognized by the proteases enterokinase and aggregated Factor Xa, respectively. Such affinity peptides can then be cleaved enzymatically by methods known per se.
[0019]
In the case of direct binding, the affinity peptide remains bound to the desired polypeptide. That is, the affinity peptide cannot be cleaved chemically or enzymatically. Thus, this form of binding is advantageous when the activity of the desired polypeptide is not adversely affected by the presence of the affinity peptide.
[0020]
As the above-mentioned ligand, nickel ion, cellulose, glutathione and the like are preferable in view of their low molecular weight and high specificity. As the magnetic carrier, magnetized agarose, magnetized cellulose and the like are preferable from the viewpoint of price, strength and particle size.
[0021]
As another aspect of the purification method of the present invention, a fusion comprising a polypeptide region (CBD) having affinity for cellulose directly or indirectly linked to the amino terminal amino acid or carboxy terminal amino acid of the polypeptide. A purification method using a protein can be mentioned. In this case, a magnetized cellulose carrier may be used alone as the magnetic carrier, or one obtained by binding cellulose as a ligand to a magnetic carrier such as a magnetized agarose carrier may be used.
[0022]
The cell producing the polypeptide is preferably a microorganism. Examples of the microorganism include bacteria, yeast, and the like, and Escherichia coli is particularly preferable.
[0023]
The disruption of the cells producing the polypeptide is preferably performed using ultrasound or an enzyme. When an enzyme is used, a lytic enzyme such as β-1,3-glucan laminari pentaohydrolase such as lysozyme or zymolyce (manufactured by Soba) is particularly preferred.
[0024]
The polypeptide obtained by purification by the above method is preferably removed by selective cleavage. In that case, it is preferable to use a protease, and among them, thrombin, Factor Xa, enterokinase and the like are particularly preferable.
[0025]
The kit reagent in the present invention used in the purification method as described above includes a magnetic carrier having a ligand that binds to the target polypeptide, a cell disruption / adsorption solution, a washing solution used for removing unwanted substances, and the object Consists of an eluate used to separate the polypeptide from the carrier. The eluate is preferably composed of all or part of a solution added to the cell disruption / adsorption solution or the washing solution in order to avoid non-specific adsorption of the magnetic carrier.
[0026]
The pH of at least one of the cell disrupting / adsorbing solution and the washing solution is preferably 6-8, and more preferably in the range of pH 7-8. Further, it is more preferable that the cell disruption / adsorption solution and the washing solution have the same composition from the viewpoint of preventing the polypeptide adsorbed on the carrier from being detached.
[0027]
The eluate is preferably prepared by adding a substance that competitively inhibits specific adsorption of the target polypeptide to the magnetic carrier. The substance that competitively inhibits the specific adsorption of the target polypeptide to the magnetic carrier is preferably imidazole, cellobiose, glutathione or the like.
[0028]
Furthermore, in order to avoid the non-specific adsorption described above, it is preferable to add an alkali metal salt in the cell disruption / adsorption solution, the washing solution and the eluate. Among them, NaCl, KCl and the like are particularly preferable from the viewpoint of safety and cost.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the effects of the present invention will be further clarified by illustrating examples of the present invention.
[0030]
Example 1 Purification of 6 × His / α-glucosidase fusion protein with magnetized Ni-agarose carrier
First, a plasmid pBST (Appl Microbiol Biotechnol Vol. 44, pages 629 to 634, 1996), in which an α-glucosidase gene derived from Bacillus stearothermophilus ATCC12016 was linked to pUC119, was used as a template and α-glucosidase. A primer (5'-CCG GAA TTC ATG) that is composed of 21 nucleotide sequences complementary to the 5 'end of the gene, and an EcoRI recognition sequence, an initiation codon (ATG), and 6 histidine coding sequences in that order. CAT CAC CAT CAC CAT CAC TTG AAA AAA ACA TGG TGG AAA-3 ′) and a primer derived from pUC119 located at the 3 ′ end of the α-glucosidase gene (5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3 ′ ), PCR with KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo) was performed.
[0031]
The amplified DNA fragment (about 2.1 kbp) was cleaved with the restriction enzyme EcoRI, purified, and then ligated to pKK / EcoRI-SmaI (Pharmacia) prepared in advance. Escherichia coli JM109 was transformed with this ligated plasmid pKK / 6 × His / α-glucosidase, and 6 × His / α-glucosidase fusion protein (a fusion in which 6 histidines were linked to the N-terminal part of α-glucosidase). A transformant producing a protein was obtained. The expression of 6 × His / α-glucosidase fusion protein was confirmed by the presence or absence of α-glucosidase activity.
[0032]
Next, 6 × His / α-glucosidase fusion protein was obtained by induction culture of the transformant in isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (hereinafter referred to as IPTG; final concentration 0.2 mM). A large amount was expressed.
[0033]
Using the magnetized Ni-agarose carrier (manufactured by Scigen, UK), (1) adsorbing only the supernatant after cell disruption, (2) adsorbing the cell disruption liquid as it is, (3) adsorbing the fusion protein simultaneously with cell disruption The following three methods were used for purification. Further, as an example of a general purification method using a conventional non-magnetized carrier, purification was similarly performed by the method (1) using TALON (Clontech) or Ni-NTA (Qiagen).
[0034]
FIG. 1 shows the purification operation methods (1) to (3) and the reagents used. For solid-liquid separation, the magnetic carrier is a magnetic stand, and TALON and Ni-NTA are centrifuged. FIG. 2 shows the recovery rate and specific activity (hereinafter also referred to as SA) of the α-glucosidase activity of the eluate obtained by each purification method, and FIG. 3 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Show.
[0035]
As a result of the examination, as shown in FIG. 2, the activity recovery rate was obtained when the supernatant after cell disruption was purified using Clontech TALON, Qiagen Ni-NTA and magnetized Ni-agarose carrier. Was about 30%. However, when the crushed liquid was adsorbed as it was using a magnetized Ni-agarose carrier, and when it was adsorbed and purified simultaneously with the crushing, the activity recovery rate doubled to about 65% and about 52%, respectively. In addition, an increase trend similar to the recovery rate was observed in SA.
[0036]
In addition, from the results of SDS-PAGE shown in FIG. 3, the amount of 6 × His / α-glucosidase fusion protein recovered increases when the disrupted solution is used as it is and when it is adsorbed and purified simultaneously with disruption. Is clear.
[0037]
Example 2 Purification of lipoprotein lipase / 6 × His fusion protein with magnetized Ni-agarose carrier
First, the plasmid pUL11 (ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS Vol. 296, No. 2, pp. 505-513, 1992) in which pUC18 was linked with a lipoprotein lipase gene derived from Pseudomonas aeruginousa was used as a template. Primer derived from pUC18 located at the 5 ′ end of the protein lipase gene (5′-CAC TTT ATG CTT CCG GCT CGT ATG TTG-3 ′) and 25 complementary to the 3 ′ end of the lipoprotein lipase gene Primer (5'-GTC AGG TCC TAG TGA TGG TGA TGG TGA TGA GAT CTC AGG) connected in the order of nucleotide sequence and BglII recognition sequence, 6 histidine coding sequences, stop codon (TGA) and Eco47I recognition sequence at its 5 'end CTG GCG TTC TTC AGG CGG TTG-3 ′) was used for PCR with KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo).
[0038]
The amplified DNA fragment (about 1.3 kbp) was double-cut with restriction enzymes NcoI / Eco47I, purified, and then ligated to pUL11 / NcoI-Eco47I prepared in advance. Escherichia coli JM109 was transformed with this ligated plasmid pUL11 / lipoprotein lipase / 6 × His, and the lipoprotein lipase / 6 × His fusion protein (a fusion in which 6 histidines were linked to the C-terminal portion of the lipoprotein lipase). A transformant producing a protein was obtained.
[0039]
Next, this transformant was induced and cultured in IPTG (final concentration 0.2 mM) to express a lipoprotein lipase / 6 × His fusion protein. The expression of the lipoprotein lipase / 6 × His fusion protein was confirmed by Western blotting using an antibody (manufactured by Invitrogen) that recognizes 6 × His at the C-terminus. Western blotting was performed at Imaging high -Western- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to its instruction manual.
[0040]
In the same manner as in Example 1, the fusion protein was purified by two methods: (1) adsorption of only the supernatant after cell disruption, and (2) adsorption simultaneously with cell disruption using a magnetized Ni-agarose carrier. The purification operation methods and reagents used in (1) and (2) are the same as in FIG. FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE of each purification step obtained by each purification method.
[0041]
From the results of SDS-PAGE shown in FIG. 4, when only the supernatant after cell disruption was adsorbed and purified, no recovery of lipoprotein lipase / 6 × His fusion protein was observed. However, when it was adsorbed and purified simultaneously with crushing using a magnetized Ni-agarose carrier, several minor bands were observed, but it was revealed that the target fusion protein could be purified specifically.
[0042]
Example 3 Purification of α-glucosidase / Cellose binding domain (CBD) fusion protein with magnetized cellulose carrier
Plasmid pXYN (Sakka, K. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57, 237-277) ligating the region encoding the xylanase A gene from Clostrodium stercorarium. (1993)) as a template, a primer (5'-CCC TCC GGA) with 27 nucleotide sequences complementary to the 5 'end of the Cellose binding domain (CBD) and MroI and BglII recognition sequences at the 5' end AGA TCT TCA CCA GTG CCT GCA CCT GGT GAT AAC-3 ') and 20 nucleotide sequences complementary to the 3' end of the CBD gene and a stop codon (TAA), KpnI, EcoRI recognition sequence connected to the 5 'end PCR with KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was performed using the primers (5′-CCG AAT TCG GTA CCC TTA AGT TCC TGA TTT TGA G-3 ′).
[0043]
The amplified DNA fragment (about 500 bp) is double-cut with the restriction enzyme BglII / EcoRI, purified, and then plasmid pBST in which the restriction enzyme BglII recognition sequence is inserted into the 3 ′ end of the α-glucosidase gene by point mutation. (Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 44, 629-634, 1996; see Example 1) was ligated to the product double-cut with restriction enzymes BglII / EcoRI. α-glucosidase and CBD are designed in advance so that the translation frames match. Transformation of Escherichia coli JM109 with this ligated plasmid pUC18 / α-glucosidase / CBD to produce α-glucosidase / CBD fusion protein (a fusion protein in which CBD is linked to the C-terminal part of α-glucosidase) Acquired the body. Expression of α-glucosidase / CBD fusion protein was confirmed by the presence or absence of α-glucosidase activity.
[0044]
Next, this transformant was induced and cultured in IPTG (final concentration 0.2 mM) to express a large amount of α-glucosidase / CBD fusion protein. Using the magnetized cellulose carrier (Cortex, USA), the fusion protein was purified by two methods: (1) adsorbing only the supernatant after cell disruption, and (2) adsorbing simultaneously with cell disruption. did.
[0045]
FIG. 5 shows a purification operation method and reagents used in (1) and (2). Solid-liquid separation is performed on a magnetic stand as a magnetic carrier. FIG. 6 shows the recovery rate and specific activity (SA) of α-glucosidase activity of the eluate obtained by each purification method, and FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE.
[0046]
As shown in FIG. 5, when only the supernatant after cell disruption was adsorbed and purified using a magnetized cellulose carrier, the activity recovery rate was 1.2%. However, when the magnetized cellulose carrier was used for adsorption and purification simultaneously with the crushing, the activity recovery rate was remarkably increased to 20%. In addition, an increase trend similar to the recovery rate was observed in SA.
[0047]
In addition, from the results of SDS-PAGE in FIG. 7, it is clear that the amount of α-glucosidase / CBD fusion protein recovered increases when adsorbed and purified simultaneously with the disruption.
[0048]
As described above, the same tendency as in Example 1 is recognized, and when the target protein is relatively strong in hydrophobicity, when only the disrupted supernatant is used for the adsorption reaction with the ligand, the polypeptide region having affinity Penetration of the target protein, aggregation of the fusion protein, or nonspecific adsorption of the target protein with cell debris reduces the amount of target protein extracted into the supernatant and decreases the adsorption rate to the ligand It seems to be. And it seems that the recovery of the target protein becomes insufficient, which is reflected in the SA difference.
[0049]
On the other hand, when purified by adding the carrier as it is to the disrupted suspension, or purified by adsorption to the carrier simultaneously with disruption, the His-tag fusion protein (protein C It can be purified by specific adsorption to the carrier until 6 × His is bound to the terminal or N-terminal), and it seems that the recovery rate of the target protein is increased and the degree of purification (SA) is increased.
[0050]
【The invention's effect】
As described above, by using the method for purifying a polypeptide of the present invention, it has become possible to efficiently purify a fusion protein that is relatively strong in hydrophobicity, compared to conventional methods.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a purification flow of 6 × His fusion protein in Examples 1 and 2. FIG.
2 is a graph showing the recovery rate (%) and specific activity (U / mg) of α-glucosidase in Example 1. FIG.
3 is a diagram showing an SDS-PAGE of each purification step of 6 × His / α-glucosidase fusion protein in Example 1. FIG.
4 is a diagram showing SDS-PAGE of each purification step of 6 × His / lipoprotein lipase fusion protein in Example 2. FIG.
5 is a diagram showing a purification flow of α-glucosidase / CBD fusion protein in Example 3. FIG.
6 is a graph showing the recovery rate (%) and specific activity (U / mg) of α-glucosidase in Example 3. FIG.
7 is a diagram showing SDS-PAGE of each purification step of α-glucosidase / CBD fusion protein in Example 3. FIG.

Claims

In a method for purifying a polypeptide from cells that produce the desired polypeptide, a step of disrupting the cell and a ligand having an affinity for the polypeptide as it is without removing fragments from the disrupted solution of the cell A method for purifying a polypeptide, comprising simultaneously performing the step of adsorbing the polypeptide on a magnetic carrier to which is bound, and then recovering the polypeptide.

The purification method according to claim 1, wherein the polypeptide is a fusion protein.

The polypeptide according to any one of claims 1 to 2 , wherein the polypeptide is a fusion protein in which a polypeptide region having affinity for a ligand is directly or indirectly bound to the amino terminal amino acid or carboxy terminal amino acid of the polypeptide. The purification method as described.

The purification method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the ligand is nickel ion.

Purification method according to any one of claims 1-4 magnetic carrier is a magnetic agarose carrier or magnetic cellulose carriers.

The polypeptide according to any one of claims 1 to 2 , wherein the polypeptide is a fusion protein in which a polypeptide region having affinity for cellulose is directly or indirectly bound to an amino terminal amino acid or a carboxy terminal amino acid of the polypeptide. The purification method as described.

The purification method according to claim 6, wherein a magnetic cellulose support or a magnetic support combined with cellulose is used.

The purification method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the cell producing the polypeptide is a microorganism.

The purification method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the cell producing the polypeptide is Escherichia coli.

Purification method according to any one of claims 1 to 9, disrupted by ultrasonic cells to produce the polypeptide.

Purification method according to any one of claims 1 to 9, the expression of the polypeptide to disrupted by an enzyme.

The purification method according to claim 11 , wherein the enzyme is lysozyme or β-1,3-glucan laminaripentahydrolase.

A method for purifying a polypeptide, wherein the polypeptide obtained by purification by the method according to any one of claims 1 to 12 is removed by selective cleavage.

The purification method according to claim 13 , wherein a protease is used for selective cleavage of the polypeptide obtained by purification by the method according to any one of claims 1 to 12 .

The purification method according to claim 14 , wherein the protease is at least one selected from the group consisting of thrombin, Factor Xa, and enterokinase.