JP4210116B2

JP4210116B2 - 標的遺伝子の発現阻害方法

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Publication number: JP4210116B2
Application number: JP2002556740A
Authority: JP
Inventors: ローランドクロイツァー; シュテファンリマ−; シルヴィアリマ−; フィーリップハドヴィガー
Original assignee: Ribopharma AG
Current assignee: Alnylam Europe AG
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2009-01-14
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Description

本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する方法、使用法および医薬に関する。

二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、医学的または生物工学的に興味深い遺伝子の発現を抑制する方法は、ＷＯ９９／３２６１９およびＷＯ００／４４８９５によって知られている。これらの公知の方法はきわめて効果的であるが、それでもなお、それらの効率をさらに増強する必要がある。
ＷＯ９９／３２６１９号公報ＷＯ００／４４８９５号公報

本発明の目的は、最先端技術に伴う欠点を取り除くことである。特に、標的遺伝子の発現のさらにより効果的な抑制が達成される方法、使用法および医薬を開示する。

驚くべきことに、この発明の特徴により、インビトロおよびインビボにおける標的遺伝子の発現阻害の効率性において、激的な増強が達成される。ｄｓＲＮＡの末端に特定構造がある結果として、標的化された様式で、標的遺伝子の発現に対する抑制作用を仲介するそれらの効率性および安定性の両方に作用し得る。細胞中における活性濃度は、この増強された安定性の結果として増強される。

本発明に関して、「標的遺伝子」は、細胞中に存在する二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ鎖を意味するものとして理解され、ＤＮＡ鎖に相補的で、転写に必要な鋳型として役立つ全ての転写領域を含む。言い換えれば、「標的遺伝子」は、一般的にはセンス鎖である。１つの鎖またはアンチセンス鎖（ａｓ１）は、ＲＮＡ転写産物またはそのプロセス産物（例えば、標的遺伝子の発現期間中に形成されるｍＲＮＡ）に相補的であり得る。「〜に導入する（され）」という用語は、細胞中への取り込みを意味するものとして理解される。取り込みは、細胞自身によって行われる場合もある。しかしながら、それは補助的な薬剤または装置によって仲介されてもよい。「オーバーハング」は、ワトソン−クリックの対合したヌクレオチドを示さない、末端に位置する一本鎖の突出を意味するものとして理解される。「二本鎖構造」は、個々の鎖のヌクレオチドがワトソン＆クリックに従って、一般的に対となっている構造を意味するものとして理解される。本発明に関して、二本鎖構造は、個々にミスマッチを示してもよい。

特に有利な実施形態において、ｄｓＲＮＡＩは、その鎖、もしくはアンチセンス鎖ａｓ１の３’末端、および／または他方の鎖、もしくはアンチセンス鎖ｓｓ１の３’末端においてオーバーハングを発現する。ｄｓＲＮＡはまた、一端で平滑であり得る。その場合、平滑末端は、鎖（アンチセンス鎖；ａｓ１）のｄｓＲＮＡＩの５’末端を示す側に有利的に位置する。この実施形態において、ｄｓＲＮＡＩは、生体において非常に優れた有効性ならびに優れた安定性を示す。インビボでの全体としての有効性は顕著である。オーバーハングは、有利には、１〜４個のヌクレオチド、好ましくは１個または２個のヌクレオチドからなる。

さらなる実施形態によれば、この方法の有効性は、本発明のｄｓＲＮＡＩに対応する少なくとも１つのさらなるｄｓＲＮＡＩＩが細胞中に導入される場合に、さらに促進され得る。ここで、ｄｓＲＮＡＩの二本鎖構造の１つの鎖、または１つの鎖の少なくとも１つのセグメントは、標的遺伝子のセンス鎖の第１の領域に相補的であり、そして、ｄｓＲＮＡＩＩの二本鎖構造の別の鎖、または別の鎖の少なくとも１つのセグメントは、標的遺伝子のセンス鎖の第２の領域に相補的である。標的遺伝子の発現の阻害は、この場合、著しく増強される。第１および第２の領域は、部分的にオーバーラップしたり、お互いに隣接したり、または分離されていてもよい。

ｄｓＲＮＡＩおよび／またはさらなるｄｓＲＮＡＩＩが２５個未満の連続するヌクレオチド対の長さである場合、有利であることが示されている。ヌクレオチド対の長さが１９〜２３個である場合、特に効果的であることが示されている。１〜４個のヌクレオチドを含む一本鎖のオーバーハングが、好ましくは１９〜２３個のヌクレオチド対によって形成される二本鎖において存在する場合、効率はさらに増強され得る。

標的遺伝子は、さらなる実施形態によれば、添付配列表に示す配列番号１から１４０の配列のうちの１つを有し得る。それは次に挙げる群：オンコジーン；サイトカイニン遺伝子；Ｉｄタンパク質遺伝子；プリオン遺伝子；血管形成を誘導する分子、接着分子、および細胞表面レセプターを発現する遺伝子；転移および／または侵襲プロセスに関与するタンパク質の遺伝子；プロテイナーゼならびにアポトーシスおよび細胞周期を調節する分子の遺伝子；ＥＧＦレセプターを発現する遺伝子、から選択され得る。特に、標的遺伝子は、ＭＤＲ１遺伝子であり得る。これに関連して、配列番号１４１−１７３のうちの１つ、または同類のアンチセンス（ａｓ）およびセンス配列（ｓｓ）の組み合わせからなるｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが用いられてもよい。

さらなる有利な実施形態によれば、発現は、ＲＮＡ干渉の原理に従って阻害される。標的遺伝子は、病原体、好ましくはマラリア原虫において有利に発現する。それは、ウイルスまたはウイロイド、特に、ヒトにおいて病原性であるウイルスまたはウイロイドの構成要素であり得る。ウイルスまたはウイロイドはまた、動物または植物において病原性であるものであり得る。

他の実施形態において、ヌクレオシドチオホスフェートによって置換された不対ヌクレオチドが提供される。

ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの少なくとも一端は、細胞内での分解、または個々の鎖の解離に対抗するために修飾されていてもよい。有利には、相補的なヌクレオチド対からなる二本鎖構造の結合は、少なくとも１つの化学結合によって増強される。化学結合は、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、好ましくは、ファンデルワース相互作用、もしくはスタッキング相互作用によるもの、または金属イオン配位したもののいずれかによって達成され得る。さらに、化学結合が一端の近辺で生じる場合、有利であり、かつ安定性を増すことが示されている。化学結合に関する他の有利な実施形態は、従属請求項における特徴に見出すことが可能であるため、さらなる説明は省略する。

ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩは、ミセル構造、好ましくはリポソームに包含されている場合、特に、より容易に細胞に導入され得る。細胞へのｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの輸送のためには、ウイルスに直接起因するか、ウイルスに由来するか、または、合成により産生された少なくとも１つのウイルスコートタンパク質によって、結合、会合または包含された状態であることが有利であることが明らかになっている。コートタンパク質は、ポリオーマウイルス由来であってもよい。特に、コートタンパク質は、ポリオーマウイルスのウイルスタンパク質１および／またはウイルスタンパク質２を含んでいてもよい。さらなる実施形態によれば、コートタンパク質からのカプシドまたはカプシド様構造の形成時に、一端は、カプシドまたはカプシド様構造の内部に向かっていることが前提となっている。さらに、ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩ（ａｓ１／２）の１つの鎖は、標的遺伝子の一次ＲＮＡ転写産物またはプロセスされたＲＮＡ転写産物に相補的であることが有利である。細胞は、脊椎動物の細胞またはヒトの細胞のいずれかであり得る。

さらに、ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩは、哺乳動物、好ましくはヒトに対して、１日に５ｍｇ／ｋｇ体重の最大用量でさえ、投与され得ることが実証されている。この低用量の投与であっても、その効力は顕著である。

驚くべきことに、ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩは緩衝液中で混合され、その後、経口投与あるいは静脈内、腫瘍内、腹腔内のいずれかへの注射または注入によって、または吸入によって投与され得る。

さらに、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩ）の使用法を提供し、ここで、ｄｓＲＮＡは最大４９の連続したヌクレオチド対から構成される二本鎖構造を有し、そして、二本鎖構造の１つの鎖（アンチセンス鎖、ａｓ１）、または二本鎖構造の鎖の少なくとも１つのセグメントは、標的遺伝子のセンス鎖に相補的であり、また、ｄｓＲＮＡＩは、一端で１〜４個のヌクレオチドから構成されるオーバーハングを有する。

本発明の他の局面によれば、細胞における標的遺伝子の発現阻害に十分な量の１つの二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩ）を含有する医薬が提供され、ここで、ｄｓＲＮＡＩは、最大４９個の連続したヌクレオチド対から構成される二本鎖構造を有し、そして、二本鎖構造の１つの鎖（アンチセンス鎖、ａｓ１）または二本鎖構造の１つの鎖の少なくとも１つのセグメントが標的遺伝子のセンス鎖に相補的となり、ｄｓＲＮＡＩは、一端で１〜４個のヌクレオチドから構成されるオーバーハングを有する。

ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの他の有利な実施形態については、前述の記載を参照のこと。

以下、図面、および実施例に基づいて、本発明についてより詳細に説明する。

図１ａおよび図１ｂは、第１および第２の二本鎖ＲＮＡを示す図である。

図２は、標的遺伝子を示す図である。

図３は、ＮＴＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第１の実験）。

図４は、ＮＴＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第２の実験）。

図５は、ＮＴＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第３の実験）。

図６は、ＮＴＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第４の実験）。

図７は、Ｈｅｌａ−Ｓ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光の関係を示す（第５の実験）。

図８は、ｐｃＤＮＡ−ＹＦＰのトランスフェクション後、またはｐｃＤＮＡ−ＹＦＰおよび種々のｄｓＲＮＡの同時トランスフェクション後における、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図９は、ｐｃＤＮＡ−ＹＦＰのトランスフェクション後、またはｐｃＤＮＡ−ＹＦＰおよび種々のｄｓＲＮＡの同時トランスフェクション後における、Ｈｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図１０は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＳ１のゲル電気泳動による分離を示す。

図１１は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＳ１のゲル電気泳動による分離を示す。

図１２は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＳ７のゲル電気泳動による分離を示す。

図１３は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＳ７のゲル電気泳動による分離を示す。

図１４は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＫ３のゲル電気泳動による分離を示す。

図１５は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＰＫＣ１／２のゲル電気泳動による分離を示す。

図１６は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＳ１Ａ／Ｓ４Ｂのゲル電気泳動による分離を示す。

図１７は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＫ２のゲル電気泳動による分離を示す。

図１８は、トランスジェニックＧＦＰマウス由来の腎臓パラフィン切片のＧＦＰ特異的な免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。

図１９は、トランスジェニックＧＦＰマウス由来の心臓パラフィン切片のＧＦＰ特異的な免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。

図２０は、トランスジェニックＧＦＰマウス由来の膵臓パラフィン切片のＧＦＰ特異的な免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。

図２１は、血漿におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。

図２２は、腎臓におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。

図２３は、心臓におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。

図２４は、Ｕ８７−ＭＧグリア芽腫細胞におけるＥＧＦＲ発現のウエスタンブロット分析を示す。

図２５ａは、７４時間後に採取された細胞において、大腸癌細胞系ＬＳ１７４ＴのＭＤＲＩｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す。

図２５ｂは、図２５ａにおけるバンドの定量化を示す。２つの値の平均値を表す。

図２６ａは、４８時間後に採取された細胞において、大腸癌細胞系ＬＳ１７４ＴのＭＤＲＩｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。

図２６ｂは、図２６ａにおけるバンドの定量化を示す。２つの値の平均値を表す。

図２７は、１７５ｎＭのｄｓＲＮＡのトランスフェクションの透過光および蛍光顕微鏡像の比較を示す（表４の配列Ｒ１）。

図１ａおよび１ｂに模式的に示した二本鎖リボ核酸ｄｓＲＮＡＩおよびｄｓＲＮＡＩＩは、それぞれ第１の末端（Ｅ１）および第２の末端（Ｅ２）を有する。第１および第２のリボ核酸ｄｓＲＮＡＩ／ｄｓＲＮＡＩＩは、約１〜４個の不対ヌクレオチドで形成される一本鎖の断片を両端（Ｅ１、Ｅ２）に有する。２つの可能な変異体が示され（変異体１および２）、ここで、変異体２は、平滑末端を有する（Ｅ２）。しかしながら、平滑末端は、他の変異体において、他方の末端に位置していてもよい（Ｅ１）。

図２は、ＤＮＡ上に位置する標的遺伝子を模式的に示す。標的遺伝子は、黒線で表される部分である。標的遺伝子は、第１の領域（Ｂ１）および第２の領域（Ｂ２）を有する。

それぞれの場合において、第１のｄｓＲＮＡＩ（ａｓ１）の１つの鎖または第２のｄｓＲＮＡＩＩ（ａｓ１）の１つの鎖は、標的遺伝子の対応するＢ１領域またはＢ２領域のそれぞれに対して相補的である。

標的遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡＩ／ｄｓＲＮＡＩＩがそれらの末端（Ｅ１、Ｅ２）に一本鎖の断片を有するとき、特に効果的に阻害される。その一本鎖の断片は、ａｓ１鎖もしくはａｓ２鎖、またはそのアンチ鎖上（ｓｓ１もしくはｓｓ２）、またはａｓ１鎖、ａｓ２鎖上、およびそのアンチ鎖上に位置していてもよい。

領域Ｂ１およびＢ２は、図２に示すように互いに分離していてもよい。しかしながら、それらはまた、隣接またはオーバーラップしていてもよい。

Ｉ．線維芽細胞におけるＹＦＰ遺伝子の発現の阻害：
二本鎖ＲＮＡは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）（Ａｅｑｕｏｒｉａｖｉｃｔｏｒｉａ藻由来のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の変異体である）の配列由来であり、これをＹＦＰコーディングプラスミドと一緒に線維芽細胞へマイクロインジェクションにより注入した。続いて、ｄｓＲＮＡを含まない細胞と比較して蛍光の減少を分析した。

実験プロトコル：
一本鎖ＲＮＡ（複数）およびそれらの相補的一本鎖（複数）を、配列番号１４８、１４９、および１５９から、ＲＮＡシンセサイザ（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および従来の化学的手法を用いて合成した。続いて、これらをＨＰＬＣを用いて精製した。個々の鎖の二本鎖へハイブリダイゼーションを、その一本鎖の化学量論的混合物を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）および１００ｍＭＮａＣｌ中で９０℃まで加熱し、次いで、それをゆっくり６時間かけて室温まで冷却することによって行った。このようにして得たｄｓＲＮＡを、試験細胞にマイクロインジェクションにより注入した。

この細胞培養物実験に使用した試験システムは、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３、ＥＣＡＣＣＮｏ．９３０６１５２４（動物細胞培養物のヨーロッパコレクション）であった。８００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ−ＹＦＰフラグメントをｐｃＤＮＡ３ベクターの対応する制限部位に含むｐｃＤＮＡ−ＹＦＰプラスミドを、マイクロインジェクションに使用した。同時に注入した配列相同ｄｓＲＮＡの影響下でのＹＦＰの発現を試験した。蛍光顕微鏡下での緑色蛍光の分析を、早くとも注入の３時間後に行った。

細胞培養物の調製：
細胞を、４．５ｇ／ｌグルコースおよび１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）、２ｍＭＬ−グルタミン、ならびにペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／１００μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を含有するＤＭＥＭ中、インキュベータ中で、５％ＣＯ₂を含む大気中３７℃でインキュベートした。細胞を、指数関数的成長状態に維持するために、３日毎に継代した。トランスフェクションの一日前に、細胞をトリプシン処理し（１０×トリプシン／ＴＥＤＴＡ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、そしてコートしたペトリ皿（ＣＯＲＮＩＮＧ細胞培養皿、３５ｍｍ、ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．，ＣｏｒｎｉｎｇＮＹ）中に細胞密度０．３×１０⁵で配置した。そのペトリ皿を、少なくとも３０分間３７℃で、０．２％ゼラチン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）とともにインキュベートし、ＰＢＳで一回洗浄し、そしてすぐにその細胞を培養するために使用した。個々の細胞を再び探すために、ＣＥＬＬｏｃａｔｅカバースリップ（四角形、サイズ５５μｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用した。

マイクロインジェクション：
ペトリ皿を、マイクロインジェクションの約１０分前にインキュベータから取り出した。ペトリ皿１つあたりかつ一回のインキュベートあたり約５０個の細胞を、マイクロインジェクションで注入した（ＦｅｍｔｏＪｅｔ，Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ５１７１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。チップの内径が０．５μｍのガラスキャピラリー（ＦｅｍｔｏＴｉｐ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用した。注入時間は、３０ｈＰＡの圧力で０．８秒であった。マイクロインジェクションは、蛍光用に装備されたＯｌｙｍｐｕｓＩＸ５０顕微鏡下で行った。使用した注入緩衝液は、１４ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、および１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．０からなり、これは、０．０１μｇ／μｌのｐｃＤＮＡ−ＹＦＰを含んでいた。デキストラン７００００（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と組み合わせた０．０８％（ｗ／ｖ）テキサスレッドの注入溶液を、首尾よいマイクロインジェクション試験のために添加した。特定のｄｓＲＮＡを用いたＹＦＰ発現の阻害を分析するために、ｄｓＲＮＡを注入溶液に添加した。アッセイ１：０．０１μＭｄｓＲＮＡ（配列番号１４８／１４９）；アッセイ２：０．０１μＭｄｓＲＮＡ（配列番号１４８／１５９）；アッセイ３：ＲＮＡなし。マイクロインジェクション後、細胞を少なくともさらに３時間インキュベータ中でインキュベートした。次いで、細胞内ＹＦＰ蛍光を、顕微鏡下で分析した：赤色および緑色の両方に同時に蛍光発色した細胞：マイクロインジェクションは成功であり、ｄｓＲＮＡの結果としてのＹＦＰ発現の阻害は観察されなかったか、またはｄｓＲＮＡが注入されなかったコントロール細胞が存在した；赤色蛍光細胞のみ：マイクロインジェクションは成功であり、ｄｓＲＮＡはＹＦＰ発現を阻害した。

結果：
ｄｓＲＮＡ濃度０．１μＭで、一本鎖領域を有し、２ヌクレオチドのオーバーハングを各々両方の３'末端に有するｄｓＲＮＡ（配列番号１４８／１５９）を使用することにより、末端に一本鎖オーバーハングを有さないｄｓＲＮＡと比較して、線維芽細胞におけるＹＦＰ遺伝子の発現の阻害が、顕著に増強された（表１）。

１９〜２５塩基対を含み、数個、好ましくは１〜３個からなるオーバーハングを有する短いｄｓＲＮＡ分子を使用し、塩基対合していない一本鎖ヌクレオチドは、このようにして、対応する一本鎖オーバーハングのない同数の塩基対を有するｄｓＲＮＡを同じＲＮＡ濃度で使用した場合よりも、哺乳動物細胞における遺伝子発現を比較的より強力に阻害することが可能である。

ＩＩ．培養されたＨＥＬＡ−Ｓ３細胞およびマウス線維芽細胞における標的遺伝子の遺伝子発現のｄｓＲＮＡによる阻害
ｄｓＲＮＡでのＲＮＡ干渉に基づくＹＦＰコーディングプラスミドの一過性トランスフェクション後のＹＦＰ発現の阻害の効率は、塩基対領域の３'末端および長さを操作することによって調整され得る。

実施例：
遺伝子発現の特異的阻害におけるｄｓＲＮＡの効率を決定するために、一過性にトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＮＩＨＳｗｉｓｓマウス胚、ＥＣＣＡＣ［動物細胞培養物のヨーロッパコレクション］Ｎｏ．９３０６１５２４）およびＨＥＬＡ−Ｓ３（ヒト子宮頸癌細胞、ＤＳＭＺ［微生物および細胞培養物のドイツコレクション］Ｎｏ．ＡＣＣ１６１）を使用した。ｐｃＤＮＡ−ＹＦＰプラスミド（８００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ−ＹＦＰフラグメントを、ベクターｐｃＤＮＡ３の対応する切断部位に含む）を、トランスフェクションのために使用した。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の配列に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を産生し、そしてｐｃＤＮＡ−ＹＦＰプラスミドとともに線維芽細胞中に一過性にトランスフェクトした（使用された特定のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＹＦＰおよびＧＦＰの両方の遺伝子配列の対応するセグメントに相補的である）。蛍光の減少を、４８時間後に定量した。ｐｃＤＮＡ−ＹＦＰとのみトランスフェクトしたか、またはｐｃＤＮＡ−ＹＦＰおよびコントロールｄｓＲＮＡ（ＹＦＰ配列由来ではない）とトランスフェクトしたかのいずれかの細胞を、コントロールとして使用した。

試験プロトコル：
ｄｓＲＮＡ合成：
配列表において観察される個々のＲＮＡ鎖ならびにそれらの相補的な一本鎖を、ＲＮＡシンセサイザ（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および従来の化学的手法を使用して合成した。次いで、合成の原産物の精製を、ＨＰＬＣを用いて行った。ＮｕｃｌｅｏＰａｃＰＡ−１００（９×２５０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ））を使用し、２０ｍＭトリス、１０ｍＭＮａＣｌＯ₄、ｐＨ６．８、１０％アセトニトリルを低塩緩衝液として、そして２０ｍＭトリス、４００ｍＭＮａＣｌＯ₄、ｐＨ６．８、１０％アセトニトリルを高塩緩衝液として使用した。流速は、１分間あたり３ｍｌであった。一本鎖の二本鎖へのハイブリダイゼーションを、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８、および１００ｍＭＮａＣｌ中で一本鎖の化学量論的混合物を８０〜９０℃まで過熱し、次いでゆっくりと６時間かけて室温まで冷却することによって行った。

細胞の播種：
全ての細胞培養を、適切なワークステーション（ＨＳ１８／ＨｅｒａＳａｆｅ、Ｋｅｎｄｒｏ，Ｈｅｒａｅｕｓ）において滅菌条件下で行った。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＨＥＬＡ−Ｓ３の培養を、インキュベータ（ＣＯ₂−インキュベータＴ２０、ＨｅｒａＣｅｌｌ、Ｋｅｎｄｒｏ，Ｈｅｒａｅｕｓ）中で、３７℃、５％ＣＯ₂、および飽和大気湿度で、マウス線維芽細胞についてはＤＭＥＭ（ダルベッコ修飾イーグル培地、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中、そしてＨＥＬＡ細胞についてはＨａｍ’ｓＦ１２中で、１０％ＦＣＳ（胎仔ウシ血清、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／１００μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を用いて行った。細胞を指数関数的増殖状態に維持するために、細胞を３日毎に継代した。トランスフェクションの２４時間前に、その細胞をトリプシン処理し（１０×トリプシン／ＥＤＴＡ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、そして９６ウェルのプレート（ＭｕｌｔｉｗｅｌｌＳｃｈａｌｅｎ９６ウェル、フラットボトム、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ＆ＷｅｉｓｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＧｍｂＨ）に１．０×１０⁴細胞／くぼみの細胞密度で播種し、そして１５０μｌの増殖培地にて培養した。

一過性トランスフェクションの実行：
トランスフェクションを、製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ^TM試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。０．１５μｇｐｃＤＮＡ−ＹＦＰプラスミドを、各ウェルに配置した。全てのトランスフェクション容量は、６０μｌであった。各々の場合において、３つのサンプルを開始した。最初に、プラスミドＤＮＡをｄｓＲＮＡと複合体化させた。そのプラスミドＤＮＡおよびｄｓＲＮＡを、無血清培地中で希釈し、そして１μｌＰＬＵＳ試薬を、０．１μｇのプラスミドＤＮＡ（１０μｌの容量中）当たりに使用した。次いで、これを混合した後、１５分間室温でインキュベートした。インキュベーションの間、０．５μｌのリポフェクタミンを、０．１μｇのプラスミドＤＮＡ当たり１０μｌの無血清培地中で希釈し、十分に混合し、プラスミド／ｄｓＲＮＡ／ＰＬＵＳ混合物に添加し、そして再び１５分間インキュベートした。培地をインキュベーションの間に換えた。細胞を２００μｌの無血清培地で一回洗浄し、その後４０μｌの無血清培地中、インキュベータ中で、ＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ／ＰＬＵＳ／リポフェクタミンを添加するまでインキュベートした。２０μｌのＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ／ＰＬＵＳ／リポフェクタミンを1ウェル当たり添加した後、細胞をインキュベータ中で２．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２００μｌの増殖培地で一回洗浄し、そして蛍光検出が行われるまで、インキュベータ中で２００μｌの増殖培地にて２４時間インキュベートした。

蛍光検出：
最後に培地を換えてから２４時間後に、細胞の蛍光を、ＷＩＢ蛍光キューブおよびデジタルＣＣＤカメラ（ＯｒｃａＩＩＩｍ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）ならびにＣ４７４２−９５プレビューモニタを装備した蛍光顕微鏡（ＩＸ５０−Ｓ８Ｆ２、Ｕ−ＵＬＳ１００Ｈｇ蛍光ユニット、ＢｒｅｎｎｅｒＵ−ＲＦＬ−Ｔ２００、オリンパス）を、ＵＳＨＩ０２Ｄ水銀ランプ（ＵｓｈｉｏＩｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）とともに使用して写真撮影した。蛍光像の分析を、分析ソフトウェア３．１（ＳｏｆｔＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。ＹＦＰ蛍光を細胞密度に関連付けるために、細胞核の染色を行った（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色）。このために、細胞を、まず１００μｌのメチルカルノア（７５％メタノール、２５％氷酢酸）中で５分間固定し、次いで、再びメチルカルノア中で１０分間固定した。風乾した後、その固定した細胞を暗所で３０分間、１ウェル当たり１００μｌのＨｏｅｃｈｓｔ染色液（７５ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。ＰＢＳ（ＤｕｌｂｅｃｃｏＰＢＳ（Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺を含まない）、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）で二回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した細胞を、蛍光顕微鏡（オリンパス、Ｈｏｅｃｈｓｔ用のＷＵ蛍光キューブ）下で写真撮影した。

培養した細胞中のｄｓＲＮＡによるＹＦＰ発現の阻害に関する結果を、図３〜図９に要約する：一過性トランスフェクション後のＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞におけるＹＦＰ特異的ｄｓＲＮＡおよびコントロールｄｓＲＮＡのＹＦＰ発現に対する効果を、図３、４、５、および６に要約する。実験は、試験プロトコルに記載されるように行った。ｄｓＲＮＡの濃度は、トランスフェクション反応の間の培地中の濃度に関連する。ｄｓＲＮＡの表示は、表２に見いだされ得る。それは、表面の割合に関して、写真像あたりの相対的な蛍光を示す。３つの異なる写真像をウェルあたり分析した。平均値は、３つの像から得る。

ＨＥＬＡ−Ｓ３細胞中でのＹＦＰ遺伝子発現のｄｓＲＮＡによる特異的阻害を、図７および図９に示す。図７は、ＹＦＰのＨｅＬａ細胞中での発現に対する、種々の濃度でさまざまに構成されたｄｓＲＮＡ構築物の阻害作用を示す（表２）。図８は、ｄｓＲＮＡなし、および特異的抗ＹＦＰ指向性ｄｓＲＮＡありで、ＹＦＰで一過性にトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞の代表的な蛍光顕微鏡像を示す（倍率１００倍）。
８Ａ：ＹＦＰコントロール
８Ｂ：Ｓ１、１０ｎＭ
８Ｃ：Ｓ４、１０ｎＭ
８Ｄ：Ｓ７、１０ｎＭ
８Ｅ：Ｓ７／Ｓ１１、１ｎＭ
８Ｆ：Ｓ７／Ｓ１２、１ｎＭ。

図９は、ｄｓＲＮＡなし、および特異的抗ＹＦＰ指向性ｄｓＲＮＡありで、ＹＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＬＡ−３Ｓ細胞の代表的な蛍光顕微鏡像を示す（倍率１００倍）。
９Ａ：Ｋ２コントロール、１０ｎＭ
９Ｂ：Ｓ１、１０ｎＭ
９Ｃ：Ｓ４、１０ｎＭ
９Ｄ：Ｓ７、１０ｎＭ
９Ｅ：Ｓ７／Ｓ１１、１ｎＭ
９Ｆ：Ｓ７／Ｓ１２、１ｎＭ
９Ｇ：Ｓ１Ａ／Ｓ４Ｂ、１０ｎＭ
９Ｈ：ＹＦＰコントロール。

結果：
図３は、ＹＦＰプラスミドおよび特異的抗ＹＦＰ配列指向性ｄｓＲＮＡでのマウス線維芽細胞の一過性同時トランスフェクション後のＹＦＰ発現が、ｄｓＲＮＡの２２塩基対含有領域および１９塩基対含有領域の３’末端が、２ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖セグメントを有する場合に、特に効果的に阻害され得ることを示す。平滑３’末端を有するＳ１ｄｓＲＮＡが、１ｎＭの濃度（トランスフェクションの間の細胞培養培地中の濃度に関して）でＹＦＰ発現に対して阻害効果を示さないのに対して、Ｓ７ｄｓＲＮＡ（１９ヌクレオチド対）およびＳ４（２２ヌクレオチド対）（各々２ｎｔオーバーハングを両方の３’末端に有する）は、対応するコントロールｄｓＲＮＡ（Ｋ３およびＫ２）に比較して、ＹＦＰ発現を、それぞれ５０％および７０％阻害した。１０ｎＭの濃度で、Ｓ１と表示された平滑末端を有するｄｓＲＮＡは、ＹＦＰ発現を約６５％阻害するのに対して、Ｓ４ｄｓＲＮＡは、ＹＦＰ発現を約９３％阻害する（図４）。Ｓ４およびＳ７と表示されたｄｓＲＮＡの阻害効果は、濃度依存的である（図３および図４；図７もまた参照のこと）。

図４は、両方の（センスおよびアンチセンス鎖の）３’末端での一本鎖構造が、ＹＦＰ遺伝子発現の効率的な抑制にとって必要ではないことを示す。ＹＦＰ発現の効率的阻害を達成するために、アンチセンス鎖の３’末端での２ｎｔのオーバーハングのみが必要である。したがって、Ｓ４ｄｓＲＮＡ（両方の３’末端での２ｎｔのオーバーハング）およびＳ１Ａ／Ｓ４Ｂ（アンチセンス鎖の３’末端での１つの２ｎｔオーバーハング）の両方について、１ｎＭの濃度でのＹＦＰ発現の阻害は、約７０％である。しかし、一方で、２ｎｔのオーバーハングがセンス鎖の３’末端に位置している場合（かつ、アンチセンス鎖の３’末端が一本鎖領域を有さない場合）、ＹＦＰ遺伝子発現の阻害は５０％である。同様に、より高濃度での阻害は、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端が２ｎｔオーバーハングを有する場合、顕著により良好である。

ＹＦＰ発現のより顕著な阻害は、塩基対領域が、２２（Ｓ１およびＳ４）、２０（Ｓ１３またはＳ１３／１４）、または１９（Ｓ７）ではなく、２１ヌクレオチド対を有する場合に達成される（図５、６、および７）。したがって、５ｎＭの濃度において、ＹＦＰ発現のＳ１（２２塩基対であって平滑末端を有する）による阻害は、約４０％であるのに対して、Ｓ７／Ｓ１２（２１塩基対であって平滑末端）による阻害（これもまた５ｎＭで）は、約９２％である。２１塩基対を有するｄｓＲＮＡがさらに２ｎｔのオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端に有する場合（Ｓ７／Ｓ１１）、阻害は約９７％である（Ｓ４による約７３％の阻害およびＳ７による約７０％の阻害と比較のこと）。

ＩＩＩ．二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の血清安定性の分析：
細胞培養物中で見出されたｄｓＲＮＡによって仲介される標的遺伝子の遺伝子発現に対する阻害の有効性を、インビボで使用するために増強することが、本発明の目的である。これは、血清中でのｄｓＲＮＡの安定性を改善する事によって、および血液循環における分子の保持時間を増大させることによって、あるいは上記よりもたらされる機能的分子の有効濃度を増大させることによって、達成される。

実施例：
ＧＦＰ発現阻害ｄｓＲＮＡの血清安定性を、マウスおよびヒト血清においてエキソビボで試験した。

試験プロトコル：
ヒトおよびマウスの血清の、対応するｄｓＲＮＡとのインキュベーションを、３７℃で行った。各々の場合において、８５μｌの血清を１５μｌの１００μＭｄｓＲＮＡとともにインキュベートした。所定のインキュベーション時間（３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間）の後、サンプルを−８０℃で凍結させた。０時間における血清なしのｄｓＲＮＡ（＋８５μｌｄｄＨ₂Ｏ）および血清ありのｄｓＲＮＡを、コントロールとして使用した。

ｄｓＲＮＡをそのインキュベーションから単離するために（氷上で行った）、４００μｌの０．１％ＳＤＳを各インキュベーションに添加し、次いでそれらをフェノール抽出し（５００μｌフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ＩＡＡ、２５：２４：１、Ｒｏｔｉフェノール、Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を各インキュベーションに添加した）、次いで最高の設定で３０秒間ボルテックスにかけた（ＶｏｒｔｅｘＧｅｎｉｅ−２、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）。１０分間氷上でインキュベートした後、相分離を、１２，０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ３Ｋ３０、Ｒｏｔｏｒ１２１３１−Ｈ）によって行った。上部の水性相（約２００μｌ）を回収し、次いで分解に供し（まずＤＮａｓｅＩ、次いでプロテイナーゼＫ（２０μｌ１０×ＤＮａｓｅ緩衝液（１００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＣａＣｌ₂）））、そして１０ＵＤＮａｓｅＩ（Ｄ７２９１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、３０分間、３７℃でインキュベートし、次いで、６ＵＤＮａｓｅＩを再び添加し、さらに２０分間３７℃でインキュベートした。次いで、５μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、０４−１０７５、Ｐｅｑｌａｂ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、そして３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、フェノール抽出を行った。５００μｌのフェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（２５：２４：１）をこれに添加して、３０秒間、最高設定でボルテックスし、次いで、１０分間、１２，０００×ｇおよび４℃で遠心分離した。上清液を捨て、順次４０μｌの３ＭＮａ−Ａｃ（酢酸ナトリウム）、ｐＨ５．２および１ｍｌ１００％ＥｔＯＨに交換した。これを十分に混合させ、そして少なくとも１時間−８０℃で沈殿させた。沈殿物を１２，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによってペレット化し、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、そして再び遠心分離した（１０分間、１２，０００×ｇ、４℃）。次いで、風乾したペレットを３０μｌのＲＮＡゲル適用緩衝液（７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ［０．０９Ｍトリスホウ酸緩衝液、０．００２M ＥＤＴＡ、０．０２％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー、０．２％［ｗ／ｖ］キシレンシアノール］）中で混合し、ゲルに適用するまで−２０℃で保存した。

ｄｓＲＮＡの特徴付けをするために、分析用変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分析用ＰＡＧＥ）を行った。尿素ゲルをランの直前に作製した：７Ｍ尿素（２１ｇ）を、２５ｍｌの４０％水性アクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液（Ｒｏｔｉｐｈｏｒｅｓｉｓゲル、Ａ５１５．１、Ｒｏｔｈ）および５ｍｌの１０×ＴＢＥ（１リットルの蒸留水当たり１０８ｇトリス、５５ｇホウ酸、３．９ｇＥＤＴＡ）中で攪拌しながら溶解し、そして蒸留水で５０ｍｌに希釈した。注ぎ入れる直前に、５０μｌＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）および５００μｌの１０％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を添加した。重合化の後に、ゲルを直立型電気泳動装置（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）に配置し、そして最初の分画を３０分間、４０ｍＡの一定アンペアで行った。１×ＴＢＥ緩衝液を、泳動用緩衝液として使用した。ゲルにアプライする前に、ＲＮＡサンプルを５分間１００℃で加熱し、氷上で冷却し、次いで２０秒間卓上遠心分離機（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭｉｎｉｓｐｉｎ）上で遠心分離した。１５μｌの各サンプルをゲルにアプライした。テストランは、４０ｍＡの一定アンペアで約２時間続けて行った。ラン後、ゲルをステインオール染色液（２０ｍｌのステインオール溶液［２００ｍｌのホルムアミドに溶解した２００ｍｇステインオール］、２００ｍｌの蒸留水および１００ｍｌのホルムアルデヒド）で染色し、次いでバックグラウンド染色を、蒸留水で４５分間すすぐことによって除去した。そのゲルを、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＶＤＳ写真記録システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して写真撮影した。図１０〜１７は、ヒト血清またはマウス血清とのインキュベーション後の２０％７Ｍ尿素ゲル中での電気泳動分離後のｄｓＲＮＡの血清安定性を示す。
図１０：マウス血清中でのＳ１（０−２２−０）のインキュベーション
１．０時間（血清なし）
２．０時間
３．３０分間
４．１時間
５．２時間
６．４時間
７．１２時間
８．２μｌの１００μＭＳ１（インキュベーションなし）
Ｓ１Ａ）センス鎖Ｓ１（１０μｌの２０μＭＳ１Ａ）
Ｓ１Ｂ）アンチセンス鎖Ｓ１（１０μｌ２０μＭＳ１Ｂ）。

図１１：ヒト血清中でのＳ１（０−２２−０）のインキュベーション
１．２μｌの１００μＭＳ１（非処理）（インキュベーションなし）
２．３０分間
３．２時間
４．４時間
５．６時間
６．８時間
７．１２時間
８．２４時間
Ｓ１Ａ）センス鎖Ｓ１（１０μｌの２０μＭＳ１Ａ）
Ｓ１Ｂ）アンチセンス鎖Ｓ１（１０μｌの２０μＭＳ１Ｂ）。

図１２：マウス血清中でのＳ７（２−１９−２）のインキュベーション
１．０時間（血清なし）
２．３０分間
３．４時間
４．１２時間。

図１３：ヒト血清中でのＳ７（２−１９−２）のインキュベーション
１．センス鎖Ｓ７（１０μｌの２０μＭＳ７Ａ）
２．アンチセンス鎖Ｓ７（１０μｌ２０μＭＳ７Ｂ）
３．３０分間
４．１時間
５．２時間
６．４時間
７．６時間
８．１２時間
９．２４時間
１０．０時間（血清なし）。

図１４：マウス血清中でのＫ３（２−１９−２）のインキュベーション
１．センス鎖Ｋ３（１０μｌの２０μＭＫ３Ａ）
２．アンチセンス鎖Ｋ３（１０μｌの２０μＭＫ３Ｂ）
３．０時間（血清なし）
４．０時間（血清あり）
５．３０分間
６．１時間
７．２時間
８．４時間
９．１２時間。

図１５：マウス血清中でのＰＫＣ１／２（０−２２−２）のインキュベーション
１．３０分間
２．１時間
３．２時間
４．４時間
５．１２時間
６．２μｌの１００μＭＰＫＣ１／２（非処理）。

図１６：ヒト血清中でのＳ１Ａ／Ｓ４Ｂ（０−２２−２）のインキュベーション
１．０時間（血清なし）
２．２４時間
３．１２時間
４．８時間
５．６時間
６．４時間
７．２時間
８．３０分間
９．センス鎖Ｓ１Ａ（１０μｌの２０μＭＳ１Ａ）
１０．アンチセンス鎖Ｓ４Ｂ（１０μｌの２０μＭＳ４Ｂ）。

図１７：ヒト血清中でのＫ２（２−２２−２）のインキュベーション
１．センス鎖Ｋ２（１０μｌの２０μＭＫ２Ａ）
２．アンチセンス鎖Ｋ２（１０μｌの２０μＭＫ２Ｂ）
３．０時間（血清なし）
４．３０分間
５．２時間
６．４時間
７．６時間
８．８時間
９．１２時間
１０．２４時間。

結果：
３’末端に一本鎖領域のないｄｓＲＮＡは、一本鎖２ｎｔオーバーハングを３’末端に有するｄｓＲＮＡよりも、ヒト血清およびマウス血清の両方において顕著に安定である（図１０〜１４および図１７）。マウス血清およびヒト血清の両方におけるＳ１のインキュベーションの１２時間後および１４時間後のそれぞれにおいて、元のサイズの１つのバンドは、ほとんど完全に元の状態のままである。対照的に、両方の３’末端に２ｎｔのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡの安定性は、ヒト血清およびマウス血清の両方において顕著に減少している。Ｓ７（図１２および１３）またはＫ３（図１４）のインキュベーションのわずか４時間後においてさえ、元のサイズのバンドでなお検出可能なものはない。

ｄｓＲＮＡの血清中での安定性を増強するためには、ｄｓＲＮＡが１つの平滑末端を有していれば十分である。元のサイズのバンドは、Ｓ７（４時間後に完全に分解した；図１２、トラック３）と比較して、４時間のインキュベーション後にマウス血清においてほとんど全く分解していない（図１５；トラック４）。

ｄｓＲＮＡの生物学的有効性に関する１つの最適な妥協案は、１つの平滑末端および１つの２ヌクレオチド一本鎖領域を有するｄｓＲＮＡの使用であり得る。ただしここで、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に位置している。

本明細書において使用される配列は、以下の表２および配列番号１４８〜１５１および１５３〜１６７に再生される。

ＩＶ．インビボ研究：
ＧＦＰ配列および非特異的ｄｓＲＮＡそれぞれに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、タンパク質生合成に関与する全ての細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する「ＧＦＰラボマウス」の尾静脈に注入した。実験の終わりに、その動物を屠殺し、そして組織切片および血漿ＧＦＰ発現を分析した。

試験プロトコル：
ｄｓＲＮＡ生合成：
配列表に見出される個々のＲＮＡ鎖ならびにそれらの相補的な個々の鎖を、ＲＮＡシンセサイザ（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および従来の化学的手法を使用して合成した。次いで、生合成の原産物の精製を、ＨＰＬＣを用いて行った。ＮｕｃｌｅｏＰａｃＰＡ−１００、９×２５０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用した：２０ｍＭトリス、１０ｍＭＮａＣｌＯ₄、ｐＨ６．８、１０％アセトニトリルを低塩緩衝液として使用し、そして２０ｍＭトリス、４００ｍＭＮａＣｌＯ₄、ｐＨ６．８、１０％アセトニトリルを高塩緩衝液として使用した。流速は３ｍｌ／分であった。個々の鎖の、二本鎖へのハイブリダイゼーションを、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８、１００ｍＭＮａＣｌ中で個々の鎖の化学量論的混合物を、８０〜９０℃に加熱し、次いでそれを室温まで６時間かけてゆっくり冷却することによって行った。

試験動物条件および実験の手順：
トランスジェニック実験マウス系統ＴｇＮ（ＧＦＰＵ）５Ｎａｇｙ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）を使用した；この系統は、以前に試験された全ての細胞においてＧＦＰ（βアクチンプロモーターおよびＣＭＶ中間初期エンハンサーを有する）を発現することが示されている（ＨａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓＡＫら、１９９３、ＭｅｃｈＤｅｖ．７６：７９−９０；ＨａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓＡＫら、１９９８、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１９：２２０−２２２）。ＧＦＰトランスジェニックマウスは、蛍光に基づいて（手持ち用ＵＶランプを使用して）対応する野生型（ＷＴ）から容易に区別され得る。対応するＷＴは、増殖目的のために、ヘテロ接合体ＧＦＰ型と常に対合させた。実験は、ドイツ動物権利法に従って行った。動物を、ＩＩＩ型Ｍａｋｒｏｌｏｎケージ（Ｅｈｒｅｔ，Ｅｍｍｅｎｄｉｎｇｅｎ）において、２２℃の一定温度で、かつ１２時間の昼／夜周期で、３〜５匹の動物のグループで制御された環境下で維持した。８／１５ソフト木粒の経木（Ａｌｔｏｍｉｎ、Ｌａｇｅ）を使用した。動物には、水道水および標準的食餌（Ａｌｔｏｒｍｉｎ１３２４ペレット）を自由に与えた。

実験に使用したヘテロ接合体ＧＦＰ動物を、上記のように３匹の動物のグループにしてケージの中で維持した。ｄｓＲＮＡ溶液の注射を、尾静脈の静脈内に（ｉ．ｖ．）１２時間周期で（５：３０と７：００との間および１７：３０と１９：００との間）、５日間の期間にわたって行った。注入容量は、６０μｌ／１０ｇ体重であり、用量は、体重１ｋｇあたりそれぞれ２．５ｍｇｄｓＲＮＡまたは５０μｇであった。そのグループは以下のように分けられた：
グループＡ：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）をそれぞれ６０μｌ／１０ｇ体重、
グループＢ：非特異的コントロールｄｓＲＮＡ（平滑末端および２２ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有するＫ１コントロール）を２．５ｍｇ／ｋｇ体重、
グループＣ：別の非特異的コントロールｄｓＲＮＡ（両方の３’末端に２ｎｔオーバーハングを有し、かつ１９ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有するＫ３コントロール）を２．５ｍｇ／ｋｇ体重、
グループＤ：ｄｓＲＮＡ（平滑末端および２２ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有する特異的抗ＧＦＰ指向性（以下、Ｓ１と呼ぶ））を２．５ｍｇ／ｋｇ体重、
グループＥ：ｄｓＲＮＡ（両方の鎖の３’末端に２ｎｔのオーバーハングを有し、かつ１９ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有する、特異的抗ＧＦＰ（以下、Ｓ７と呼ぶ）を２．５ｍｇ／ｋｇ体重、
グループＦ：５０μｇＳ１ｄｓＲＮＡ／ｋｇ体重（すなわち、グループＤの１／５０の用量）。

合計１０回の注入の最後の注入の後、動物を１４〜２０時間後に屠殺し、そして臓器および血液を以下に記載されるように除去した。

臓器除去：
動物をＣＯ₂吸入により屠殺した直後に、その血液および種々の臓器（胸腺、肺（ａｌｏｎｇ）、心臓、脾臓、胃、腸、膵臓、脳、腎臓、および肝臓）を除去した。その臓器を冷滅菌ＰＢＳで素早くすすぎ、滅菌したメスを使用して小片に切断した。一部分を、免疫組織化学染色のために２４時間メチルカルノア（ＭＣ，６０％メタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）中で固定した；一部分を、液体窒素中で迅速に瞬時凍結（ｆｌａｓｈｆｒｏｚｅｎ）させ、そして凍結切片を作製するためおよびタンパク質単離のために、−８０℃で保存した；そして、別のより小さな部分をＲＮＡｅａｓｙＰｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）中で、−８０℃で、ＲＮＡ単離のために凍結させた。除去した後すぐに、血液を３０分間氷上に置き、混合し、そして５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｍｉｎｉスピン、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。その上清液（本明細書中では血漿と呼ぶ）を捨て、そして−８０℃で保存した。

生検の処理：
組織をＭＣ中で２４時間固定した後、その組織片を、室温で、漸増濃度の一連のアルコール中で脱水した：７０％メタノール、８０％メタノール、２×９６％メタノール、および３×１００％イソプロパノールをそれぞれ４０分間。その後、その組織を１００％イソプロパノール中、６０℃で、インキュベータ中で暖め、その後イソプロパノール／パラフィン混合物中で１時間６０℃でインキュベートし、そしてパラフィン中で２時間のインキュベーションを３回行い、次いでパラフィン中に埋め込んだ。イムノペルオキシダーゼ染色のために、３μｍの厚さの組織切片を、回転ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して調製し、スライドガラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ，Ｖｏｇｅｌ）上に置き、そしてインキュベータ中で、６０℃で３０分間インキュベートした。

ＧＦＰのイムノペルオキシダーゼ染色：
切片をキシロール中で５分間、３回パラフィン除去し、漸減濃度の一連のアルコール（１００％エタノールで３分間を３回、９５％エタノールで２分間を２回）で再水和し、次いで３％Ｈ₂Ｏ₂／メタノール中でインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。以下に記載する全てのインキュベーション工程は、湿室中で行った。ＰＢＳで３分間３回洗浄した後、インキュベーションを一次抗体（ヤギ抗ＧＦＰ、ｓｃ−５３８４、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００希釈）で、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、４℃で終夜行った。次いで、ビオチン化二次抗体（ロバ抗ヤギ；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：２０００希釈）でのインキュベーションを、３０分間、室温で行い、その後アビジンＤペルオキシダーゼ（１：２０００希釈、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにインキュベートした。各抗体のインキュベーションの後、その切片をＰＢＳ中で３分間３回洗浄し、そしてその緩衝液の残渣および細胞細片をその切片から除去した。全ての抗体を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ中にて希釈した。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）での染色を、ＤＡＢ基質キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、製造業者の指示書に従って行った。ＧｉｌｌのヘマトキシリンＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ）を、核対比染色のために使用した。漸増濃度の一連のアルコールおよび５分間３回のキシロール中での脱水後、その切片をＥｎｔｅｌｌａｎ（Ｍｅｒｃｋ）で被覆した。その染色の顕微鏡分析を、ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を装着したオリンパスＩＸ５０顕微鏡を使用して行った。

組織片からのタンパク質の単離：
８００μｌの単離緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭＥＤＴＡ；２．５ｍＭＥＧＴＡ；１０％グリセロール；０．１％Ｔｗｅｅｎ；１ｍＭＤＤＴ；１０ｍＭ β−グリセリンリン酸；１ｍＭＮａＦ；０．１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄（Ｒｏｃｈｅ製の「完全」プロテアーゼインヒビタータブレットを含む））を、まだ凍結している組織片の各々に添加し、次いで３０秒間を２回、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（ＤＩＡＸ９００、６Ｇジスペーサー、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）を使用してホモジナイズし、ホモジナイゼーション工程の合間には氷上で冷却した。氷上での３０分間のインキュベーションの後、それを混合し、そして１０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離（３Ｋ３０、Ｓｉｇｍａ）した。次いで、その上清液を再び氷上で１０分間インキュベートし、混合し、そして２０分間、１５，０００×ｇで遠心分離した。次いで、タンパク質の決定を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６（Ｚｏｒ＆Ｓｅｌｉｎｇｅｒ、１９９６にしたがって改変）に従って、Ｒｏｔｉ−Ｎａｎｏｑｕａｎｔシステム（Ｒｏｔｈ）を製造業者の指示書に従って使用して、その上清液に対して行った。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でタンパク質較正のために使用した。

ＳＤＳゲル電気泳動：
タンパク質の電気泳動による分離を、Ｂｉｏｍｅｔｒａから入手したＭｕｌｔｉｇｅｌ−Ｌｏｎｇ電気泳動チャンバにおいて、Ｌａｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ２７７：６８０−６８５、１９７０）に従って変性不連続１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって行った。この上部に、分離ゲル（７．５ｍｌアクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％、０．９％）、３．８ｍｌ１．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．４、１５０μｌの１０％ＳＤＳ、３．３ｍｌ二重蒸留水、２５０μｌ硫酸アンモニウム［１０％］、９μｌＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン））を１．５ｍｍの厚さまで流し入れ、そして０．１％ＳＤＳを重合が起こるまで重層した。次いで、収集ゲルを流し込んだ（０．８３μｌアクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％／０．９％）、６３０μｌの１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３．３ｍｌ二重蒸留水、５０μｌの１０％ＳＤＳ、５０μｌの１０％過硫酸アンモニウム、５μｌＴＥＭＥＤ）。

ゲルにアプライする前に、対応する量の４×サンプル緩衝液（２００ｍＭトリス、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、１００ｍＭＤＴＴ［ジチオスレイトール］、０．０２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセリン）をタンパク質に添加し、そして熱ブロック上で１００℃で変性した。氷上で冷却した後、これを迅速に遠心分離し、そしてゲルにアプライした。同量の血漿またはタンパク質（３μｌ血漿、または２５μｇ全タンパク質）を、各トラックに使用した。冷水冷却電気泳動を室温で一定５０Ｖで行った。ＢｉｏＲａｄ（ＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＳｔａｎｄａｒｄ）から入手したタンパク質ゲルマーカーを、標準長として使用した。

ウエスタンブロットおよび免疫検出：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＰＶＤＦ（２フッ化ポリビニル）膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）へのタンパク質の転写を、Ｋｙｈｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１０：２０３−２１０、１９８４）に従う半乾法を使用して、室温で０．８ｍＡ／ｃｍ²の一定アンペアで、１．５時間行った。トリス／グリシン緩衝液（３９ｍＭＧｌｙ、４６ｍＭトリス、０．１％ＳＤＳ、および２０％メタノール）を転写緩衝液として使用した。電気泳動による転写を分析するために、ブロット後ゲルおよびブロット膜の両方を、免疫検出後にクーマシー（０．１％クーマシーＧ２５０、４５％メタノール、１０％氷酢酸）を使用して染色した。そのブロット膜を、転写後に、１％脱脂粉乳／ＰＢＳ中で、室温で１時間インキュベートして、非特異的バンドを飽和させた。その後、３分間０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄した。その後の抗体のインキュベーションおよび洗浄は全て、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳを使用して行った。一次抗体（ヤギ抗ＧＦＰ、ｓｃ−５３３４、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、１：１０００希釈で、室温で１時間行った。その後、５分間の洗浄を３回行い、二次抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、室温で１時間、１：１０，０００希釈で標識した。次いで、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を製造業者の指示書に従って使用して、検出を行った。

図１８〜２０は、３μｍのパラフィン切片上での、特異的抗ＧＦＰ指向性ｄｓＲＮＡを静脈内注射した後のＧＦＰ発現の阻害を示す（抗ＧＦＰイムノペルオキシダーゼで染色した）。テストランにおいて、２２ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有し、３’末端にオーバーハングを有さない抗ＧＦＰ指向性ｄｓＲＮＡ（Ｄ）および対応する非特異的コントロールｄｓＲＮＡ（Ｂ）、ならびに１９ヌクレオチド対を含む二本鎖領域を有し、３’末端に２ｎｔのオーバーハングを有する特異的抗ＧＦＰ指向性ｄｓＲＮＡ（Ｅ）および対応する非特異的コントロールｄｓＲＮＡ（Ｃ）を、５日間にわたって１２時間ごとに交代で行った。（Ｆ）はグループＤの投薬量の１／５０を受けた。ｄｓＲＮＡ（Ａ）を受けなかった動物および野生型動物はまた、さらなるコントロールとして試験した。図１８は腎臓切片におけるＧＦＰ発現の阻害を、図１９は心臓組織切片におけるＧＦＰ発現の阻害を、図２０は膵臓組織におけるＧＦＰ発現の阻害を、示す。血漿および組織中でのＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を、図２１〜２３に示す。図２１は、血漿中でのＧＦＰ発現の阻害を示す；図２２は、腎臓組織中でのＧＦＰ発現の阻害を示す；図２３は、心臓組織中でのＧＦＰ発現の阻害を示す。種々の動物からの全タンパク質単離物を適用したものを図２３に示す。同量の全タンパク質を、各トラックに適用した。非特異的コントロールｄｓＲＮＡを受けた動物（グループＢとＣの動物）において、ＧＦＰ発現は、ｄｓＲＮＡを全く受けなかった動物と比較して減少しなかった。２ｎｔオーバーハングを両方の鎖の３’末端に含み、かつ１９ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を含む特異的抗ＧＦＰ指向性ｄｓＲＮＡを受けた動物は、非処理動物と比較して、試験した組織（心臓、腎臓、膵臓、および血液）中でのＧＦＰ発現の有意な阻害を示した（図１８〜２３）。平滑末端を有し、かつ２２ヌクレオチド対を含む二本鎖領域を有する特異的抗ＧＦＰ指向性ｄｓＲＮＡを与えられたグループＤおよびＦにおける動物において、ｄｓＲＮＡを１日当たり５０μｇ／ｋｇ体重の投薬量で与えられた動物のみが、ＧＦＰ発現の特異的阻害を示した。しかし、これはグループＥの動物よりも顕著ではなかった。

組織切片およびウエスタンブロットでのＧＦＰ阻害の要約的分析は、ＧＦＰ発現の阻害が、血液および腎臓で最も強いことを示す（図１８、２１、および２２）。

Ｖ．ＥＧＦＲ過剰発現またはＥＧＦＲ誘導型増殖によって特徴付けられる癌の形態に対する治療的アプローチとしての、ｄｓＲＮＡでのＥＧＦレセプターの遺伝子発現の阻害：
上皮成長因子（＝ＥＧＦ）レセプター（＝ＥＧＦＲ）は、チロシンキナーゼレセプターに属する。チロシンキナーゼレセプターは、細胞増殖、細胞分化、遊走プロセス、および細胞活力のような一連の細胞内プロセスの制御に関与する固有のチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質である（ＶａｎｄｅｒＧｅｅｒら、１９９４に概説される）。ＥＧＦＲファミリーは、膜貫通ドメイン、システインリッチ細胞外ドメイン、および触媒性細胞内ドメインを有する４つのメンバー、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）からなる。ＥＧＦＲ配列（１７０ｋＤａのタンパク質）は、１９８４年以来公知である（Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８４）。

ＥＧＦＲは、ＥＧＦ、ＴＧＦα（トランスフォーミング成長因子）、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、およびニューレギュリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）のようなペプチド増殖因子によって活性化される。リガンド結合は、ホモダイマーまたはへテロダイマーの形成、およびその後の細胞質チロシンの自己リン酸化を誘導する（Ｕｌｌｒｉｃｈ＆Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，１９９０；Ａｌｒｏｙ＆Ｙａｒｄｅｎ，１９９７）。リン酸化されたアミノ酸は、複雑なネットワークにおけるシグナル伝達の近位の段階に関与する多数のタンパク質の結合部位を形成する。ＥＧＦＲは最も多様な腫瘍疾患に関与し、そしてそれゆえ、治療的アプローチにとって適切な標的である（Ｈｕａｎｇ＆Ｈａｒａｉ，１９９９）。異常ＥＧＦＲ活性を導くメカニズムは、過剰発現、増幅、変異体レセプター形態の構成性活性化、または自己分泌ループに関連し得る（Ｖｏｌｄｖｅｒｇら、１９９７）。ＥＧＦＲの過剰発現は、乳癌（Ｗａｌｋｅｒ＆Ｄｅａｒｉｎｇ，１９９９）、非小（ｎｏｎ−ｍｉｎｏｒ）肺癌（Ｆｏｎｔａｎｉｎｉｉｉら、１９９８）、膵臓癌、結腸癌、（Ｓａｌｏｍｏｎら、１９９５）、およびグリア芽細胞腫（Ｒｉｅｓｋｅら、１９９８）のような一連の腫瘍について記載されている。特に、悪性グリア芽細胞腫については、現在まで、有効かつ特異的な治療剤は存在していない。

実施例：
ＥＧＦＲ遺伝子発現の特異的阻害におけるｄｓＲＮＡの有効性を検出するために、Ｕ−８７ＭＧ細胞（ヒトグリア芽細胞腫細胞）、ＥＣＣＡＣ（動物細胞培養物のヨーロッパコレクション）Ｎｏ．８９０８１４０２を用い、そして、特異的な抗ＥＧＦレセプター指向性のｄｓＲＮＡ（配列番号５１）でトランスフェクションした。インキュベーションの約７２時間後に、細胞を回収し、タンパク質を単離し、そしてＥＧＦＲの発現をウエスタンブロットにより分析した。

試験プロトコル：
ｄｓＲＮＡ合成：
配列表に示す個々のＲＮＡ鎖およびそれらの相補的な個々の鎖を、ＲＮＡシンセサイザ（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、および従来の化学的手法によって合成した。次いで、合成の原産物の精製を、ＨＰＬＣを用いて行った。ＮｕｃｌｅｏＰａｃＰＡ−１００、９×２５０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用い、２０ｍＭトリス、１０ｍＭＮａＣｌＯ₄、ｐＨ６．８、１０％アセトニトリルを低塩緩衝液として、そして２０ｍＭトリス、４００ｍＭＮａＣｌＯ₄、ｐＨ６．８、１０％アセトニトリルを高塩緩衝液として用いた。フローは３ｍｌ／分であった。個々の鎖の二本鎖へのハイブリダイゼーションを、１０ｍＭリン酸ナトリウム塩緩衝液、ｐＨ６．８、１００ｍＭＮａＣｌ中で個々の鎖の化学量論的混合物を８０〜９０℃に加熱し、次いでそれを室温まで６時間かけてゆっくりと冷却することによって行った。

細胞の播種：
全ての細胞培養を、適切なワークステーション（ＨＳ１８／ＨｅｌａＳａｆｅ、Ｋｅｎｄｒｏ、Ｈｅｒａｅｕｓ）において無菌条件下で行った。Ｕ−８７ＭＧ細胞の培養は、インキュベータ（ＣＯ₂インキュベータＴ２０、Ｈｅｌａ細胞、Ｋｅｎｄｒｏ、Ｈｅｒａｅｕｓ）中で、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、１×ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／１００μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ修飾イーグル培地、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で、３７℃、５％ＣＯ₂の飽和大気湿度中で行った。細胞の指数関数的な増殖状態を維持するために、細胞を３日ごとに継代した。トランスフェクションによるｄｓＲＮＡアプリケーションの２４時間前に、細胞をトリプシン処理（１０×トリプシン／ＥＤＴＡ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）し、１．５μｌの増殖培地が入った６ウェルプレート（６ウェルプレート、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ＆ＷｅｉｓｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＧｍｂＨ）の中に配置した。

培養したＵ−８７ＭＧ細胞中でのｄｓＲＮＡのアプリケーション
ｄｓＲＮＡのアプリケーションを、製造業者の指示書に従い、オリゴフェクタミン^TM試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクションすることによって行った。全トランスフェクション容量は１ｍｌであった。最初に、ｄｓＲＮＡを、無血清培地に希釈した：ウェルごとに、特異的な抗ＥＧＦＲ指向性ｄｓＲＮＡの２０μＭストック溶液の０．５μｌおよび非特異的ｄｓＲＮＡの２０μＭストック溶液の９．５μｌ（Ｋ１Ａ／Ｋ２Ｂ）を、１７５μｌの血清フリーの培地（トランスフェクションインキュベート中の２００ｎＭｄｓＲＮＡまたは１０ｎＭの特異的ＥＧＦＲ−ｄｓＲＮＡ）で希釈した。オリゴフェクタミン^TM試薬もまた、無血清培地で希釈した：各ウェルに３μｌを１２μｌの培地に加え、その後、室温で１０分間インキュベートした。次いで、希釈したオリゴフェクタミン^TM試薬を希釈したｄｓＲＮＡの培地に添加し、混合し、室温でさらに２０分間インキュベートした。培地をインキュベーションの間に交換した。細胞を１ｍｌの無血清培地で１回洗浄し、ｄｓＲＮＡ／オリゴフェクタミン^TM試薬を添加するまで、インキュベータ内で８００μｌの無血清培地とのインキュベートを続けた。ウェル当たり２００μｌのｄｓＲＮＡ／オリゴフェクタミン^TM試薬を添加後、タンパク質の単離を行うまでインキュベータ内での細胞のインキュベートを続けた。

タンパク質単離：
トランスフェクションのおよそ７２時間後、細胞を回収し、タンパク質を単離した。培地を取り除き、そして細胞単層をＰＢＳで１回洗浄した。２００μｌのタンパク質単離緩衝液（１×「完全」プロテアーゼインヒビター、Ｒｏｃｈｅ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセリン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭ β−リン酸グリセリン、１ｍＭＮａＦ、０．１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄）を添加後、細胞を細胞スクレイパーで取り除き、氷上で１０分間インキュベートしてエッペンドルフ試薬管に移し、そして−８０℃で少なくとも３０分間保存した。解凍後、溶解物をディスペンサー（ＤＩＡＸ９００、６Ｇディスペンサー、ＨｅｉｄｏｌｐｈＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＧｍｂＨ、Ｓｃｈｗａｂａｃｈ）で、３番目の設定で１０秒間ホモジナイズし、氷上で１０分間インキュベートし、そして４℃、１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した（３Ｋ３０、Ｓｉｇｍａ）。ブラッドフォードに従ったタンパク質の決定は、製造業者の指示書に従って、Ｒｏｔｈ（ＲｏｔｈＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）から入手したＲｏｔｉ−Ｎａｎｏｑｕａｎｔシステムを用いて上清流体で行った。適切に希釈した２００μｌのタンパク質溶液を８００ｍｌの１×ワーキング溶液に混合し、そして、吸光度をベックマン分光光度計（ＤＵ２５０）で蒸留水に対して４５０ｎｍおよび５９０ｎｍでセミマイクロキュベット中で測定した。ＢＳＡ希釈液は、較正のために使用した（ビードＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）。

ＳＤＳゲル電気泳動：
タンパク質のゲル電気泳動分離を、Ｌａｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ２７７：６８０−６８５、１９７０）に従って、変性不連続７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて、Ｂｉｏｍｅｔｒａから入手したＭｕｌｔｉｇｅｌ−Ｌｏｎｇ電気泳動チャンバで行った。この上部に、分離ゲル（３．７５ｍｌアクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％、０．９％）、３．８ｍｌ１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．４、１５０μｌ１０％ＳＤＳ、７．１５ｍｌ蒸留水、１５０μｌ１０％過硫酸アンモニウム、９μｌＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン））を１．５ｍｍの厚みまで流し入れ、そして０．１％ＳＤＳを重合が起こるまで重層した。その後、収集ゲルを流し込んだ（０．８３ｍｌアクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％、０．９％）、６３０μｌ１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３．４ｍｌ蒸留水、５０μｌ１０％ＳＤＳ、５０μｌ１０％過硫酸アンモニウム、５μｌＴＥＭＥＤ）。

ゲルにアプライする前に、４×サンプル緩衝液（２００ｍＭトリス、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、１００ｍＭＤＴＴ［ジチオスレイトール］、０．０２％ブロムフェノールブルー、２０％グリセリン）を、タンパク質に対して１：３の割合で添加し、そして、１００℃で５分間変性した。氷上で冷却後、迅速に遠心分離し、そしてゲルにアプライした。等量のタンパク質を各トラック（３５μｇ全タンパク質）に用いた。水冷ゲルランは、室温で一定５０Ｖで行った。ＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＳｔａｎｄａｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）を、標準長として用いた。

ウエスタンブロットおよび免疫検出：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＰＶＤＦ（２フッ化ポリビニル）膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）へのタンパク質の転写を、Ｋｙｈｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｏｎの半乾式方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１０：２０３−２１０、１９８４）に従って、室温で一定０．５ｍＡ／ｃｍ²で１．５時間行った。カソード緩衝液（３０ｍＭトリス、４０ｍＭグリシン、１０％メタノール、および０．０１％ＳＤＳ、ｐＨ９．４）、アノード緩衝液Ｉ（３００ｍＭトリス、ｐＨ１０．４、１０％メタノール）、およびアノード緩衝液ＩＩ（３０ｍＭトリス、ｐＨ１０．４、１０％メタノール）を転写緩衝液として用いた。ブロットスタックを３ＭＭＷｈａｔｍａｎ紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｌｌ）で組み立てる前に、ゲルをカソード緩衝液でインキュベートし、そしてＰＶＤＦ膜（予め１００％メタノールで３０秒処理した）をアノード緩衝液ＩＩ中で５分間インキュベートした：２層の３ＭＭ紙（アノード緩衝液Ｉ）、１層の３ＭＭ紙（アノード緩衝液ＩＩ）、ＰＶＤＦ膜、ゲル、３層の３ＭＭ紙（カソード緩衝液）。電気泳動の転写を分析するために、ブロット後のゲルおよびブロット膜の両方を、クーマシー（０．１％クーマシーＧ２５０、４５％メタノール、１０％氷酢酸）を用いて免疫検出後に染色した。

転写後、ブロット膜を、１％脱脂粉乳粉末／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で室温１時間インキュベートした。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３分間の洗浄を３回行った。以降の抗体のインキュベーションおよび洗浄は全て、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳを使用して行った。一次抗体（ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン、特異的ヤギＩｇＧ、カタログ番号ＡＦ２３１、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）とのインキュベーションを、１．５μｇ／ｍｌの濃度で室温２時間シェーカー上で行った。その後、５分間ずつ３回洗浄し、１：１０，０００に希釈した二次抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼで標識、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で室温１時間インキュベートした。洗浄（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３分間を３回）後、直ちにＥＣＬ反応（化学発光強化）で検出を行った。１８ｍｌの蒸留水に、２００μｌのＡ溶液（２５０ｍＭルミノール、Ｒｏｔｈ、ＤＭＳＯに溶解）、８９μｌのＢ溶液（９０ｍＭＰクマル酸、Ｓｉｇｍａ、ＤＭＳＯに溶解）、および２ｍｌ３０％Ｈ₂Ｏ₂
溶液をピペットで加えた。膜の大きさによって、４〜６ｍｌを直接膜上にピペットで加えて室温で１時間インキュベートし、次いで直ちにＸ線フィルム（ＢｉｏｍａｘＭＳ、Ｋｏｄａｋ）の上に置いた。ここで用いた配列は、下の表３および配列番号１５３、１５７、１５８、１６８〜１７３に示す。

Ｕ−８７ＭＧグリア芽腫細胞でのＥＧＦＲ発現の阻害：
細胞の播種の２４時間後、それらを上記のように１０ｎＭのｄｓＲＮＡでトランスフェクトした（オリゴフェクタミン）。７２時間後に細胞を回収し、タンパク質を単離した。タンパク質の単離は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。３５μｇの全タンパク質を各トラックにアプライした。図２４は、対応するウエスタンブロット分析を示し、これは、アンチセンス鎖の３'末端に２ｎｔオーバーハングを有する特異的抗ＥＧＦＲ指向性のｄｓＲＮＡを用いて、Ｕ−８７ＭＧ細胞でのトランスフェクション後のＥＧＦＲ発現は、対応するコントロールと比較して顕著に阻害されることを示す。特異的なｄｓＲＮＡを用いた内因性遺伝子のこの発現の阻害は、実施例ＩＩに記載した、一過性のトランスフェクション後に細胞に挿入した人工的な遺伝子の発現を阻害する結果を確認するものである。ＥＳ−７およびＥＳ−８によって仲介されるＥＧＦＲの発現阻害は、明らかに小さくなる。図２４で使用したｄｓＲＮＡを、表３に示す。

ＶＩ．多剤耐性遺伝子１（ＭＤＲ１）の発現の阻害：
試験プロトコル：
ＭＤＲ１発現のブロックのインビトロでの検出を、大腸ガン細胞系ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ−アメリカンタイプカルチャーコレクション；Ｔｏｍら、１９７６）を用いて行った。この細胞系は、ＭＤＲ１の発現が、培養培地にリファンピシンを添加することによって誘導されることが知られている（Ｇｅｉｃｋら、２００１）。トランスフェクションを種々の市販のトランスフェクションキット（リポフェクタミン、オリゴフェクタミンの両方を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ、Ｑｉａｇｅｎから入手）を用いて行い、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒキットがこの細胞系に最も適していることが分かった。

４つの短い二本鎖リボ核酸（Ｒ１〜Ｒ４）を、ＲＮＡ干渉実験の実施のために用いた。これらの配列を表４に示す。リボ核酸は、ＭＤＲ１のコード配列（配列番号３０）の断片に相同である。配列Ｒ１〜Ｒ３は、２２マーのセンス鎖および２４マーのアンチセンス鎖からなり、そしてそれらから生じる二本鎖は、その３'末端で２ヌクレオチドオーバーハングを有する（０−２２−２）。Ｒ４配列はＲ１に対応している；しかしながら、それぞれの３'末端で各々２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９マーの二本鎖を構成する（２−１９−２）。

表４に示す配列を、配列表において、配列番号１４１〜１４７、１５２、１５３、および１５８の配列と指定した。各々の場合においてｄｓＲＮＡを、１７５ｎＭの濃度で二重アッセイとして細胞（１日前に３．８×１０⁵細胞／ウェルで１２ウェルプレートで播種した）に、トランスフェクトした。各トランスフェクションアッセイにおいて、９３．３μｌのＥＣ−Ｒ緩衝液（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）に３．２μｌの促進剤Ｒを混合し、次いでその特定の２０μＭのｄｓＲＮＡを３．５μｌ添加し、よく混合し、そして室温で５分間インキュベートした。ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒトラスフェクト試薬を６μｌ添加後、１０秒間激しく混合し、それから室温で１０分間インキュベートした。その合間に、細胞から培地を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄し、次いでＦＣＳを含まない新鮮な２００μｌの培地を各ウェルの細胞に添加した。１０分間のインキュベート後、１００μｌのＦＣＳフリー培地を各トランスフェクションアッセイにピペットで加え、混合し、次いで混合物を細胞の上に一滴ずつピペットで加えた（４００μｌの培地全容量に対してｄｓＲＮＡの濃度は１７５μＭ）。ｄｓＲＮＡ／ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ複合体を、細胞と共にＦＣＳフリー培地で３７℃で４時間インキュベートした。それから、培地を、１０μＭリファンピシンおよび１０％ＦＣＳを含む新鮮な培地に交換した。ＭＤＲ１遺伝子配列に相同性を示さない非特異的なｄｓＲＮＡ配列をコントロールとして用い、そしてｄｓＲＮＡを除く全ての試薬を含むＭＯＣＫトランスフェクションを実施した。

細胞を２４時間、４８時間、および７２時間で回収し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で除去した。次いで各サンプルからの１０μｇの全ＲＮＡを、１％アガロース−ホルムアミデヒドゲル上で電気泳動することによって分離し、ナイロン膜上でブロットし、次いで、５’−α³²Ｐ−ｄＣＴＰでランダムにマークした特異的なプローブを内部コントロールとして、初めはＭＤＲ１に対してハイブリダイズし、ブロットの除去後はＧＡＰＤＨに対してハイブリダイズし、それからＸ線フィルム上で感光させた。

Ｘ線フィルムを、デジタル化（イメージマスター、ＶＤＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、そしてＩｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔソフトウェアを用いて定量化した。その際、ＭＤＲ１特異的なバンドと、対応するＧＡＰＤＨバンドとの間の調整を行った。

結果：
図２５および２６に、対応するＧＡＰＤＨ値（図２５ｂ、２６ｂ）の調節後の、ＭＤＲ１特異的なバンドの定量的分析を伴うノーザンブロットを示す（図２５ａ、２６ａ）。ＭＤＲ１−ｍＲＮＡは、ＭＯＣＫトランスフェクションと比較すると、５５％の減少が認められ、非特異的コントロールトランスフェクションと比較すると、４５％の減少が認められた。４８時間後に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３と指定した。ｄｓＲＮＡ構築物でのＭＤＲ１−ｍＲＮＡレベルは顕著に減少した（表４）。Ｒ４構築物においては、４８時間後にコントロールと比較して有意な減少は認められなかった（図２６ａおよび２６ｂ）。７４時間後には、４８時間後での値と比較したコントロールと比べ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３においてＭＤＲ１−ｍＲＮＡレベルの顕著により強力な減少が認められた（図２５ａおよび２６ｂ）。ＭＤＲ１−ｍＲＮＡレベルの顕著な減少は、このときＲ４でも同様に認められた。従って、アンチセンス鎖の３’末端で２ｎｔのオーバーハングを有し、さらに２２ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有する構築物は、両方の鎖の（アンチセンス鎖およびセンス鎖）３’末端で２ｎｔのオーバーハングおよび１９ヌクレオチド対からなる二本鎖領域を有するコンストラクトに比べ、ＭＤＲ１−ｍＲＮＡレベルをより効率的に減少させる。これは、それぞれの場合において、ＭＤＲ１に相同な配列領域には比較的依存しない（４８時間後；図２６ｂ）。これらの結果は、Ｕ−８７ＭＧ細胞でのトランスフェクション後に特異的なｄｓＲＮＡを用いてＥＧＦＲ遺伝子発現が阻害されることが記載されている実施例ＩＶでの知見を補強する。

トランスフェクションの効率は、テキサスレッド（テキサスレッド−Ａ［ＧＡＴＣ］₅Ｔ：これもまた１７５ｎＭでトランスフェクトした）で標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、別の実験で決定した（図２７ａ、２７ｂ；４００×拡大、トランスフェクションの４８時間後）。トランスフェクション効率は、全細胞数に対する赤色蛍光細胞に基づいて、約５０％であった。もし、細胞のトランスフェクション率が約５０％であることを考慮に入れる場合、ＭＤＲ１−ｍＲＮＡレベルが（コントロールと比較して）約４５〜５５％まで減少することが認められたことを前提にして、特異的なｄｓＲＮＡとのトランスフェクトに成功した全ての細胞において、ＭＤＲ１−ｍＲＮＡはほとんど完全かつ特異的に破壊されると結論づけることは妥当である。

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図１ａおよび図１ｂは、第１および第２の二本鎖ＲＮＡを示す図である。図２は、標的遺伝子を示す図である。図３は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第１の実験）。図４は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第２の実験）。図５は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第３の実験）。図６は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光を示す（第４の実験）。図７は、Ｈｅｌａ−Ｓ３細胞への種々のｄｓＲＮＡの適用後における相対的ＹＦＰ蛍光の関係を示す（第５の実験）。図８は、ｐｃＤＮＡ−ＹＦＰのトランスフェクション後、またはｐｃＤＮＡ−ＹＦＰおよび種々のｄｓＲＮＡの同時トランスフェクション後における、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図９は、ｐｃＤＮＡ−ＹＦＰのトランスフェクション後、またはｐｃＤＮＡ−ＹＦＰおよび種々のｄｓＲＮＡの同時トランスフェクション後における、Ｈｅｌａ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図１０は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＳ１のゲル電気泳動による分離を示す。図１１は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＳ１のゲル電気泳動による分離を示す。図１２は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＳ７のゲル電気泳動による分離を示す。図１３は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＳ７のゲル電気泳動による分離を示す。図１４は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＫ３のゲル電気泳動による分離を示す。図１５は、マウス血清中でのインキュベーション後におけるＰＫＣ１／２のゲル電気泳動による分離を示す。図１６は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＳ１Ａ／Ｓ４Ｂのゲル電気泳動による分離を示す。図１７は、ヒト血清中でのインキュベーション後におけるＫ２のゲル電気泳動による分離を示す。図１８は、トランスジェニックＧＦＰマウス由来の腎臓パラフィン切片のＧＦＰ特異的な免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。図１９は、トランスジェニックＧＦＰマウス由来の心臓パラフィン切片のＧＦＰ特異的な免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。図２０は、トランスジェニックＧＦＰマウス由来の膵臓パラフィン切片のＧＦＰ特異的な免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。図２１は、血漿におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。図２２は、腎臓におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。図２３は、心臓におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。図２４は、Ｕ８７−ＭＧグリア芽腫細胞におけるＥＧＦＲ発現のウエスタンブロット分析を示す。図２５ａは、７４時間後に採取された細胞において、大腸癌細胞系ＬＳ１７４ＴのＭＤＲＩｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す。図２５ｂは、ａにおけるバンドの定量化を示す。２つの値の平均値を表す。図２６ａは、４８時間後に採取された細胞において、大腸癌細胞系ＬＳ１７４ＴのＭＤＲＩｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。図２６ｂは、図２６ａにおけるバンドの定量化を示す。２つの値の平均値を表す。図２７は、１７５ｎＭのｄｓＲＮＡのトランスフェクションの透過光および蛍光顕微鏡像の比較を示す（表４の配列Ｒ１）。

Claims

脊椎動物の培養細胞またはヒト以外の脊椎動物の細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
前記標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量の少なくとも１つの二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩ）を導入する工程を包含し、
前記ｄｓＲＮＡＩは、１９〜２３個の連続するヌクレオチド対からなる二本鎖構造を有し、そして当該二本鎖構造の１つの鎖（ａｓ１）または当該１つの鎖（ａｓ１）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子に相補的であり、
前記ｄｓＲＮＡＩは、前記１つの鎖（ａｓ１）の３'末端において１〜４個のヌクレオチドからなるオーバーハングを有し、そして平滑末端（Ｅ１、Ｅ２）は、当該１つの鎖（ａｓ１）の５'末端を含有し、
前記標的遺伝子がＭＤＲ１遺伝子である、方法。
前記オーバーハングが、１個または２個のヌクレオチドからなる、請求項１に記載の方法。
請求項１または２に規定されるｄｓＲＮＡＩに従う構造を有する少なくとも１つのさらなる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩＩ）が、脊椎動物の培養細胞またはヒト以外の脊椎動物の細胞中に導入される工程をさらに包含し、ここで、前記ｄｓＲＮＡＩの１つの鎖（ａｓ１）は、前記標的遺伝子の第一の領域（Ｂ１）に相補的であり、そしてｄｓＲＮＡＩＩの別の鎖（ａｓ２）または当該別の鎖（ａｓ２）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子の第二の領域（Ｂ２）に相補的である、請求項１または２に記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡＩＩが、１９〜２３個の連続するヌクレオチド対を有する、請求項３に記載の方法。
前記第一の領域（Ｂ１）および前記第二の領域（Ｂ２）が、部分的に重複するか、または互いに隣接している、請求項３または４に記載の方法。
前記第一の領域（Ｂ１）および前記第二の領域（Ｂ２）が、互いに分離している、請求項３または４に記載の方法。
前記標的遺伝子が、配列番号１〜１４０のうちの１つを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
配列番号１４１〜１４７及び１５２のうちの１つか、または互いに同類でありかつ配列番号１４１〜１４７及び１５２に属する２つのアンチセンス配列（ａｓ１／２）とセンス配列（ｓｓ１／２）が組み合わされているｄｓＲＮＡ構築物が、前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩとして使用される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
ＲＮＡ干渉の原理に従って発現が阻害される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記標的遺伝子が、病原体において発現される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記標的遺伝子が、ウイルスまたはウイロイドの構成要素である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
前記ウイルスまたはウイロイドがヒト病原性ウイルスまたはヒト病原性ウイロイドである、請求項１１に記載の方法。
前記ウイルスまたはウイロイドが、動物または植物において病原性であるウイルスまたはウイロイドである、請求項１１に記載の方法。
不対ヌクレオチドが、ヌクレオシドチオホスフェートによって置換されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの少なくとも一端（Ｅ１、Ｅ２）が、前記細胞中での分解または個々の鎖の解離に対抗するために修飾されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
前記相補的ヌクレオチド対によりもたらされる前記二本鎖構造の結合が、少なくとも１つの化学結合によって増大する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
前記化学結合が、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、スタッキング相互作用、金属イオン配位のいずれかによって達成される、請求項１６に記載の方法。
前記化学結合が、一端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺で形成される、請求項１６または１７に記載の方法。
前記化学結合が、１または数個の連結基によって作られ、ここで当該連結基は、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはオリゴエチレングリコール鎖である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
前記化学結合が、ヌクレオチドのかわりに分枝ヌクレオチドアナログを使用して形成される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
前記化学結合が、プリンアナログによって形成される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
前記化学結合が、アザベンゼンユニットによって形成される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
以下の群：
メチレンブルー；ビス−（２−クロロエチル）−アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ'−（ｐ−グリオキシル−ベンゾイル）−シスタミン；４−チオウラシル；ソラレン、
の少なくとも１つが、前記化学結合を作るために使用される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
前記化学結合が、前記二本鎖領域の末端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺に付着したチオホスホリル基によって形成される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
前記化学結合が、前記末端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺に存在するトリプルへリックス結合によって形成される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、ミセル構造またはリポソーム中に包含される、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、ウイルスから生じるか、ウイルスに由来するか、または合成により産生される少なくとも１つのウイルスコートタンパク質に結合もしくは会合されているか、またはそれにより包含されている、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
前記コートタンパク質がポリオーマウイルス由来である、請求項２７に記載の方法。
前記コートタンパク質が、前記ポリオーマウイルスのウイルスタンパク質１（ＶＰ１）および／またはウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を含有する、請求項２８に記載の方法。
カプシドまたはカプシド様構造の形成において、１つの側面が、当該カプシドまたはカプシド様構造の内側に向かっている、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの１つの鎖（ａｓ１、ａｓ２）が、前記標的遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセスされたＲＮＡ転写物に相補的である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、１日あたり５ｍｇ／ｋｇ体重の最大投与量でヒト以外の哺乳動物に投与される、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、適用のために緩衝溶液において混合される、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、経口投与、または静脈内注射もしくは注入、腫瘍内注射もしくは注入、腹腔内注射もしくは注入、あるいは吸入によって投与される、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
脊椎動物の培養細胞またはヒト以外の脊椎動物の細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩ）の使用であって、
前記ｄｓＲＮＡＩは、１９〜２３個の連続するヌクレオチド対からなる二本鎖構造を有し、そして前記二本鎖構造の１つの鎖（ａｓ１）または当該１つの鎖（ａｓ１）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子に相補的であり、
前記ｄｓＲＮＡＩは、前記１つの鎖（ａｓ１）の３'末端において１〜４個のヌクレオチドからなるオーバーハングを有し、そして平滑末端（Ｅ１、Ｅ２）は、当該１つの鎖（ａｓ１）の５'末端を含有し、
前記標的遺伝子がＭＤＲ１遺伝子である、使用。
前記オーバーハングが、１個または２個のヌクレオチドからなる、請求項３５に記載の使用。
請求項３５または３６に規定されるｄｓＲＮＡＩに従う構造を有する少なくとも１つのさらなる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩＩ）が脊椎動物の培養細胞またはヒト以外の脊椎動物の細胞中に導入され、ここで、前記ｄｓＲＮＡＩの二本鎖構造の前記１つの鎖（ａｓ１）または当該１つの鎖（ａｓ１）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子の第一の領域（Ｂ１）に相補的であり、そしてここでｄｓＲＮＡＩＩの別の鎖（ａｓ２）または当該別の鎖（ａｓ２）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子の第二の領域（Ｂ２）に相補的である、請求項３５または３６に記載の使用。
前記ｄｓＲＮＡＩＩが、１９〜２３個の連続するヌクレオチド対を有する、請求項３７に記載の使用。
前記第一の領域（Ｂ１）および前記第二の領域（Ｂ２）が、部分的に重複するか、または互いに隣接している、請求項３７または３８に記載の使用。
前記第一の領域（Ｂ１）および前記第二の領域（Ｂ２）が、互いに分離している、請求項３７または３８に記載の使用。
前記標的遺伝子が、配列番号１〜１４０のうちの１つを有する、請求項３５〜４０のいずれかに記載の使用。
配列番号１４１〜１４７及び１５２のうちの１つか、または互いに同類でありかつ配列番号１４１〜１４７及び１５２に属する２つのアンチセンス配列（ａｓ１／２）とセンス配列（ｓｓ１／２）が組み合わされているｄｓＲＮＡ構築物が、前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩとして使用される、請求項３５〜４１のいずれかに記載の使用。
ＲＮＡ干渉の原理に従って発現が阻害される、請求項３５〜４２のいずれかに記載の使用。
前記標的遺伝子が、病原体において発現される、請求項３５〜４３のいずれかに記載の使用。
前記標的遺伝子が、ウイルスまたはウイロイドの構成要素である、請求項３５〜４４のいずれかに記載の使用。
前記ウイルスまたはウイロイドがヒト病原性ウイルスまたはヒト病原性ウイロイドである、請求項４５に記載の使用。
前記ウイルスまたはウイロイドが、動物または植物において病原性であるウイルスまたはウイロイドである、請求項４５に記載の使用。
不対ヌクレオチドが、ヌクレオシドチオホスフェートによって置換されている、請求項３５〜４７のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡの少なくとも一端（Ｅ１、Ｅ２）が、前記細胞中での分解または個々の鎖の解離に対抗するために修飾されている、請求項３５〜４８のいずれかに記載の使用。
前記相補的ヌクレオチド対によりもたらされる前記二本鎖構造の結合が、少なくとも１つの化学結合によって増大する、請求項３５〜４９のいずれかに記載の使用。
前記化学結合が、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、スタッキング相互作用、金属イオン配位のいずれかによって達成される、請求項５０に記載の使用。
前記化学結合が、一端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺で形成される、請求項５０または５１に記載の使用。
前記化学結合が、１または数個の連結基によって作られ、ここで当該連結基は、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはオリゴエチレングリコール鎖である、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
前記化学結合が、ヌクレオチドのかわりに分枝ヌクレオチドアナログを使用して形成される、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
前記化学結合が、プリンアナログによって形成される、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
前記化学結合が、アザベンゼンユニットによって形成される、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
以下の群：
メチレンブルー；ビス−（２−クロロエチル）−アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ'−（ｐ−グリオキシル−ベンゾイル）−シスタミン；４−チオウラシル；ソラレン、
の少なくとも１つが、前記化学結合を作るために使用される、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
前記化学結合が、前記二本鎖領域の末端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺に付着したチオホスホリル基によって形成される、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
前記化学結合が、前記末端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺に存在するトリプルへリックス結合によって形成される、請求項５０〜５２のいずれかに記載の使用。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、ミセル構造またはリポソーム中に包含される、請求項３５〜５９のいずれかに記載の使用。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、ウイルスから生じるか、ウイルスに由来するか、または合成により産生される少なくとも１つのウイルスコートタンパク質に結合もしくは会合されているか、またはそれにより包含されている、請求項３５〜６０のいずれかに記載の使用。
前記コートタンパク質がポリオーマウイルス由来である、請求項６１に記載の使用。
前記コートタンパク質が、前記ポリオーマウイルスのウイルスタンパク質１（ＶＰ１）および／またはウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を含有する、請求項６２のいずれかに記載の使用。
カプシドまたはカプシド様構造の形成において、１つの側面が、当該カプシドまたはカプシド様構造の内側に向かっている、請求項３５〜６３のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの１つの鎖（ａｓ１、ａｓ２）が、前記標的遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセスされたＲＮＡ転写物に相補的である、請求項３５〜６４のいずれかに記載の使用。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、１日あたり５ｍｇ／ｋｇ体重の最大投与量でヒト以外の哺乳動物に投与される、請求項３５〜６５のいずれかに記載の使用。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、適用のために緩衝溶液において混合される、請求項３５〜６６のいずれかに記載の使用。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、経口投与、または静脈内注射もしくは注入、腫瘍内注射もしくは注入、腹腔内注射もしくは注入、あるいは吸入によって投与される、請求項３５〜６７のいずれかに記載の使用。
細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するための医薬であって、
前記標的遺伝子の発現を阻害するために十分な用量の少なくとも１つの二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩ）を含有し、
ここで、前記ｄｓＲＮＡＩは、１９〜２３個の連続するヌクレオチド対からなる二本鎖構造を有し、そして前記二本鎖構造の１つの鎖（ａｓ１）または当該１つの鎖（ａｓ１）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子に相補的であり、
さらにここで、前記ｄｓＲＮＡＩは、前記１つの鎖（ａｓ１）の３'末端において１〜４個のヌクレオチドからなるオーバーハングを有し、そして平滑末端（Ｅ１、Ｅ２）は、当該１つの鎖（ａｓ１）の５'末端を含有し、
前記標的遺伝子がＭＤＲ１遺伝子である、医薬。
前記オーバーハングが、１個または２個のヌクレオチドからなる、請求項６９に記載の医薬。
請求項６９または７０に規定されるｄｓＲＮＡＩに従う構造を有する少なくとも１つのさらなる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡＩＩ）が、前記細胞中に導入され、ここで、前記ｄｓＲＮＡＩの１つの鎖（ａｓ１）は、前記標的遺伝子の第一の領域（Ｂ１）に相補的であり、そしてｄｓＲＮＡＩＩの別の鎖（ａｓ２）または当該別の鎖（ａｓ２）の少なくとも１つのセグメントは、前記標的遺伝子の第二の領域（Ｂ２）に相補的である、請求項６９または７０に記載の医薬。
前記ｄｓＲＮＡＩＩが、１９〜２３個の連続するヌクレオチド対を有する、請求項７１に記載の医薬。
前記第一の領域（Ｂ１）および前記第二の領域（Ｂ２）が、部分的に重複するか、または互いに隣接している、請求項７１または７２に記載の医薬。
前記標的遺伝子が、配列番号１〜１４０のうちの１つを有する、請求項６９〜７３のいずれかに記載の医薬。
配列番号１４１〜１４７及び１５２のうちの１つか、または互いに同類でありかつ配列番号１４１〜１４７及び１５２に属する２つのアンチセンス配列（ａｓ１／２）とセンス配列（ｓｓ１／２）が組み合わされているｄｓＲＮＡ構築物が、前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩとして使用される、請求項６９〜７４のいずれかに記載の医薬。
ＲＮＡ干渉の原理に従って発現が阻害される、請求項６９〜７５のいずれかに記載の医薬。
前記標的遺伝子が、病原体において発現される、請求項６９〜７６のいずれかに記載の医薬。
前記標的遺伝子が、ウイルスまたはウイロイドの構成要素である、請求項６９〜７７のいずれかに記載の医薬。
前記ウイルスまたはウイロイドがヒト病原性ウイルスまたはヒト病原性ウイロイドである、請求項７８に記載の医薬。
前記ウイルスまたはウイロイドが、動物または植物において病原性であるウイルスまたはウイロイドである、請求項７８に記載の医薬。
不対ヌクレオチドが、ヌクレオシドチオホスフェートによって置換されている、請求項６９〜８０のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの少なくとも一端（Ｅ１、Ｅ２）が、前記細胞中での分解または個々の鎖の解離に対抗するために修飾されている、請求項６９〜８１のいずれかに記載の医薬。
前記相補的ヌクレオチド対によりもたらされる前記二本鎖構造の結合が、少なくとも１つの化学結合によって増大する、請求項６９〜８２のいずれかに記載の医薬。
前記化学結合が、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、スタッキング相互作用、金属イオン配位のいずれかによって達成される、請求項８３に記載の医薬。
前記化学結合が、一端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺で形成される、請求項８３または８４に記載の医薬。
前記化学結合が、１または数個の連結基によって作られ、ここで当該連結基は、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはオリゴエチレングリコール鎖である、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
前記化学結合が、ヌクレオチドのかわりに分枝ヌクレオチドアナログを使用して形成される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
前記化学結合が、プリンアナログによって形成される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
前記化学結合が、アザベンゼンユニットによって形成される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
以下の群：
メチレンブルー；ビス−（２−クロロエチル）−アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ'−（ｐ−グリオキシル−ベンゾイル）−シスタミン；４−チオウラシル；ソラレン、
の少なくとも１つが、前記化学結合を作るために使用される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
前記化学結合が、前記二本鎖領域の末端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺に付着したチオホスホリル基によって形成される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
前記化学結合が、前記末端（Ｅ１、Ｅ２）の近辺に存在するトリプルへリックス結合によって形成される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の医薬。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、ミセル構造またはリポソーム中に包含される、請求項６９〜９２のいずれかに記載の医薬。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、ウイルスから生じるか、ウイルスに由来するか、または合成により産生される少なくとも１つのウイルスコートタンパク質に結合もしくは会合されているか、またはそれにより包含されている、請求項６９〜９３のいずれかに記載の医薬。
前記コートタンパク質がポリオーマウイルス由来である、請求項９４に記載の医薬。
前記コートタンパク質が、前記ポリオーマウイルスのウイルスタンパク質１（ＶＰ１）および／またはウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を含有する、請求項９５に記載の医薬。
カプシドまたはカプシド様構造の形成において、１つの側面が、当該カプシドまたはカプシド様構造の内側に向かっている、請求項６９〜９６のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩの１つの鎖（ａｓ１、ａｓ２）が、前記標的遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセスされたＲＮＡ転写物に相補的である、請求項６９〜９７のいずれかに記載の医薬。
前記細胞が脊椎動物細胞またはヒト細胞である、請求項６９〜９８のいずれかに記載の医薬。
前記第一の領域（Ｂ１）および前記第二の領域（Ｂ２）が互いに分離している、請求項７１または７２に記載の医薬。
前記ｄｓＲＮＡが、１用量あたり５ｍｇの最大量で投与される、請求項６９〜１００のいずれかに記載の医薬。
前記ｄｓＲＮＡが、適用のために緩衝溶液において混合される、請求項６９〜１０１のいずれかに記載の医薬。
前記ｄｓＲＮＡＩ／ＩＩが、経口投与、または静脈内注射もしくは注入、腫瘍内注射もしくは注入、腹腔内注射もしくは注入、あるいは吸入によって投与される、請求項６９〜１０２のいずれかに記載の医薬。