JP4210737B2

JP4210737B2 - 遺伝子サイレンシングを仲介する低分子干渉リボ核酸のインビボにおける製造方法

Info

Publication number: JP4210737B2
Application number: JP2003512247A
Authority: JP
Inventors: フィリップディー．ザモア; ジョルジフトバグナー; ジュアニータマクラクラン; クレイグシー．メロー; アラグリショック
Original assignee: University of Massachusetts Boston
Current assignee: University of Massachusetts Amherst
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2022-07-12
Also published as: KR101021695B1; US7691995B2; ES2606290T3; KR20040022449A; ES2566561T3; IL159756A0; CA2921821A1; US20140179760A1; CA2453183C; US20160102309A1; US20060009402A1; EP1412371A4; US9850487B2; CA2453183A1; EP2360251A3; ES2609014T3; US9175287B2; EP1412371B1; EP1412371A1; US20100233810A1

Description

技術分野
本発明は、リボ核酸干渉（ribonucleic acid interference；RNAi）に関連し、より特定すると、インビボにおけるRNAiに関連する。

背景
RNAiは、二重鎖RNAによる、配列特異的な、転写後の、遺伝子の発現のサイレンシングである。RNAiは、細胞における長い二重鎖RNAの酵素的切断によって誘導される、21〜25個のヌクレオチドの低分子干渉RNA（small interfering RNA(siRNA)）と呼ばれる二重鎖RNA分子によって仲介される。siRNAはまた、細胞外において化学的にまたは酵素的に合成され、その後（例えばトランスフェクションによって）細胞に送達され得る（例えば、Fireら, 1998, 「線虫における二重鎖RNAによる潜在的および特異的な遺伝的干渉（Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans）」, Nature, 391:806〜11；Tuschlら, 1999, 「インビトロにおける二重鎖RNAによる標的mRNAの分解（Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro）」, Genes Dev., 13:3191〜7；Zamoreら, 2000, 「RNAi：二重鎖RNAは21〜23ヌクレオチド間隔におけるmRNAのATP依存的な切断を司る（RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals）」, Cell, 101: 25〜33；Elbashirら, 2001, 「哺乳動物細胞培養において21ヌクレオチドRNAの二本鎖はRNA干渉を仲介する（Duplexes of 21-nucleotide RNAs madiate RNA interference in mammalian cell culture）」, Nature, 411: 494〜498；および、Elbashirら, 2001, 「RNA干渉は21-ヌクレオチドRNAおよび22-ヌクレオチドRNAによって仲介される（RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs）」, Genes Dev, 15: 188〜200を参照のこと）。

二重鎖siRNAは、siRNA の1つの鎖の配列を含むメッセンジャーRNA（mRNA）を中断または切断の標的とすることによって、遺伝子サイレンシングを仲介する。トランスフェクションによって哺乳動物細胞に導入されたsiRNAは配列特異的な遺伝子サイレンシングを仲介するが、一方、長い二重鎖RNAは配列非特異的な反応を誘導する。

概要
本発明は、細胞（例えばインビボ）において発現された場合に細胞によってプロセシングされ、細胞自身のRNAi経路を用いて（特定のmRNAを切断の標的とすることによって）標的遺伝子を選択的にサイレンシングする標的化siRNAを生産するような、新しい、人工の、設計されたRNA前駆体の発見に基づく。これらの設計されたRNA前駆体をコードする核酸分子を、インビボにおいて、適切な調節配列と共に（例えばプラスミドのようなベクターにおける導入遺伝子）細胞に導入することによって、設計されたRNA前駆体の発現は、時間的にもおよび空間的にも、即ち、特定の時点において、および／または、特定の組織、器官、もしくは細胞において、選択的に調節されることが可能である。

一般に、本発明は、設計されたリボ核酸（RNA）前駆体をコードする核酸配列に機能的に連結された調節配列を含む単離核酸分子を特徴とし、前駆体は以下の(i)〜(iii)を含む：
（i）標的遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）の配列に対して相補的な、少なくとも18ヌクレオチドの配列を含む、第一のステム部分；
（ii）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステム（例えば酵素ダイサー(Dicer)によってプロセシングされ得るステム）を形成するために、第一のステム部分に対して十分に相補的な、少なくとも18ヌクレオチドの配列を含む、第二のステム部分；および
（iii）2つのステム部分を連結するループ部分。
その他の局面においては、本発明は、設計されたRNAそれ自体を特徴とする。RNA前駆体は、標的遺伝子のmRNAのある部分を標的とし、mRNAを切断することによってmRNAの翻訳を中断し、それにより、阻害されるべきタンパク質の発現を妨げる。標的遺伝子は、例えば、例として点突然変異を有するような、例えば変異したヒト遺伝子などの、ヒトの遺伝子であることが可能であり、または、それらはウイルス遺伝子もしくは他の遺伝子であることが可能である。

これらの分子および前駆体においては、第一のステム部分は、mRNA配列に対して完全に相補的である（即ち全く相補的である）ことが可能である。他の態様においては、ステム部分は、相補的であることが可能である、即ち、配列は実質的に相補的であることが可能である（例えば、一連の20ヌクレオチドに渡って、1つまたは2つのミスマッチ以外は存在し得ない）。同様に、第二のステム部分は、第一のステム部分に対して完全に相補的である、または実質的に相補的であることが可能である。第一のステム部分は、RNA前駆体の5'末端または3'末端に位置することが可能である。

これらの前駆体においては、ループ部分は、少なくとも4、7、または11、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができ、mRNAの配列はmRNAの翻訳開始点の3'側の100〜300ヌクレオチドから位置する。mRNAの配列は、mRNAの5'非翻訳領域（UTR）または3'UTRに位置することができる。第一のステム部分および第二のステム部分は各々約18〜約30ヌクレオチド、または約22〜約28ヌクレオチドを含み得る。第一のステム部分および第二のステム部分は各々同じ数のヌクレオチドを有し得る、または、第一のステム部分および第二のステム部分の一方が、他方のステム部分よりも1〜4多いヌクレオチドを有し得る。これらの突出部のヌクレオチドは全てウラシルであることが可能である。

これらの核酸分子において、調節配列はPol IIIプロモーターまたはPol IIプロモーターであることが可能であり、構成性であり得る、または誘導性であり得る。特定の態様においては、設計されたRNA前駆体は、配列番号：1、2、3、4、5、8または9において示される配列を有することができ、核酸分子は、配列番号：10、11、17、18、20または21において示される配列、またはその相補鎖を有し得る。

他の態様においては、本発明は、新しい核酸分子を含む、例えばプラスミドまたはウイルス（例えばレトロウイルス）ベクターのようなベクターをも特徴とする。

その他の局面においては、本発明は、新しい核酸分子を含む、例えば哺乳動物細胞のような宿主細胞を含む。本発明は、新しい核酸分子を含む導入遺伝子をも含む。

本発明のその他の局面においては、本発明は、1つまたは複数の細胞が1つまたは複数の新しい核酸分子を含む導入遺伝子を含む、非ヒトトランスジェニック動物を特徴とし、トランスジェニック動物の1つまたは複数の細胞において導入遺伝子が発現されることにより、設計されたRNA前駆体による標的遺伝子のリボ核酸干渉（RNAi）を示す動物がもたらされる。例えば、導入遺伝子は、1つまたは複数の心臓細胞、リンパ球、肝細胞、血管内皮細胞、または脾臓細胞において選択的に発現されることが可能である。これらの動物においては、調節配列は構成性もしくは誘導性であり得る、または、調節配列は、組織特異的であることが可能である。幾つかの態様においては、調節配列はPol IIIプロモーターまたはPol IIプロモーターであり得、外因性の配列であり得る。これらのトランスジェニック動物は、本明細書において説明される、非ヒトの霊長類、またはマウスもしくはラットのような齧歯類、または他の動物（例えば、ヤギもしくはウシのような他の哺乳動物；または鳥類）であることが可能である。

本発明は、新しいトランスジェニック動物に由来する細胞をも含む。例えば、これらの細胞は、リンパ球、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、血管内皮細胞、または脾臓細胞であることが可能である。

その他の局面においては、本発明は、例えば動物または培養物の細胞において、標的遺伝子のリボ核酸干渉（RNAi）を誘導する方法を含む。新しい方法は、設計されたRNA前駆体をコードする核酸分子および誘導可能なプロモーターを含む導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を得る段階；および、前駆体を発現するよう細胞を誘導し、細胞内において低分子干渉リボ核酸（siRNA）を形成させることにより、動物における標的遺伝子のRNAiを誘導する段階を含む。

または、本方法は、宿主細胞を得る段階；細胞を培養する段階；および細胞がRNA前駆体を発現し、細胞内において低分子干渉リボ核酸（siRNA）を形成可能にさせることにより、細胞における標的遺伝子のRNAiを誘導する段階を含む。

「導入遺伝子」は、人工的手段によって細胞に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの部分となる任意の核酸分子である。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的にまたは完全に非相同である（即ち外来性の）遺伝子を含み得るか、または、その生物体の内因性の遺伝子に対して相同である遺伝子であり得る。「導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック動物に対して部分的にまたは完全に非相同である、即ち外来のものである、または、トランスジェニック動物の内因性の遺伝子に対して相同であるが、天然の遺伝子のものとは異なる位置においてその動物のゲノムに挿入されるように設計される、例えば動物のようなトランスジェニック生物において発現されるべき、1つまたは複数の設計されたRNA前駆体をコードする、1つまたは複数の選択された核酸配列（例えばDNA）を含む核酸分子をも意味する。導入遺伝子は、選択された配列に全て機能的に連結された、選択された核酸配列の発現のために必要な、1つまたは複数のプロモーター、および、イントロンのような任意の他のDNAを含み、エンハンサー配列を含み得る。

「形質転換細胞」は、組換えDNA技術によって、それに（またはその祖先細胞に）設計されたRNA前駆体をコードする核酸分子または導入遺伝子が導入された細胞である。

本明細書において使用されるように、「機能的に連結された」という用語は、例えば設計されたRNA前駆体をコードする、選択された核酸配列が、プロモーター（例えば組織特異的プロモーター）と近接にあり、それにより、選択された核酸配列の発現をプロモーターに調節させることを意味する。加えて、プロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選択された核酸配列の上流に位置する。

「プロモーター」は、転写を誘導するために十分な核酸配列を意味する。組織特異的なプロモーターは、特定の細胞、例えば造血細胞、または、動物内の特定の組織の細胞、例えば、心臓、筋肉、または血管内皮における、選択された核酸配列の発現に影響を与える。本用語は、主に1つの組織において選択された核酸配列の発現を調節するが、他の組織における発現をも引き起こす、いわゆる「リーキー（leaky）」プロモーターをも含む。そのようなプロモーターは、イントロン配列およびエンハンサー配列のような、発現に必要とされる付加的なDNA配列をも含み得る。

「トランスジェニック」は、人工的手段によって細胞に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの部分となる、核酸（例えばDNA配列）を含む任意の細胞を意味する。「トランスジェニック動物」は、胚的細胞に挿入され、その細胞から発生する動物、またはそのような動物の子孫のゲノムの部分となる導入遺伝子を含む動物を意味する。本明細書において説明されるトランスジェニック動物においては、導入遺伝子は、特定の組織細胞に、設計されたRNA前駆体の発現を起こさせる。トランスジェニック技術によって生産されることが可能な任意の動物が本発明に含まれるが、哺乳動物が好ましい。好ましい哺乳動物は、非ヒトの霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ならびに、モルモット、ハムスター、ラット、スナネズミ、および好ましくはマウスのような齧歯類を含む。

「単離された核酸分子または配列」は、由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて（一方が5'末端において、および一方が3'末端において）それが直接連続するコード配列の双方と直接連続していない核酸分子または配列である。したがって、本用語は、例えば、ベクターに；自律複製プラスミドもしくはウイルスに；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み入れられるか、または、他の配列とは独立した別個の分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片）として存在する、組換えDNAもしくはRNAを含む。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAをも含む。

「標的遺伝子」は、発現が選択的に阻害されるか、または、「サイレンシングされる」遺伝子である。このサイレンシングは、細胞のRNAi系によって、設計されたRNA前駆体から生み出されたsiRNAによって、標的遺伝子のmRNAを切断することにより達成される。RNA前駆体の二本鎖ステムのある部分またはセグメントは、標的遺伝子のmRNAの約18〜約40またはそれ以上のヌクレオチドの部分に対して相補的な、例えば完全に相補的なアンチセンス鎖である。

設計されたRNA前駆体、または、設計された核酸分子のように、「設計された」という用語は、前駆体または分子の核酸配列の全てまたは部分が人間によって作製または選択されるという点で、その前駆体または分子が、天然には認められないことを示す。一旦作製または選択されれば、その配列は、細胞内の機構によって複製、翻訳、転写、またはプロセシングされることが可能である。したがって、設計された核酸分子を含む導入遺伝子から細胞内において生産されたRNA前駆体は、設計されたRNA前駆体である。

他に定義付けられない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が下記にて説明される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参照として本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に従うものとする。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示するだけのものであり、制限することは意図しない。

本発明は、幾つかの利点を提供する。例えば、本発明は、先行技術における著しい欠陥をさらに改善し、克服するものである。siRNAを用いて、哺乳動物細胞においてRNAiを誘導するための過去の方法は、細胞培養に制限されていた。新しい方法では、RNAiを完全な動物、例えば哺乳動物に拡大し、したがってRNAiを特定の細胞型、器官、もしくは組織に、および／または、特定の発生段階に標的化させることが可能になる。

加えて、本技術では、DNA分子の作製が比較的安価であるため、siRNAの構築が単純化され、コストが削減される。したがって、各々が特定の遺伝子を標的とする設計されたRNA前駆体をコードする核酸分子を含む、大集団のプラスミドまたは他のベクターを、例えばアレイフォーマットにおいて、容易に調製することができる。さらに、既知の技術を用いてインビトロにおいて培養することが可能な様々な細胞に新しい核酸分子を導入することができる。さらに、siRNAは一過的なものであるが、トランスジェニックヘアピンによってsiRNAが長期継続で供給されるため、新規の方法によって、長期の（例えば永続的な）細胞系における標的遺伝子の発現の減少が可能になる。

本発明の、1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。

詳細な説明
線虫（Caenorhabditis elegans）におけるlin-4およびlet-7、ならびに、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびヒトにおけるlet-7のような、マイクロRNA（micro RNA；miRNA）としても知られる一過性低分子リボ核酸（small temporal RNA；stRNA）は、タンパク質をコードしないが、代わりに、それらの標的mRNAの3'非翻訳領域（3'UTR）における配列に結合することによってmRNAの生産的な翻訳を阻害すると考えられる。Hutvagnerら, Science, 293: 834 （2001年7月12日）において説明されるように、ショウジョウバエにおけるlet-7 RNAは、RNA干渉（RNAi）経路における、より長い、構築された前駆体二重鎖RNAからの低分子RNAの生成と同様に、より大きな前駆体転写産物から切断されることが示された。

siRNAと同様に、stRNAも21〜25ヌクレオチド長であるが、siRNAとは異なり、単鎖であり、標的mRNAの切断を介した遺伝子サイレンシングを仲介しない。図1において示されるように、RNAi経路およびstRNA経路は交わっている；いずれも、遺伝子発現を抑制する活性な低分子RNA成分を生産するために、RNAプロセシング酵素ダイサーを必要とする。ダイサー、およびおそらく他のタンパク質がプレstRNAに作用し、mRNAの翻訳を抑制する成熟した単鎖stRNAを生じさせる。RNAiにおいては、ダイサーは長い二重鎖RNAを切断して、標的mRNAの破壊を仲介するsiRNA二本鎖を生じさせる。

長い二重鎖RNAがダイサーによって対称に切断されて二本鎖siRNAを生み出す一方、最新の証拠によって、stRNAは非対称に切断され、単鎖stRNAのみを生み出すことが示唆される。stRNA前駆体は、標的の切断を仲介しない、または、長い二重鎖RNAによって誘導される配列非特異的な反応を誘発しないステムループRNAである。一方、本発明は、細胞内においてプロセシングされた場合に、標的の切断を仲介するsiRNAを生み出す、新しい、設計されたRNA前駆体を提供する。これらのsiRNAは、標的mRNAの切断を仲介する限り、二重鎖または単鎖であることが可能である。そのような設計されたRNA前駆体は、トランスジェニック哺乳動物において、細胞型特異的または発生段階特異的な様式で発現され、特定の細胞、または、決められた時点の細胞においてRNAiを誘導することが可能である。

二重鎖RNAをsiRNAにプロセシングし（Zamoreら, (2000), 前記にて引用）、プレlet-7-stRNAを成熟let-7 stRNAにプロセシングする（Hutvagnerら, (2001), 前記にて引用）、インビトロにおいてRNAiを仲介するショウジョウバエの胚の溶解物（Tuschlら, (1999), 前記にて引用）は、設計されたRNA前駆体の、インビトロでRNAiを仲介する能力をアッセイするために使用することができる。このアッセイ法により、新しい、設計されたRNA前駆体を試験することが可能になる。新しい、設計された前駆体は、様々な改変によって、および、それらの二本鎖ステムの1つの部分が、標的遺伝子のmRNAの部分に対して相補的な、好ましくは完全に相補的な核酸配列を含むという事実によって、天然に生じる野生型stRNA前駆体とは異なる。

siRNAを生じる設計されたRNA前駆体
天然に生じるstRNA前駆体（プレstRNA）は、let-7についてのstRNA前駆体（プレlet-7）を示す図2Aにおいて例示される、ある特定の要素または成分を有する。各前駆体は、一般に相補的な2つの部分、および、ステムの2つの部分を連結する1つのループを含む、二本鎖ステムを形成する単鎖である。典型的なプレstRNAにおいては、ステムは、1つまたは複数のバルジ（bulge）、例えばステムの1つの部分において単一のヌクレオチドの「ループ」を形成する過剰ヌクレオチド、および／または、ステムの2つの部分の互いのハイブリダイゼーションにおいてギャップを形成する、1つもしくは複数の非対合ヌクレオチドを含む。

本発明の設計されたRNA前駆体は、天然に生じるプレstRNAと同様であるが、野生型前駆体配列とは多くの点で異なる人工構築物である。主要な相違点は、二本鎖ステムの1つの部分が、標的mRNAに対して相補的な（またはアンチセンスの）核酸配列であることである。したがって、設計されたRNA前駆体は、2つの部分、および、その2つのステム部分を連結する1つのループを有する二本鎖ステムを含む。2つのステム部分は、約18もしくは19〜約25、30、35、37、38、39もしくは40またはそれ以上のヌクレオチド長である。哺乳動物細胞において使用された場合、インターフェロン経路のような非特異的な反応の誘発を避けるために、ステム部分の長さは約30ヌクレオチド未満であるべきである。非哺乳動物細胞においては、ステムは、30ヌクレオチドより長いことが可能である。実際、ステムは、標的mRNAに対して相補的なはるかに大きな部分（完全なmRNAまでのものであり、完全なmRNAを含む）を含み得る。二本鎖ステムの2つの部分は、ハイブリダイズして二本鎖ステムを形成するために十分に相補的でなければならない。したがって、2つの部分は、必ずしもそうである必要はないが、完全にまたは全く相補的であることが可能である。加えて、2つのステム部分は、同じ長さであることが可能である、または、一方の部分が1、2、3もしくは4ヌクレオチドの突出部を含み得る。突出部のヌクレオチドは、例えば、ウラシル（U）を含んでもよく、例えば全てUであってもよい。

天然のプレstRNA配列からの他の相違点は、限定はしないが、非対合ヌクレオチドもしくはバルジヌクレオチドが欠失されること、付加的な塩基対合ヌクレオチドが一方もしくは双方のステム部分に導入されること、ループ配列が改変され、対合ヌクレオチドの数が増加または減少すること、または、ループ配列の全てもしくは部分がテトラループもしくは他のループ配列と置き換えられることを含む。したがって、設計されたRNA前駆体のループは、2、3、4、5、6、7、8、9またはそれ以上、例えば、15または20、またはそれ以上のヌクレオチド長であることができる。テトラループ配列は、限定はしないが、Nが任意のヌクレオチドでありRがプリンヌクレオチドであるような、配列GNRA（配列番号：13）、GGGG（配列番号：14）、およびUUUU（配列番号：15）を含んでもよい。

そのような設計されたRNA前駆体の4つの例が、図2B〜図2Eにおいて例示される。図2Bおよび図2Cは、ステム部分では全ての非対合ヌクレオチドおよびバルジヌクレオチドが除去または対合されているが、ループがプレstRNAにおける野生型ループと同じものであるような、設計された前駆体を例示するものである。図2Dおよび図2Eは、テトラループを有する2つの設計されたRNA前駆体を例示する。図2Dにおいては、テトラループUUUU（配列番号：15）が、図2Aにおける野生型ループの部分に置き換わっている。図2Eにおいては、テトラループGGGG（配列番号：14）が、完全な野生型ループ配列と置き換わっている。

図4Bおよび図4Cは、付加的な、設計されたRNA前駆体を例示する。各々の設計されたRNA前駆体は、そのステムにおいて、ホタルルシフェラーゼmRNAの配列のある部分に対して完全に相補的な配列を含む。図4B（配列番号：8）においては、この領域は太字で示され、ステムの3'側に位置する。図4C（配列番号：9）においては、この相補的な配列はステムの5'側にある。天然に生じるプレlet-7 RNAとは異なり、これらの設計されたRNA前駆体は、完全に相補的なステムを有し、ルシフェラーゼmRNAに対するRNAiを誘導する。

さらに、設計されたRNA前駆体（プレsiRNA）を生み出すよう、天然に生じるstRNA前駆体を改変することには、望ましいsiRNA二本鎖の配列を含むようにRNAの配列を変化させる段階が含まれる。望ましいsiRNA二本鎖、およびしたがって、設計されたRNA前駆体における2つのステム部分の双方は、当技術分野において既知の方法によって選択される。これらは、標的遺伝子のmRNA配列から、翻訳開始点の3'側における100〜200または300ヌクレオチドの領域から、18、19、20、21ヌクレオチドの、またはそれ以上の配列を選択する段階を含むが、これらに限定されることはない。一般に、配列は、5'UTR（非翻訳領域）、コード配列、または3'UTRのような、標的遺伝子からのmRNAの任意の部分から選択することができる。この配列は、選択的に、2つの近接AAヌクレオチドを含む標的遺伝子の領域の直後に続けることができる。約21個のヌクレオチド配列の最後の2つのヌクレオチドが、UUであるように（siRNAのアンチセンス鎖がUUで始まるように）選択することが可能である。この約21個のヌクレオチド配列が使用され、設計されたRNA前駆体における二本鎖ステムの1つの部分が作製される。この配列は、例えば酵素学的に、野生型プレstRNA配列のステム部分に置き換えることができる、または、合成される完全な配列に含まれる。例えば、ステムループ設計RNA前駆体全体をコードする、または、前駆体の二本鎖ステムに挿入されるべき部分をコードする、DNAオリゴヌクレオチドを合成することができ、および、制限酵素を使用し、例えば野生型プレstRNAから、設計されたRNA前駆体構築物を構築することができる。

設計されたRNA前駆体は、二本鎖ステムにおいて、インビボで生産されることが望ましいsiRNAの約21〜22個のヌクレオチド配列を含む。したがって、設計されたRNA前駆体のステム部分は、その発現が減少されるか、または阻害される遺伝子のエキソン内部分の配列に対応した、少なくとも18または19個のヌクレオチド対を含む。ステムのこの領域に隣接する2つの3'ヌクレオチドは、設計されたRNA前駆体からのsiRNAの生産が最大化されるように、ならびに、インビボおよびインビトロでRNAiにより破壊するために、対応するmRNAを標的化することにおいて、結果的に生じるsiRNAの効率が最大化されるように選択される。

これらの設計されたRNA前駆体のその他の明らかな特徴は、長さ、配列および／または構造の結果として、それらが、インターフェロン反応もしくはアポトーシスの誘導のような配列非特異的な反応を誘導しないこと、または、それらが、RNAiを誘導するために現在使用されている長い二重鎖RNA（＞150 bp）よりも、そのような配列非特異的な反応のレベルの低下を誘導することである。例えば、インターフェロン反応は、30塩基対よりも長いdsRNAによって誘発される。

設計されたRNA前駆体をコードする導入遺伝子
新しい、設計されたRNA前駆体は、例えば、自動DNA合成機（Biosearch、Applied Biosystems等から市販されているような）を使用して、当技術分野において既知の標準的な方法によって合成することができる。これらの合成の設計されたRNA前駆体は、下記に説明されるように直接的に使用すること、または、当技術分野において既知の方法によって発現ベクターにクローニングすることが可能である。

設計されたRNA前駆体は、インビトロまたはインビボにおいて、特定のmRNAを破壊の標的とすることが望ましいような細胞に送達されるべきである。DNAまたはRNAを細胞に送達するためには、多くの方法が開発されてきた。例えば、インビボの送達のためには、組織の部位に直接的に分子を注入することができる、または全身投与することができる。インビトロの送達には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような、当技術分野において既知の方法が含まれる。

内因性のmRNAの発現を抑制するのに十分な核酸分子の細胞内濃度に到達させるために、例えば、強いPol IIIプロモーター（例えばU6またはPolIII H1-RNAプロモーター）またはPol IIプロモーターの制御下にオリゴヌクレオチドが置かれるような組換えDNA構築物を使用することができる。インビトロまたはインビボにおいて標的細胞をトランスフェクションするためのそのような構築物の使用は、十分な量の設計されたRNA前駆体の転写をもたらし、そのmRNAをコードする遺伝子の発現を減少させるために、対応するmRNA配列をRNAiによる切断の標的とすることができるsiRNAの生産を導く。例えば、インビボにおいて、細胞によって取り込まれた、設計されたRNA前駆体の転写を行うようにベクターを導入することが可能である。そのようなベクターは、転写されて望ましいstRNA前駆体を生産し得る限り、エピソームのままであることができるか、または、染色体に組み込まれたものとなることができる。

そのようなベクターは、当技術分野において既知の組換えDNA法によって構築されることができる。ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、または、哺乳動物細胞または他の標的細胞型における複製および発現のために使用される本明細書において説明されるものなどの、当技術分野において既知の他のベクターであることが可能である。設計されたRNA前駆体をコードする核酸配列は、既知の技術を用いて調製することができる。例えば、2つの合成DNAオリゴヌクレオチドを合成し、完全な、設計されたRNA前駆体をコードする新規の遺伝子を作製することができる。クローニングのための適切な「付着末端」を残して対合するDNAオリゴヌクレオチドは、プロモーター配列（例えばPol IIプロモーターまたはPol IIIプロモーター）および設計されたRNA前駆体配列に対して3'側の適切なターミネーター配列（例えば、SV40からの切断およびポリアデニル化シグナル配列またはPol IIIターミネーター配列）を含むプラスミドにおける制限部位に挿入することができる。

本発明は、前述の発現ベクターのいずれかを含み、それにより、その宿主細胞において本発明の核酸分子が発現されるような、遺伝子操作された宿主細胞をも包含する。宿主細胞は、既知の技術および方法を用いて培養することが可能である（例えば、「動物細胞の培養（Culture of Animal Cells）」(R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. 1987)；「分子クローニング（Molecular Cloning）」, Sambrookら(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を参照のこと）。

本発明のベクターの宿主細胞への導入が成功したことは、様々な既知の方法を用いてモニタリングすることができる。例えば、一過的なトランスフェクションを、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光マーカーのようなレポーターによって標識化することが可能である。安定したトランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞、例えば昆虫細胞および哺乳動物細胞に、ハイグロマイシンB耐性のような、特定の環境因子（例えば抗生物質および薬剤）に対する耐性を提供するようなマーカーを用いて示すことが可能である。

調節配列
設計されたRNA前駆体の発現は、調節配列によって行われ、本発明のベクターは、例えばマウス細胞のような哺乳動物細胞；昆虫細胞；植物細胞；または他の細胞において作用する、当技術分野において既知の任意の調節配列を含み得る。調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御因子を含む。設計されたRNA前駆体をコードする配列が導入される細胞またはトランスジェニック動物の将来的な使用、および、望ましいRNA前駆体の発現レベルのような要因に、適切な調節配列が依存することは理解されると思われる。当業者は、適切な調節配列を選択することが可能である。例えば、本明細書において説明されるトランスジェニック動物は、特定の細胞型（例えば造血細胞）における、被験ポリペプチドまたは設計されたRNA前駆体の役割を決定するために使用することができる。この場合、広範に導入遺伝子の発現を誘導する調節配列、または、造血細胞においてのみ導入遺伝子を発現する造血特異的な調節配列を使用することができる。造血細胞における設計されたRNA前駆体の発現は、その細胞が、特定の遺伝子の特異的な標的化RNAiに対して感受性であることを意味する。様々な調節配列の例は、以下に説明される。

調節配列は、誘導性または構成性であることができる。適切な構成性調節配列は、α-アクチン調節配列のようなハウスキーピング遺伝子の調節配列を含むか、または、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）もしくはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する調節配列のように、ウイルス起源のものであってもよい。

または、調節配列は、特定の器官もしくは細胞型において導入遺伝子の発現を誘導することができる（例えば、Laskoら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232）を参照のこと）。肝臓についてのアルブミン調節配列（Pinkertら, 1987, Genes Dev. 1:268〜276）；内皮細胞についてのエンドセリン調節配列（Lee, 1990, J.Biol.Chem. 265:10446〜50）；表皮についてのケラチン調節配列；心臓についてのミオシン軽鎖-2調節配列（Leeら, 1992, J.Biol.Chem. 267:15875〜85）、および膵臓についてのインスリン調節配列（Bucchiniら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511〜2515）、または造血細胞についてのvav調節配列（Oligvyら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14943〜14948）を含む、幾つかの組織特異的調節配列が、当技術分野において知られている。造血起源の細胞において導入遺伝子の構成的な発現を誘導するその他の適切な調節配列は、マウスMHCクラスI調節配列である（Morelloら, 1986, EMBO J. 5:1877〜1882）。MHCの発現はサイトカインによって誘導されるため、この調節配列に機能的に連結された被験遺伝子の発現を、サイトカインの存在下においてアップレギュレートすることができる。

さらに、導入遺伝子の発現は、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンのようなある生理学的調節因子に対して感受性の調節配列のような、誘導可能な調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができる（Dochertyら, 1994, FASEB J. 8:20〜24）。細胞またはマウスのような哺乳動物における導入遺伝子の発現の制御に適した、そのような誘導性の発現系は、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）（集合的に「調節分子」と呼ばれる）による調節を含む。これらの発現系の各々は、文献において十分に説明されており、調節分子の存在または不在によって制御される様式における、動物での導入遺伝子の発現を可能にする。誘導可能な発現系の概説については、例えばMills, 2001, Genes Devel. 15:1461〜1467、およびそこに引用される参考文献を参照のこと。

上記に言及される調節因子は、サイトメガロウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター（Bernoistら, Nature, 290:304, 1981）、tet系、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fd外皮タンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α-接合因子のプロモーターを含むが、これらに限定されることはない。付加的なプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスの3'末端繰り返し配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら, Cell 22:787〜797, 1988）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441, 1981）；またはメタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, Nature 296:39, 1988）を含む。

設計されたRNA前駆体を試験するためのアッセイ法
設計されたRNA前駆体が実際に成熟stRNAまたはsiRNAの直接の前駆体であったかどうかを決定するために、ショウジョウバエの胚の溶解物を使用することができる。この溶解物アッセイ法は、Tuschlら, 1999, 前記、Zamoreら, 2000, 前記、およびHutvagnerら, 2001, 前記において説明される。これらの溶解物は、インビトロにおいてRNAiを反復発生し、したがって、RNAi様の機構によって、提案される前駆体RNAが成熟stRNAまたはsiRNAに切断されたかどうかを研究することを可能にする。簡単に述べると、前駆体RNAをショウジョウバエの胚の溶解物と様々な時間インキュベートし、その後、プライマー伸長またはノーザンハイブリダイゼーションによって、成熟siRNAまたはstRNAの生産についてアッセイする。インビボの設定におけるように、細胞を含まない反応においては、成熟RNAが蓄積する。したがって、ショウジョウバエの胚の溶解物においては、提案される前駆体に対応するRNAが、成熟stRNAまたはsiRNA二本鎖に転換されることが示され得る。

さらに、設計されたRNA前駆体は、ショウジョウバエの胚の溶解物において機能的に試験することができる。この場合、設計されたRNA前駆体を、標準的なインビトロのRNAi反応において、5'放射性標識された標的mRNAの存在下にて、溶解物中で様々な時間インキュベートする。標的mRNAを、（Tuschlら, 1999, 前記およびそこの参考文献において説明されるように）グアニリルトランスフェラーゼを用いて、または他の適切な方法を用いて、5'放射性標識することができる。インビトロにおける反応の産物をその後、変性アクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上にて単離および解析し、反応系における設計されたRNA前駆体の存在に反応して標的mRNAが切断されたかどうかを決定する。mRNA標的のそのような切断の程度および位置は、前駆体の設計によって配列特異的なRNAiを仲介することができるプレsiRNAが作製されたかどうかを示す。

トランスジェニック動物
本発明の設計されたRNA前駆体は、トランスジェニック動物において発現可能である。これらの動物は、設計されたRNA前駆体の産物（siRNA）による破壊の標的とされる核酸（およびそれらのコードされるポリペプチド）の（野生型または正常なものと比較した）過剰発現または低発現によって引き起こされるかまたは増悪される障害の研究のための、および、破壊の標的とされる核酸またはポリペプチドの発現または活性を調節する治療物質の開発のためのモデル系となる。

トランスジェニック動物は、家畜類（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギなど）、齧歯類（ラット、モルモット、およびマウスなど）、非ヒトの霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）、およびペット動物（例えば、イヌおよびネコ）であってもよい。線虫またはショウジョウバエのような無脊椎動物、および、魚類（例えばゼブラフィッシュ）または鳥類（例えばニワトリ）のような哺乳動物ではない脊椎動物を使用することができる。マウスのような哺乳動物における使用のためには、18〜30ヌクレオチド長のステムを有する設計されたRNA前駆体が好ましい。

トランスジェニック創始動物は、例えば、PCRまたはノーザン解析を用いて、そのゲノムにおける新しいRNA前駆体をコードする導入遺伝子の存在、および／または、その動物の組織もしくは細胞における導入遺伝子の発現に基づいて同定することができる。発現は、標的配列の発現（RNAまたはタンパク質）における減少によって確証される。

導入遺伝子を有する付加的な動物を育種するために、トランスジェニック創始動物を使用することができる。さらに、RNA前駆体をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物にさらに育種することが可能である。加えて、トランスジェニック創始動物またはその子孫から得られる細胞は、培養して、導入遺伝子を含む一次細胞系、二次細胞系、または不死化細胞系を確立することができる。

非ヒトトランスジェニック動物を作製するための手順
細胞（例えば、体細胞および生殖細胞の双方）への、または祖先の生殖系列への導入遺伝子の導入によって付加的な遺伝子を獲得した動物である、非ヒトトランスジェニック動物を得るために、多くの方法が使用されてきた。幾つかの場合においては、トランスジェニック動物は、商業的な施設（例えば、Michigan State Universityにおけるトランスジェニックショウジョウバエ-ファシリティー(The Transgenic Drosophila Facility)、Medical College of Georgia(Augusta, Georgia)におけるトランスジェニックゼブラフィッシュ-コアファシリティー(Transgenic Zebrafish Core Facility)、およびXenogen Biosciences(St. Louis, MO)）によって作製され得る。一般に、トランスジェニック動物を生み出すためには、導入遺伝子を含む構築物を施設に供給する。

トランスジェニック動物を生み出すための方法は、その動物の生殖系列に導入遺伝子を導入する段階を含む。1つの方法は、初期（例えば四細胞期前；Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5016；Brinsterら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438）の胚の前核に遺伝子構築物をマイクロインジェクションすることによるものである。または、レトロウイルスへの感染によって、導入遺伝子を前核に導入することができる。そのようなトランスジェニックマウスを生産するための詳細な手順は説明されている（例えば、Hoganら, 「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY(1986)；米国特許第5,175,383号(1992)を参照のこと）。この手順は、他の動物種にも適用されている（例えば、Hammerら, 1985, Nature 315:680；Murrayら, 1989, Reprod. Fert. Devl. 1:147；Purselら, 1987, Vet. Immunol. Histopath. 17:303；Rexroadら, 1990, J. Reprod. Fert. 41(補遺):119；Rexroadら, 1989, Molec. Reprod. Devl. 1:164；Simonsら, 1988, Bio Technology 6:179；Vizeら, 1988, J. Cell. Sci. 90:295；およびWagner, 1989, J. Cell. Biochem. 13B(補遺):164）。

要約すると、本手順は、発生する哺乳動物の細胞において保持されるべき導入遺伝子の1つまたは複数のコピーを生じさせるために、哺乳動物の受精卵の前核に構築物をマイクロインジェクションすることによって、動物に導入遺伝子を導入する段階に関与する。導入遺伝子構築物の受精卵への導入後に、インビトロにおいて卵を様々な時間インキュベートすることができ、または代理宿主に再移植することができ、またはその双方を行うことが可能である。1つの一般的な方法は、種に依存して、インビトロにおいて胚を約1〜7日間インキュベートし、その後、それらを代理宿主に再移植するものである。形質転換の操作を受けた胚の子孫における導入遺伝子の存在は、組織片のサザンブロット解析によって試験することが可能である。

生殖系列のトランスジェニック動物を生産するためのその他の方法は、胚性幹（ES）細胞の使用によるものである。遺伝子構築物は、ゲノムの転写活性のある領域において、相同組換えによって胚性幹細胞に導入することができる（Thomasら, 1987, Cell 51:503；Capecchi, Science 1989, 244:1288；Joynerら, 1989, Nature 338:153）。適切な構築物は、エレクトロポレーション（Ausubelら, 「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, 1987）によるもののようなDNA仲介のトランスフェクションによって胚性幹細胞に導入することもできる。胚性幹細胞（例えばES-D3、ATCC#CCL-1934、ES-E14TG2a、ATCC#CCL-1821、アメリカン-タイプ-カルチャーコレクション（American Type Culture Collection；Rockville, MD））を培養するための詳細な手順、および胚性幹細胞からトランスジェニック動物を作製する方法は、「奇形癌および胚性幹細胞、実際的方法（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach）」, E. J. Robertson編（IRL Press, 1987）にて見出すことができる。要約すると、ES細胞は、インビトロにおいて培養される、前移植胚から得られる（Evansら, 1981, Nature 292:154〜156）。導入遺伝子は、DNAのトランスフェクションにより、または、レトロウイルス仲介の導入により、ES細胞に効率よく導入されることが可能である。その結果生じる形質転換ES細胞はその後、非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わせることができる。ES細胞は胚を形成し、結果的に生じるキメラ動物の生殖系列の元となる。

上記の方法において、取り込まれ、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子として遺伝可能な、直鎖状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして、導入遺伝子を導入することができる。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして遺伝可能なように構築することもできる（Gassmannら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292）。プラスミドは、宿主において自律複製できるDNA分子である。

非ヒトトランスジェニック動物を、例えば設計されたRNA前駆体をコードする遺伝子を有する組換えウイルスベクターを用いて、インビボ（例えば直接注入）かまたはエクスビボ（例えば、宿主外にて細胞を感染させ、後に再移植する）か、または、インビトロ（例えば宿主外にて細胞を感染させる）のいずれかにおいて、細胞を感染またはトランスフェクションすることによって得ることもできる。適切なウイルスベクターの例は、組換えレトロウイルスベクター（Valerioら, 1989, Gene 84:419；Scharfmanら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:462；MillerおよびButtimore, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:2895）、組換えアデノウイルスベクター（Freidmanら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:3791；Levreroら, 1991, Gene 101:195）、および組換え単純疱疹ウイルスベクター（Finkら, 1992, Human Gene Therapy 3:11）を含む。そのような方法は、トランスジェニック動物の作製以外の使用のために、細胞に構築物を導入するためにも有用である。

他の方法は、新しい、設計されたRNA前駆体をコードする導入遺伝子を、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純疱疹ウイルス-1を含むウイルスベクター、または、組換え細菌プラスミドもしくは組換え真核生物のプラスミドに挿入する段階を含む。ウイルスベクターは細胞を直接的にトランスフェクションする。他の方法は、例えば陽イオン性リポソーム（リポフェクチン（lipofectin））、または誘導（例えば抗体結合）ポリリシン結合体、グラミシジンS、人工ウイルスエンベロープ、またはそのような細胞内担体の他のもの、および、導入遺伝子構築物の直接注入またはインビボにおいて実施されるリン酸カルシウム沈殿法を活用して、プラスミドDNAの形態において導入遺伝子を送達する段階を含む。そのような方法は、トランスジェニック動物の作製以外の使用のために、細胞に構築物を導入するためにインビトロにおいて使用することもできる。

レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、インビボまたはインビトロにおける外因性の遺伝子を導入するための組換え遺伝子送達系として使用することができる。これらのベクターは、細胞への遺伝子の効率のよい送達を提供し、導入された核酸は、宿主の染色体DNAに安定して組み込まれる。複製欠損レトロウイルスのみを生産する特殊化された細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発によって、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が増加し、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療のための遺伝子導入における使用について特徴付けられる（概説については、Miller, 1990, Blood 76:271を参照のこと）。複製欠損レトロウイルスは、標準技術によるヘルパーウイルスの使用によって標的細胞を感染させるために使用することができるビリオンにパッケージングすることができる。組換えレトロウイルスを生産するための、および、インビトロまたはインビボにおいて細胞をそのようなウイルスに感染させるためのプロトコールは、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」, Ausubel, F.M.ら（編）Greene Publishing Associates, (1989), 第9.10〜9.14節、および他の標準実験マニュアルにおいて見出すことができる。

適切なレトロウイルスの例は、当業者に知られているpLJ、pZIP、pWEおよびpEMを含む。自己向性（Ecotropic）および両種向性（amphotropic）のレトロウイルス系の双方を調製するための、適切なパッケージングウイルス系統の例は、Psi-Crip、Psi-Cre、Psi-2およびPsi-Amを含む。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボにおいて、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型に、様々な遺伝子を導入するために使用されてきた（例えば、Eglitisら, 1985, Science 230:1395〜1398；DanosおよびMulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460〜6464；Wilsonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014〜3018；Armentanoら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141〜6145；Huberら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039〜8043；Ferryら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377〜8381；Chowdhuryら, 1991, Science 254:1802〜1805；van Beusechemら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640〜7644；Kayら, 1992, Human Gene Therapy 3:641〜647；Daiら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892〜10895；Hwuら, 1993, J.Immunol. 150:4104〜4115；米国特許第4,868,116号；同第4,980,286号；国際公開公報第89/07136号；同第89/02468号；同第89/05345号；および同第92/07573号を参照のこと）。

その他の例においては、組換えレトロウイルスゲノムを、PA317およびPsi-CRIP（Cornetteら, 1991, Human Gene Therapy 2:5〜10；Coneら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）のような適切なパッケージング細胞系にトランスフェクションすることによって、細胞のゲノムに挿入された遺伝子を導入および発現できる組換えレトロウイルスベクターを生産することができる。組換えアデノウイルスベクターは、感受性の宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）において、広範な種類の細胞および組織を感染させるために使用することができ（Hsuら, 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、感染のために分裂活性のある細胞を必要としないという利点も有する。

本発明において有用な、その他のウイルス遺伝子送達系も、アデノウイルスに由来するベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、関心対象の遺伝子産物をコードし発現するが、正常な細胞溶解性ウイルスの生活環において複製するその能力については不活性化されているように操作することができる。例えば、Berknerら（1988, BioTechniques 6:616）、Rosenfeldら（1991, Science 252:431〜434）、およびRosenfeldら（1992, Cell 68:143〜155）を参照のこと。アデノウイルス株Ad5型dl324または他のアデノウイルス株（例えば、Ad2、Ad3、Ad7等）に由来する、適切なアデノウイルスベクターが当業者には知られている。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞を感染できないようなある状況においては好都合なものとなり得、上皮細胞を含む、広範な種類の細胞型を感染させるために使用することができる（Rosenfeldら, 1992, 前記にて引用）。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮を行うことができ、上記のように、感染性のスペクトルに影響を与えるように改変することができる。その上、導入されたアデノウイルスDNA（およびそこに含まれる外来のDNA）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれず、エピソームのままであり、それにより、導入されたDNA（例えばレトロウイルスDNA）が宿主ゲノムに組み込まれたものとなるような、インサイチューの挿入突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題が避けられる。さらに、アデノウイルスゲノムの外来のDNAを保有する能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（8 kbまで）（Berknerら, 前記にて引用；Haj-AhmandおよびGraham, 1986, J. Viol. 57:267）。

対象の導入遺伝子を送達するために有用な、さらにその他のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（AAV）である。アデノ関連ウイルスは、効率のよい複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのようなその他のウイルスを必要とする、天然に生じる欠損ウイルスである。概説については、Muzyczkaら（1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158:97〜129）を参照のこと。それはまた、そのDNAを非分裂細胞に組み込むことができ、高い頻度の安定した組み込みを示す、数少ないウイルスの1つでもある（例えば、Flotteら(1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349〜356；Samulskiら, 1989, J. Virol. 63:3822〜3828；およびMcLaughlinら(1989, J. Virol. 62:1963〜1973))を参照のこと）。AAVの約300個の少ない塩基対を含むベクターは、パッケージングされることが可能であり、組み込むことができる。外因性のDNAのための空間は約4.5 kbに限られている。Tratschinら（1985）, Mol. Cell. Biol. 5:3251〜3260において説明されるもののようなAAVベクターは、細胞にDNAを導入するために使用することができる。AAVベクターを用いて、異なる細胞型に、様々な核酸が導入されてきた（例えば、Hermonatら(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466〜6470；Tratschinら(1985), Mol. Cell. Biol. 4:2072〜2081；Wondisfordら(1988), Mol. Endocrinol. 2:32〜39；Tratschinら(1984), J. Virol. 51:611〜619；およびFlotteら(1993), J. Biol. Chem. 268:3781〜3790を参照のこと）。

上記にて例示されるもののようなウイルス移入法に加え、ある動物の組織において、本発明の設計されたRNA前駆体の発現を引き起こすために、非ウイルス法を使用することもできる。遺伝子移入のほとんどの非ウイルス法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳動物細胞によって使用される正常な機構に依存するものである。好ましい態様においては、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、本発明の対象の遺伝子を標的細胞によって取り込ませるために、エンドサイトーシス経路に依存する。この型の典型的な遺伝子送達系は、リポソームに由来する系、ポリリシン結合体、および人工ウイルスエンベロープを含む。他の態様には、Meuliら（2001）, J. Invest. Dermatol., 116(1):131〜135；Cohenら（2000）, Gene Ther., 7(22)；1896〜905；およびTamら, (2000), Gene Ther., 7(21):1867〜74において説明されるような、プラスミド注入系が含まれる。

典型的な態様においては、本発明の設計されたRNA前駆体をコードする遺伝子は、（例えばリポフェクチンのように）その表面上において正の電荷を有する、および、（選択的に）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体によって標識される、リポソームに封入されることが可能である（Mizunoら, (1992), No Shinkei Geka, 20:547〜551；国際公開公報第91/06309号；日本特許出願第1047381号；および欧州特許公開第EP-A-43075号）。

導入遺伝子を有する動物は、（例えばサザン解析を用いて）ゲノムDNAにおける導入遺伝子の存在を検出することによって同定することができる。加えて、設計されたRNA前駆体の発現は、（例えばノーザン解析によって）直接的に検出することが可能である。導入遺伝子の発現は、標的配列に対応するタンパク質の量における減少を検出することによって確認することもできる。導入遺伝子が、誘導可能なプロモーター、または、発生段階において調節されるプロモーターの制御下にある場合、標的タンパク質の発現は各々、導入遺伝子が誘導された場合に減少する、または、導入遺伝子が発現される発生段階において減少する。

トランスジェニック動物のクローン
本明細書において説明される非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmutら（(1997), Nature, 385:810〜813および国際公開公報第97/07668号および同第97/07669号）において説明される方法に従って生産することができる。要するに、細胞、例えばトランスジェニック動物に由来する体細胞を、単離し、成長周期から抜け出しG₀期に入り休止するよう誘導することが可能である。休止細胞をその後、例えばその休止細胞が単離された同じ種のある動物からの脱核した卵母細胞と、電気パルスを使用することによって、融合することができる。再構築された卵母細胞はその後、桑実胚または未分化胚芽細胞に発達するように培養され、その後、偽妊娠雌性養親動物に移植される。この雌性養親動物から生まれる子孫は、例えば体細胞のような細胞が単離された動物のクローンとなると考えられる。

トランスジェニック動物が作製された場合、トランスジェニック動物の細胞および対照動物からの細胞を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてスクリーニングし、RNA前駆体核酸配列の存在が決定される。または、（例えばノーザンブロット解析または逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)；Sambrookら, 「分子クローニング−実験マニュアル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）」, (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) のような標準法によって、）細胞をスクリーニングし、RNA前駆体が発現されているかどうかを決定することができる。

本発明のトランスジェニック動物は、ホモ接合またはヘテロ接合であることができ、本発明の恩典の1つは、ヘテロ接合体においてでさえも標的mRNAが有効に分解されることである。本発明は、全てのそれらの細胞において本発明の導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、および、それらの全ての細胞ではないが幾つかの細胞において導入遺伝子を有する動物を提供する。即ち、本発明は、モザイク動物を提供する。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー、例えば逆向き（head-to-head）反復配列または順方向（head-to-tail）反復配列として組み込むことができる。

トランスジェニック動物を作製し、評価するために使用することができる技術の概説については、当業者はGordon（Intl. Rev. Cytol. 115:171〜229, 1989）を参照することができ、例えば：Hoganら「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986）；Krimpenfortら, Bio/Technology 9:86, 1991；Palmiterら, Cell 41:343, 1985；Kraemerら, 「早期哺乳動物胚の遺伝子操作（Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo）」, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1985；Hammerら, Nature 315:680, 1985；Purcelら, Science, 244:1281, 1986；Wagnerら, 米国特許第5,175,385号；およびKrimpenfortら, 米国特許第5,175,384号から付加的な手引きを得ることができる。

トランスジェニック植物
本発明において特徴付けられる真核生物には、本発明の設計されたRNA前駆体をコードする外因性の核酸を含む植物がある。

したがって、本発明に係る方法は、本明細書において説明される核酸分子または構築物（例えば導入遺伝子）を有する植物を作製する段階を含む。外因性の核酸を単子葉植物または双子葉植物に導入するための技術は、当技術分野において知られており、限定はしないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する形質転換、ウイルスベクターを介する形質転換、エレクトロポレーション、およびパーティクルガン形質転換を含む。例えば、米国特許第5,204,253号および同第6,013,863号を参照のこと。形質転換のためのレシピエント組織として細胞培養物または組織培養物が使用される場合、当業者に既知の技術によって、形質転換培養物から植物を再分化することができる。例えばあるポリペプチドをコードする核酸を他の系統に導入するために、核酸を他の種に導入するために、または他の望ましい形質のさらなる選択のために、トランスジェニック植物を育種計画に入れることができる。または、トランスジェニック植物は、そのような技術を行うことができる種については、栄養繁殖させることができる。後代は、特定の植物または植物系統の子孫を含む。植物の後代は、F₁、F₂、F₃において形成される種子、およびそれに続く世代の植物体、または、BC₁、BC₂、BC₃において形成される種子、およびそれに続く世代の植物体を含む。トランスジェニック植物によって生産される種子を成長させることができ、その後、自家受粉させ（または他殖および自家受粉させ）、新規のポリペプチドをコードする核酸についてホモ接合である種子を得ることができる。

本発明を実施するための適切な植物群は、ベニバナ、アルファルファ、ダイズ、ナタネ（高級エルカ酸およびキャノーラ）、またはヒマワリのような双子葉植物を含む。同様に適切なものは、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、イネ、キビ、アマランス、またはモロコシ属のような単子葉植物である。同様に適切なものは、ジャガイモ、ブロッコリー、エンドウ、甘味種トウモロコシ、ポップコーン、トマト、豆類（インゲンマメ、ライマメ、乾燥したマメ（dry beans）、サヤインゲンを含む）などのような蔬菜作物または根菜類である。同様に適切なものは、モモ、ナシ、リンゴ、サクランボ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、プラム、マンゴー、およびヤシのような果実作物である。したがって、本発明は、カシューナッツ属（Anacardium）、ラッカセイ属（Arachis）、アスパラガス属（Asparagus）、ロウトウ属（Atropa）、カラスムギ属（Avena）、アブラナ属（Brassica）、ミカン類（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、ベニバナ属（Carthamus）、ココヤシ属（Cocos）、コーヒー属（Coffea）、キュウリ属（Cucumis）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、アブラヤシ属（Elaeis）、イチゴ属（Fragaria）、ダイズ属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、ヒマワリ属（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、オオムギ属（Hordeum）、ヒヨス属（Hyoscyamus）、アキノノゲシ属（Lactuca）、アマ属（Linum）、ドクムギ属（Lolium）、ハウチワマメ属（Lupinus）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、マジョラーナ（Majorana）、ウマゴヤシ属（Medicago）、タバコ属（Nicotiana）、オリーブ属（Olea）、イネ属（Oryza）、キビ属（Panicum）、チカラシバ属（Pannesetum）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、トネリバハゼノキ属（Pistachia）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、トウゴマ属（Ricinus）、ライムギ属（Secale）、キオン属（Senecio）、カラシ属（Sinapis）、ナス属（Solanum）、モロコシ属（Sorghum）、カカオ属（Theobromus）、トリゴネラ属（Trigonella）、コムギ属（Triticum）、ソラマメ属（Vicia）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）、およびトウモロコシ属（Zea）からの種を含む、広い範囲の植物に渡って使用される。

本発明の核酸分子は、植物において存在する特定の核酸構築物に含むために選択された調節因子に従って、細胞特異的または組織特異的な様式で植物において発現することができる。本発明のキメラポリペプチドを発現するための適切な細胞、組織、および器官は、限定はしないが、卵細胞、中心細胞、助細胞、接合体、胚珠原基、珠心、珠皮、内皮、雌性配偶体細胞、胚、花軸、子葉、胚柄、内乳、種皮、基本分裂組織、維管束、形成層、師部、皮層、シュートまたは根の頂端分裂組織、側生シュートまたは根の分裂組織、花分裂組織、葉原基、葉肉細胞、および葉の表皮細胞、例えば、クチクラ層の形成に関与する表皮細胞を含む。同様に適切なものは、液体培地において、または、半固体培地上において成長する細胞および組織である。

トランスジェニック真菌
本発明において特徴付けられる他の真核生物は、本発明の設計されたRNA前駆体をコードする外因性の核酸分子を含む真菌である。

したがって、本発明に係る方法は、本明細書において説明されるような核酸分子または構築物を真菌に導入する段階を含む。外因性の核酸を多くの真菌に導入するための技術は、当技術分野において知られている。例えば、米国特許第5,252,726号および同第5,070,020号を参照のこと。形質転換真菌は、当業者に既知の技術によって培養することができる。そのような真菌は、あるポリペプチドをコードする核酸を他の真菌株に導入するために、核酸を他の種に導入するために、または他の望ましい形質のさらなる選択のために使用することができる。

本発明を実施するための適切な真菌群は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）、S.ポンベ（S.pombe）、S.カールスベルゲンシス（S.carlsbergeris）、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のような、分裂酵母および出芽酵母を含む。アスペルギルス属（Aspergillus）およびペニシリウム属（Penicillium）のような糸状菌も有用である。

薬学的組成物
本発明の分子は、薬学的組成物に組み入れることが可能である。そのような組成物は、典型的には、例えば、設計されたRNA前駆体をコードする核酸分子（例えば導入遺伝子）、または前駆体RNAそれ自体のような核酸分子、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的な投与に対して適合性の溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補足的な活性な化合物を組成物に組み入れることもできる。

薬学的組成物は、意図されるその投与経路に対して適合性であるように製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。投与は、経口であることも可能である。皮内投与、または皮下投与のような非経口投与のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射のための水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液のような緩衝液、および、塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性を調整するための作用物質。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてpHを調整することができる。非経口調製物を、アンプル、使い捨ての注射器、またはガラスもしくはプラスチックから製造される複数回投与バイアルに封入することが可能である。

注射の使用に適した薬学的組成物は、注入可能な滅菌溶液または分散の臨機的な調製のための、（水溶性の場合）滅菌水溶液または分散、および滅菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切な担体は、生理的食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝溶液（PBS）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射可能な程度に流動性があるべきである。それは、製造および保管の条件下において安定したものであるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒体、およびその適切な混合物であることが可能である。適切な流動率は、例えばレシチンのようなコーティング剤を使用することによって、分散の場合は必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の阻害は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどのような、様々な抗菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅延させる作用物質を組成物中に含むことによって、注射用組成物の持続性の吸収をもたらすことが可能である。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙される成分の1つまたは組み合わせと共に、必要とされる量の活性な化合物を適切な溶媒中に組み入れ、その後、ろ過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散は、活性な化合物を、基礎分散媒体および上記に列挙されるものから必要な他の成分を含む滅菌溶媒に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前にろ過滅菌されたその溶液から、任意の付加的な望ましい成分を活性成分に加えたものの粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。

経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用の担体を含む。経口の治療的投与のために、活性な化合物は、賦形剤と共に組み入れ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態において使用することができる。経口組成物は、洗口剤としての使用のために液体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバントの材料は、組成物の部分として含まれることが可能である。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質をもつ化合物のいずれかを含み得る：マイクロクリスタリンセルロース、トラガガントガムもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくはラクトースのような賦形剤；アルギン酸、Primogel（商標）、もしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes（商標）のような滑沢剤；二酸化ケイ素コロイド溶液のような流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンのような甘味剤；または、ペパーミント、メチルサリチル酸、もしくはオレンジ着香料のような着香剤。

吸入によって投与するためには、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のような気体、または噴霧器を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態において送達される。

全身投与は、経粘膜的手段または経皮的手段によるものも可能である。経粘膜投与または経皮投与のためには、浸透される障壁に適した浸透剤が製剤において使用される。そのような浸透剤は、当技術分野においては一般に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻用スプレーまたは坐剤の使用によって達成することが可能である。経皮投与のためには、活性な化合物は、当技術分野において一般に知られるような軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。

化合物は、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来的な坐剤基剤を用いて）または停留浣腸剤の形態において調製することも可能である。

ある態様においては、活性な化合物は、埋込剤およびマイクロカプセル化送達系を含む、徐放製剤のような、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護するような担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性の、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかである。材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販されているものから得ることができる。薬学的に許容される担体として、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的指向するリポソームを含む）を使用することもできる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号において説明されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。

投与を容易にするために、および用量の一貫性を保つために、経口組成物または非経口組成物を用量単位形態に製剤化することは好都合である。本明細書において使用されるような用量単位形態は、治療される被験者のための単回用量として適した、物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して、望ましい治療的効果をもたらすよう計算された、予め決定された量の活性な化合物を含む。

そのような化合物の毒性および治療的有効性は、例えばLD50（集団の50％に対して致死的である投与量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手法によって決定することができる。毒性効果と治療的効果の間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高度の治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用される可能性があるが、非感染細胞への潜在的なダメージを最小限にするために、およびしたがって副作用を減少させるために、そのような化合物を、冒された組織の部位に指向させる送達系を設計するよう注意を払うべきである。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の用量の製剤化において使用することができる。本発明の組成物の用量は、好ましくは、毒性のほとんどないまたは全くない、ED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内にて異なってよい。本発明の方法において使用される任意の化合物については、治療的有効量は、細胞培養アッセイから最初に評価することができる。投与量は、細胞培養において決定されるようなIC50（即ち、症状の最大時の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、または、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の、ある循環血漿濃度範囲に達するように（例えばポリペプチドの低下したある濃度に達するように）、動物モデルにおいて製剤化することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することが可能である。

設計されたRNA前駆体、またはそれ自体の前駆体をコードする配列を含む組成物の治療的有効量（即ち、有効用量）は、標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を少なくとも30％阻害する量である。ある態様においては、より高いパーセンテージ、例えば、45％、50％、75％、85％、90％またはそれ以上の阻害が好ましい可能性がある。例示な投与量は、被験者または試料重量のkg当たり、分子のmg量またはμg量（例えば、約1μg/kg〜約500 mg/kg、約100μg/kg〜約5 mg/kg、または、約1μg/kg〜約50μg/kg）を含む。組成物は、約1〜10週間の間に渡って、例えば、2〜8週間の間、または約3〜7週間の間、または約4、5、もしくは6週間に渡って、週1回投与することができる。当業者には、限定はしないが、疾患または障害の重症度、過去の治療法、被験者の一般的健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある要因が、被験者を有効に治療するのに必要とされる用量および投与頻度に影響を与え得ることが理解される。さらに、治療的有効量の組成物を用いた被験者の治療は、単回の治療または一連の治療を含み得る。幾つかの場合においては、設計されたRNA前駆体の一過的な発現が望ましい可能性がある。誘導可能なプロモーターが、設計されたRNA前駆体をコードする構築物に含まれる場合、発現を誘導するために使用される適切な投与量の物質が被験者に送達された際に、発現がアッセイされる。

ある組成物の適切な投与量が、調節されるべき発現または活性に関する、分子（設計された前駆体をコードする配列）の効力に依存することは、さらに理解される。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、これらの分子の1つまたは複数が動物（例えばヒト）に投与される場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初に比較的低い投与量を製剤化し、後に、適切な反応が得られるまで投与量を増加させることができる。加えて、任意の特定の被験者についての特定の投与量レベルは、使用される特定の化合物の活性、被験者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事、ならびに投与頻度、投与経路、排泄率、薬剤のいずれかの組み合わせ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む、様々な要因に依存することが理解される。

本発明の核酸分子は、一般に、ベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号を参照のこと）によって、または定位的な注入（例えば、Chenら(1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054〜3057を参照のこと）によって被験者に送達されることが可能である。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得る、または、遺伝子送達溶媒が埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。または、例えばレトロウイルスベクターのように、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクターを完全な状態で生産することができる場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を生産する、1つもしくはそれ以上の細胞を含み得る。

薬学的組成物を、容器、包装、またはディスペンサーの中に、投与のための使用説明書と共に含ませることができる。

治療の方法
本発明は、転写される任意の遺伝子の、異常なもしくは望ましくない発現もしくは活性に関連する障害に対してリスクのある（または感受性の）被験者、または、そのような障害を有する被験者を治療する、予防的方法および治療的方法の双方を提供する。本明細書において使用されるように、「治療」という用語は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治療する、治癒させる、緩和する、軽減する、変化させる、治す、回復させる、改善する、またはそれに影響を与えるために、障害、例えば疾患もしくは状態、疾患の症状、または疾患に対する素因を有する患者への治療的作用物質の適用もしくは投与として、または、そのような患者から単離された組織もしくは細胞系への治療的作用物質の適用もしくは投与として定義付けられる。治療的作用物質は、本発明の設計されたRNA前駆体、または、その前駆体をコードする核酸分子（DNA）である。

治療の予防的方法および治療的方法の双方に関して、被験者のゲノムについて得られる知識、特に、その発現が疾患と関連する遺伝子配列（即ち、突然変異遺伝子）についての知識に基づいて、そのような治療は特異的に設計または改変することができる。したがって、本発明の分子は、本明細書において説明されるように、その遺伝子の発現を阻害するために、その発現が標的とされる遺伝子の知識に基づいて設計することができる。

したがって、ある局面においては、本発明は、設計された前駆体RNAをコードする、設計された核酸配列を被験者に投与することによって、被験者において、異常な、または望ましくない、遺伝子の発現または活性に関連する障害、例えば疾患もしくは状態を治療するための方法を提供する。遺伝子の異常な、または望ましくない、発現または活性に引き起こされる、または起因する障害に対してリスクのある被験者は、例えば、当技術分野において既知の診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。予防薬の投与は、疾患もしくは障害が予防されるように、または、その進行が遅延されるように、異常に特徴的な症状の発現以前に行うことが可能である。

本発明の分子は、細胞増殖性障害および／または細胞分化障害、骨代謝に関連する障害、免疫障害、造血障害、心臓血管障害、肝臓障害、ウイルス性疾患、痛みまたは代謝障害の1つまたは複数を調節するための新規の治療的物質として作用し得る。

細胞増殖性障害および／または細胞分化障害の例は、癌、例えば、癌腫、肉腫、転移性の障害または造血新生物形成性障害、例えば白血病を含む。転移性の腫瘍は、限定はしないが、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓起源のものを含む、多くの原発性腫瘍型から生じ得る。

本明細書において使用されるように、「癌」、「過増殖性」、および「新生物形成性の」という用語は、自律増殖能を有する細胞、即ち、迅速に激増する細胞の増殖によって特徴付けられる、異常な状態または状況を指す。過増殖性および新生物形成性の疾患状態は、病理学的なものとして、即ち、疾患状態を特徴付けるもしくは構成するものとして分類することができる、または、非病理学的なものとして、即ち、正常なものからは逸脱するが、疾患状態とは関連しないものとして分類することができる。本用語は、組織病理学的型または侵襲性の段階と関係なく、全ての型の癌の成長または腫瘍形成の過程、転移性の組織、または悪性にトランスフォーメーションされた細胞、組織、もしくは器官を含むことを意図する。「病理学的な過増殖性」細胞は、悪性腫瘍の成長によって特徴付けられる疾患状態において生じる。非病理学的過増殖性細胞の例は、創傷修復に関連する細胞の増殖を含む。

「癌」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ、胃腸、および尿生殖管を冒すもののような、様々な器官系の悪性疾患、ならびに、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣の腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌および食道の癌のような悪性疾患を含む腺癌を含む。

「癌」という用語は、当技術分野において認識されており、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む上皮組織または内分泌組織の悪性疾患を指す。例示的には、癌は、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭部および頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものを含む。本用語は、例えば癌性組織および肉腫性の組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫をも含む。「腺癌」は、腺の組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成しているような癌を指す。

「肉腫」という用語は、当技術分野において認識されており、間葉誘導の悪性腫瘍を指す。

増殖性障害の付加的な例は、造血新生物形成性障害を含む。本明細書において使用されるように、「造血新生物形成性障害」という用語は、造血起源の、例えば骨髄球系、リンパ球系もしくは赤血球系、またはその前駆細胞から生じる、過形成／新生物形成性細胞に関与する疾患を含む。好ましくは、不十分に分化した急性白血病、例えば赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から疾患は生じる。さらなる例示的な骨髄性障害は、限定はしないが、急性前骨髄性白血病（APML）、急性骨髄性白血病（AML）および慢性骨髄性白血病（CML）を含む（Vaickus,L.,(1991), Crit.Rev.、Oncol./Hemotol. 11:267〜97において概説されている）；リンパ球系悪性疾患は、限定はしないが、B細胞系ALLおよびT細胞系ALL、慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病（PLL）、ヘアリーセル白血病（HLL）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）を含む、急性リンパ芽球性白血病（ALL）を含む。悪性リンパ腫の付加的な形態は、限定はしないが、非ホジキンリンパ腫およびその変異型、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫（ATL）、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）、大顆粒リンパ性白血病（LGF）、ホジキン病およびリード・ステルンベルグ病を含む。

一般に、本発明の設計されたRNA前駆体は、特定の障害に関連する遺伝子を標的とするように設計される。標的とすることができる増殖性障害と関連するそのような遺伝子の例は、活性化されたras、p53、BRCA-1およびBRCA-2を含む。標的とすることができる、他の特定の遺伝子は、筋萎縮性側索硬化症と関連するもの（ALS；例えば、スーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)）；ハンティングトン病と関連するもの（例えばhuntingtin）、パーキンソン病と関連するもの（parkin）、および常染色体優性遺伝病に関連する遺伝子である。

本発明の設計されたRNAは、様々な免疫障害、特に遺伝子の過剰発現または突然変異遺伝子の発現と関連するものを治療するために使用することができる。造血障害または造血疾患の例は、限定はしないが、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、ぜん息、アレルギー性ぜん息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らいの境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感覚神経性難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症を含む）、移植の場合の対宿主性移植片病、およびアトピー性アレルギーのようなアレルギーを含む。

心臓または「心臓血管障害」に関与する障害の例は、限定はしないが、心臓血管系、例えば心臓、血管、および／または血液に関与する疾患、障害、または状態を含む。心臓血管障害は、動脈圧の不均等、心臓の機能不全、または血管の閉塞によって、例えば血栓によって引き起こされうる。そのような障害の例は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈攣縮、うっ血性心不全、冠動脈疾患、弁膜症、不整脈、および心筋症を含む。

本明細書において説明される方法によって治療できる障害は、限定はしないが、既存の線維の虚脱および圧縮を伴う、細胞外マトリックスの生産と分解の間の不均等から生じるもののような、肝臓における線維組織の蓄積に関連する障害を含む。

さらに、本発明の分子は、限定はしないが、B型肝炎、C型肝炎、単純疱疹ウイルス（HSV）、HIV-AIDS、ポリオウイルス、および痘瘡ウイルスを含むウイルス性疾患を治療するために使用することができる。本発明の分子は、本明細書において説明されるように、発現されるウイルスの配列を標的とし、したがってウイルスの活性および複製を軽減するように設計される。本分子は、ウイルスに感染した組織の治療および／または診断において使用することができる。同様に、そのような分子は、肝細胞癌のようなウイルス関連癌の治療において使用することができる。

RNAiを誘導するための設計されたRNA前駆体の使用
本明細書において説明されるように、細胞または完全な生物体に導入された、設計されたRNA前駆体は、望ましいsiRNA分子の生産を導く。そのようなsiRNA分子はその後、RNAi経路の内因性のタンパク質成分と相互作用し、特定のmRNA配列に結合し、切断および破壊の標的とする。この方式において、設計されたRNA前駆体から生じたsiRNAによって標的とされるmRNAは、細胞または生物体から激減させられ、細胞または生物体における、mRNAによってコードされるタンパク質の濃度の減少が導かれる。

例えば、過剰発現が無制限の細胞増殖を導くようなキナーゼの活性を低下させる低分子を見出そうとしている可能性がある。このキナーゼは、様々な癌細胞において過剰発現される。決定されるべき重要な問題は、成体の哺乳動物においてこのキナーゼの活性を低下させることが、予測されない有害な効果を生じるか否かということである。成体マウスの組織内のキナーゼをコードするmRNAをRNAi経路による破壊の標的とする、設計されたRNA前駆体を発現させることによって、そのような潜在的な薬剤の有害効果を決定することができる。即ち、ここで説明される方法によって、薬剤の標的としてのキナーゼの適性を迅速に評価することが可能になる。

アレイ中の各細胞またはベクターが、異なる標的遺伝子について特異的な、設計されたRNA前駆体をコードする核酸分子を含むようなマイクロアレイにおいて多数の細胞またはベクターを作製するために、設計されたRNA前駆体をコードする新しい核酸分子を使用することもできる。例えば、Ziauddinら, Nature, 411:107〜110(2001)を参照のこと。

実施例
本発明は、特許請求の範囲において説明される本発明の範囲を制限することなく、以下の実施例においてさらに説明される。

実施例1−設計されたRNA前駆体の生産
ホタルルシフェラーゼについての遺伝子を切断の標的とする、設計されたRNA前駆体を生産するために、ホタルルシフェラーゼからのmRNAのコード部分の配列を試験し、適切な配列を選択した。翻訳開始点に対して3'側の、100ヌクレオチドより多いが300ヌクレオチド未満の位置において、配列

は、配列AAの直後に認められた。この配列はsiRNAを選択するための基準に合致するため選択された。ある設計前駆体RNAをその後、下記に示されるように（および図2Bにおいて示されるように）、この配列（下線）を含むように設計した：

合成デオキシオリゴヌクレオチド配列を、公表されたプロトコールにしたがって、酵素T7 RNAポリメラーゼを用いて、この設計されたRNA前駆体を調製するためのインビトロの転写鋳型として使用できるように調製した。下記には、2つのデオキシオリゴヌクレオチドが示される。オリゴヌクレオチドは、インビトロにおけるRNAへの転写を容易にするために、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの配列（上の鎖において下線を施してある）を含む。
上のオリゴヌクレオチド：

下のオリゴヌクレオチド：

次に、2つのデオキシオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって二重鎖DNAを形成し、T7 RNAポリメラーゼを用いてRNAに転写した。その結果生じた、設計されたRNA前駆体を標準法によって精製し、その後、標準RNAi反応においてインビトロにおける標的mRNAの切断を促進する能力について試験した。

手短に言えば、インビトロの転写によって、ホタルルシフェラーゼmRNAを調製し、α-³²P-GTPおよびグアニリルトランスフェラーゼを以前に説明されたように（Tuschlら, (1999), 前記にて引用）用いて放射性標識し、放射性標的mRNAを作製した。以前に説明されたように（Tuschlら, (1999), 前記にて引用）、ショウジョウバエの胚の溶解物および50 nMの設計されたRNA前駆体（ESP）を用いて0時間および3時間の標準のインビトロのRNAi反応において、放射性標的mRNAをインキュベートした。以前に説明されたように（Zamoreら, (2000), 前記にて引用）、反応産物を単離し、変性アクリルアミドゲル電気泳動によって解析した。図3において示されるように、設計されたRNA前駆体は、放射性標的mRNAの配列特異的な切断（5'切断産物）を誘導した。したがって、前駆体は、RNAiを仲介することが示された。図3は、ESPと同じ配列特異的な5'切断産物を生産した、標準siRNA（同様に0時間および3時間インキュベートした）のRNA切断産物をも示す。

実施例2−設計されたlet-7前駆体RNAはインビトロにおいてRNAiを非対称に誘発する
プレlet-7（図4Bおよび図4C）のステムをホタルルシフェラーゼに対して相補的な配列を含むように変化させた、2つの設計されたlet-7 RNA前駆体（ESP）を調製した。ほとんどのstRNAがウラシルから開始するため、ルシフェラーゼに相補的な配列（アンチセンスルシフェラーゼ）がUから開始するように、ESPを設計した。stRNAは、（例えばいずれかのステム上の）前駆体ヘアピンの5'側または3'側のいずれかにおいてコードされることが可能であるため、アンチセンスルシフェラーゼ配列（太字）を、1つのESPにおけるステムの3'側（3'ESP）（図4B）および第二のステムにおける5'側（5'ESP）（図4C）に置いた。

以下のDNAオリゴヌクレオチド対を用いることによって、実施例1において一般に説明されるようにESP RNAを調製し、部分的に単鎖のT7 RNAポリメラーゼ転写鋳型を作製した：

アンチセンスホタルルシフェラーゼ標的RNAについては、以前に説明されている（A.Nykanen, B.Haley, P.D. Zamore, Cell 107:309, 2001）。

インビトロの反応においてルシフェラーゼ特異的なRNAiを誘導する、各ESPの能力を、ホタルルシフェラーゼmRNAの部分およびlet-7に完全に相補的な配列を含む標的mRNA（概要を図4Dにおいて示される）に対して試験した（標的は標準技術によって構築され、T7 RNAポリメラーゼを用いて合成された）。対照として、アンチセンスルシフェラーゼ配列を含むsiRNA二本鎖が使用された（図4A）。

図4Eは、5'ESPおよび3'ESPがインビトロにおける標的RNAの切断を等しく促進できるかどうかを決定するためのアッセイ法（アッセイ条件は、ESPおよび対照を0時間および2時間インキュベートしたことを除いて、実施例1において説明される）の結果を示すオートラジオグラフである。3'ESPおよび5'ESPの双方とも、ルシフェラーゼ配列内の標的RNAの切断を行い、対照siRNAを用いてRNAi反応を行わせた場合と同じ部位が切断された。

実施例3−設計されたRNA前駆体をコードする導入遺伝子の調製
細胞の全てにおいてホタルルシフェラーゼmRNAを発現するトランスジェニックマウスにおける、ルシフェラーゼmRNAを破壊の標的とするよう設計された前駆体をコードする導入遺伝子を調製するために、標準の組換えDNA法によって、実施例1において説明される設計RNA前駆体配列を、核酸分子にクローニングする。例として、図5において例示されるように、構成的に発現されるプロモーター配列、および、設計RNA前駆体をコードする望ましい核酸配列（導入遺伝子）を含むベクターがある。このベクターは、標準法によってトランスジェニックマウスを生産するための、ES細胞への導入に適した配列をも含む。その結果生じる導入遺伝子は、トランスジェニックマウスの全ての細胞において設計RNA前駆体を発現する。

設計された前駆体RNAはその後、ダイサーおよびRNAi機構の他の成分によってプロセシングされ、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対して指向させられるsiRNAが生じる。このsiRNAは、ルシフェラーゼmRNAの切断を誘導し、動物の細胞におけるルシフェラーゼmRNAの発現の減少をもたらす。

様々なトランスジェニック動物において、構成的に発現される系または誘導可能な発現系のいずれかを用いて、他の標的遺伝子をサイレンシングするために、同一の方法を使用することができる。

他の態様
本発明をその詳細な説明と関連させて説明してきたが、前述の説明は例示することを意図するものであり、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲内にある。

stRNA経路およびsiRNA経路の二元性を示す概略図である。野生型stRNA前駆体（配列番号：1）の概略図である。合成された設計RNA前駆体（配列番号：2、3、4，および5）の概略図である。標準RNAi反応において、設計されたRNA前駆体がインビトロの標的mRNAの切断を促進できるかどうかを決定するためのアッセイ結果を示すオートラジオグラフである。合成ルシフェラーゼsiRNA（4A；配列番号：6および7）、ならびに、5'側および3'側の合成された設計RNA前駆体（4B；配列番号：8；および4C；配列番号：9）の概略図である。インビトロのルシフェラーゼ/let-7 RNAi反応のための、キメラ標的mRNAの概略図である。siRNAに誘導される標的切断の部位は、「はさみ」によって示される。図4Bおよび図4Cの5'側および3'側の、合成された設計RNA前駆体が、標準RNAi反応において、インビトロの標的mRNAの切断を促進できるかどうかを決定するためのアッセイ結果を示すオートラジオグラフである。設計されたRNA前駆体（配列番号：2）をコードする導入遺伝子、ならびに、二重鎖siRNA（配列番号：7および配列番号：12）を形成する、前駆体の転写およびプロセシングの概略図である。

Claims

哺乳動物細胞でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導することができ、細胞によりプロセシングされてｍＲＮＡの開裂を仲介するｓｉＲＮＡを生じる、以下を含む、単離核酸分子：
設計されたリボ核酸（ＲＮＡ）前駆体をコードする核酸配列に機能的に連結された調節配列であり、該前駆体が
（ｉ）哺乳動物細胞中の標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配
列に対して相補的な、１８個乃至３０個のヌクレオチドの配列を含む、第
一のステム部分；
（ｉｉ）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するため
に、第一のステム部分の１８個乃至３０個のヌクレオチドの配列に対して
相補的な、１８個乃至３０個のヌクレオチドの配列を含む、第二のステム
部分；および
（ｉｉｉ）２つのステム部分を連結するループ部分
を含む調節配列。
第一のステム部分がｍＲＮＡ配列に対して完全に相補的である、請求項１記載の核酸分子。
第二のステム部分が第一のステム部分に対して完全に相補的である、請求項１記載の核酸分子。
第一のステム部分がＲＮＡ前駆体の５’末端に位置する、請求項１記載の核酸分子。
第一のステム部分がＲＮＡ前駆体の３’末端に位置する、請求項１記載の核酸分子。
ループ部分が少なくとも４個のヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸分子。
ループ部分が少なくとも７個のヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸分子。
ループ部分が少なくとも１１個のヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸分子。
１８個乃至３０個のヌクレオチドが相補的である相手であるｍＲＮＡの配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳開始点の１００個乃至３００個のヌクレオチド３’側に位置する、請求項１記載の核酸分子。
１８個乃至３０個のヌクレオチドが相補的である相手であるｍＲＮＡの配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに位置する、請求項１記載の核酸分子。
第一のステム部分および第二のステム部分が各々２２個乃至２８個のヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸分子。
第一のステム部分および第二のステム部分が各々同じ数のヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸分子。
第一のステム部分および第二のステム部分の一方が、他方のステム部分より１個乃至４個多いヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸分子。
調節配列がＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターを含む、請求項１記載の核酸分子。
調節配列が構成性または誘導性である、請求項１記載の核酸分子。
設計されたＲＮＡ前駆体の配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、または配列番号９において示される配列である、請求項１記載の核酸分子。
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２１において示される配列またはその相補鎖を含む、請求項１記載の核酸分子。
請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
ベクターがプラスミドまたはウィルスベクターである、請求項１８記載のベクター。
ウィルスベクターがレトロウィルスベクターである、請求項１９記載のベクター。
請求項１記載の核酸分子を含む宿主細胞。
細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１記載の宿主細胞。
請求項１記載の核酸を含む導入遺伝子。
ｉｎｖｉｖｏの哺乳動物細胞でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができ、細胞によりプロセシングされてｍＲＮＡの開裂を仲介するｓｉＲＮＡを生じる、以下（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、設計されたＲＮＡ前駆体：
（ｉ）哺乳動物細胞の標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列に
対して相補的な、１８個乃至３０個のヌクレオチドの配列を含む、第一の
ステム部分；
（ｉｉ）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、
第一のステム部分の１８個乃至３０個のヌクレオチド配列に対して相補的
な、１８個乃至３０個のヌクレオチドの配列を含む、第二のステム部分；
および
（ｉｉｉ）２つのステム部分を連結するループ部分。
第一のステム部分がｍＲＮＡ配列に対して完全に相補的である、請求項２４記載の前駆体。
第二のステム部分が第一のステム部分に対して完全に相補的である、請求項２４記載の前駆体。
第一のステム部分がＲＮＡ前駆体の５’末端に位置する、請求項２４記載の前駆体。
第一のステム部分がＲＮＡ前駆体の３’末端に位置する、請求項２４記載の前駆体。
ループ部分が少なくとも４個のヌクレオチドを含む、請求項２４記載の前駆体。
ループ部分が少なくとも７個のヌクレオチドを含む、請求項２４記載の前駆体。
ループ部分が少なくとも１１個のヌクレオチドを含む、請求項２４記載の前駆体。
１８個乃至３０個のヌクレオチドが相補的である相手であるｍＲＮＡの配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲに位置する、請求項２４記載の前駆体。
第一のステム部分および第二のステム部分が各々２２個乃至２８個のヌクレオチドを含む、請求項２４記載の前駆体。
第一のステム部分および第二のステム部分が各々同じ数のヌクレオチドを含む、請求項２４記載の前駆体。
第一のステム部分および第二のステム部分の一方が、他方のステム部分より１個乃至４個多いヌクレオチドを含む、請求項２４記載の前駆体。
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、または配列番号９において示される配列を含む、請求項２４記載の前駆体。
標的遺伝子がヒト遺伝子である、請求項２４記載の前駆体。
標的遺伝子が変異したヒト遺伝子である、請求項２４記載の前駆体。
標的遺伝子がウィルス遺伝子である、請求項２４記載の前駆体。
１つまたは複数の細胞が請求項１記載の核酸分子を含む導入遺伝子を含む、非ヒトトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物の１つまたは複数の細胞において該導入遺伝子が発現されることにより、設計されたＲＮＡ前駆体による標的遺伝子のリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を示す動物がもたらされるトランスジェニック動物。
１つまたは複数の心臓細胞、リンパ球、肝細胞、血管内皮細胞、または脾臓細胞において導入遺伝子が発現される、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
調節配列が構成性または誘導性である、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
調節配列が組織特異的である、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
調節配列がＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターである、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
調節配列が外因性の配列である、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
動物が非ヒトの霊長類である、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
動物が齧歯類である、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
動物がマウスである、請求項４０記載のトランスジェニック動物。
細胞が請求項１に記載の核酸分子を含む、請求項４０記載のトランスジェニック動物に由来する細胞。
リンパ球、肝細胞、心臓細胞、血管内皮細胞、または脾臓細胞である、請求項４９記載の細胞。
動物の細胞における標的遺伝子のリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であり、以下の段階を含む方法：
設計されたＲＮＡ前駆体をコードする核酸分子および誘導可能なプロモーターを含む導入遺伝子を含む、請求項４０記載のトランスジェニック動物を得る段階；および
該前駆体を発現するように該細胞を誘導し、該細胞内において低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成させることにより、該動物における該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階。
細胞における標的遺伝子のリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であり、以下の段階を含む方法：
請求項２１記載の宿主細胞を得る段階；
該細胞を培養する段階；および
該細胞がＲＮＡ前駆体を発現し、該細胞内において低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成可能にさせることにより、該細胞における該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階。
第一のステム部分、第二のステム部分、またはループ部分が、天然で生じるｓｔＲＮＡ前駆体を由来とするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
ヌクレオチド配列が、ｓｔＲＮＡ前駆体中のバルジまたは非対合になった１つまたは複数のヌクレオチドを除去または対合するように改変された、請求項５３記載の核酸分子。
ｓｔＲＮＡ前駆体がプレ−ｌｅｔ−７（配列番号１）である、請求項５３記載の核酸分子。
第一のステム部分、または第二のステム部分が更に１個、２個、３個、または４個のヌクレオチドの突出部を含む、請求項１記載の核酸分子。
突出部が２つのウラシルを含む、請求項５６の核酸分子。
ループ部分が、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から成る群より選択される配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
第一のステム部分、第二のステム部分、またはループ部分が、天然で生じるｓｔＲＮＡ前駆体を由来とするヌクレオチド配列を含む、請求項２４記載の前駆体。
ヌクレオチド配列が、ｓｔＲＮＡ前駆体中のバルジまたは非対合になった１つまたは複数のヌクレオチドを除去または対合するように改変された、請求項５９に記載の前駆体。
ｓｔＲＮＡ前駆体がプレ−ｌｅｔ−７前駆体（配列番号１）である、請求項５９に記載の前駆体。
第一のステム部分、または第二のステム部分が更に１個、２個、３個、または４個のヌクレオチドの突出部を含む、請求項２４記載の前駆体。
突出部が２つのウラシルを含む、請求項６２記載の前駆体。
ループ部分が、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から成る群より選択される配列を含む、請求項２４記載の前駆体。
請求項２１記載の宿主細胞を得る段階；
該細胞を培養する段階；および
該細胞が該ＲＮＡ前駆体を発現できるようにして、該細胞内に低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成させることで、該細胞内で該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階
を含む、細胞内で標的遺伝子のリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法。
哺乳動物細胞でリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であって、
該細胞が該ＲＮＡ前駆体を発現して該細胞内で低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成するような条件下で、該細胞内に請求項１記載の核酸分子を導入することにより、該細胞内で該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階を含む、方法。
哺乳動物細胞でリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であって、
該細胞が該ＲＮＡ前駆体を発現して該細胞内で低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成するような条件下で、該細胞内に請求項１８記載のベクターを導入することにより、該細胞内で該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階を含む、方法。
哺乳動物細胞でリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であって、
該細胞が該ＲＮＡ前駆体を発現して該細胞内で低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成するような条件下で、該細胞内に請求項２０記載のレトロウィルスベクターを導入することにより、該細胞内で該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階を含む、方法。
哺乳動物細胞でリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であって、
該細胞が該ＲＮＡ前駆体を発現して該細胞内で低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成するような条件下で、該細胞内に請求項２３記載の導入遺伝子を導入することにより、該細胞内で該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階を含む、方法。
哺乳動物細胞でリボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する方法であって、
該細胞内で該ＲＮＡ前駆体が低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を形成するような条件下で、該細胞内に請求項２４記載のＲＮＡ前駆体を導入することにより、該細胞内で該標的遺伝子のＲＮＡｉを誘導する段階を含む、方法。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長であり；そして
（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長である、請求項１記載の核酸分子。
（ｉ）第一のステム部分の配列が２２個乃至２８個のヌクレオチド長であり；そして
（ｉｉ）第二のステム部分の配列が２２個乃至２８個のヌクレオチド長である、請求項１記載の核酸分子。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至３０個のヌクレオチド長であり；そして
（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長である、請求項１記載の核酸分子。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長であり；そして
（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至３０個のヌクレオチド長である、請求項１記載の核酸分子。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長であり；そして
（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長である、請求項１記載の核酸分子。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長であり；そして
（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長である、請求項２４記載の設計されたＲＮＡ前駆体。
（ｉ）第一のステム部分の配列が２２個乃至２８個のヌクレオチド長であり；そして（ｉｉ）第二のステム部分の配列が２２個乃至２８個のヌクレオチド長である、請求項２４記載の設計されたＲＮＡ前駆体。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至３０個のヌクレオチド長であり；そして（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長である、請求項２４記載の設計されたＲＮＡ前駆体。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長であり；そして（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至３０個のヌクレオチド長である、請求項２４記載の設計されたＲＮＡ前駆体。
（ｉ）第一のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長であり；そして（ｉｉ）第二のステム部分の配列が１８個乃至２５個のヌクレオチド長である、請求項２４記載の設計されたＲＮＡ前駆体。
調節配列が哺乳動物調節配列である、請求項１記載の核酸分子。
哺乳動物調節配列が組織特異的調節配列である、請求項８１記載の核酸分子。
前駆体がダイサーによりプロセッシングされる、請求項１記載の核酸分子。
前駆体がダイサーによりプロセッシングされる、請求項２４記載の設計されたＲＮＡ前駆体。