JP4236435B2

JP4236435B2 - microscope

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Publication number: JP4236435B2
Application number: JP2002270411A
Authority: JP
Inventors: 慶記池滝; 武史渡邊; 正明藤井; 尾松　　孝茂; 公寿山元; 智雄鈴木
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-09-17
Filing date: 2002-09-17
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2022-09-17
Also published as: JP2004109368A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図３〜図６を参照して説明する。図３は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図３に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図４に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して図５に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図６に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図４の吸収過程や図６の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図４のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図５のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図５の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合には画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図３に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図７は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図７はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図７に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図８は、図７と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図８において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では蛍光自体が完全に抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図８の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、顕微鏡の超解像性を高めるため、超解像顕微鏡の機能を十分に活かすための蛍光ラベラー分子や、利用する波長λ１および波長λ２の２つの光の試料への照射タイミング等が開示されている（例えば、特許文献３参照）。この先行技術では、少なくとも基底状態を含む３つの量子状態を有し、第１電子励起状態を除く高位のエネルギー状態から基底状態へ脱励起するときの遷移が蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である各種分子を染色する蛍光ラベラー分子と、生化学的な染色技術を施した生体分子とを化学結合させた試料を、染色する分子を励起する波長λ１の光でＳ１状態に励起し、続いて波長λ２の光により即座に高位の量子準位に励起することで、Ｓ１状態からの蛍光を抑制するようにしている。このように分子の光学的性質を利用して、空間的な蛍光領域を人為的に抑制することで、空間分解能の向上を図ることができる。
【００１８】
このような分子の光学的性質は、量子化学的な立場から説明することができる。すなわち、一般に、分子はそれを構成する各原子がσまたはπ結合によって結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道は、σ分子軌道またはπ分子軌道を有していて、これらの分子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は各原子を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を決めている。これに対して、π分子軌道の電子は各原子の結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて弱い力で束縛されている。
【００１９】
多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果、原子の運動エネルギーや構造変化のために、光が分子に与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに変化する。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態では消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速（ピコ秒より短い）に起こるので、その過程で仮に蛍光が起きてもその寿命が極めて短い。
【００２０】
これに対し、π分子軌道の電子は、励起しても分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時間とどまり、ナノ秒オーダで蛍光を放出して脱励起する性質を有している。
【００２１】
量子化学によれば、分子がπ分子軌道をもつことと、二重結合をもつこととは同等であり、用いる蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富にもつ分子を選定することが必要条件となる。このことは、二重結合をもつ分子でもベンゼンやピラジン等の６員環分子において、Ｓ２励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられている（例えば、非特許文献１参照）。
【００２２】
したがって、ベンゼンやピラジン等の６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すれば、Ｓ１状態からの蛍光寿命が長く、しかも光励起によりＳ１状態からＳ２状態に励起することで、分子からの蛍光を容易に抑制できるので、超解像性を効果的に利用することができる。すなわち、これら蛍光ラベラー分子により染色して観察を行なえば、高空間分解能で試料の蛍光像を観察することができるのみならず、その分子の側鎖の化学基を調整することにより、生体試料の特定の化学組織のみを選択的に染色できるので、試料の詳細な化学組成までも分析可能となる。
【００２３】
また、一般に、二重共鳴吸収過程は２つ光の波長や偏光状態等が特定の条件を満たすときにのみ起こるので、これを用いることで分子の構造を非常に詳細に知ることができる。すなわち、光の偏光方向と分子の配向方向とは強い相関関係があり、２つ波長の光のそれそれの偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき、二重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、２つ波長の光を試料に同時に照射して、それぞれの光りの偏光方向を回転することにより、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観測しようとする組織の空間配向の情報も得ることができる。このことは、２つ光の波長を調整することでも可能である。
【００２４】
以上のように、特許文献３に記載の技術によると、超解像性以外にも、高い分析能力を有していることがわかる。さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善し、かつ蛍光抑制を効果的に起こすことができ、超解像性をより効果的に発現することが可能となる。
【００２５】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザ光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図９に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、輪帯光学系８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて輪帯光学系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【００２６】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは輪帯光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１０に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた液晶空間変調器を用いることができる。
【００２７】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】
特開平１１−９５１２０号公報
【特許文献４】
特開２００１−２７２３４５号公報
【非特許文献１】
M.Fujii et.al.Chem.Phys.Lett.171(1990)341
【００２８】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡は、観察性能上の各種機能に優れている。しかし、かかる顕微鏡では、異なる波長の２色のレーザ光源を用いることから、顕微鏡の性能を十分に発揮させるためには、光源の更なる安定性が要求される。すなわち、超解像現象の発現の度合いは、イレース光とポンプ光とが試料上でいかに位置ずれなくオーバーラップして集光するかにかかっている。特に、光源としてパルス発振型レーザを用いる場合には、レーザショット毎にポンプ光の光軸とイレース光の光軸とが独立して変動してしまうと、本来、蛍光を抑制してはいけない領域からの蛍光をも抑制してしまうこととなって、解像度が向上せず、むしろ蛍光強度が低下して画質が悪くなるという弊害が生じることになる。
【００２９】
以下、超解像蛍光顕微鏡を図１１に示すように構成した場合を例にとって説明する。図１１に示す超解像蛍光顕微鏡は、上記の特許文献２に開示されているもので、ローダミン６Ｇで染色された試料１００を観察するものである。この顕微鏡では、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射される波長１０６４ｎｍのレーザ光をベータ硼酸バリウム（ＢＢＯ）結晶からなる波長変換素子１０２により２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をハーフミラー１０３で透過光と反射光との二光路に分岐して、その透過光をポンプ光としてダイクロイックミラー１０４および１０５を順次透過させた後、対物レンズ１０６により二次元移動ステージ１０７上に載置された試料１００に集光させるようにしている。
【００３０】
また、ハーフミラー１０３での反射光は、反射ミラー１０８で反射させた後、Ｂａ（ＮＯ₃）₂結晶からなるラマンシフタ１０９で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をイレース光として反射ミラー１１０で反射させた後、位相板１１１により中空ビームに整形し、さらにダイクロイックミラー１０４によりポンプ光と同軸上に揃えて、ダイクロイックミラー１０５を経て対物レンズ１０６により試料１００に集光させるようにしている。
【００３１】
一方、試料１００からの蛍光は、対物レンズ１０６を経てダイクロイックミラー１０５で反射させた後、蛍光集光レンズ１１２、シャープカットフィルタ１１３およびピンホール１１４を経てフォトマル１１５で受光するようになっている。なお、試料１００に投射されるポンプ光およびイレース光は、フォトマル１１６で受光され、その出力に基づいてＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射されるレーザ光の強度が一定となるように制御されるようになっている。
【００３２】
かかる構成の超解像蛍光顕微鏡においては、特にＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１をパルス発振させる場合に、以下のような問題が生じる。
１）パルス発振毎に、レーザ光の光軸が揺らぐ。
２）レーザ光の波面が乱れているため、空間変調による形状整形を前提とするイレース光には適用し難い。
【００３３】
特に、上記１）に関しては、長い光路でレーザ光をガイドすると、空気の揺らぎでもレーザ光の光軸が変動して、集光点における位置安定性が更に悪くなる。このため、最悪の場合、ポンプ光の集光領域とイレース光の集光領域とがオーバーラップせず、超解像の効果が全く現れなくなることがあり得る。
【００３４】
この１）の問題の解決方法として、光ファイバを用いてパルスレーザ光を伝達することが考えられる。しかしながら、パルスレーザの場合には、連続発振型のレーザいわゆるＣＷレーザとは異なり、レーザ光の時間平均の光強度は小さいものの、パルス尖頭値はメガワットにも及ぶことがあるため、光ファイバの入射端面が焼損したり、光ファイバ内で誘導ラマン光が発生したりする等の問題がある。特に、誘導ラマン光が発生すると、その光が試料からの蛍光信号を観測する際のバックグラウンドとなって顕微鏡画像の画質が劣化することになる。
【００３５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の主たる目的は、良好な波面を保ちつつ、かつ第１の光と第２の光とを光軸変動を生じることなく試料に照射でき、常に安定して超解像現象を発現できる顕微鏡を提供することにある。
【００３６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、第１の光源からの第１の光と第２の光源からの第２の光とを、重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、上記試料の光応答を光検出器で検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方からの上記第１の光または第２の光を、上記第１の光源側または第２の光源側から順に配置した空間フィルタ、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波として上記重ね合わせ光学系に導くよう構成したことを特徴とするものである。
【００３７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方がパルス光源であることを特徴とするものである。
【００３８】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の顕微鏡において、上記第１の光の波長は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料の上記分子を、基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあり、
上記第２の光の波長は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い他の電子状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあることを特徴とするものである。
【００４０】
請求項４に係る発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有することを特徴とするものである。
【００４１】
先ず、本発明の原理について説明する。例えば、末松・伊賀著：「光ファイバ通信入門」オーム社（1979年）にも記載されているように、シングルモード光ファイバに、光ファイバ内で条件を満たす波長の光が入射すると、均一な波面が伝搬して、出射端面から波面が完全に揃った球面波が出射される。したがって、この光を、例えばレンズによりコリメートすれば、波面の均一な平行光を生成でき、また、この波面の揃った平行光を位相板や液晶型の光空間変調器により中空ビーム化すれば、理想的な中空状のイレース光を得ることが可能となる。しかも、このように光ファイバを用いる光学系では、光ファイバの出射端部を機械的に固定すれば、光軸の揺らぎは原理的に生じないという特徴がある。
【００４２】
ところが、レーザ光源から出射される例えばパルス光は、空間モードが非常に悪く、いわゆる波面の揃ったガウシアンプロファイルとはならないと共に、発散角（ダイバージェンス）も種々の角度を持っているため、レンズで集光しても回折限界まで絞り込めないが普通である。例えば、波長６００ｎｍの光に対しては、コア径が５μｍ程度の光ファイバが対応するが、この場合のパルス光の集光径は、光ファイバのコア径よりも遥かに大きくなる。
【００４３】
超解像顕微鏡法では、特に、イレース光の強度が大きい方が好ましいが、勢い光ファイバの出射端面から強度の大きいイレース光を取り出そうとすると、光ファイバの入射端面に入射させるレーザ光も強くする必要がある。この際、臨界角以下の浅い角度で入射端面に集光した光は、微量の減衰はあるものの、ほぼ１００％に近い効率で出射端面から取り出すことができるが、それ以外の光は光ファイバの入射端面で散乱されて光ファイバを透過できない。しかも、この部分には常時強い光が照射されるので、焼けによる損傷が発生して、光ファイバの入射端面全体が焦げてしまう。これは、パルスレーザ光の大半を占める高次のモードが、光ファイバのコア径内に絞りきれなかったのが原因である。
【００４４】
そこで本発明の好適一実施の形態では、空間フィルタを有して光ファイバ光学系を構成し、レーザ光源からのレーザ光を、空間フィルタを介して光ファイバに入射させる。具体的には、図１に示すように、空間フィルタ１を集光レンズ２、ピンホール３、コリメータレンズ４、および集光レンズ５をもって構成し、レーザ光源からのレーザ光を集光レンズ２でピンホール３に集光させ、ピンホール３で回折された光をコリメータレンズ４でコリメートした後、シングルモード光ファイバ６の取り込み立体角と整合させて、集光レンズ５により光ファイバ６の入射端面に再び集光させる。なお、ピンホール３のサイズは、集光レンズ２の焦点距離と入射するレーザ光のビーム径とによって決まる回折限界の大きさを目安に設定する。
【００４５】
このようにすれば、光ファイバ６のコア内に集光した全ての光を取り込んで、球面波として取り出すことが可能となる。しかも、光ファイバ端面の焼けの原因となる余分な光は、空間フィルタ１のピンホール３でカットされるので、測定の最中に光ファイバ６が焦げて使えなくなることもなくなる。したがって、高強度の光ファイバ出射光を取り出すために、レーザ光自体の強度を高くしても、光ファイバ６を焼損することがなくなる。
【００４６】
また、光ファイバ内で発生する誘導ラマン光については、非常に単純なフィルタ光学系を適用することで対処することができる。例えば、上記特許文献４に記載の超解像蛍光顕微鏡では、一般に、試料からの蛍光を検出する検出器の前方にポンプ光およびイレース光の波長成分をカットするノッチフィルタが配置されているので、光ファイバ内で誘導ラマン光が発生する場合には、このノッチフィルタの通過阻止波長帯域内に誘導ラマン光の発光スペクトル帯域が位置するように、ノッチフィルタを構成する。
【００４７】
あるいは、光ファイバの出射端側に、所望の波長のポンプ光またはイレース光を透過する波長分散素子を配置して光ファイバ光学系を構成する。なお、波長分散素子は、狭帯域のバンドパスフィルタ、多層膜を用いた干渉フィルタ、回折格子等を用いることができる。
【００４８】
本発明の好適一実施の形態では、誘導ラマン光をより確実にカットするため、ポンプ光またはイレース光を伝達する光ファイバの出射端面側に、波長分散素子としてポンプ光またはイレース光の波長を中心波長とする狭帯域のバンドパスフィルタを配置して光ファイバ光学系を構成し、光ファイバから出射されてバンドパスフィルタを透過したポンプ光またはイレース光を試料に投射する。さらに、試料からの発光を受光する検出器の前方には、上記のバンドパスフィルタの通過波長帯域よりも広い通過阻止波長帯域を有するノッチフィルタを配置して、このノッチフィルタを透過した光を検出器で受光するようにする。
【００４９】
このようにすれば、光ファイバで発生した誘導ラマン光のみならず、ポンプ光およびイレース光が検出器に入射するのを確実に防止して、試料からの蛍光のみを受光できるので、顕微鏡画像のバックグラウンドを低減することが可能となる。なお、検出器の前方に配置するノッチフィルタは、例えば、直入射設計の誘電体多層膜ミラー等を用いることができる。
【００５０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による顕微鏡の一実施の形態について、図２を参照して詳細に説明する。
【００５１】
図２は本発明の一実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、レーザ走査型の超解像蛍光顕微鏡で、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察するものである。
【００５２】
ここで、ローダミン６Ｇは、５３０ｎｍの励起波長帯域で基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）への励起による吸収が最大となる。また、第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー的に高い高位の電子励起状態に励起できる吸収帯が、波長６００〜６５０ｎｍの領域に存在する。
【００５３】
そこで、本実施の形態では、第１の光源としてパルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１を用い、その２倍高調波（５３２ｎｍ）をポンプ光（第１の光）として用いる。また、第２の光源は、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１２とＢａ（ＮＯ_３）_２結晶からなるラマンシフタ１３とを有し、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１２の２倍高調波をラマンシフタ１３で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換するように構成して、この波長５９９ｎｍのレーザ光をイレース光（第２の光）として用いる。
【００５４】
なお、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１および１２は、レーザ共振器の設計パラメータの調整により、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数で、ピコ秒のレーザパルスを発振することができる。例えば、スイス：Time-Bandwidth社製のＧＥ−１００シリーズは、標準仕様で、１００ＭＨｚの繰り返し周波数において、パルス幅：６psecのパルス光を平均出力５０ｍＷで発振することができる。これは、１パルスの持つエネルギーが、５００ｐＪに対応する。また、共振器を設計変更することで、繰り返し周波数を、２５ＭＨｚ〜１ＧＨｚの間で調整することができる。
【００５５】
パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光は、ポンプ光用光ファイバ光学系１５を経て重ね合わせ光学系を構成するキューベット型のハーフミラーからなるビームコンバイナ１６に入射させる。ポンプ光用光ファイバ光学系１５は、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２１と、偏波面保存シングルモードファイバ２２と、コリメータレンズ２３と、波長分散素子である中心波長５３２ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ２４とを有して構成し、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、光結合部２１を介して偏波面保存シングルモードファイバ２２のコアに入射させて伝播させ、この偏波面保存シングルモードファイバ２２から出射されるポンプ光を、コリメータレンズ２３により平行光にビーム整形した後、バンドパスフィルタ２４を経てビームコンバイナ１６に入射させる。なお、バンドパスフィルタ２４は、例えば誘電体多層膜により形成された中心波長５３２ｎｍ、通過波長帯域幅１ｎｍの市販のナローバンドフィルタ（例えば、米国Barr Associates Inc.製）を用いることができる。
【００５６】
このように、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２１を介して偏波面保存シングルモードファイバ２２に入射させれば、空間フィルタにより球面波成分のみを選別して偏波面保存シングルモードファイバ２２に入射させることができるので、偏波面保存シングルモードファイバ２２からの出射光をコリメータレンズ２３で平行光に変換することにより、均一平面波のポンプ光を得ることができる。また、このコリメータレンズ２３からのポンプ光を、中心波長５３２ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ２４に入射させれば、偏波面保存シングルモードファイバ２２内で誘導ラマン光が発生しても、これをバンドパスフィルタ２４で通過を阻止でき、所望の波長（５３２ｎｍ）のポンプ光を得ることができる。
【００５７】
一方、ラマンシフタ１３からのイレース光は、イレース光用光ファイバ光学系２５を経て図１０に示したような位相板２６に入射させ、ここで中空ビーム化してビームコンバイナ１６に入射させてポンプ光と同軸上に合成する。イレース光用光ファイバ光学系２５は、ポンプ光用光ファイバ光学系１５と同様に、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２７と、偏波面保存シングルモードファイバ２８と、コリメータレンズ２９と、波長分散素子である中心波長５９９ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ３０とを有して構成し、ラマンシフタ１３からのイレース光を、光結合部２７を介して偏波面保存シングルモードファイバ２８のコアに入射させて伝播させ、この偏波面保存シングルモードファイバ２８から出射されるイレース光を、コリメータレンズ２９により平行光にビーム整形した後、バンドパスフィルタ３０を経て位相板２６に入射させる。なお、バンドパスフィルタ３０は、例えば誘電体多層膜により形成された中心波長５９９ｎｍ、通過波長帯域幅１ｎｍのナローバンドフィルタを用いる。
【００５８】
このように、ラマンシフタ１３からのイレース光を、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２７を介して偏波面保存シングルモードファイバ２８に入射させることにより、偏波面保存シングルモードファイバ２８から完全な球面波のイレース光を得ることができ、さらにこの偏波面保存シングルモードファイバ２８からの出射光をコリメータレンズ２９で平行光に変換することにより、均一平面波のイレース光を得ることができる。また、コリメータレンズ２９からのイレース光を、中心波長５９９ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ３０に入射させることにより、偏波面保存シングルモードファイバ２８内で誘導ラマン光が発生しても、これをバンドパスフィルタ３０で通過を阻止でき、所望の波長（５９９ｎｍ）のイレース光を得ることができる。
【００５９】
ビームコンバイナ１６により同軸上に合成されたポンプ光およびイレース光は、キューベット型のハーフミラーからなるビームセパレータ３１を透過させた後、互いに直交する軸を中心に揺動可能なガルバノミラー３２および３３で順次反射させて対物レンズ３４によりローダミン６Ｇで染色された生体試料３５の表面に集光させ、その集光点をガルバノミラー３２，３３の揺動により移動させて試料面上を２次元走査する。なお、図２では、図面を簡略化するために、ガルバノミラー３２，３３を互いに平行な軸を中心に揺動するように示している。
【００６０】
また、ポンプ光およびイレース光の照射により試料３５から発する蛍光は、対物レンズ３４によりコリメートしたのち、入射光路とは逆の経路を辿って、ガルバノミラー３３および３２を経てビームセパレータ３１に入射させ、該ビームセパレータ３１で反射される蛍光を集光レンズ３６によりピンホール３７に集光させる。
【００６１】
ピンホール３７は、試料３５の蛍光発光点に対して共焦点位置に配置し、このピンホール３７を透過した蛍光を、ポンプ光カットノッチフィルタ３８およびイレース光カットノッチフィルタ３９を透過させて、それぞれポンプ光およびイレース光を除去した後、光検出器である光電子増倍管４０で受光して蛍光出力信号を得、この蛍光出力信号を、顕微鏡を制御する図示しないコンピュータのビデオフレームメモリに格納して、試料３５の蛍光２次元画像を図示しないモニタにリアルタイムで表示する。なお、ガルバノミラー３２，３３は、モニタに表示する蛍光２次元画像のビデオレートに同期して揺動させる。
【００６２】
ポンプ光カットノッチフィルタ３８の通過阻止波長帯域は、ポンプ光用光ファイバ光学系１５におけるバンドパスフィルタ２４の通過波長帯域よりも広くする。同様に、イレース光カットノッチフィルタ３９の通過阻止波長帯域も、イレース光用光ファイバ光学系２５におけるバンドパスフィルタ３０の通過波長帯域よりも広くする。なお、これらポンプ光カットノッチフィルタ３８およびイレース光カットノッチフィルタ３９は、ポンプ光およびイレース光を含む波長帯域の光の通過を阻止する市販の１枚のフィルタ（例えば、米国Barr Associates Inc.製）をもって構成することもできる。
【００６３】
以上のように、本実施の形態では、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、ポンプ光用光ファイバ光学系１５を経てビームコンバイナ１６に入射させると共に、ラマンシフタ１３からのイレース光を、イレース光用光ファイバ光学系２５を経て位相板２６に入射させ、ここで中空ビーム化してビームコンバイナ１６に入射させてポンプ光と同軸上に合成するようにしたので、ポンプ光およびイレース光を光軸の揺らぎを生じることなく、試料面上でオーバーラップさせることができ、超解像効果を確実に得ることができる。また、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１や、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１２およびラマンシフタ１３を、対物レンズ３４を有する光学ベンチとは別体に配置できるので、顕微鏡設計の自由度を広くできる利点もある。
【００６４】
また、ポンプ光用光ファイバ光学系１５には、偏波面保存シングルモードファイバ２２の入射端面側に空間フィルタを設け、出射端面側にコリメータレンズ２３を設けたので、完全な球面波のポンプ光を取り出して均一平面波に変換することができると共に、光ファイバ端面の焼けの原因となる余分な光をカットすることができる。同様に、イレース光用光ファイバ光学系２５には、偏波面保存シングルモードファイバ２８の入射端面側に空間フィルタを設け、出射端面側にコリメータレンズ２９を設けたので、完全な球面波のイレース光を取り出して均一平面波に変換することができると共に、光ファイバ端面の焼けの原因となる余分な光をカットすることができる。したがって、特にイレース光においては、位相板２６で正確に中空ビーム化することができ、超解像性を確実に発現できると共に、高強度のイレース光を取り出すために、レーザ光自体の強度を高くしても、偏波面保存シングルモードファイバ２８を焼損することがなくなる。
【００６５】
また、ポンプ光用光ファイバ光学系１５には、偏波面保存シングルモードファイバ２２の出射端面側に狭帯域のバンドパスフィルタ２４を設けて所望の波長のポンプ光のみを透過させるようにし、同様に、イレース光用光ファイバ光学系２５には、偏波面保存シングルモードファイバ２８の出射端面側に狭帯域のバンドパスフィルタ３０を設けて所望の波長のイレース光のみを透過させるようにしたので、偏波面保存シングルモードファイバ２２，２８内で誘導ラマン光が発生しても、その通過を確実に阻止することができる。したがって、誘導ラマン光が試料３５からの蛍光信号を観測する際のバックグラウンドとなるのを防止することができる。しかも、本実施の形態では、光電子増倍管４０の前方にバンドパスフィルタ２４の通過波長帯域よりも広い通過阻止波長帯域のポンプ光カットノッチフィルタ３８、およびバンドパスフィルタ３０の通過波長帯域よりも広い通過阻止波長帯域のイレース光カットノッチフィルタ３９を配置しているので、偏波面保存シングルモードファイバ２２，２８で発生した誘導ラマン光のみならず、ポンプ光およびイレース光が光電子増倍管４０に入射するのを確実に防止して、試料３５からの蛍光のみを受光できるので、画質の良好な顕微鏡画像を得ることができる。
【００６６】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、偏波面保存シングルモードファイバ２２や２８内で誘導ラマン光が発生する場合において、その誘導ラマン光の発光スペクトル帯域がポンプ光カットノッチフィルタ３８やイレース光カットノッチフィルタ３９の通過阻止波長帯域内にあるときは、バンドパスフィルタ２４や３０を省略することができる。また、イレース光を中空ビームにビーム整形する位相変調素子は、上述した位相板に限らず、液晶空間光変調器や他の公知の素子を使用することができる。さらに、上記実施の形態では、ポンプ光およびイレース光をパルス光としたが、そのいずれか一方または双方が連続波の場合にも、本発明を有効に適用することができる。
【００６７】
付記項
１．第１の光源からの第１の光と第２の光源からの第２の光とを、重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、上記試料の光応答を光検出器で検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方からの上記第１の光または第２の光を、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波として上記重ね合わせ光学系に導くよう構成したことを特徴とする顕微鏡。
２．上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方がパルス光源であることを特徴とする付記項１に記載の顕微鏡。
３．上記第１の光の波長は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料の上記分子を、基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあり、
上記第２の光の波長は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い他の電子状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあることを特徴とする付記項１または２に記載の顕微鏡。
４．上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記第１の光源または第２の光源との間に配置した空間フィルタを有することを特徴とする付記項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
５．上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有することを特徴とする付記項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
６．上記光検出器の前方に、上記試料の光応答による発光を通過させ、上記第１の光または第２の光の通過を阻止するノッチフィルタを配置したことを特徴とする付記項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
７．上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有し、上記光検出器の前方には、上記試料の光応答による発光を通過させ、上記第１の光または第２の光の通過を阻止するノッチフィルタを配置し、かつ上記ノッチフィルタの通過阻止波長帯域を上記波長分散素子の通過波長帯域よりも広くしたことを特徴とする付記項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
８．上記波長分散素子は、バンドパスフィルタからなることを特徴とする付記項５または７に記載の顕微鏡。
９．上記ノッチフィルタは、多層膜波長分散素子からなることを特徴とする付記項６または７に記載の顕微鏡。
１０．上記ノッチフィルタは、直入射型の多層膜反射鏡からなることを特徴とする付記項６または７に記載の顕微鏡。
【００６８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、第１の光源からの第１の光または第２の光源からの第２の光の少なくとも一方を、第１の光源側または第２の光源側から順に配置した空間フィルタ、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波とし、これら第１の光および第２の光を重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、試料の光応答を光検出器で検出するようにしたので、良好な波面を保ちつつ、かつ第１の光と第２の光とを光軸変動を生じることなく試料に照射でき、常に安定して超解像現象を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明するための図である。
【図２】本発明の一実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。
【図３】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図４】図３の分子の第１電子励起状態を示す概念図である。
【図５】同じく、第２電子励起状態を示す概念図である。
【図６】同じく、第２電子励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図７】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図８】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図９】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１０】図９に示す位相板の構成を示す平面図である。
【図１１】従来の超解像顕微鏡の他の例の構成を示す図である。
【符号の説明】
１空間フィルタ
２集光レンズ
３ピンホール
４コリメータレンズ
５集光レンズ
６シングルモード光ファイバ
１１，１２パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ
１３ラマンシフタ
１５ポンプ光用光ファイバ光学系
１６ビームコンバイナ
２１，２７光結合部
２２，２８偏波面保存シングルモードファイバ
２３，２９コリメータレンズ
２４，３０バンドパスフィルタ
２５イレース光用光ファイバ光学系
２６位相板
３１ビームセパレータ
３２，３３ガルバノミラー
３４対物レンズ
３５試料
３６集光レンズ
３７ピンホール
３８ポンプ光カットノッチフィルタ
３９イレース光カットノッチフィルタ
４０光電子増倍管[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microscope, and more particularly to a new high-performance and high-performance optical microscope that obtains high spatial resolution by illuminating a stained sample with light of a plurality of wavelengths from a highly functional laser light source.
[0002]
[Prior art]
Optical microscope technology is old and various types of microscopes have been developed. In recent years, more advanced microscope systems have been developed due to advances in peripheral technologies such as laser technology and electronic image technology.
[0003]
Against this background, we propose a highly functional microscope that not only controls the contrast of the resulting image but also enables chemical analysis using the double resonance absorption process that occurs when the sample is illuminated with light of multiple wavelengths. (For example, refer to Patent Document 1).
[0004]
This microscope selects specific molecules using double resonance absorption and observes absorption and fluorescence due to specific optical transitions. This principle will be described with reference to FIGS. FIG. 3 shows the electronic structure of the valence electron orbital of the molecules constituting the sample. First, the electrons in the valence orbital of the molecule in the ground state (S0 state) shown in FIG. 3 are excited by light of wavelength λ1. Thus, the first electronic excitation state (S1 state) shown in FIG. Next, the second electron excitation state (S2 state) shown in FIG. 5 is obtained by exciting similarly with light of another wavelength λ2. In this excited state, the molecule emits fluorescence or phosphorescence and returns to the ground state as shown in FIG.
[0005]
In the microscope method using the double resonance absorption process, an absorption image and a light emission image are observed using the absorption process of FIG. 4 and the fluorescence and phosphorescence emission of FIG. In this microscope method, first, the molecules constituting the sample are excited to the S1 state as shown in FIG. 4 with light having a resonance wavelength λ1 by laser light or the like. At this time, the number of molecules in the S1 state within the unit volume is It increases as the intensity of light to be applied increases.
[0006]
Here, since the linear absorption coefficient is given by the product of the absorption cross section per molecule and the number of molecules per unit volume, in the excitation process as shown in FIG. The coefficient depends on the intensity of the light having the wavelength λ1 irradiated first. That is, the linear absorption coefficient with respect to the wavelength λ2 can be controlled by the intensity of the light with the wavelength λ1. This indicates that the contrast of the transmitted image can be completely controlled by the light of the wavelength λ1 when the sample is irradiated with the light of the two wavelengths of the wavelength λ1 and the wavelength λ2 and a transmission image by the wavelength λ2 is taken.
[0007]
When the deexcitation process by fluorescence or phosphorescence in the excited state of FIG. 5 is possible, the emission intensity is proportional to the number of molecules in the S1 state. Therefore, image contrast can be controlled when used as a fluorescence microscope.
[0008]
Furthermore, the microscope method using a double resonance absorption process enables not only the above-described image contrast control but also chemical analysis. That is, since the outermost shell valence electron orbit shown in FIG. 3 has energy levels unique to each molecule, the wavelength λ1 varies depending on the molecule, and the wavelength λ2 is also unique to the molecule.
[0009]
Here, even when illuminating with a conventional single wavelength, it is possible to observe an absorption image or fluorescence image of a specific molecule to some extent, but generally the wavelength regions of absorption bands of several molecules overlap. It is impossible to accurately identify the chemical composition of the sample.
[0010]
On the other hand, in the microscope method using the double resonance absorption process, the molecules that absorb or emit light are limited by the two wavelengths of λ1 and λ2, so that the chemical composition of the sample can be identified more accurately than the conventional method. Become. In addition, when valence electrons are excited, only light having a specific electric field vector with respect to the molecular axis is strongly absorbed. Therefore, if the polarization direction of the wavelengths λ1 and λ2 is determined and an absorption or fluorescence image is taken, the same Even molecules can be used to identify the orientation direction.
[0011]
Recently, a fluorescence microscope having a high spatial resolution exceeding the diffraction limit using a double resonance absorption process has also been proposed (see, for example, Patent Document 2).
[0012]
FIG. 7 is a conceptual diagram of a double resonance absorption process in a molecule. A molecule in the ground state S0 is excited by light having a wavelength λ1 to S1, which is a first electronically excited state, and further excited by a second electron by light having a wavelength λ2. The state of being excited by the state S2 is shown. FIG. 7 shows that the fluorescence from S2 of certain molecules is extremely weak.
[0013]
In the case of molecules having optical properties as shown in FIG. 7, a very interesting phenomenon occurs. FIG. 8 is a conceptual diagram of the double resonance absorption process as in FIG. 7, where the X axis of the horizontal axis represents the spread of the spatial distance, and the light of the spatial region A1 irradiated with the light of wavelength λ2 and the light of wavelength λ2 is not irradiated. A space area A0 is shown.
[0014]
In FIG. 8, in the spatial region A0, a large number of molecules in the S1 state are generated by the excitation of light of wavelength λ1, and at this time, fluorescence emitted at wavelength λ3 is seen from the spatial region A0. However, in the spatial region A1, since the light of wavelength λ2 is irradiated, most of the molecules in the S1 state are immediately excited to the higher S2 state and no S1 state molecule exists. Such a phenomenon has been confirmed by several molecules. Thereby, in the spatial region A1, the fluorescence of the wavelength λ3 is completely lost, and the fluorescence from the S2 state is not originally present. Therefore, in the spatial region A1, the fluorescence itself is completely suppressed (fluorescence suppression effect) and only from the spatial region A0 Fluorescence will be emitted.
[0015]
This is extremely important when considered from the field of application of a microscope. That is, in a conventional scanning laser microscope or the like, a laser beam is condensed into a micro beam by a condensing lens and scanned on an observation sample. The size of the micro beam at that time is determined by the numerical aperture and wavelength of the condensing lens. The diffraction limit is determined by, and in principle, no further spatial resolution can be expected.
[0016]
However, in the case of FIG. 8, two types of light of wavelength λ1 and wavelength λ2 are spatially superposed and the fluorescent region is suppressed by irradiation of light of wavelength λ2, for example, the light of wavelength λ1 Focusing on the irradiation region, the fluorescent region can be made narrower than the diffraction limit determined by the numerical aperture and wavelength of the condenser lens, and the spatial resolution can be substantially improved. Therefore, by utilizing this principle, it becomes possible to realize a super-resolution microscope, for example, a fluorescence microscope, using a double resonance absorption process exceeding the diffraction limit.
[0017]
Furthermore, in order to enhance the super-resolution of the microscope, a fluorescent labeler molecule for fully utilizing the function of the super-resolution microscope, the irradiation timing of the two light beams of wavelength λ1 and wavelength λ2 to be used, etc. are disclosed. (For example, refer to Patent Document 3). In this prior art, there are at least three quantum states including the ground state, and the transition when the de-excitation from the higher energy state excluding the first electronic excited state to the ground state is a thermal relaxation process rather than the relaxation process by fluorescence. A sample in which a fluorescent labeler molecule for staining various dominant molecules and a biomolecule subjected to biochemical staining technology are chemically bonded is excited to the S1 state with light of wavelength λ1 that excites the molecule to be stained. Subsequently, the fluorescence from the S1 state is suppressed by immediately exciting to a higher quantum level with light of wavelength λ2. As described above, the spatial resolution can be improved by artificially suppressing the spatial fluorescent region by utilizing the optical properties of the molecules.
[0018]
The optical properties of such molecules can be explained from a quantum chemical standpoint. That is, in general, in a molecule, each atom constituting the molecule is connected by a σ or π bond. In other words, the molecular orbitals of the molecules have σ molecular orbitals or π molecular orbitals, and the electrons existing in these molecular orbitals play an important role in bonding each atom. Among them, the electrons in the σ molecular orbitals strongly bond each atom, and determine the interatomic distance in the molecule that is the skeleton of the molecule. On the other hand, the electrons in the π molecular orbitals hardly contribute to the bonding of each atom, but rather are bound to the whole molecule by a very weak force.
[0019]
In many cases, when electrons in the σ molecular orbital are excited by light, the atomic spacing of the molecules changes greatly, and a large structural change including molecular dissociation occurs. As a result, most of the energy that light gives to molecules changes to thermal energy due to atomic kinetic energy and structural changes. Therefore, excitation energy is not consumed in the form of light called fluorescence. In addition, since the structure change of molecules occurs at a very high speed (shorter than picoseconds), even if fluorescence occurs in the process, the lifetime is extremely short.
[0020]
On the other hand, electrons in the π molecular orbitals do not substantially change the molecular structure even when excited, stay in the high-level quantum discrete level for a long time, and emit fluorescence in the order of nanoseconds to be de-excited. It has properties.
[0021]
According to quantum chemistry, having a π molecular orbital is equivalent to having a double bond, and it is necessary to select a molecule with abundant double bonds as the fluorescent labeler molecule to be used. It becomes. This has been confirmed that even in a molecule having a double bond, fluorescence from the S2 excited state is extremely weak in a 6-membered ring molecule such as benzene and pyrazine (for example, see Non-Patent Document 1).
[0022]
Therefore, if a molecule containing a six-membered ring molecule such as benzene or pyrazine is selected as the fluorescent labeler molecule, the fluorescence lifetime from the S1 state is long, and further, the fluorescence from the molecule is excited by excitation from the S1 state to the S2 state by photoexcitation. Can be easily suppressed, so that super-resolution can be effectively utilized. In other words, if the fluorescent labeler molecules are stained and observed, not only can the fluorescence image of the sample be observed with high spatial resolution, but also by adjusting the chemical groups of the side chains of the molecule, Since only a specific chemical tissue can be selectively stained, even a detailed chemical composition of a sample can be analyzed.
[0023]
In general, the double resonance absorption process occurs only when two light wavelengths, polarization states, and the like satisfy specific conditions. By using this, the molecular structure can be known in detail. That is, there is a strong correlation between the polarization direction of light and the orientation direction of molecules, and when the polarization direction of two wavelengths of light and the orientation direction of molecules form a specific angle, the double resonance absorption process is It happens strongly. Therefore, by simultaneously irradiating the sample with two wavelengths of light and rotating the polarization direction of each light, the degree of disappearance of the fluorescence changes, so information on the spatial orientation of the tissue to be observed from that state Can also be obtained. This is also possible by adjusting the wavelengths of the two lights.
[0024]
As described above, according to the technique described in Patent Document 3, it can be seen that, in addition to super-resolution, it has a high analytical capability. Furthermore, by devising the irradiation timing of the two lights of wavelength λ1 and wavelength λ2, it is possible to improve S / N and effectively suppress fluorescence, and to express super resolution more effectively. It becomes possible to do.
[0025]
As a specific example of such super-resolution microscopy, light of wavelength λ1 (especially laser light) that excites fluorescent labeler molecules from the S0 state to the S1 state is used as pump light, and wavelength λ2 that excites the S1 state to the S2 state. As shown in FIG. 9, the light is emitted from the light source 81 and the erase light is emitted from the light source 82. The pump light is reflected by the dichroic mirror 83, and then the sample 85 is reflected by the annular optical system 84. The erase light is condensed on the phase plate 86, and then the beam is transmitted through the dichroic mirror 83 so as to be spatially superimposed on the pump light and condensed on the sample 85 by the annular optical system 84. Have been proposed (see, for example, Patent Document 4).
[0026]
According to this microscope, fluorescence other than the vicinity of the optical axis where the intensity of the erase light becomes zero is suppressed. As a result, a region narrower than the spread of the pump light (Δ <0.61 · λ1 / NA, where NA is an annular zone) Only the fluorescent labeler molecules present in the numerical aperture) of the optical system 84 are observed, and as a result, super-resolution is developed. As the phase plate 86 for converting the erase light into a hollow beam, for example, as shown in FIG. 10, a configuration in which a phase difference π is given at a point-symmetrical position with respect to the optical axis, or a liquid crystal surface is used. A liquid crystal spatial modulator can be used.
[0027]
[Patent Document 1]
JP-A-8-184552
[Patent Document 2]
JP 2001-100102 A
[Patent Document 3]
JP-A-11-95120
[Patent Document 4]
JP 2001-272345 A
[Non-Patent Document 1]
M.Fujii et.al.Chem.Phys.Lett.171 (1990) 341
[0028]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the conventionally proposed super-resolution fluorescence microscope is excellent in various functions in observation performance. However, since such a microscope uses two-color laser light sources having different wavelengths, further stability of the light source is required in order to fully exhibit the performance of the microscope. That is, the degree of occurrence of the super-resolution phenomenon depends on how the erase light and the pump light overlap and collect on the sample without positional deviation. In particular, when a pulsed laser is used as the light source, if the optical axis of the pump light and the optical axis of the erase light fluctuate independently for each laser shot, the area where fluorescence should not be suppressed originally As a result, the resolution is not improved and the fluorescence intensity is lowered and the image quality is deteriorated.
[0029]
Hereinafter, a case where the super-resolution fluorescence microscope is configured as shown in FIG. 11 will be described as an example. The super-resolution fluorescent microscope shown in FIG. 11 is disclosed in the above-mentioned Patent Document 2, and observes the sample 100 stained with rhodamine 6G. In this microscope, a laser beam having a wavelength of 1064 nm emitted from a mode-locked Nd: YAG laser 101 is converted into a laser beam having a wavelength of 532 nm of a second harmonic by a wavelength conversion element 102 made of beta barium borate (BBO) crystal. Then, the laser light is branched into two optical paths of transmitted light and reflected light by the half mirror 103, and the transmitted light is sequentially transmitted through the dichroic mirrors 104 and 105 as pump light, and then two-dimensionally moved by the objective lens 106. Light is focused on the sample 100 placed on the stage 107.
[0030]
The reflected light from the half mirror 103 is reflected by the reflecting mirror 108 and then Ba (NO _Three ) ₂ The wavelength is converted into a laser beam having a wavelength of 599 nm by a Raman shifter 109 made of crystal, and this laser beam is reflected as an erase beam by a reflection mirror 110, then shaped into a hollow beam by a phase plate 111, and further pump light by a dichroic mirror 104. The light is condensed on the sample 100 by the objective lens 106 through the dichroic mirror 105 so as to be aligned on the same axis.
[0031]
On the other hand, the fluorescence from the sample 100 is reflected by the dichroic mirror 105 through the objective lens 106, and then received by the photomultiplier 115 through the fluorescence condensing lens 112, the sharp cut filter 113, and the pinhole 114. . Note that the pump light and erase light projected on the sample 100 are received by the photomultiplier 116 and controlled so that the intensity of the laser light emitted from the Nd: YAG laser 101 is constant based on the output. It has become.
[0032]
In the super-resolution fluorescence microscope having such a configuration, the following problems occur particularly when the Nd: YAG laser 101 is pulse-oscillated.
1) The optical axis of the laser beam fluctuates for each pulse oscillation.
2) Since the wavefront of the laser beam is disturbed, it is difficult to apply to erase light premised on shape shaping by spatial modulation.
[0033]
In particular, with respect to the above 1), when the laser beam is guided along a long optical path, the optical axis of the laser beam fluctuates even when air fluctuates, and the position stability at the focal point is further deteriorated. For this reason, in the worst case, the condensing region of the pump light and the condensing region of the erase light may not overlap, and the super-resolution effect may not appear at all.
[0034]
As a method for solving the problem 1), it is conceivable to transmit pulsed laser light using an optical fiber. However, in the case of a pulse laser, unlike a continuous wave laser, a so-called CW laser, although the time-average light intensity of the laser light is small, the pulse peak value may reach megawatts. There are problems such as burning of the incident end face and generation of stimulated Raman light in the optical fiber. In particular, when stimulated Raman light is generated, the light becomes a background when observing a fluorescent signal from the sample, and the image quality of the microscope image is deteriorated.
[0035]
Therefore, the main object of the present invention made in view of such a point is that the sample can be irradiated with the first light and the second light without causing fluctuations in the optical axis while maintaining a good wavefront, and is always stable. An object of the present invention is to provide a microscope capable of exhibiting a super-resolution phenomenon.
[0036]
[Means for Solving the Problems]
The invention according to claim 1 that achieves the above object is the condensing optical system in which the first light from the first light source and the second light from the second light source are partially overlapped by the overlapping optical system. In a microscope that collects light on the sample and detects the optical response of the sample with a photodetector,
The first light or the second light from at least one of the first light source or the second light source, A spatial filter arranged in order from the first light source side or the second light source side; The optical fiber and the collimator lens are guided through the optical fiber optical system to the superposition optical system as a uniform plane wave.
[0037]
The invention according to claim 2 is the microscope according to claim 1, wherein at least one of the first light source and the second light source is a pulsed light source.
[0038]
The invention according to claim 3 is the microscope according to claim 1 or 2, wherein the first light has a wavelength of the ground state of the sample including a molecule having three electronic states including at least a ground state. In the resonance absorption wavelength band for transition from the first electronic excited state to
The wavelength of the second light is in a resonance absorption wavelength band that causes the molecule to transition from the first electronic excited state to another electronic state having a higher energy level.
[0040]
Claim 4 The invention according to claim 1 to claim 1 3 In the microscope according to any one of the above, the optical fiber optical system includes a wavelength dispersion element that transmits the first light or the second light disposed between the optical fiber and the overlapping optical system. It is characterized by having.
[0041]
First, the principle of the present invention will be described. For example, as described in Suematsu and Iga: “Introduction to Optical Fiber Communication”, Ohm Corporation (1979), when light of a wavelength satisfying the condition in an optical fiber is incident on a single mode optical fiber, it is uniform. The wave front propagates and a spherical wave with the wave front completely aligned is emitted from the exit end face. Therefore, if this light is collimated by, for example, a lens, parallel light having a uniform wavefront can be generated, and if this parallel light having a uniform wavefront is formed into a hollow beam by a phase plate or a liquid crystal type spatial light modulator, Ideal hollow erase light can be obtained. In addition, the optical system using the optical fiber is characterized in that the optical axis does not fluctuate in principle if the exit end of the optical fiber is mechanically fixed.
[0042]
However, for example, pulsed light emitted from a laser light source has a very poor spatial mode, does not have a so-called Gaussian profile with a uniform wavefront, and has various divergence angles (divergences). Even if light is used, it is not possible to narrow down to the diffraction limit. For example, an optical fiber having a core diameter of about 5 μm corresponds to light having a wavelength of 600 nm. In this case, the condensed diameter of the pulsed light is much larger than the core diameter of the optical fiber.
[0043]
In super-resolution microscopy, in particular, it is preferable that the intensity of the erase light is large. However, if the erase light having a high intensity is extracted from the exit end face of the momentary optical fiber, the laser light incident on the incident end face of the optical fiber is also strengthened. There is a need. At this time, the light collected on the incident end face at a shallow angle equal to or less than the critical angle can be extracted from the exit end face with an efficiency close to 100%, although there is a slight attenuation, but other light can be extracted from the optical fiber. It is scattered at the incident end face and cannot pass through the optical fiber. In addition, since intense light is always applied to this portion, damage due to burning occurs, and the entire incident end face of the optical fiber is burnt. This is because high-order modes that occupy most of the pulsed laser light could not be fully drawn into the core diameter of the optical fiber.
[0044]
Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, an optical fiber optical system is configured with a spatial filter, and laser light from a laser light source is incident on the optical fiber through the spatial filter. Specifically, as shown in FIG. 1, the spatial filter 1 includes a condenser lens 2, a pinhole 3, a collimator lens 4, and a condenser lens 5, and laser light from a laser light source is collected by the condenser lens 2. After condensing in the pinhole 3 and diffracting the light diffracted in the pinhole 3 with the collimator lens 4, it is matched with the solid angle taken in by the single mode optical fiber 6, and the incident end face of the optical fiber 6 is collected by the condenser lens 5. To collect light again. The size of the pinhole 3 is set with reference to the diffraction limit determined by the focal length of the condenser lens 2 and the beam diameter of the incident laser beam.
[0045]
If it does in this way, it will become possible to take in all the light condensed in the core of optical fiber 6, and to take out as a spherical wave. In addition, excess light that causes burning of the end face of the optical fiber is cut by the pinhole 3 of the spatial filter 1, so that the optical fiber 6 is not burnt and cannot be used during the measurement. Therefore, even if the intensity of the laser light itself is increased in order to extract the light emitted from the optical fiber having high intensity, the optical fiber 6 is not burned out.
[0046]
Further, the stimulated Raman light generated in the optical fiber can be dealt with by applying a very simple filter optical system. For example, in the super-resolution fluorescence microscope described in Patent Document 4, a notch filter that cuts the wavelength components of pump light and erase light is generally arranged in front of a detector that detects fluorescence from a sample. When the stimulated Raman light is generated in the optical fiber, the notch filter is configured so that the emission spectrum band of the stimulated Raman light is located within the pass-blocking wavelength band of the notch filter.
[0047]
Alternatively, an optical fiber optical system is configured by arranging a wavelength dispersion element that transmits pump light or erase light having a desired wavelength on the output end side of the optical fiber. As the wavelength dispersion element, a narrow-band bandpass filter, an interference filter using a multilayer film, a diffraction grating, or the like can be used.
[0048]
In a preferred embodiment of the present invention, in order to cut the stimulated Raman light more reliably, the wavelength of the pump light or erase light is centered on the exit end face side of the optical fiber that transmits the pump light or erase light as a wavelength dispersion element. An optical fiber optical system is configured by arranging a narrow-band bandpass filter having a wavelength, and pump light or erase light emitted from the optical fiber and transmitted through the bandpass filter is projected onto the sample. In addition, a notch filter having a wider pass blocking wavelength band than that of the above band pass filter is placed in front of the detector that receives the light emitted from the sample, and the light transmitted through this notch filter is detected. So that it can receive light.
[0049]
In this way, not only stimulated Raman light generated in the optical fiber but also pump light and erase light can be reliably prevented from entering the detector, and only fluorescence from the sample can be received. The background can be reduced. As the notch filter disposed in front of the detector, for example, a dielectric multilayer mirror having a normal incidence design can be used.
[0050]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, an embodiment of a microscope according to the present invention will be described in detail with reference to FIG.
[0051]
FIG. 2 is a diagram showing the configuration of the main part of the optical system of the microscope in one embodiment of the present invention. The microscope of the present embodiment is a laser scanning super-resolution fluorescence microscope for observing a biological sample stained with rhodamine 6G.
[0052]
Here, rhodamine 6G has the maximum absorption due to excitation from the ground state (S0) to the first electronically excited state (S1) in the excitation wavelength band of 530 nm. In addition, an absorption band that can be excited from the first electronically excited state (S1) to a higher electron excited state that is higher in energy exists in a wavelength region of 600 to 650 nm.
[0053]
Therefore, in this embodiment, the pulse Nd: YAG laser 11 is used as the first light source, and its second harmonic (532 nm) is used as the pump light (first light). The second light source includes a pulse Nd: YAG laser 12 and Ba (NO ₃ ) ₂ A Raman shifter 13 made of crystal, and the second harmonic of the pulse Nd: YAG laser 12 is wavelength-converted into a laser beam having a wavelength of 599 nm by the Raman shifter 13, and the laser beam having a wavelength of 599nm is erased ( Second light).
[0054]
The pulse Nd: YAG lasers 11 and 12 can oscillate picosecond laser pulses at a repetition rate on the order of MHz by adjusting design parameters of the laser resonator. For example, the GE-100 series manufactured by Time-Bandwidth, Switzerland, is a standard specification and can oscillate pulsed light having a pulse width of 6 psec with an average output of 50 mW at a repetition frequency of 100 MHz. This corresponds to 500 pJ of energy of one pulse. Further, by changing the design of the resonator, the repetition frequency can be adjusted between 25 MHz and 1 GHz.
[0055]
The pump light from the pulse Nd: YAG laser 11 is incident on a beam combiner 16 composed of a cuvette half mirror constituting the superposition optical system via an optical fiber optical system 15 for pump light. An optical fiber optical system 15 for pump light includes an optical coupling unit 21 having the spatial filter shown in FIG. 1, a polarization-preserving single mode fiber 22, a collimator lens 23, and a narrow band having a center wavelength of 532 nm as a wavelength dispersion element. The band-pass filter 24 is configured so that the pump light from the pulse Nd: YAG laser 11 is incident on the core of the polarization-preserving single-mode fiber 22 through the optical coupling unit 21 and propagates. The pump light emitted from the wavefront-preserving single-mode fiber 22 is shaped into parallel light by the collimator lens 23 and then incident on the beam combiner 16 through the bandpass filter 24. The band pass filter 24 may be a commercially available narrow band filter (for example, manufactured by Barr Associates Inc., USA) having a center wavelength of 532 nm and a pass wavelength bandwidth of 1 nm formed of a dielectric multilayer film, for example.
[0056]
As described above, if the pump light from the pulse Nd: YAG laser 11 is incident on the polarization-preserving single-mode fiber 22 via the optical coupling unit 21 having the spatial filter shown in FIG. Since only the components can be selected and made incident on the polarization-maintaining single-mode fiber 22, the light emitted from the polarization-maintaining single-mode fiber 22 is converted into parallel light by the collimator lens 23, thereby generating uniform plane wave pump light. Can be obtained. Further, if the pump light from the collimator lens 23 is incident on a narrow band-pass filter 24 having a center wavelength of 532 nm, even if stimulated Raman light is generated in the polarization-preserving single mode fiber 22, this is converted into a band. Passing can be blocked by the pass filter 24, and pump light having a desired wavelength (532 nm) can be obtained.
[0057]
On the other hand, the erase light from the Raman shifter 13 is incident on the phase plate 26 as shown in FIG. 10 through the optical fiber optical system 25 for erase light. Synthesize on the same axis. As with the optical fiber optical system 15 for pump light, the optical fiber optical system 25 for erase light includes an optical coupling unit 27 having the spatial filter shown in FIG. 1, a polarization-preserving single mode fiber 28, a collimator lens 29, and the like. And a band-pass filter 30 having a center wavelength of 599 nm, which is a wavelength dispersion element, and the erase light from the Raman shifter 13 is passed through the optical coupling unit 27 to the core of the polarization-preserving single mode fiber 28. The erase light emitted from the polarization-preserving single mode fiber 28 is shaped into parallel light by the collimator lens 29 and then incident on the phase plate 26 through the band pass filter 30. As the band pass filter 30, a narrow band filter having a center wavelength of 599 nm and a pass wavelength bandwidth of 1 nm formed of a dielectric multilayer film is used, for example.
[0058]
In this way, the erase light from the Raman shifter 13 is incident on the polarization-maintaining single mode fiber 28 through the optical coupling unit 27 having the spatial filter shown in FIG. A uniform spherical wave erase light can be obtained by converting the emitted light from the polarization plane preserving single mode fiber 28 into a parallel light by the collimator lens 29. Further, even if stimulated Raman light is generated in the polarization plane preserving single mode fiber 28 by causing the erase light from the collimator lens 29 to enter a narrow band pass filter 30 having a center wavelength of 599 nm, Passage can be blocked by the filter 30, and erase light having a desired wavelength (599 nm) can be obtained.
[0059]
The pump light and erase light synthesized coaxially by the beam combiner 16 are transmitted through a beam separator 31 composed of a cuvette half mirror, and then oscillated around mutually orthogonal axes. Are sequentially reflected and focused on the surface of the biological sample 35 stained with rhodamine 6G by the objective lens 34, and the focused point is moved by the swinging of the galvanometer mirrors 32 and 33 to perform two-dimensional scanning on the sample surface. . In FIG. 2, in order to simplify the drawing, the galvanometer mirrors 32 and 33 are shown so as to swing around axes parallel to each other.
[0060]
In addition, the fluorescence emitted from the sample 35 by the irradiation of the pump light and the erase light is collimated by the objective lens 34, and then enters the beam separator 31 through the galvanometer mirrors 33 and 32, following the path opposite to the incident optical path, The fluorescent light reflected by the beam separator 31 is condensed on the pinhole 37 by the condenser lens 36.
[0061]
The pinhole 37 is disposed at a confocal position with respect to the fluorescence emission point of the sample 35, and the fluorescence transmitted through the pinhole 37 is transmitted through the pump light cut notch filter 38 and the erase light cut notch filter 39, respectively. After removing the pump light and the erase light, the photomultiplier tube 40, which is a photodetector, receives the light to obtain a fluorescence output signal, and this fluorescence output signal is stored in a video frame memory of a computer (not shown) that controls the microscope. Thus, the two-dimensional fluorescence image of the sample 35 is displayed in real time on a monitor (not shown). The galvanometer mirrors 32 and 33 are swung in synchronization with the video rate of the fluorescent two-dimensional image displayed on the monitor.
[0062]
The passage blocking wavelength band of the pump light cut notch filter 38 is made wider than the passing wavelength band of the band pass filter 24 in the optical fiber optical system 15 for pump light. Similarly, the pass blocking wavelength band of the erase light cut notch filter 39 is also made wider than the pass wavelength band of the band pass filter 30 in the optical fiber optical system 25 for erase light. The pump light cut notch filter 38 and the erase light cut notch filter 39 are one commercially available filter that blocks the passage of light in the wavelength band including the pump light and erase light (for example, manufactured by Barr Associates Inc., USA). Can also be configured.
[0063]
As described above, in the present embodiment, the pump light from the pulse Nd: YAG laser 11 is incident on the beam combiner 16 through the optical fiber optical system 15 for pump light, and the erase light from the Raman shifter 13 is erased. Since it is incident on the phase plate 26 via the optical fiber optical system 25 for light, and is made into a hollow beam and incident on the beam combiner 16 so as to be synthesized coaxially with the pump light, the pump light and the erase light are combined with the optical axis. Therefore, the super-resolution effect can be obtained with certainty. In addition, since the pulse Nd: YAG laser 11, the pulse Nd: YAG laser 12, and the Raman shifter 13 can be arranged separately from the optical bench having the objective lens 34, there is an advantage that the degree of freedom in microscope design can be widened.
[0064]
In addition, since the optical fiber optical system 15 for pump light is provided with a spatial filter on the incident end face side of the polarization plane preserving single mode fiber 22 and a collimator lens 23 on the exit end face side, a perfect spherical wave of pump light is supplied. It can be taken out and converted into a uniform plane wave, and excess light that causes burning of the end face of the optical fiber can be cut off. Similarly, in the optical fiber optical system 25 for erase light, a spatial filter is provided on the incident end face side of the polarization plane preserving single mode fiber 28 and a collimator lens 29 is provided on the exit end face side. Can be taken out and converted into a uniform plane wave, and excess light that causes burning of the end face of the optical fiber can be cut off. Therefore, particularly in the case of the erase light, the phase plate 26 can accurately form a hollow beam, so that the super-resolution can be expressed with certainty, and the intensity of the laser light itself is increased in order to extract the high-intensity erase light. Even so, the polarization-preserving single mode fiber 28 is not burned out.
[0065]
In addition, the optical fiber optical system 15 for pump light is provided with a narrow-band bandpass filter 24 on the exit end face side of the polarization-maintaining single mode fiber 22 so as to transmit only pump light of a desired wavelength. In the optical fiber optical system 25 for erase light, a narrow-band bandpass filter 30 is provided on the exit end face side of the polarization plane preserving single mode fiber 28 so as to transmit only erase light of a desired wavelength. Even if stimulated Raman light is generated in the wavefront-preserving single mode fibers 22 and 28, the passage thereof can be reliably prevented. Therefore, it is possible to prevent the stimulated Raman light from becoming a background when observing the fluorescence signal from the sample 35. Moreover, in the present embodiment, the pump light cut-notch filter 38 having a wider pass blocking wavelength band than the pass wavelength band of the band pass filter 24 and the pass wavelength band of the band pass filter 30 are located in front of the photomultiplier tube 40. Since the erase light cut-notch filter 39 having a wide pass blocking wavelength band is arranged, not only the stimulated Raman light generated in the polarization-maintaining single mode fibers 22 and 28 but also the pump light and the erase light are supplied to the photomultiplier tube 40. Since it is possible to reliably prevent incidence and receive only the fluorescence from the sample 35, a microscopic image with good image quality can be obtained.
[0066]
In addition, this invention is not limited only to the said embodiment, Many deformation | transformation or a change is possible. For example, when stimulated Raman light is generated in the polarization-maintaining single mode fibers 22 and 28, the emission spectrum band of the stimulated Raman light is within the pass blocking wavelength band of the pump light cut notch filter 38 and the erase light cut notch filter 39. The band-pass filters 24 and 30 can be omitted. Further, the phase modulation element that shapes the erase light into a hollow beam is not limited to the above-described phase plate, and a liquid crystal spatial light modulator and other known elements can be used. Furthermore, in the above embodiment, the pump light and erase light are pulsed light, but the present invention can be effectively applied to the case where one or both of them are continuous waves.
[0067]
Additional notes
1. The first light from the first light source and the second light from the second light source are partially overlapped by the overlapping optical system and condensed on the sample by the condensing optical system, and the optical response of the sample In a microscope that detects light with a photodetector,
The first light or the second light from at least one of the first light source or the second light source is guided to the superposing optical system as a uniform plane wave through an optical fiber optical system having an optical fiber and a collimator lens. A microscope characterized by being configured as described above.
2. 2. The microscope according to appendix 1, wherein at least one of the first light source and the second light source is a pulse light source.
3. The wavelength of the first light is within a resonance absorption wavelength band that causes the molecule of the sample including a molecule having at least three electronic states including the ground state to transition from the ground state to the first electronic excited state.
Additional Item 1 or 2, wherein the wavelength of the second light is in a resonance absorption wavelength band that causes the molecule to transition from the first electronic excited state to another electronic state having a higher energy level. The microscope described.
4). The said optical fiber optical system has a spatial filter arrange | positioned between the said optical fiber and the said 1st light source, or a 2nd light source, The microscope as described in any one of the additional items 1-3 characterized by the above-mentioned. .
5. The optical fiber optical system includes a wavelength dispersion element that transmits the first light or the second light disposed between the optical fiber and the overlapping optical system. The microscope according to any one of the above.
6). Additional notes 1-5, wherein a notch filter is disposed in front of the photodetector to allow light emission by the optical response of the sample to pass therethrough and prevent the passage of the first light or the second light. The microscope as described in any one.
7). The optical fiber optical system includes a wavelength dispersion element that transmits the first light or the second light disposed between the optical fiber and the superposition optical system, and is disposed in front of the photodetector. A notch filter that allows light emission due to the optical response of the sample to pass and blocks the passage of the first light or the second light is disposed, and a passage blocking wavelength band of the notch filter is a pass wavelength of the wavelength dispersion element. The microscope according to any one of additional items 1 to 4, wherein the microscope is wider than the band.
8). The microscope according to Additional Item 5 or 7, wherein the wavelength dispersive element includes a band-pass filter.
9. Item 8. The microscope according to item 6 or 7, wherein the notch filter includes a multilayer wavelength dispersion element.
10. Item 8. The microscope according to item 6 or 7, wherein the notch filter is a direct-incidence multilayer reflector.
[0068]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, at least one of the first light from the first light source or the second light from the second light source is A spatial filter arranged in order from the first light source side or the second light source side; A uniform plane wave is obtained through an optical fiber optical system having an optical fiber and a collimator lens, and the first light and the second light are partially overlapped by the superposition optical system and condensed on the sample by the condensing optical system. Since the optical response of the light is detected by the light detector, the sample can be irradiated with the first light and the second light without causing fluctuations in the optical axis while maintaining a good wavefront. Super-resolution phenomenon can be expressed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram for explaining the principle of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a main configuration of an optical system of a microscope according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a conceptual diagram showing an electronic structure of a valence electron orbit of a molecule constituting a sample.
4 is a conceptual diagram showing a first electronic excited state of the molecule of FIG. 3. FIG.
FIG. 5 is a conceptual diagram similarly showing a second electron excited state.
FIG. 6 is also a conceptual diagram showing a state in which the second electron excited state returns to the ground state.
FIG. 7 is a conceptual diagram for explaining a double resonance absorption process in a molecule.
FIG. 8 is also a conceptual diagram for explaining a double resonance absorption process.
FIG. 9 is a diagram illustrating a configuration of an example of a conventional super-resolution microscope.
10 is a plan view showing the configuration of the phase plate shown in FIG. 9. FIG.
FIG. 11 is a diagram showing a configuration of another example of a conventional super-resolution microscope.
[Explanation of symbols]
1 Spatial filter
2 Condensing lens
3 Pinhole
4 Collimator lens
5 Condensing lens
6 Single mode optical fiber
11,12 pulse Nd: YAG laser
13 Raman Shifter
15 Optical fiber optical system for pump light
16 Beam combiner
21, 27 Optical coupling part
22, 28 Polarization plane preserving single mode fiber
23, 29 Collimator lens
24, 30 band pass filter
25 Optical fiber optics for erase light
26 Phase plate
31 Beam separator
32, 33 Galvano mirror
34 Objective lens
35 samples
36 condenser lens
37 pinhole
38 Pump light cut notch filter
39 Erase light cut notch filter
40 photomultiplier tubes

Claims

The first light from the first light source and the second light from the second light source are partially overlapped by the overlapping optical system and condensed on the sample by the condensing optical system, and the optical response of the sample In a microscope that detects light with a photodetector,
Spatial filter, optical fiber, and collimator in which the first light or the second light from at least one of the first light source or the second light source is arranged in order from the first light source side or the second light source side A microscope characterized by being guided to the superposition optical system as a uniform plane wave through an optical fiber optical system having a lens.

2. The microscope according to claim 1, wherein at least one of the first light source and the second light source is a pulsed light source.

The wavelength of the first light is within a resonance absorption wavelength band that causes the molecule of the sample including a molecule having at least three electronic states including the ground state to transition from the ground state to the first electronic excited state.
The wavelength of the second light is in a resonance absorption wavelength band that causes the molecule to transition from the first electronic excited state to another electronic state having a higher energy level. The microscope described.

The optical fiber optics, claim 1-3, characterized in that it comprises a wavelength dispersive element for transmitting the first light or the second light is arranged between the optical system superimposed said optical fiber and said The microscope according to any one of the above.