JP4245415B2

JP4245415B2 - Method for producing molecular recognition phosphor

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Publication number: JP4245415B2
Application number: JP2003173695A
Authority: JP
Inventors: 基邦一谷; 健二山本; 由岐夫山口
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2023-06-18
Also published as: JP2004226395A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に用いられる分子認識蛍光体及びそれを用いた標的物質の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原、抗体、ＤＮＡ等の生体関連物質や、ダイオキシン等の環境関連物質を高感度に測定する方法として、分子認識蛍光体を蛍光物質等のマーカー物質に結合した分子認識蛍光体が用いられている。しかし、従来用いられていた蛍光物質は感度や蛍光寿命が短いという問題があった。
【０００３】
これに対して、近年、高感度なマーカー物質に用いることができる蛍光物質として無機超微粒子（以下、無機ナノ粒子ともいう）が注目されている。無機ナノ粒子は、蛍光強度が強く、蛍光スペクトルの半値幅が狭い、即ちシャープな蛍光を発するという特徴を有する。無機ナノ粒子は、バルク結晶における励起粒子ボーア半径と同等の粒子径を有する半導体の超微粒子（超微結晶）であり、量子閉じ込め効果の発現によって光学スペクトル、即ち吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを粒子径によって調整することが可能である。つまり、粒子径によって異なる波長の光を発し得る。
【０００４】
無機ナノ粒子を分子認識蛍光体として用いるためには、無機ナノ粒子と分子認識蛍光体とを接合させる必要がある。例えば、非特許文献１には、無機ナノ粒子に直接又はアビジン等のタンパク質を介して分子認識蛍光体を接合させる方法が開示されている。しかしながら、このような分子認識蛍光体は製造方法が煩雑であったり、これを用いて標的物質の測定を行ってもわずかな条件の違いで反応が再現できなかったりするという問題点があった。また、無機ナノ粒子と分子認識蛍光体とを接合して得た分子認識蛍光体は、分散安定性に乏しく凝集しやすいという問題もあった。
【０００５】
【非特許文献１】
ｐｈｙｓ．ｓｔａｔ．ｓｏｌ．（ｂ）２２９，４０７（２００２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に用いられる分子認識蛍光体及びそれを用いた標的物質の測定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明１は、無機化合物及び／又は有機化合物からなる支持体（Ａ）と、前記支持体（Ａ）の表面に物理的及び／又は化学的に接合している蛍光物質（Ｂ）と、前記支持体（Ａ）の表面に物理的及び／又は化学的に接合している分子認識物質（Ｃ）とからなることを特徴とする分子認識蛍光体である。
【０００８】
本発明２は、無機化合物及び／又は有機化合物からなる支持体（Ａ）と、前記支持体（Ａ）の表面に物理的及び／又は化学的に接合している蛍光物質（Ｂ）と、前記蛍光物質（Ｂ）の表面に物理的及び／又は化学的に接合している分子認識物質（Ｃ）とからなることを特徴とする分子認識蛍光体である。
【０００９】
本発明３は、無機化合物及び／又は有機化合物からなる支持体（Ａ）、前記支持体（Ａ）の表面に物理的及び／又は化学的に接合している蛍光物質（Ｂ）、前記支持体（Ａ）と前記蛍光物質（Ｂ）との接合体を被覆する被覆層（Ｄ）、並びに、前記被覆層（Ｄ）の表面に物理的及び／又は化学的に接合している分子認識物質（Ｃ）からなることを特徴とする分子認識蛍光体である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明１の分子認識蛍光体は、支持体（Ａ）、蛍光物質（Ｂ）及び分子認識物質（Ｃ）からなる。
上記支持体（Ａ）としては、上記蛍光物質（Ｂ）及び／又は分子認識物質（Ｃ）を接合することができ、かつ、上記蛍光物質（Ｂ）の蛍光発光を阻害しないものであれば特に限定されず、例えば、ガラス、シリカ等の無機化合物、樹脂等の有機化合物、有機・無機複合材料等が挙げられる。
【００１１】
上記支持体（Ａ）を構成する有機化合物としては特に限定されず、例えば、（不）飽和炭化水素、芳香族炭化水素、（不）飽和脂肪族、芳香族カルボン酸、（不）飽和脂ケトン、芳香族ケトン、（不）飽和アルコール、芳香族アルコール、（不）飽和アミン、芳香族アミン、（不）飽和チオール、芳香族チオール、有機珪素化合物、これらの誘導体、これら１種以上の化合物からなる縮合体、これら１種以上の化合物からなる重合体等が挙げられる。なお、上記（不）飽和とは、飽和及び不飽和の両方を意味を有するものである。
【００１２】
上記縮合体及び重合体としては、例えば、ポリエチレン、ポリブタジエン等のポリオレフィン；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテル；ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルエステル、フェノール樹脂、メラミン樹脂、アリル樹脂、フラン樹脂、ポリエステル、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、アクリロニトリル／スチレン樹脂、スチレン／ブタジエン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ビニル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンオキシド、糖、澱粉、セルロース、ポリペプチド、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルフォン、ポリアセタール、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ベンゾグアナミン樹脂等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
また、上記重合体を得るために用いる重合性単量体としては特に限定されず、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン、メチルペンテン等のオレフィン類及びその誘導体；スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、ジビニルベンゼン、クロロメチルスチレン等のスチレン誘導体；フッ化ビニル；塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸−２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチレン（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体；フタル酸等のジカルボン酸類；ジアリルフタレート；ベンゾグアナミン；トリアリルイソシアネート等が挙げられる。これらの重合性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１４】
上記支持体（Ａ）を構成する有機・無機複合材料としては特に限定されず、例えば、上記有機化合物にガラスやシリカ等の無機化合物が混合されたもの等が挙げられる。
上記支持体（Ａ）を構成する無機化合物、有機化合物、有機・無機複合材料等としては、市販品を用いてもよいし、合成してもよい。
【００１５】
上記支持体（Ａ）は、正又は負の電荷を有していることが好ましい。正又は負の電荷を有することにより、例えば、支持体（Ａ）が正の電荷を有している場合には負の電荷を有している蛍光物質（Ｂ）を、支持体（Ａ）が負の電荷を有している場合には正の電荷を有している蛍光物質（Ｂ）を用いると、静電引力によって支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを接合することができる。
【００１６】
上記支持体（Ａ）に正又は負の電荷を帯電させる方法としては、例えば、上記支持体（Ａ）の製造時に正又は負の電荷を有する重合単量体を混入させる方法、正又は負の電荷を有するラジカル開始剤により重合を行う方法、正又は負の電荷を有する分散安定剤又は乳化剤を用いる方法等が挙げられる。これらのなかでも、正又は負の電荷を有する重合単量体を混入させる方法、正又は負の電荷を有する分散安定剤又は乳化剤を用いる方法が好適である。
【００１７】
上記正の電荷を有する重合性単量体としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ―トリメチル―Ｎ−２−メタクリロイルオキシエチルアンモニウムクロライド等のアンモニウム基含有モノマー、メタクリル酸フェニルジメチルスルホニウムメチル硫酸塩等のスルホニウム基を有するモノマー等が挙げられる。
上記正の電荷を有するラジカル開始剤としては、例えば、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［２−（１−ヒドロキシ−ブチル）］−プロピオンアミド｝、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）及びこれらの塩等が挙げられる。
【００１８】
上記負の電荷を有する重合性単量体としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、スチレン、ビニルベンゼンスルホン酸等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いられる支持体（Ａ）の形状としては特に限定されないが、微粒子、基板、薄膜、繊維、中空糸からなる群より選択される少なくとも１つの形状を有することが好ましく、その目的に応じて適切なものを選択することができる。
なかでも、特に微粒子であることが好ましい。支持体（Ａ）が微粒子であると、水又は有機溶媒中で安定に分散させることができ、蛍光物質（Ｂ）や分子認識物質（Ｃ）を均一に接合させることができる。
【００２０】
上記微粒子の粒子径は、好ましい下限は５ｎｍ、好ましい上限は５０μｍである。５ｎｍ未満であると、遠心分離によって沈殿しにくくなるので、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）や分子認識物質（Ｃ）とを接合させる際に、未接合の蛍光物質（Ｂ）や分子認識物質（Ｃ）を除くことが困難になる。５０μｍを超えると、分散安定性が低下し、凝集しやすくなる。より好ましい下限は１０ｎｍ、より好ましい上限は５μｍである。。
【００２１】
上記微粒子のＣＶ値は、２０％以下であることが好ましい。２０％を超えると、蛍光物質（Ｂ）や分子認識物質（Ｃ）を接合した後の分子認識蛍光体の粒子径も不均一となり、上記分子認識蛍光体を均一に分散させにくくなることがある。なお、上記微粒子のＣＶ値は、下記式により算出することができる。
粒子径のＣＶ値（％）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径×１００
上記ＣＶ値の測定方法としては、蛍光物質（Ｂ）や分子認識物質（Ｃ）を接合する前は、粒度分布径等で測定できるが、蛍光物質（Ｂ）や分子認識物質（Ｃ）を接合した後は、ＳＥＭ写真の画像解析等で測定することができる。
【００２２】
上記微粒子の製造方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ミニエマルジョン重合法、エマルジョン重合法、転層乳化重合、マイクロサスペンション重合法、懸濁重合法、分散重合法、シード重合法、ソープフリー析出重合法等が挙げられる。これらのなかでも粒子径の制御性に優れるソープフリー析出重合法が好適に用いられる。
【００２３】
上記蛍光物質（Ｂ）としては特に限定されず、有機化合物、無機化合物のいずれであっても用いることができる。なかでも、無機化合物からなる蛍光物質（Ｂ）は蛍光がシャープであり、安定性も高いことから好適に用いることができる。
上記蛍光物質（Ｂ）として用いることのできる有機化合物としては、例えば、ルシフェラーゼ等の蛋白質、下記式（１）で表されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン等が挙げられる。
【００２４】
【化１】

【００２５】
上記蛍光物質（Ｂ）として用いることのできる無機化合物としては、３〜１６族の金属元素からなる蛍光物質であれば特に限定されず、例えば、ユウロピウム、テルビニウム、サマリウム、ジスプロシウム等の希土類化合物や、カドミウム、亜鉛等のカルコゲン化合物等からなる無機蛍光粒子、３〜１６族の金属元素の有機金属化合物が挙げられる。
上記有機金属化合物としては、例えば、ビス（８−ヒドロキシキノリン）亜鉛、トリス（ジベンゾイルメタン）−モノ（フェナンチロリン）ユウロピウム（ＩＩＩ）、トリス（２−フェニルピリジン）イリジウム、トリス（８−ヒドロキシキノリン）アルミニウム（ＩＩＩ）、トリス（８−ヒドロキシキノリン）ガリウム（ＩＩＩ）等が挙げられる。
上記無機蛍光粒子としては、例えば、ＢａＭｇＡｌ_１０Ｏ_１７Ｅｕ、Ｙ_２Ｏ_３Ｅｕ、（Ｙ，Ｇｄ）ＢＯ_３Ｅｕ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等が挙げられる。
更に、これらの複合材料としては、例えば、ＣｄＳをコア−ＣｄＳｅをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＣｄＳをシェル、ＣｄＳをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳｅをシェルとするコア−シェル構造を有するもの等が挙げられる。
なかでも、上記蛍光物質（Ｂ）としては、上記無機蛍光粒子が好ましい。
これらの蛍光物質（Ｂ）は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
また、上記無機蛍光粒子の表面は、化学的又は物理的に修飾されていてもよく、界面活性剤、分散安定剤又は酸化防止剤の等の添加剤が加えられたものであってもよい。このような界面活性剤及び／又は表面修飾を加えることにより、上記無機蛍光粒子の分散性を向上させることができる。
【００２７】
上記無機蛍光粒子の粒子径としては特に限定されないが、通常、好ましい下限は０．５ｎｍ、好ましい上限は１００ｎｍである。この範囲内であると、充分な蛍光強度や分散安定性を得ることができる。より好ましい下限は１ｎｍ、より好ましい上限は５０ｎｍ、更に好ましい上限は１０ｎｍである。
【００２８】
上記蛍光物質（Ｂ）は、上記無機蛍光粒子が無極性官能基及び／又は極性官能基を有する有機化合物で表面修飾されているものであってもよい。上記蛍光物質（Ｂ）がこのような構造をとることにより、水又は有機溶媒への分散性、分散安定性が向上する。また、上記官能基同士の電荷の反発により蛍光物質（Ｂ）が凝集することを抑制できることに加え、官能基を介して支持体（Ａ）と物理的及び／又は化学的に接合させることができる。
上記無極性及び／又は極性官能基を有する有機化合物としては、例えば、オクタンチオール、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキサイド、メルカプトフェノール、メルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオール等が挙げられる。
【００２９】
上記蛍光物質（Ｂ）は、正又は負の電荷を有していることが好ましい。正又は負の電荷を有することにより、例えば、静電引力によって支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを接合することができる。また、蛍光物質（Ｂ）同士は静電反発することから、支持体（Ａ）に、蛍光物質（Ｂ）同士が重なって結合することを防止することができる。
【００３０】
上記蛍光物質（Ｂ）に正又は負の電荷を帯電させる方法としては、例えば、上記蛍光物質（Ｂ）に正又は負の電荷を有する材質を用いる方法や正又は負の電荷を有する表面修飾剤を用いる方法等が挙げられる。また、上記蛍光物質（Ｂ）が無機蛍光粒子と極性官能基を有する有機化合物とからなる場合には、正又は負の電荷を有する有機化合物を用いることで容易に上記蛍光物質（Ｂ）に正又は負の電荷を帯電させることができる。具体的には、例えば、負の電荷を帯電させる場合にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸等を用い、正の電荷を帯電させる場合にはアミノプロパンチオール等を用いる。
【００３１】
上記分子認識物質（Ｃ）としては、標的物質に特異的に反応するものであれば特に限定されないが、抗原、抗体等のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、シクロデキストリン、クラウンエーテル等の環状化合物が挙げられる。
【００３２】
本発明１の分子認識蛍光体においては、上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とが物理的及び／又は化学的に接合しており、また、上記支持体（Ａ）と分子認識物質（Ｃ）とが物理的及び／又は化学的に接合している。
上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合の態様としては特に限定されず、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、静電引力、化学結合等により接合する態様が挙げられる。この接合の態様は支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）の材質及び表面官能基によって任意に選択することができる。
【００３３】
また、上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを化学結合により接合する場合としては、例えば、表面にアミノ基を有する粒子を支持体（Ａ）とし、表面にカルボン酸基を有する蛍光物質（Ｂ）を用いることにより共有結合（アミド結合）によって接合することができる。
【００３４】
上記支持体（Ａ）と分子認識物質（Ｃ）との接合の態様としては特に限定されず、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、静電引力、化学結合等により接合する態様が挙げられる。例えば、支持体（Ａ）としてポリスチレンを、分子認識物質（Ｃ）としてタンパク質を用いる場合には、タンパク質の疎水部とポリスチレンの疎水部との疎水性相互作用によって支持体（Ａ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合することができる。
【００３５】
上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを、及び、上記支持体（Ａ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合する順序は特に限定されない。上記支持体（Ａ）に蛍光物質（Ｂ）を接合した後に分子認識物質（Ｃ）を接合してもよく、上記支持体（Ａ）に分子認識物質（Ｃ）を接合した後に蛍光物質（Ｂ）を接合してもよく、また、上記支持体（Ａ）に蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）とを同時に接合してもよい。
【００３６】
上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを接合する方法、及び、上記支持体（Ａ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合する方法としては特に限定されず、例えば、支持体（Ａ）が分散している溶液中に蛍光物質（Ｂ）をそのまま添加又は蛍光物質（Ｂ）の分散溶液を添加して混合し、次いで、分子認識物質（Ｃ）をそのまま添加又は分子認識物質（Ｃ）の分散液を添加して混合する方法等が挙げられる。接合しなかった蛍光物質（Ｂ）、分子認識物質（Ｃ）は、例えば、遠心分離等の操作によって取り除くことができる。
【００３７】
上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを、及び、上記支持体（Ａ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合する際には、接合を促進する物質を添加してもよい。例えば、縮合試薬を添加すると、タンパク質のアミノ基と支持体とを化学的に結合するのを促進することができる。
【００３８】
本発明の発光性素子は、更に、蛍光強度向上剤（Ｅ）を含有することが好ましい。蛍光強度向上剤（Ｅ）を含有することにより、蛍光強度を飛躍的に向上させることができる。これにより、プラズマディスプレイパネルに用いた場合には輝度の高い画像が得られ、マーカー物質に用いた場合には高い感度が得られる。
また、蛍光強度向上剤（Ｅ）を含有することにより、量子ドットのブリンキングを制御して、ブリンキングの発生を抑制することができ、プラズマディスプレイパネルに用いた場合に画像がちらついたり、マーカー物質に用いた場合に感度がばらついたりするのを防ぐことができる。なお、ここでブリンキングとは蛍光強度が変動して大きくなったり、小さくなったりすることを意味する。
【００３９】
上記蛍光強度向上剤（Ｅ）は、アジ化ナトリウム及び／又は電子供与体からなる。
上記電子供与体としては特に限定されないが、親水性化合物が好ましく、なかでも、ピロール（Ｃ_４Ｈ_５Ｎ）、アスコルビン酸及びホウ素化テトラメチルアンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種が好適である。
これらのアジ化ナトリウム、電子供与体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４０】
本発明１の分子認識蛍光体に上記蛍光強度向上剤（Ｅ）を含有させる方法としては特に限定されず、上記支持体（Ａ）、上記蛍光物質（Ｂ）又は上記分子認識物質（Ｃ）中に含有又はこれらの表面に吸着させてもよいし、上記支持体（Ａ）と上記蛍光物質（Ｂ）と上記分子認識物質（Ｃ）とからなる分子認識蛍光体を分散させる水溶液中に溶解させてもよい。
【００４１】
上記蛍光強度向上剤（Ｅ）を水溶液中に溶解させて用いる場合には、上記蛍光強度向上剤（Ｅ）の濃度の好ましい下限は０．００１重量％、好ましい上限は３０重量％である。０．００１重量％未満であると、充分な蛍光強度向上効果が得られないことがあり、３０重量％を超えると、蛍光物質（Ｂ）や支持体（Ａ）が凝集してかえって蛍光強度が低下することがある。ことがある。
【００４２】
本発明２の分子認識蛍光体は、支持体（Ａ）、蛍光物質（Ｂ）及び分子認識物質（Ｃ）とからなる。上記支持体（Ａ）、蛍光物質（Ｂ）及び分子認識物質（Ｃ）としては、本発明１の分子認識蛍光体と同様のものを用いることができる。
本発明２の分子認識蛍光体では、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とが物理的及び／又は化学的に接合しており、更に蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）とが物理的及び／又は化学的に接合している。
【００４３】
本発明２の分子認識蛍光体における支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合の態様は、本発明１の分子認識蛍光体における支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合の態様と同様である。
本発明２の分子認識蛍光体における蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）との接合の態様としては特に限定されず、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、静電引力、化学結合等により接合する態様が挙げられる。例えば、蛍光物質（Ｂ）がコア−シェル型ＣｄＳｅ／ＺｎＳである場合、分子認識物質（Ｃ）として断片化した抗体を用いると、分子認識物質（Ｃ）のＳＨ基と蛍光物質（Ｂ）のＺｎＳとがＳ−Ｓ結合を形成することができる。また、蛍光物質（Ｂ）が表面にアミノ酸を有する場合には、タンパク質からなる分子認識物質（Ｃ）のカルボン酸基とアミド結合を形成することができる。
【００４４】
上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを、及び、上記蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合する順序は特に限定されない。上記支持体（Ａ）に蛍光物質（Ｂ）を接合した後に分子認識物質（Ｃ）を接合してもよく、上記蛍光物質（Ｂ）に分子認識物質（Ｃ）を接合した後に支持体（Ａ）に接合してもよく、また、上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）、蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）とを同時に接合してもよい。
【００４５】
上記支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とを接合する方法、及び、上記蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合する方法としては特に限定されず、例えば、支持体（Ａ）が分散している溶液中に蛍光物質（Ｂ）をそのまま添加又は蛍光物質（Ｂ）の分散溶液を添加して混合し、次いで、分子認識物質（Ｃ）をそのまま添加又は分子認識物質（Ｃ）の分散液を添加して混合する方法等が挙げられる。接合しなかった蛍光物質（Ｂ）、分子認識物質（Ｃ）は、例えば、遠心分離等の操作によって取り除くことができる。
また、接合の際には縮合試薬等の接合を促進する物質を添加してもよい。
【００４６】
本発明２の分子認識蛍光体は、更に、蛍光強度向上剤（Ｅ）を含有することが好ましい。上記蛍光強度向上剤（Ｅ）については、本発明１の分子認識蛍光体と同様である。
【００４７】
本発明３の分子認識蛍光体は、支持体（Ａ）、蛍光物質（Ｂ）、分子認識物質（Ｃ）及び被覆層（Ｄ）からなる。上記支持体（Ａ）、蛍光物質（Ｂ）及び分子認識物質（Ｃ）としては、本発明１の分子認識蛍光体と同様のものを用いることができる。
上記被覆層（Ｄ）としては、上記支持体（Ａ）と同様の無機化合物や有機化合物からなるものを用いることができる。上記被覆層（Ｄ）は、上記支持体（Ａ）と同一のものからなるものであってもよいし、異なるものからなるものであってもよい。
【００４８】
本発明３の分子認識蛍光体では、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とが物理的及び／又は化学的に接合しており、接合した支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）とは被覆層（Ｄ）により被覆されており、更に、被覆層（Ｄ）と分子認識物質（Ｃ）とが物理的及び／又は化学的に接合している。
【００４９】
本発明３の分子認識蛍光体における支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合の態様は、本発明１の分子認識蛍光体における支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合の態様と同様である。
【００５０】
上記被覆層（Ｄ）は、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合体を被覆する。これにより、蛍光物質（Ｂ）の剥がれ落ちや、酸化劣化等による蛍光強度の低下を抑制することができる。また、支持体（Ａ）に蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）の両方を接合することが困難な場合、支持体（Ａ）に蛍光物質（Ｂ）を接合した後、分子認識物質（Ｃ）が接合しやすい被覆層（Ｄ）を形成することで効率よく分子認識蛍光体を得ることができる。
【００５１】
上記被覆層（Ｄ）を形成する方法としては特に限定されず、例えば、被覆層（Ｄ）がシリカからなる場合には、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合体について、ゾル−ゲル反応により被覆層（Ｄ）の形成する方法等が挙げられる。また、被覆層（Ｄ）が樹脂からなる場合には、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合体を含有する溶液にモノマーと重合開始剤とを添加し、支持体（Ａ）と蛍光物質（Ｂ）との接合体の存在下で重合反応を行う方法等が挙げられる。
【００５２】
本発明３の分子認識蛍光体における被覆層（Ｄ）と分子認識物質（Ｃ）との接合の態様としては特に限定されず、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、静電引力、化学結合等により接合する態様が挙げられる。例えば、被覆層（Ｄ）としてポリスチレンを、分子認識物質（Ｃ）としてタンパク質を用いる場合には、タンパク質の疎水部とポリスチレンの疎水部との疎水性相互作用によって被覆層（Ｄ）と分子認識物質（Ｃ）とを接合することができる。
【００５３】
本発明３の分子認識蛍光体は、更に、蛍光強度向上剤（Ｅ）を含有することが好ましい。上記蛍光強度向上剤（Ｅ）については、本発明１の分子認識蛍光体と同様である。
【００５４】
本発明３の分子認識蛍光体を作製する方法としては特に限定されず、例えば、支持体（Ａ）に蛍光物質（Ｂ）を接合した後、その表面に被覆層（Ｄ）を形成し、その後更に、被覆層（Ｄ）に分子認識物質（Ｃ）を接合する方法等が挙げられる。
接合の際には縮合試薬等の接合を促進する物質を添加してもよい。
【００５５】
本発明の分子認識蛍光物質は、上述の構成からなることにより、極めて容易に作製することができる。また、本発明の分子認識蛍光物質は、蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）が支持体（Ａ）に接合しているため、蛍光物質（Ｂ）の凝集を抑制することができる。そのため、例えば、支持体（Ａ）が微粒子で、溶媒に分散させて使用する場合、支持体（Ａ）が充分な分散安定性を有していれば、本発明の分子認識蛍光体は、従来のものに比べて高い分散安定性を示す。分散性が低いと生じる凝集物と非凝集物とは標的物質に対する活性が異なるため、凝集物が多いと再現性低下の原因となるが、本発明の分子認識蛍光体では凝集が少ないため、優れた安定性を示し、極めて再現性の高い結果が得られる。更に、蛍光物質（Ｂ）と分子認識物質（Ｃ）とが必ずしも直接結合させる必要がないため、容易に様々な標的物質に対する分子蛍光認識体を得ることができる。
また、本発明の分子認識蛍光体の分子認識物質（Ｃ）がＤＮＡである場合にはＤＮＡハイブリダイゼーションの定量的検出や、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ等のマイクロチップセンサーへも好適に用いることができる。
【００５６】
本発明の分子認識蛍光体は、分子認識物質（Ｃ）を選択することにより、種々の生体関連物質、環境関連物質等を標的物質として測定することができる。
本発明の分子認識蛍光体を用いる標的物質の測定方法もまた、本発明の１つである。
【００５７】
本発明の分子認識蛍光体を用いる標的物質の測定方法としては、例えば、本発明の分子認識蛍光体を含有する溶液中に被験液を加えて混合する工程１と、得られた混合液に励起光を照射する工程２と、励起光の照射により発生した蛍光の強度又は波長を測定する工程３とを有する方法が挙げられる。
例えば、標的物質が抗原である場合に、該抗原に対するポリクローナル抗体を分子認識物質（Ｃ）とした本発明の分子認識蛍光体を用いてこの測定方法により測定を行うと、抗原抗体反応により支持体が凝集する。凝集によって発光効率が減少することから、反応前後での蛍光の強度の変化を測定することにより標的物質の定量が可能となる。
【００５８】
また、本発明の分子認識蛍光体を用いる標的物質の測定方法としては、例えば、固相化された抗体又はレセプターに標的物質を結合させる工程１と、標的物質に本発明の分子認識蛍光体を結合させる工程２と、励起光を照射する工程３と、励起光の照射により発生した蛍光の強度又は波長を測定する工程４とを有する方法が挙げられる。
例えば、標的物質が抗原である場合に、該抗原に対する抗体が固定化されたプレートに標的物質（抗原）を含む被検液を添加し、余剰の成分を洗浄によって取り除いた後、該抗原に対する抗体を分子認識物質（Ｃ）とした本発明の分子認識蛍光体を添加し、余剰の分子認識蛍光体を洗浄によって除去した後、励起光を照射して蛍光を測定することで標的物質の定量が可能となる。
【００５９】
更に、本発明の分子認識蛍光体を用いる標的物質の測定方法としては、例えば、少なくとも一方が本発明の分子認識蛍光体であるドナー蛍光体とアクセプター蛍光体とを含む溶液中に被験液を加えて混合する工程１と、得られた混合液に励起光を照射する工程２と、励起光の照射により発生した蛍光の強度又は波長変化を測定する工程３とを有する方法が挙げられる。
この方法は蛍光エネルギー転移法と呼ばれる方法であり、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体からなる溶媒中でこれらの蛍光体が数ナノメートルのオーダーで接近することにより、励起されたドナー蛍光体の励起エネルギーがアクセプター蛍光体へ転移し、アクセプター蛍光体が発光する。この場合、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の発光色は異なるものを選択することが好ましい。
【００６０】
上記励起光としては特に限定されず、例えば、紫外線、可視光線、赤外線、放射線等が挙げられる。本発明の標的物質の測定方法においては、励起光の照射により発生した蛍光を時間分解測定してもよい。これにより更に高い感度での測定が可能になる。
【００６１】
本発明の標的物質の測定方法の測定対象となる標的物質としては、例えば、抗原、抗体、異常プリオン等のタンパク質；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ダイオキシン等の内分泌攪乱物質；ウイルス、ペプチド、金属イオン等が挙げられる。
【００６２】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００６３】
（実施例１）
スチレン６ｇ、メタクリル酸グリシジル１０．５ｇ及びジビニルベンゼン０．２ｇからなるモノマー混合物を水５５０ｇに窒素バブリングしながら回転速度２００ｒｐｍで分散させた。窒素フロー下で、アゾ系重合開始剤としてアゾビスアミジノプロパン２塩基塩０．３ｇを加え、７０℃で２４時間反応させ、有機化合物からなる支持体（Ａ−１）を作製した。得られた支持体（Ａ−１）の平均粒子径をＬｅｅｄ：ｓ＋ｎｏｒｔｈｒｕｐ社製ＭＩＣＲＯＴＲＡＣＵＰＡ１５０を用いて測定したところ２０３ｎｍ、粒度分布（ＣＶ）は１５％であった。また、粒子表面の帯電を示す指標であるゼータ電位をゼータ電位測定装置（日本ルフト社製、Ｍｏｄｅｌ５０２）を用いて測定したところ＋１３ｍＶであった。
この支持体（Ａ−１）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水で調整して支持体（Ａ−１）分散液を得た。
【００６４】
一方、蛍光物質（Ｂ−１）として、３６５ｎｍの励起光を照射することで５８０ｎｍの蛍光を発する、表面をメルカプトウンデカン酸で親水処理したコアシェル型ＣｄＳｅ／ＺｎＳ粒子を選択した。この蛍光物質（Ｂ−１）は、平均粒子径が約５ｎｍ、ゼータ電位が−４５mVであった。
この蛍光物質（Ｂ−１）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に分散して蛍光物質（Ｂ−１）分散液を調製した。
【００６５】
支持体（Ａ−１）分散液２００μＬに蛍光物質（Ｂ−１）分散液２０μＬをホモジナイザーで撹拌しながら添加し、支持体（Ａ−１）と蛍光物質（Ｂ−１）とを接合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除いた後、沈殿に精製水６００μＬを加え再分散した。この分散液に、分子認識物質（Ｃ）としてジフテリア抗原に対するポリクローナル抗体の溶液（２ｕｎｉｔ／ｍＬ）を１００μＬ添加し攪拌して混合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除いた後、沈殿に精製水６００μＬを加え再分散して分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００６６】
（実施例２）
スチレン５２ｇ、メタクリル酸フェニルジメチルスルホニウムメチル硫酸塩１．６７ｇからなるモノマー混合物を水２５０ｇに窒素バブリングしながら回転速度２００ｒｐｍで分散させた。窒素フロー下でアゾ系重合開始剤としてアゾビスアミジノプロパン２塩酸塩１．３５ｇを加え、６０℃で２４時間反応させ、有機化合物からなる支持体（Ａ−２）を作製した。得られた支持体（Ａ−２）について実施例１と同様にして測定したところ、平均粒子径は２５７ｎｍ、粒度分布（ＣＶ）は２０％：ゼータ電位は＋６３ｍＶであった。
得られた支持体（Ａ−２）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に懸濁させて支持体（Ａ−２）分散液を調製した。
得られた支持体（Ａ−２）分散液を用いた以外は実施例１と同様にして分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００６７】
（実施例３）
メタクリル酸メチル４８ｇ、ジメタクリル酸エチレングリコール１．９ｇ、メタクリル酸エチレントリメチルアンモニウム塩酸塩１．０ｇからなるモノマー混合物を水１０００ｇに窒素バブリングしながら回転速度２５０ｒｐｍで分散させた。窒素フロー下でアゾ系開始剤としてアゾビスアミジノプロパン２塩酸塩１．４ｇを加え、７０℃で２４時間反応させ、有機化合物からなる支持体（Ａ−３）を作製した。得られた支持体（Ａ−３）の平均粒子径は３１５ｎｍ、粒度分布（ＣＶ）は１１％、ゼータ電位は＋５７ｍＶであった。
得られた支持体（Ａ−３）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に懸濁させて支持体（Ａ−３）分散液を調製した。
得られた支持体（Ａ−３）分散液を用いた以外は実施例１と同様にして分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００６８】
（実施例４）
メタクリル酸グリシジル２４ｇ、ジメタクリル酸エチレングリコール０．９３ｇ、メタクリル酸エチレントリメチルアンモニウム塩酸塩０．４９ｇからなるモノマー混合物を水５００ｇに窒素バブリングしながら回転速度２５０ｒｐｍで分散させた。窒素フロー下でアゾ系開始剤としてアゾビスアミジノプロパン２塩酸塩０．６５ｇを加え、７０℃で２４時間反応させ、有機化合物からなる支持体（Ａ−４）を作製した。得られた支持体（Ａ−４）の平均粒子径は４９３ｎｍ、粒度分布（ＣＶ）は１５％、ゼータ電位は＋３９ｍＶであった。
得られた支持体（Ａ−４）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に懸濁させて支持体（Ａ−４）分散液を調製した。
得られた支持体（Ａ−４）分散液を用いた以外は実施例１と同様にして分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００６９】
（実施例５）
メタクリル酸グリシジル１５ｇ、ジメタクリル酸エチレングリコール０．５６ｇ、メタクリル酸エチレントリメチルアンモニウム塩酸塩０．１５ｇからなるモノマー混合物を水５００ｇに窒素バブリングしながら回転速度２５０ｒｐｍで分散させた。窒素フロー下でアゾ系開始剤としてアゾビスアミジノプロパン２塩酸塩０．３９ｇを加え、７０℃で２４時間反応させ、有機化合物からなる支持体（Ａ−５）を作製した。得られた支持体（Ａ−５）の平均粒子径は５１９ｎｍ、粒度分布（ＣＶ）は２０％、ゼータ電位は＋３０ｍＶであった。
得られた支持体（Ａ−５）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に懸濁させて支持体（Ａ−５）分散液を調製した。
得られた支持体（Ａ−５）分散液を用いた以外は実施例１と同様にして分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００７０】
（実施例６）
市販のポリスチレンを主成分とする微粒子（積水化学工業社製）を支持体（Ａ−６）とした。この支持体（Ａ−６）の平均粒子径は３０４ｎｍ、粒度分布（ＣＶ）は２％、ゼータ電位は−６８ｍＶであった。
得られた支持体（Ａ−６）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に懸濁させて支持体（Ａ−６）分散液を調製した。
【００７１】
一方、蛍光物質（Ｂ−２）として、３６５ｎｍの励起光を照射することで５８０ｎｍの蛍光を発する、表面をメルカプトウンデカン酸で親水処理したコアシェル型ＣｄＳｅ／ＺｎＳ粒子を選択した。この蛍光物質（Ｂ−２）は、平均粒子径が約５ｎｍ、ゼータ電位は＋３０ｍＶであった。
この蛍光物質（Ｂ−２）を固形分濃度０．１重量％となるように精製水に分散して蛍光物質（Ｂ−２）分散液を調製した。
【００７２】
支持体（Ａ−６）分散液２００μＬに蛍光物質（Ｂ−２）分散液２０μＬをホモジナイザーで撹拌しながら添加し、支持体（Ａ−６）と蛍光物質（Ｂ−２）とを接合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除いた後、沈殿に精製水６００μＬを加え再分散した。この分散液に、分子認識物質（Ｃ）としてジフテリア抗原に対するポリクローナル抗体の溶液（２ｕｎｉｔ／ｍＬ）を１００μＬ添加し攪拌して混合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除いた後、沈殿に精製水６００μＬを加え再分散して分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００７３】
実施例１〜６で作製した分子認識蛍光体の分散液に、５０００Ｌｆのジフテリア抗原１μＬを添加した。抗原の添加前及び添加２時間後に３６５ｎｍの紫外線を照射して分子認識蛍光体を励起させて発現した蛍光の波長及び強度を日本分光社製ＦＰ−６５００を用いて測定した。なお、蛍光の強度は抗原添加前の分子認識蛍光体の分散液の場合を１００とした。
また、実施例１〜６で作製した分子認識蛍光体の水分散液を４℃、２４時間保存した後、水分散液の状態を観察したが、凝集等の発生は認められなかった。更に、保存後の水分散液に同様にしてジフテリア抗原を添加し、２時間後に３６５ｎｍの紫外線を照射して分子認識蛍光体を励起させて発現した蛍光の波長及び強度を日本分光社製ＦＰ−６５００を用いて測定した。
結果を表１に示した。
【００７４】
【表１】

【００７５】
表１から、いずれの実施例で得られた分子認識蛍光体の水分散液も、抗原を添加することで蛍光強度が減少していることから、抗原の検出が可能であることがわかった。
【００７６】
（比較例１）
精製水２００μＬに実施例１で用いた蛍光物質（Ｂ）の分散液２０μＬをホモジナイザーで攪拌しながら添加した。これに実施例１と同様にジフテリア抗体を加え攪拌した後、精製水４００μＬを加えた。その後、更にジフテリア抗原１μＬを添加した。
実施例１と同様の方法により蛍光強度を測定したところ、抗原添加前と抗原添加２時間後とでは蛍光強度の変化は認められなかった。
これより、支持体（Ａ）を有しない場合には、抗原の検出ができないことがわかった。
【００７７】
（実施例７）
実施例１で調製した支持体（Ａ−１）分散液２００μＬに実施例１で調製した蛍光物質（Ｂ−１）分散液２０μＬをホモジナイザーで撹拌しながら添加し、支持体（Ａ−１）と蛍光物質（Ｂ−１）とを接合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除き、沈殿に１％アジ化ナトリウム水溶液６００μＬを加え、再分散した後、３６５ｎｍの励起光を３万秒間照射した。この分散液に、分子認識物質（Ｃ）としてジフテリア抗原に対するポリクローナル抗体の溶液（２ｕｎｉｔ／ｍＬ）を１００μＬ添加し攪拌して混合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除いた後、沈殿に精製水６００μＬを加え再分散して分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００７８】
（実施例８）
実施例１で調製した支持体（Ａ−１）分散液２００μＬに実施例１で調製した蛍光物質（Ｂ−１）分散液２０μＬをホモジナイザーで撹拌しながら添加し、支持体（Ａ−１）と蛍光物質（Ｂ−１）とを接合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除き、沈殿に０．１％ピロール水溶液６００μＬを加え、再分散した後、３６５ｎｍの励起光を３万秒間照射した。この分散液に、分子認識物質（Ｃ）としてジフテリア抗原に対するポリクローナル抗体の溶液（２ｕｎｉｔ／ｍＬ）を１００μＬ添加し攪拌して混合した。遠心分離（６５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により接合体を沈殿し、上澄み液を除いた後、沈殿に精製水６００μＬを加え再分散して分子認識蛍光体の水分散液を得た。
【００７９】
実施例７、８で作製した分子認識蛍光体の分散液に、５０００Ｌｆのジフテリア抗原１μＬを添加した。抗原の添加前及び添加２時間後に３６５ｎｍの紫外線を照射して分子認識蛍光体を励起させて発現した蛍光の波長及び強度を日本分光社製ＦＰ−６５００を用いて測定した。なお、蛍光の強度は抗原添加前の分子認識蛍光体の分散液の場合を１００とした。
結果を表２に示した。
【００８０】
【表２】

【００８１】
表２より、蛍光強度向上剤としてアジ化ナトリウム又はピロールを併用した場合には、これらを併用しなかった実施例１で作製した分子認識蛍光体に比べて著しく蛍光強度が向上することがわかった。
【００８２】
【発明の効果】
本発明によれば、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に用いられる分子認識蛍光体及びそれを用いた標的物質の測定方法を提供できる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a molecule-recognizing phosphor used in a highly sensitive measurement method for target substances such as biologically relevant substances and environment-related substances, and a method for measuring target substances using the same.
[0002]
[Prior art]
As a method for measuring biologically related substances such as antigens, antibodies, DNA, and environment-related substances such as dioxin with high sensitivity, molecular recognition phosphors in which molecular recognition phosphors are bound to marker substances such as fluorescent substances are used. . However, conventionally used fluorescent materials have a problem of short sensitivity and fluorescence lifetime.
[0003]
On the other hand, in recent years, inorganic ultrafine particles (hereinafter also referred to as inorganic nanoparticles) have attracted attention as fluorescent substances that can be used for highly sensitive marker substances. Inorganic nanoparticles are characterized by high fluorescence intensity and a narrow half-width of the fluorescence spectrum, that is, sharp fluorescence. Inorganic nanoparticles are semiconductor ultrafine particles (ultrafine crystals) having a particle diameter equivalent to the excited particle Bohr radius in the bulk crystal, and the optical spectrum, that is, the absorption spectrum and the fluorescence spectrum are changed depending on the particle diameter by the manifestation of the quantum confinement effect. It is possible to adjust. That is, light having different wavelengths can be emitted depending on the particle diameter.
[0004]
In order to use inorganic nanoparticles as a molecular recognition phosphor, it is necessary to bond the inorganic nanoparticles and the molecule recognition phosphor. For example, Non-Patent Document 1 discloses a method of bonding a molecular recognition phosphor to inorganic nanoparticles directly or via a protein such as avidin. However, such a molecule-recognizing phosphor has a problem that the manufacturing method is complicated, and even if the target substance is measured using the phosphor, the reaction cannot be reproduced with a slight difference in conditions. In addition, the molecule-recognized phosphor obtained by joining inorganic nanoparticles and the molecule-recognized phosphor has a problem that it has poor dispersion stability and tends to aggregate.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
phys. stat. sol. (B) 229, 407 (2002)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above situation, the present invention aims to provide a molecule-recognized phosphor used in a high-sensitivity measurement method for target substances such as biological substances and environment-related substances, and a method for measuring a target substance using the same. .
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention 1 includes a support (A) composed of an inorganic compound and / or an organic compound, a fluorescent material (B) physically and / or chemically bonded to the surface of the support (A), It is a molecular recognition phosphor characterized by comprising a molecular recognition substance (C) physically and / or chemically bonded to the surface of the support (A).
[0008]
The present invention 2 comprises a support (A) comprising an inorganic compound and / or an organic compound, a fluorescent material (B) physically and / or chemically bonded to the surface of the support (A), A molecular recognition phosphor characterized by comprising a molecular recognition material (C) physically and / or chemically bonded to the surface of the fluorescent material (B).
[0009]
The present invention 3 includes a support (A) composed of an inorganic compound and / or an organic compound, a fluorescent material (B) physically and / or chemically bonded to the surface of the support (A), and the support. A coating layer (D) that covers a joined body of (A) and the fluorescent material (B), and a molecular recognition substance (physically and / or chemically bonded to the surface of the coating layer (D)). A molecular recognition phosphor characterized by comprising C).
The present invention is described in detail below.
[0010]
The molecular recognition phosphor of the present invention 1 comprises a support (A), a fluorescent material (B), and a molecular recognition material (C).
Especially as said support body (A), if the said fluorescent substance (B) and / or molecular recognition substance (C) can be joined, and the fluorescence emission of the said fluorescent substance (B) is not inhibited especially It is not limited, For example, inorganic compounds, such as glass and a silica, organic compounds, such as resin, organic-inorganic composite material, etc. are mentioned.
[0011]
The organic compound constituting the support (A) is not particularly limited, and examples thereof include (un) saturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, (un) saturated aliphatics, aromatic carboxylic acids, and (unsaturated) aliphatic ketones. , Aromatic ketones, (un) saturated alcohols, aromatic alcohols, (un) saturated amines, aromatic amines, (un) saturated thiols, aromatic thiols, organosilicon compounds, derivatives thereof, and one or more of these compounds And a polymer composed of one or more of these compounds. The above (unsaturated) means both saturated and unsaturated.
[0012]
Examples of the condensate and polymer include polyolefins such as polyethylene and polybutadiene; polyethers such as polyethylene glycol and polypropylene glycol; polystyrene, poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylic acid ester, polyvinyl alcohol, and polyvinyl ester. , Phenol resin, melamine resin, allyl resin, furan resin, polyester, epoxy resin, silicone resin, polyimide resin, polyurethane, polytetrafluoroethylene, acrylonitrile / styrene resin, styrene / butadiene resin, ABS resin, vinyl resin, polyamide resin, Polycarbonate, polyacetal, polyethersulfone, polyphenylene oxide, sugar, starch, cellulose, polypeptide, polyamide, polyethylene terephthalate DOO, polysulfone, polyacetal, polyimide, polyamide-imide, polyether ether ketone, benzoguanamine resins. These may be used alone or in combination of two or more.
[0013]
Moreover, it does not specifically limit as a polymerizable monomer used in order to obtain the said polymer, For example, olefins, such as ethylene, propylene, butylene, and methylpentene, and its derivative; Styrene, (alpha) -methylstyrene, p-methyl Styrene derivatives such as styrene, p-chlorostyrene, divinylbenzene, chloromethylstyrene; vinyl fluoride; vinyl chloride; vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate; unsaturated nitriles such as acrylonitrile; (meth) acrylic acid Methyl, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, ethylene glycol (meth) acrylate, trifluoroethylene (meth) acrylate, pentafluoro Propyl (meth) acryl Over DOO, cyclohexyl (meth) (meth) acrylic acid ester derivatives such as acrylate; dicarboxylic acids such as phthalic acid, diallyl phthalate; benzoguanamine; triallyl isocyanate. These polymerizable monomers may be used alone or in combination of two or more.
[0014]
It does not specifically limit as an organic-inorganic composite material which comprises the said support body (A), For example, what mixed inorganic compounds, such as glass and a silica, with the said organic compound etc. are mentioned.
Commercially available products may be used or synthesized as the inorganic compound, organic compound, organic / inorganic composite material, etc. constituting the support (A).
[0015]
The support (A) preferably has a positive or negative charge. By having a positive or negative charge, for example, when the support (A) has a positive charge, the support (A) has a fluorescent substance (B) having a negative charge. When the negatively charged fluorescent material (B) having a positive charge is used, the support (A) and the fluorescent material (B) can be joined by electrostatic attraction. .
[0016]
Examples of a method of charging the support (A) with a positive or negative charge include, for example, a method in which a polymerization monomer having a positive or negative charge is mixed during the production of the support (A), a positive or negative charge Examples thereof include a method of polymerizing with a radical initiator having a charge, a method using a dispersion stabilizer or an emulsifier having a positive or negative charge, and the like. Among these, a method in which a polymerization monomer having a positive or negative charge is mixed, and a method using a dispersion stabilizer or an emulsifier having a positive or negative charge are preferable.
[0017]
Examples of the positively charged polymerizable monomer include N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropylacrylamide, N, N, N-trimethyl-N-2-methacryloyloxyethylammonium. Examples thereof include ammonium group-containing monomers such as chloride, and monomers having a sulfonium group such as phenyldimethylsulfonium methylsulfate methacrylate.
Examples of the radical initiator having a positive charge include 2,2′-azobis {2-methyl-N- [2- (1-hydroxy-butyl)]-propionamide}, 2,2′-azobis [ 2- (2-imidazolin-2-yl) propane], 2,2′-azobis (2-amidinopropane) and salts thereof.
[0018]
Examples of the polymerizable monomer having a negative charge include acrylic acid, methacrylic acid, styrene, and vinylbenzene sulfonic acid.
[0019]
The shape of the support (A) used in the present invention is not particularly limited, but preferably has at least one shape selected from the group consisting of fine particles, substrates, thin films, fibers, and hollow fibers, depending on the purpose. You can choose the right one.
Of these, fine particles are particularly preferable. When the support (A) is a fine particle, it can be stably dispersed in water or an organic solvent, and the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) can be uniformly bonded.
[0020]
The preferable lower limit of the particle diameter of the fine particles is 5 nm, and the preferable upper limit is 50 μm. When it is less than 5 nm, it is difficult to precipitate by centrifugation, so when bonding the support (A) to the fluorescent substance (B) or the molecular recognition substance (C), the unconjugated fluorescent substance (B) or molecule It becomes difficult to remove the recognition substance (C). When it exceeds 50 μm, the dispersion stability is lowered, and aggregation tends to occur. A more preferable lower limit is 10 nm, and a more preferable upper limit is 5 μm. .
[0021]
The CV value of the fine particles is preferably 20% or less. If it exceeds 20%, the particle diameter of the molecular recognition phosphor after joining the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) also becomes non-uniform, and it may be difficult to uniformly disperse the molecular recognition phosphor. . The CV value of the fine particles can be calculated by the following formula.
CV value of particle diameter (%) = standard deviation of particle diameter / average particle diameter × 100
As a method for measuring the CV value, before the fluorescent substance (B) or the molecular recognition substance (C) is bonded, it can be measured by a particle size distribution diameter or the like, but the fluorescent substance (B) or the molecular recognition substance (C) is bonded. Then, it can be measured by image analysis of SEM photographs.
[0022]
The method for producing the fine particles is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Examples include a mini-emulsion polymerization method, an emulsion polymerization method, a phase inversion emulsion polymerization, a microsuspension polymerization method, a suspension polymerization method, a dispersion polymerization method, a seed polymerization method, and a soap-free precipitation polymerization method. Among these, a soap-free precipitation polymerization method excellent in controllability of the particle diameter is preferably used.
[0023]
The fluorescent substance (B) is not particularly limited, and any organic compound or inorganic compound can be used. Among these, the fluorescent substance (B) made of an inorganic compound can be suitably used because it has sharp fluorescence and high stability.
Examples of the organic compound that can be used as the fluorescent substance (B) include proteins such as luciferase, fluorescein isothiocyanate (FITC) represented by the following formula (1), rhodamine, and the like.
[0024]
[Chemical 1]

[0025]
The inorganic compound that can be used as the fluorescent substance (B) is not particularly limited as long as it is a fluorescent substance composed of a metal element of Group 3 to 16, for example, rare earth compounds such as europium, terbium, samarium, dysprosium, Examples thereof include inorganic fluorescent particles made of chalcogen compounds such as cadmium and zinc, and organometallic compounds of group 3-16 metal elements.
Examples of the organometallic compound include bis (8-hydroxyquinoline) zinc, tris (dibenzoylmethane) -mono (phenanthyroline) europium (III), tris (2-phenylpyridine) iridium, and tris (8-hydroxy). Quinoline) aluminum (III), tris (8-hydroxyquinoline) gallium (III) and the like.
Examples of the inorganic fluorescent particles include BaMgAl. ₁₀ O ₁₇ Eu, Y ₂ O ₃ Eu, (Y, Gd) BO ₃ Eu, CdS, CdSe, etc. are mentioned.
Further, as these composite materials, for example, CdS is core-CdSe shell, CdSe is core-CdS shell, CdS is core-ZnS shell, CdSe is core-ZnS shell, CdSe nanocrystal is core- Examples include those having a core-shell structure in which ZnS is a shell and CdSe nanocrystals are core-ZnSe as a shell.
Especially, as said fluorescent substance (B), the said inorganic fluorescent particle is preferable.
These fluorescent substances (B) may be used alone or in combination of two or more.
[0026]
The surface of the inorganic fluorescent particles may be chemically or physically modified, and may be added with additives such as a surfactant, a dispersion stabilizer, or an antioxidant. By adding such a surfactant and / or surface modification, the dispersibility of the inorganic fluorescent particles can be improved.
[0027]
Although it does not specifically limit as a particle diameter of the said inorganic fluorescent particle, Usually, a preferable minimum is 0.5 nm and a preferable upper limit is 100 nm. Within this range, sufficient fluorescence intensity and dispersion stability can be obtained. A more preferred lower limit is 1 nm, a more preferred upper limit is 50 nm, and a still more preferred upper limit is 10 nm.
[0028]
The fluorescent substance (B) may be one in which the inorganic fluorescent particles are surface-modified with an organic compound having a nonpolar functional group and / or a polar functional group. When the fluorescent substance (B) has such a structure, dispersibility and dispersion stability in water or an organic solvent are improved. Further, in addition to suppressing aggregation of the fluorescent substance (B) due to repulsion of charges between the functional groups, it can be physically and / or chemically bonded to the support (A) via the functional groups. .
Examples of the organic compounds having nonpolar and / or polar functional groups include octanethiol, trioctylphosphine, trioctylphosphine oxide, mercaptophenol, mercaptopropionic acid, mercaptoundecanoic acid, aminopropanethiol and the like.
[0029]
The fluorescent material (B) preferably has a positive or negative charge. By having a positive or negative charge, for example, the support (A) and the fluorescent material (B) can be bonded by electrostatic attraction. Moreover, since fluorescent substance (B) repels electrostatically, it can prevent that fluorescent substance (B) overlaps and couple | bonds with a support body (A).
[0030]
Examples of a method for charging the fluorescent substance (B) with a positive or negative charge include, for example, a method using a material having a positive or negative charge for the fluorescent substance (B) or a surface modifier having a positive or negative charge. And the like. When the fluorescent substance (B) is composed of inorganic fluorescent particles and an organic compound having a polar functional group, the fluorescent substance (B) can be easily added to the fluorescent substance (B) by using an organic compound having a positive or negative charge. Alternatively, a negative charge can be charged. Specifically, for example, mercaptopropionic acid, mercaptoundecanoic acid or the like is used when charging a negative charge, and aminopropanethiol or the like is used when charging a positive charge.
[0031]
The molecular recognition substance (C) is not particularly limited as long as it specifically reacts with the target substance, but is not limited to proteins such as antigens and antibodies, nucleic acids such as DNA and RNA, and cyclic compounds such as cyclodextrins and crown ethers. Is mentioned.
[0032]
In the molecular recognition phosphor of the first aspect of the present invention, the support (A) and the fluorescent material (B) are physically and / or chemically bonded, and the support (A) and the molecular recognition material are combined. (C) is physically and / or chemically bonded.
The mode of joining the support (A) and the fluorescent substance (B) is not particularly limited, and examples include a mode of joining by hydrophobic interaction, hydrophilic interaction, electrostatic attraction, chemical bond, and the like. . This bonding mode can be arbitrarily selected depending on the materials and surface functional groups of the support (A) and the fluorescent substance (B).
[0033]
Moreover, as a case where the said support body (A) and fluorescent substance (B) are joined by a chemical bond, the particle | grains which have an amino group on the surface are used as a support body (A), and the fluorescence which has a carboxylic acid group on the surface, for example. By using the substance (B), bonding can be performed by a covalent bond (amide bond).
[0034]
The mode of bonding between the support (A) and the molecular recognition substance (C) is not particularly limited, and examples include a mode of bonding by hydrophobic interaction, hydrophilic interaction, electrostatic attraction, chemical bonding, and the like. It is done. For example, when polystyrene is used as the support (A) and protein is used as the molecular recognition substance (C), the support (A) and the molecular recognition substance are caused by the hydrophobic interaction between the hydrophobic part of the protein and the hydrophobic part of polystyrene. (C) can be joined.
[0035]
The order in which the support (A) and the fluorescent substance (B) are joined and the support (A) and the molecular recognition substance (C) are joined is not particularly limited. The molecular recognition substance (C) may be bonded after bonding the fluorescent substance (B) to the support (A), and the fluorescent substance (B) after bonding the molecular recognition substance (C) to the support (A). ), Or the fluorescent material (B) and the molecular recognition material (C) may be bonded to the support (A) at the same time.
[0036]
The method for joining the support (A) and the fluorescent substance (B) and the method for joining the support (A) and the molecular recognition substance (C) are not particularly limited. In the solution in which A) is dispersed, the fluorescent substance (B) is added as it is or a dispersion solution of the fluorescent substance (B) is added and mixed, and then the molecular recognition substance (C) is added as it is or the molecular recognition substance ( And a method of adding and mixing the dispersion liquid of C). The fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) that have not been joined can be removed, for example, by an operation such as centrifugation.
[0037]
When joining the said support body (A) and a fluorescent substance (B) and the said support body (A) and a molecule | numerator recognition substance (C), you may add the substance which accelerates | stimulates joining. For example, the addition of a condensing reagent can facilitate the chemical binding of the protein amino groups to the support.
[0038]
The light emitting device of the present invention preferably further contains a fluorescence intensity improver (E). By containing the fluorescence intensity improver (E), the fluorescence intensity can be dramatically improved. Thereby, when used for a plasma display panel, an image with high luminance is obtained, and when used for a marker substance, high sensitivity is obtained.
In addition, by containing the fluorescent intensity improver (E), it is possible to control the blinking of the quantum dots to suppress the occurrence of blinking, and when used in a plasma display panel, the image flickers, or the marker When used for a substance, it is possible to prevent the sensitivity from varying. Here, blinking means that the fluorescence intensity fluctuates to increase or decrease.
[0039]
The fluorescence intensity improver (E) comprises sodium azide and / or an electron donor.
The electron donor is not particularly limited, but a hydrophilic compound is preferable, and among them, pyrrole (C ₄ H ₅ N), at least one selected from the group consisting of ascorbic acid and tetramethylammonium boride is preferred.
These sodium azide and electron donor may be used alone or in combination of two or more.
[0040]
The method for incorporating the fluorescent intensity improver (E) into the molecular recognition phosphor of the present invention 1 is not particularly limited. In the support (A), the fluorescent substance (B), or the molecular recognition substance (C). Or may be adsorbed on these surfaces, or dissolved in an aqueous solution in which the molecular recognition phosphor comprising the support (A), the fluorescent material (B) and the molecular recognition material (C) is dispersed. May be.
[0041]
When the fluorescent intensity improver (E) is used by dissolving in an aqueous solution, the preferable lower limit of the concentration of the fluorescent intensity improver (E) is 0.001% by weight, and the preferable upper limit is 30% by weight. If it is less than 0.001% by weight, a sufficient effect of improving fluorescence intensity may not be obtained. If it exceeds 30% by weight, the fluorescent substance (B) and the support (A) are aggregated, and the fluorescence intensity is increased. May decrease. Sometimes.
[0042]
The molecular recognition phosphor of the present invention 2 comprises a support (A), a fluorescent substance (B), and a molecular recognition substance (C). As said support body (A), fluorescent substance (B), and molecular recognition substance (C), the thing similar to the molecular recognition fluorescent substance of this invention 1 can be used.
In the molecular recognition phosphor of the present invention 2, the support (A) and the fluorescent substance (B) are physically and / or chemically joined, and the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) Are physically and / or chemically bonded.
[0043]
The mode of joining the support (A) and the fluorescent material (B) in the molecular recognition phosphor of the present invention 2 is the same as the joining of the support (A) and the fluorescent material (B) in the molecular recognition phosphor of the present invention 1. This is the same as the embodiment.
There are no particular limitations on the mode of bonding between the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) in the molecular recognition phosphor of the present invention 2. For example, hydrophobic interaction, hydrophilic interaction, electrostatic attraction, chemistry A mode of joining by bonding or the like is mentioned. For example, when the fluorescent substance (B) is a core-shell type CdSe / ZnS, when a fragmented antibody is used as the molecular recognition substance (C), the SH group of the molecular recognition substance (C) and the fluorescent substance (B) ZnS can form an S—S bond. Further, when the fluorescent substance (B) has an amino acid on its surface, an amide bond can be formed with the carboxylic acid group of the molecular recognition substance (C) made of protein.
[0044]
The order in which the support (A) and the fluorescent substance (B) are joined and the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) are joined is not particularly limited. The molecular recognition substance (C) may be bonded after bonding the fluorescent substance (B) to the support (A), and the support (A) after bonding the molecular recognition substance (C) to the fluorescent substance (B). The support (A) and the fluorescent substance (B), and the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) may be joined at the same time.
[0045]
The method for joining the support (A) and the fluorescent substance (B) and the method for joining the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) are not particularly limited. In the solution in which A) is dispersed, the fluorescent substance (B) is added as it is or a dispersion solution of the fluorescent substance (B) is added and mixed, and then the molecular recognition substance (C) is added as it is or the molecular recognition substance ( And a method of adding and mixing the dispersion liquid of C). The fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) that have not been joined can be removed, for example, by an operation such as centrifugation.
Further, at the time of bonding, a substance that promotes bonding, such as a condensation reagent, may be added.
[0046]
The molecule-recognizing phosphor of the present invention 2 preferably further contains a fluorescence intensity improver (E). About the said fluorescence intensity improving agent (E), it is the same as that of the molecule | numerator recognition fluorescent substance of this invention 1.
[0047]
The molecular recognition phosphor of the present invention 3 comprises a support (A), a fluorescent material (B), a molecular recognition material (C), and a coating layer (D). As said support body (A), fluorescent substance (B), and molecular recognition substance (C), the thing similar to the molecular recognition fluorescent substance of this invention 1 can be used.
As said coating layer (D), what consists of an inorganic compound and an organic compound similar to the said support body (A) can be used. The said coating layer (D) may consist of the same thing as the said support body (A), and may consist of a different thing.
[0048]
In the molecular recognition phosphor of the present invention 3, the support (A) and the fluorescent material (B) are physically and / or chemically bonded, and the bonded support (A) and the fluorescent material (B) are bonded to each other. Is covered with a coating layer (D), and the coating layer (D) and the molecular recognition substance (C) are physically and / or chemically bonded.
[0049]
The mode of joining the support (A) and the fluorescent substance (B) in the molecular recognition phosphor of the present invention 3 is the same as the joining of the support (A) and the fluorescent substance (B) in the molecular recognition phosphor of the first invention. This is the same as the embodiment.
[0050]
The coating layer (D) covers the joined body of the support (A) and the fluorescent material (B). Thereby, the fall of the fluorescence intensity by peeling off of a fluorescent substance (B), oxidation deterioration, etc. can be suppressed. In addition, when it is difficult to join both the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) to the support (A), after the fluorescent substance (B) is joined to the support (A), the molecular recognition substance By forming the coating layer (D) in which (C) is easy to bond, a molecular recognition phosphor can be obtained efficiently.
[0051]
The method for forming the coating layer (D) is not particularly limited. For example, when the coating layer (D) is made of silica, a sol for the bonded body of the support (A) and the fluorescent material (B) is used. -The method etc. which form a coating layer (D) by gel reaction are mentioned. When the coating layer (D) is made of a resin, a monomer and a polymerization initiator are added to a solution containing a joined body of the support (A) and the fluorescent material (B), and the support (A) And a method in which a polymerization reaction is performed in the presence of a conjugate of a fluorescent substance (B).
[0052]
In the molecular recognition phosphor of the third aspect of the present invention, the bonding mode between the coating layer (D) and the molecular recognition substance (C) is not particularly limited. For example, hydrophobic interaction, hydrophilic interaction, electrostatic attraction, chemistry A mode of joining by bonding or the like is mentioned. For example, when polystyrene is used as the coating layer (D) and protein is used as the molecular recognition substance (C), the coating layer (D) and the molecular recognition substance are formed by hydrophobic interaction between the hydrophobic part of the protein and the hydrophobic part of polystyrene. (C) can be joined.
[0053]
The molecular recognition phosphor of the third aspect of the invention preferably further contains a fluorescent intensity improver (E). About the said fluorescence intensity improving agent (E), it is the same as that of the molecule | numerator recognition fluorescent substance of this invention 1.
[0054]
The method for producing the molecule-recognizing phosphor of the present invention 3 is not particularly limited. For example, after bonding the fluorescent material (B) to the support (A), the coating layer (D) is formed on the surface, and then Furthermore, the method etc. which join a molecular recognition substance (C) to a coating layer (D) are mentioned.
In joining, a substance that promotes joining, such as a condensation reagent, may be added.
[0055]
The molecule-recognizing fluorescent substance of the present invention can be very easily produced by having the above-described configuration. Moreover, since the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) are joined to the support (A), the molecular recognition fluorescent substance of the present invention can suppress aggregation of the fluorescent substance (B). Therefore, for example, when the support (A) is in the form of fine particles and dispersed in a solvent, if the support (A) has sufficient dispersion stability, the molecular recognition phosphor of the present invention is conventionally High dispersion stability compared to the above. Aggregates generated when the dispersibility is low and non-aggregates have different activities on the target substance, so a large amount of aggregates may cause a decrease in reproducibility. Show very stable and highly reproducible results. Furthermore, since the fluorescent substance (B) and the molecular recognition substance (C) do not necessarily have to be directly bonded, molecular fluorescent recognition bodies for various target substances can be easily obtained.
Further, when the molecular recognition substance (C) of the molecular recognition phosphor of the present invention is DNA, it can be suitably used for quantitative detection of DNA hybridization and microchip sensors such as DNA chips and DNA microarrays. .
[0056]
The molecule-recognizing phosphor of the present invention can measure various biologically-related substances, environment-related substances and the like as target substances by selecting the molecular recognition substance (C).
The method for measuring a target substance using the molecular recognition phosphor of the present invention is also one aspect of the present invention.
[0057]
As a method for measuring a target substance using the molecule-recognized phosphor of the present invention, for example, a step 1 in which a test solution is added to a solution containing the molecule-recognized phosphor of the present invention and mixed, and the resulting mixture is excited The method which has the process 2 which irradiates light, and the process 3 which measures the intensity | strength or wavelength of the fluorescence which generate | occur | produced by irradiation of excitation light is mentioned.
For example, when the target substance is an antigen and a measurement is performed by this measurement method using the molecular recognition phosphor of the present invention in which a polyclonal antibody against the antigen is a molecular recognition substance (C), a support is obtained by an antigen-antibody reaction. Agglomerate. Since the luminous efficiency decreases due to aggregation, the target substance can be quantified by measuring the change in fluorescence intensity before and after the reaction.
[0058]
The target substance measurement method using the molecule-recognized phosphor of the present invention includes, for example, step 1 of binding the target substance to an immobilized antibody or receptor, and the molecule-recognized phosphor of the present invention as a target substance. Examples include a method including a step 2 of combining, a step 3 of irradiating excitation light, and a step 4 of measuring the intensity or wavelength of fluorescence generated by irradiation of excitation light.
For example, when the target substance is an antigen, a test solution containing the target substance (antigen) is added to a plate on which the antibody against the antigen is immobilized, and excess components are removed by washing, and then the antibody against the antigen After adding the molecular recognition phosphor of the present invention with the molecular recognition substance (C) as the molecular recognition substance and removing the excess molecular recognition phosphor by washing, the target substance is quantified by measuring the fluorescence by irradiating excitation light. It becomes possible.
[0059]
Furthermore, as a method for measuring a target substance using the molecular recognition phosphor of the present invention, for example, a test solution is added to a solution containing at least one of the donor fluorescent substance and the acceptor fluorescent substance that is the molecular recognition phosphor of the present invention. And a step 2 of irradiating the obtained mixed solution with excitation light, and a step 3 of measuring the intensity or wavelength change of the fluorescence generated by the irradiation of the excitation light.
This method is called a fluorescence energy transfer method, and the excitation energy of the excited donor phosphor is obtained by approaching these phosphors on the order of several nanometers in a solvent composed of a donor phosphor and an acceptor phosphor. Is transferred to the acceptor phosphor, and the acceptor phosphor emits light. In this case, it is preferable to select different emission colors for the donor phosphor and the acceptor phosphor.
[0060]
The excitation light is not particularly limited, and examples thereof include ultraviolet light, visible light, infrared light, and radiation. In the target substance measurement method of the present invention, fluorescence generated by irradiation with excitation light may be time-resolved. This allows measurement with higher sensitivity.
[0061]
Examples of the target substance to be measured by the target substance measurement method of the present invention include proteins such as antigens, antibodies and abnormal prions; nucleic acids such as DNA and RNA; endocrine disrupting substances such as dioxins; viruses, peptides and metal ions. Etc.
[0062]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0063]
Example 1
A monomer mixture composed of 6 g of styrene, 10.5 g of glycidyl methacrylate and 0.2 g of divinylbenzene was dispersed in 550 g of water at a rotational speed of 200 rpm while bubbling nitrogen. Under a nitrogen flow, 0.3 g of azobisamidinopropane dibasic salt as an azo polymerization initiator was added and reacted at 70 ° C. for 24 hours to prepare a support (A-1) made of an organic compound. When the average particle diameter of the obtained support (A-1) was measured using MICROTRAC UPA150 manufactured by Lee: s + northrup, it was 203 nm and the particle size distribution (CV) was 15%. Further, the zeta potential, which is an index indicating the charge on the particle surface, was measured using a zeta potential measuring device (Model 502, manufactured by Nippon Luft Co.), and found to be +13 mV.
This support (A-1) was adjusted with purified water to a solid content concentration of 0.1% by weight to obtain a support (A-1) dispersion.
[0064]
On the other hand, as the fluorescent material (B-1), core-shell type CdSe / ZnS particles that emit fluorescence of 580 nm by irradiating with excitation light of 365 nm and whose surface was hydrophilized with mercaptoundecanoic acid were selected. This fluorescent substance (B-1) had an average particle diameter of about 5 nm and a zeta potential of −45 mV.
This fluorescent substance (B-1) was dispersed in purified water so as to have a solid content concentration of 0.1% by weight to prepare a fluorescent substance (B-1) dispersion.
[0065]
20 μL of the fluorescent substance (B-1) dispersion was added to 200 μL of the support (A-1) dispersion while stirring with a homogenizer, and the support (A-1) and the fluorescent substance (B-1) were joined. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and 600 μL of purified water was added to the precipitate for redispersion. To this dispersion, 100 μL of a polyclonal antibody solution (2 units / mL) against diphtheria antigen as a molecular recognition substance (C) was added and mixed with stirring. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and then 600 μL of purified water was added to the precipitate and redispersed to obtain an aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor.
[0066]
(Example 2)
A monomer mixture composed of 52 g of styrene and 1.67 g of phenyldimethylsulfonium methylsulfate methacrylate was dispersed in 250 g of water at a rotational speed of 200 rpm while bubbling nitrogen. Under a nitrogen flow, 1.35 g of azobisamidinopropane dihydrochloride as an azo polymerization initiator was added and reacted at 60 ° C. for 24 hours to prepare a support (A-2) composed of an organic compound. The obtained support (A-2) was measured in the same manner as in Example 1. As a result, the average particle size was 257 nm, the particle size distribution (CV) was 20%, and the zeta potential was +63 mV.
The obtained support (A-2) was suspended in purified water to a solid content concentration of 0.1% by weight to prepare a support (A-2) dispersion.
An aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor was obtained in the same manner as in Example 1 except that the obtained support (A-2) dispersion was used.
[0067]
(Example 3)
A monomer mixture consisting of 48 g of methyl methacrylate, 1.9 g of ethylene glycol dimethacrylate, and 1.0 g of ethylene trimethylammonium methacrylate was dispersed in 1000 g of water at a rotational speed of 250 rpm while bubbling nitrogen. Under a nitrogen flow, 1.4 g of azobisamidinopropane dihydrochloride as an azo initiator was added and reacted at 70 ° C. for 24 hours to prepare a support (A-3) made of an organic compound. The average particle diameter of the obtained support (A-3) was 315 nm, the particle size distribution (CV) was 11%, and the zeta potential was +57 mV.
The obtained support (A-3) was suspended in purified water to a solid content concentration of 0.1% by weight to prepare a support (A-3) dispersion.
An aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor was obtained in the same manner as in Example 1 except that the obtained support (A-3) dispersion was used.
[0068]
(Example 4)
A monomer mixture consisting of 24 g of glycidyl methacrylate, 0.93 g of ethylene glycol dimethacrylate, and 0.49 g of ethylene trimethylammonium methacrylate was dispersed in 500 g of water at a rotational speed of 250 rpm while bubbling nitrogen. Under a nitrogen flow, 0.65 g of azobisamidinopropane dihydrochloride as an azo initiator was added and reacted at 70 ° C. for 24 hours to prepare a support (A-4) made of an organic compound. The average particle diameter of the obtained support (A-4) was 493 nm, the particle size distribution (CV) was 15%, and the zeta potential was +39 mV.
The obtained support (A-4) was suspended in purified water to a solid content concentration of 0.1% by weight to prepare a support (A-4) dispersion.
An aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor was obtained in the same manner as in Example 1 except that the obtained support (A-4) dispersion was used.
[0069]
(Example 5)
A monomer mixture consisting of 15 g of glycidyl methacrylate, 0.56 g of ethylene glycol dimethacrylate, and 0.15 g of ethylene trimethylammonium methacrylate was dispersed in 500 g of water at a rotational speed of 250 rpm while bubbling nitrogen. Under a nitrogen flow, 0.39 g of azobisamidinopropane dihydrochloride as an azo initiator was added and reacted at 70 ° C. for 24 hours to prepare a support (A-5) made of an organic compound. The average particle diameter of the obtained support (A-5) was 519 nm, the particle size distribution (CV) was 20%, and the zeta potential was +30 mV.
The obtained support (A-5) was suspended in purified water to a solid content concentration of 0.1% by weight to prepare a support (A-5) dispersion.
An aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor was obtained in the same manner as in Example 1 except that the obtained support (A-5) dispersion was used.
[0070]
(Example 6)
Commercially available fine particles mainly composed of polystyrene (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) were used as the support (A-6). This support (A-6) had an average particle size of 304 nm, a particle size distribution (CV) of 2%, and a zeta potential of -68 mV.
The obtained support (A-6) was suspended in purified water to a solid content concentration of 0.1% by weight to prepare a support (A-6) dispersion.
[0071]
On the other hand, as the fluorescent material (B-2), core-shell type CdSe / ZnS particles that emit fluorescence of 580 nm by irradiating with excitation light of 365 nm and whose surface was hydrophilized with mercaptoundecanoic acid were selected. This fluorescent substance (B-2) had an average particle diameter of about 5 nm and a zeta potential of +30 mV.
This fluorescent substance (B-2) was dispersed in purified water so as to have a solid concentration of 0.1% by weight to prepare a fluorescent substance (B-2) dispersion.
[0072]
20 μL of the fluorescent substance (B-2) dispersion was added to 200 μL of the support (A-6) dispersion while stirring with a homogenizer, and the support (A-6) and the fluorescent substance (B-2) were joined. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and 600 μL of purified water was added to the precipitate for redispersion. To this dispersion, 100 μL of a polyclonal antibody solution (2 units / mL) against diphtheria antigen as a molecular recognition substance (C) was added and mixed with stirring. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and then 600 μL of purified water was added to the precipitate and redispersed to obtain an aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor.
[0073]
1 μL of 5000 Lf diphtheria antigen was added to the dispersion liquid of molecular recognition phosphors prepared in Examples 1-6. Before and after the addition of the antigen, the wavelength and intensity of fluorescence expressed by exciting the molecular recognition phosphor by irradiating with 365 nm ultraviolet rays were measured using FP-6500 manufactured by JASCO Corporation. The intensity of fluorescence was set to 100 in the case of a dispersion of molecular recognition phosphor before addition of antigen.
Moreover, after the aqueous dispersions of the molecule-recognizing phosphors prepared in Examples 1 to 6 were stored at 4 ° C. for 24 hours, the state of the aqueous dispersion was observed, but no occurrence of aggregation or the like was observed. Further, diphtheria antigen was added in the same manner to the aqueous dispersion after storage, and after 2 hours, the wavelength and intensity of fluorescence expressed by exciting the molecular recognition phosphor by irradiating with 365 nm ultraviolet light were changed to FP- manufactured by JASCO Corporation. Measurement was performed using 6500.
The results are shown in Table 1.
[0074]
[Table 1]

[0075]
It can be seen from Table 1 that the molecular dispersion phosphor aqueous dispersion obtained in any of the Examples can detect the antigen because the fluorescence intensity is reduced by adding the antigen.
[0076]
(Comparative Example 1)
20 μL of the fluorescent substance (B) dispersion used in Example 1 was added to 200 μL of purified water while stirring with a homogenizer. Diphtheria antibody was added to this and stirred as in Example 1, and then 400 μL of purified water was added. Thereafter, 1 μL of diphtheria antigen was further added.
When the fluorescence intensity was measured by the same method as in Example 1, no change in the fluorescence intensity was observed before the antigen addition and 2 hours after the antigen addition.
From this, it was found that the antigen could not be detected without the support (A).
[0077]
(Example 7)
To 200 μL of the support (A-1) dispersion prepared in Example 1, 20 μL of the fluorescent substance (B-1) dispersion prepared in Example 1 was added while stirring with a homogenizer, and the support (A-1) and The fluorescent material (B-1) was joined. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, 600 μL of 1% aqueous sodium azide solution was added to the precipitate and redispersed, and then 365 nm excitation light was irradiated for 30,000 seconds. To this dispersion, 100 μL of a polyclonal antibody solution (2 units / mL) against diphtheria antigen as a molecular recognition substance (C) was added and mixed with stirring. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and then 600 μL of purified water was added to the precipitate and redispersed to obtain an aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor.
[0078]
(Example 8)
To 200 μL of the support (A-1) dispersion prepared in Example 1, 20 μL of the fluorescent substance (B-1) dispersion prepared in Example 1 was added while stirring with a homogenizer, and the support (A-1) and The fluorescent material (B-1) was joined. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, 600 μL of a 0.1% pyrrole aqueous solution was added to the precipitate, redispersed, and irradiated with excitation light of 365 nm for 30,000 seconds. To this dispersion, 100 μL of a polyclonal antibody solution (2 units / mL) against diphtheria antigen as a molecular recognition substance (C) was added and mixed with stirring. The conjugate was precipitated by centrifugation (6500 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and then 600 μL of purified water was added to the precipitate and redispersed to obtain an aqueous dispersion of a molecular recognition phosphor.
[0079]
1 μL of 5000 Lf diphtheria antigen was added to the dispersion liquid of the molecular recognition phosphor prepared in Examples 7 and 8. Before and after the addition of the antigen, the wavelength and intensity of fluorescence expressed by exciting the molecular recognition phosphor by irradiating with 365 nm ultraviolet rays were measured using FP-6500 manufactured by JASCO Corporation. The intensity of fluorescence was set to 100 in the case of a dispersion of molecular recognition phosphor before addition of antigen.
The results are shown in Table 2.
[0080]
[Table 2]

[0081]
From Table 2, it was found that when sodium azide or pyrrole was used in combination as a fluorescence intensity improver, the fluorescence intensity was significantly improved as compared with the molecule-recognized phosphor prepared in Example 1 in which these were not used in combination. .
[0082]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the molecular recognition fluorescent substance used for the highly sensitive measuring method of target substances, such as a biological substance and an environment related substance, and the measuring method of a target substance using the same can be provided.

Claims

A support (A) comprising an inorganic compound and / or an organic compound, a fluorescent material (B) physically and / or chemically bonded to the surface of the support (A), and the support (A) And / or a method for producing a molecular recognition phosphor comprising a molecular recognition material (C) physically and / or chemically bonded to the surface of the fluorescent material (B),
The fluorescent substance (B) is inorganic fluorescent particles having a particle diameter of 0.5 to 100 nm made of a metal element of Group 3-16.
The support (A) has a positive or negative charge, and the fluorescent material (B) has a charge opposite to that of the support (A).
The support (A) and the fluorescence can be prepared by adding the fluorescent material (B) as it is to the solution in which the support (A) is dispersed or adding a dispersion solution of the fluorescent material (B) and mixing them. It has the process of joining a substance (B)
A method for producing a molecule-recognizing phosphor characterized by the above.