JP4256019B2 - Novel antibiotic TKR2462 and method for producing the same - Google Patents

Description

【０００９】
TKR2462株はポテトデキストロース寒天培地、ツァペック寒天培地、サブロー寒天培地等で良好に生育し、そのコロニーの表面はビロード状で、中心部はやや隆起している。TKR2462株の分生子柄は90〜270×1.8〜3.0 μm の滑面で、ほとんど複輪生体対称型のペニシリを形成する。メトレは12.0〜14.0×2.8〜3.2 μmで２〜４本が群生し、フィアライドは9.0〜10.0×1.8〜2.4 μm で輪生状となる。分生子は滑面の球形から亜球形で、そのサイズは2.2〜3.2×2.4〜4.0 μm である。
【００１０】
TKR2462株の菌学的性質のうち生理学的性質は、下記に示す通りである。
生育温度範囲：生育可能温度範囲が、10〜30℃であり、生育最適温度が、25℃付近である。
生育pＨ範囲：生育可能pＨ範囲が、pＨ3〜 pＨ9であり、生育最適pＨが、pＨ5〜7である。
【００１１】
上記の菌学的性質を有する菌種を、カルロス・ラミレツ（Carlos Ramirez）著、マニュアル・アンド・アトラス・オブ・ザ・ペニシリア （Manual and atlas of the Penicillia）、エルセビア・バイオメディカル・プレス（Elsevier Biomedical Press）（1982年）等の文献に記載されたペニシリウム属の菌種について検索することにより、TKR2462株は、ペニシリウム属に属する菌株であると同定することができる。
しかしながら、ペニシリウム属に属する菌株であって、TKR2462産生能を有するものについては、これまで報告がなされたことはない。そこで、本発明者らはこれを新菌株とし、ペニシリウム・エスピー TKR2462株（Penicillium sp. TKR2462）と命名し、Penicillium sp. TKR2462と表示して、平成11年4月13日に工業技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号 FERM P-17364の下で寄託した。
【００１２】
本発明においては、上記TKR2462株の他に、TKR2462株の自然的または人工的変異株、その他のペニシリウム属に属する菌種等であって、TKR2462の産生能を有する微生物を使用することができる。
本発明においては、 TKR2462は、TKR2462産生能を有する菌株を、栄養源含有培地に接種し、培養することによって製造される。栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸等を挙げることができる。窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機窒素化合物、無機窒素化合物等を挙げることができる。塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、りん酸塩等の無機塩類を挙げることができる。これらはそれぞれ単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。
【００１３】
上記栄養源含有培地には、さらに必要に応じて、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の重金属；ビオチン、ビタミンB₁等のビタミン類；その他、菌の生育を助け、 TKR2462の産生を促進する有機物、無機物等を適宜添加することができる。さらに、必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル等の消泡剤、界面活性剤等を添加することができる。
【００１４】
TKR2462を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、抗生物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される方法を採用することができるが、液体培養法、とりわけ、振とうまたは深部通気攪拌培養法を好適に使用することができる。
培養は、15〜25℃で行うことが好ましく、培地の pＨは、通常 pＨ3〜8であるが pＨ5付近であることが好ましい。培養期間は、通常3〜8日で充分な産生量を得ることができる。
上記の培養方法によって産生されたTKR2462は、培養液および菌体中に含有されて、培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄積されたTKR2462は、これら抗真菌性物質の理化学的性質を利用して培養物から分離した後、必要に応じて、さらに精製し、取得することができる。
培養物からの分離は、培養物全体を、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタノール、メチルイソブチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培養物を濾過または遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。
【００１５】
培養液からTKR2462を分離するには、上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中のTKR2462を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することもできる。担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂等を挙げることができる。溶媒としては、担体の種類、性質等によって適宜１種または２種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を適宜組み合わせたもの等を挙げることができる。
菌体から TKR2462を分離するには、アセトン等の親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。
【００１６】
本発明においては、上記のごとく、このようにして培養物中から分離されたTKR2462の粗抽出物を、必要に応じて、さらに精製する工程に付することができる。
精製は、脂溶性抗生物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等を挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、水等を挙げることができ、これらは２種以上を併用することができる。
高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基等が結合した化学結合型シリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。
【００１７】
本発明のTKR2462産生能を有する微生物は、TKR2462を菌体内または菌体外に産生する。したがって、本発明の微生物は、生きたまま必要に応じてTKR2462の産生に適した栄養培地と共に使用すれば、農園芸用薬剤の有効成分として用いることが可能である。さらに、本発明のTKR2462産生能を有する微生物を公知の殺菌方法、例えば、加熱殺菌やエチレンオキサイドガス殺菌、紫外線殺菌を行なった場合、その処理物は微生物としての増殖能を失ってはいるが、TKR2462を処理菌体内に保持している。したがって、TKR2462産生能を有する微生物および／またはその処理物は、植物の真菌性疾患の予防または治療を目的とした農園芸用薬剤の有効成分として用いることが可能である。
【００１８】
本発明のTKR2462は、そのまま、または、その薬理学的に許容される塩として真菌感染症治療用の医薬に使用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、りん酸、ふっ化水素酸、臭化水素酸等の鉱酸の塩；ぎ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマール酸、マレイン酸、こはく酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン 酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸の塩；ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属等の塩等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の TKR2462またはその薬理学的に許容される塩を医薬として投与する場合、本発明の TKR2462またはその薬理学的に許容される塩は、そのまま、または、医薬的に許容される無毒かつ不活性の担体中に、例えば、0.1〜99.5％、好ましくは0.5〜90％含有する医薬組成物として、ヒトを含む動物に投与される。このような担体としては、例えば、固形、半固形若しくは液状の希釈剤、充填剤またはその他の処方用の助剤等を挙げることができ、これらは、１種以上を用いることができる。
医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、自体公知の方法により、その投与方法に適した剤型とすることができ、例えば、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）または経直腸的に投与することができる。
経口投与は、固形、粉末または液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型等により行うことができる。
非経口投与は、例えば、溶液や懸濁剤等の皮下、筋肉内または静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の TKR2462、またはその薬理学的に許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体等の注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁または溶解し、ついで該懸濁液または溶液を滅菌することにより製造される。
局所投与（経皮投与等）は、例えば、液、クリーム、粉末、ペースト、ゲル、軟膏剤等の外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の TKR2462、または、その薬理学的に許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤等のうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。
直腸投与は、本発明のTKR2462、または、その薬理学的に許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステル等の高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物等の低融点の固体に混入した座剤等を用いて行うことができる。
【００２０】
本発明のTKR2462またはその薬理学的に許容される塩を医薬として投与する場合、抗真菌剤としての用量は、年齢、体重等の患者の状態、投与経路、病気の性質と程度等を考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、10〜2000 mgの範囲であり、この範囲において重篤な副作用なしに所望の薬効が得られる。一日数回に分割して投与することもできる。
【００２１】
また、本発明のTKR2462は、そのまま、または、その塩として農園芸用薬剤の有効成分として使用することができる。さらに、上記のごとく、本発明のTKR2462産生能を有する微生物および／またはその処理物も農園芸用薬剤の有効成分として使用することができる。なお、本発明の農園芸用薬剤には、上記有効成分から選択される少なくとも１種の成分が含有されていればよく、また、他の有効成分が含有されていてもよい。
他の有効成分としては、例えば、特開平４−４５７９２、特開平９−２５２８６、特開平９−２４９６８０、WO95/18147、WO96/28456、WO97/26367、WO97/34012、WO98/21196、WO98/23767、WO98/56755およびPCT/JP98/05797各号に記載された抗生物質または抗生物質産生能を有する微生物もしくはその処理物あるいはWO99/1289号記載の化合物が挙げられる。なお、これらの抗生物質、抗生物質産生能を有する微生物もしくはその処理物または上記化合物は、それら単独でも農園芸用薬剤の有効成分として使用できる。
【００２２】
本発明における農園芸用薬剤は、上記有効成分をそのまま使用することもできるが、通常は、製剤補助剤とともに、粉剤、水和剤、粒剤、乳剤などの種々の剤形の製剤として使用する。この際、製剤中に、１種または２種以上の有効成分が０．１〜９５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％、さらに好ましくは２〜７０重量％含まれるようする。製剤補助剤として使用する担体、希釈剤、界面活性剤の例としては、固体担体として、タルク、カオリン、ベントナイト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレーなど、液体希釈剤として、水、キシレン、トルエン、クロロベンゼン、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンアルコールなどが挙げられ、界面活性剤は、その効果により使い分けるのがよく、乳化剤として、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなど、分散剤として、リグニンスルホン酸塩、ジブチルナフタリンスルホン酸塩など、潤滑剤として、アルキルスルホン酸塩、アルキルフェニルスルホン酸塩などを挙げることができる。
【００２３】
上記製剤には、そのまま使用するものと、水等の希釈剤で所定濃度に希釈して使用するものとがある。希釈して使用する時の本発明化合物濃度は０．００１〜１．０％の範囲が好ましい。また、本発明の化合物の使用量は、畑、田、果樹園、温室などの農園芸用地１ｈａ当り、５〜５０００ｇ、好ましくは５〜５００ｇ、さらに好ましくは５０〜５００ｇである。これらの使用濃度および使用量は剤形、使用期間、使用方法、使用場所、対象作物等によっても異なるため、上記の範囲に限定されるものではない。なお、本発明における農園芸用薬剤は、他の農園芸用薬剤、例えば、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤などと組み合わせて使用することもできる。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
TKR2462株 （FERM P-17364）の斜面培養から一白金耳を、100mlの液体培地（ディフコポテトデキストロースブロス 2.4％（w/v））を入れた500ml容の三角フラスコに接種し、25℃で3日間振とうし、種培養液を得た。この種培養液1.0mlを上記液体培地125mlを入れた500ml容の三角フラスコ9本に接種し、25℃、15日間振とう培養（振とう220rpm）を行った。このようにして得た培養液を遠心分離し、上澄液と菌体とに分離した。
得られた菌体にメタノール1リットルを加えて充分混合して抽出操作をした後、減圧濃縮を行った。得られた残渣に水と酢酸エチルを300mlずつ加え、充分混合して、酢酸エチル抽出操作 を行った。この抽出液を減圧濃縮することにより、残渣70.5mgを得た。
これをアセトニトリルとメタノールの1：1混合液1.6mlに溶解し、高速液体クロマトグラフィー に付し、活性画分を得た。この画分を減圧濃縮することにより、TKR2462の精製物13.6mg を黄色粉末として得た。なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は下記によった。
装置：LC８A（島津製作所社製）
カラム：YMC pack C18（2.0cm×25cm）（ワイエムシー社製）
移動相：0.05％トリフルオロ酢酸を含む70％（v/v）アセトニトリル／水
【００２５】
実施例２
実施例１で得られたTKR2462の理化学的性質を以下のとおり測定した。
質量分析には、JMS-DX302型質量分析装置（日本電子社製）を用いた。¹H-NMRスペクトル（重メタノール中、標準物質：テトラメチルシラン）、および¹³C-NMRスペクトル（重メタノール中、標準物質：重メタノール）の測定には、JNM-A500核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いた。紫外線吸収スペクトル分析（メタノール中）には、UV-250型自記分光光度計（島津製作所社製）を用いた。赤外線吸収スペクトル分析（KBr法）には、270-30型赤外分光光度計（日立製作所社製）を用いた。
（１）質量分析
高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた黄色粉末精製物は、質量分析によるFAB-MS測定で、m/z 607 [M+H]⁺であることが判明した。
（２）紫外線吸収スペクトル
高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた黄色粉末精製物の、メタノール中における紫外線吸収スペクトル測定結果は、下記の通りである。
UV（nm）（E）：214sh（228）、244（540）、268（253）、277sh（198）、
300sh（80）、396（76）。
また、その紫外腺吸収スペクトルを図１に示す。
【００２６】
（３）赤外線吸収スペクトル
高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた黄色粉末精製物の、KBr 法による赤外線スペクトル測定結果は、下記の通りである。
IR（KBr）（cm^-1）：3460、1690、1650、1560、1330、1270、1230、1150、1100、1060、1020。
その赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
また、本物質の各種溶媒に対する溶解性は、クロロホルムに可溶、ヘキサン、メタノール、水には難溶であった。
高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた黄色粉末精製物は、図３に示す¹H-NMRスペクトル、および図４に示す¹³C-NMRスペクトルを有していた。
上記分析結果により、高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた黄色粉末精製物は、TKR2462であることが判明した。
上記TKR2462をLC-10A型高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所社製）を用いた逆相分配高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分析に供した。なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は下記によった。
カラム：CAPCELL PAK C₁₈（6mm×150mm）（資生堂社製）
移動相：0.05％トリフルオロ酢酸を含む50％（v/v）アセトニトリル／水
カラム温度：40℃
検出UV波長：220nm
その結果、上記TKR2462は図５に示す位置に溶出されることが明らかになった。
【００２７】
実施例３
実施例１で得られたTKR2462の生物学的性質を以下のとおり測定した。
得られたTKR2462を使用して各種微生物に対する抗菌スペクトルを調べた。測定は、液体培地希釈法により、菌の増殖をほぼ完全に阻止した濃度を最小生育阻害濃度（μg/ml）として求めた。結果を表２に示した。また、部分的に菌の増殖を阻害する最小濃度を半阻止濃度（μg／ml）として求め、併せて表2の括弧内に示した。表中、YNBGは、イーストナイトロジェンベース（ディフコ社製）0.67％、グルコース1.0％を含有する培地を表す。
【００２８】
【表２】

【００２９】
表２の結果から、本発明の抗真菌性物質TKR2462は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ケフィール等の病原性真菌に対して抗菌活性を有することが判明した。
また、得られたTKR2462を、ICR系マウスに50mg/kgを腹腔内投与したが、毒性は認められなかった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によりヒト、動物および植物の真菌性疾患の予防剤または治療剤として有用な抗真菌性物質TKR2462およびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 抗真菌性物質TKR2462 の紫外線吸収スペクトルを示す図である。横軸は波長（nm）を示す。
【図２】 抗真菌性物質TKR2462 の赤外線吸収スペクトルを示す図である。横軸は波数（cm^-1）を示す。
【図３】 抗真菌性物質TKR2462 の¹H-NMRスペクトルを示す図である。横軸は化学シフト値（ppm）を示す。
【図４】 抗真菌性物質TKR2462 の¹³C-NMRスペクトルを示す図である。横軸は化学シフト値（ppm）を示す。
【図５】 抗真菌性物質TKR2462 のHPLCでの溶出位置を示す図である。縦軸は相対紫外吸収強度を示し、横軸は保持時間（分）を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel antibiotic TKR2462 useful as an antifungal agent and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Fungi are known to cause various diseases by infecting humans, animals, plants and the like. For example, superficial mycosis is caused in human skin, oral cavity, etc., systemic mycosis is caused in internal organs, brain and the like, and similar infectious diseases are caused in animals such as pets and livestock. Furthermore, it causes various diseases to plants such as fruit trees and vegetables.
Of these, the main causative fungi that infect humans and cause systemic mycosis are Candida, Cryptococcus, Aspergillus, etc. Candida that infects the skin, oral cavity, vagina and the like, and ringworm fungus that infects the skin of the limbs are considered to be the main ones. In addition to these, there are various fungi in the living environment, which are thought to cause contamination of animals and plants.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
At present, only a very small number of antifungal agents are known which can be used for the purpose of treating and protecting against such fungal infections, contamination. Among these, examples of therapeutic agents for systemic infections in animals including humans include amphotericin B, flucytosine, miconazole, fluconazole and the like. However, these have problems in terms of efficacy, toxicity, antibacterial spectrum and the like, and are not sufficient as therapeutic agents.
An object of the present invention is to provide a novel antibiotic useful as an antifungal agent in view of the above-described present situation.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
For the purpose of searching for new antibiotics, the present inventors have isolated a large number of microorganisms from nature, isolated the antibiotics produced, and examined their biological properties. Microorganisms belonging to the genus Penicillium We found that antibiotics exhibiting antibacterial activity against pathogenic fungi such as Candida albicans and Candida kefir were found in the cultures. After that, the present inventors isolated this antibiotic and investigated its physicochemical properties, and as a result, confirmed that it was a novel substance not described in the literature having specific physicochemical properties, and named this antibiotic as TKR2462. Named.
Thus, the present invention provides the antibiotic TKR2462 and a method for producing the same.
The present invention also provides a novel Penicillium sp. Strain having the ability to produce the antibiotic TKR2462 useful for this production method and a processed product of the microorganism.
The antibiotic TKR2462 of the present invention, or the microorganism capable of producing the antibiotic or a processed product thereof is useful as a prophylactic or therapeutic agent for fungal diseases of humans, animals, or plants. An antifungal agent as a component is also provided. In the present specification, the “antifungal agent” includes pharmaceuticals, animal drugs, cosmetics, agricultural and horticultural drugs and the like.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The antibiotic TKR2462 of the present invention has the following physicochemical properties (1), (2), (3) and (4).
(1) Mass spectrometry: FAB-MS m / z 607 [M + H] ⁺ .
(2) Ultraviolet absorption spectrum (in methanol): The main absorption wavelengths (nm) are 214sh, 244, 268, 277sh, 300sh, 396 as shown in FIG. The E is 228, 540, 253, 198, 80, 76, respectively.
(3) Infrared absorption spectrum (KBr method): Major absorption wave numbers (cm ^-1 ) are 3460, 1690, 1650, 1560, 1330, 1270, 1230, 1150, 1100, 1060, 1020 as shown in FIG. .
(4) Solubility: Soluble in chloroform. Insoluble in hexane, methanol and water.
[0006]
Further, the antibiotic TKR2462 of the present invention has a ¹ H-NMR spectrum shown in FIG. 3 and a ¹³ C-NMR spectrum shown in FIG. 4, and is eluted at the position shown in FIG. 5 by reversed-phase partition high performance liquid chromatography. Has characteristics.
[0007]
The antibiotic TKR2462 of the present invention can be produced by culturing a strain having the ability to produce TKR2462, belonging to the genus Penicillium, and isolating the produced TKR2462 from the culture.
The strain used in the present invention is not particularly limited as long as it is a strain having the ability to produce TKR2462. Examples of such strains include Penicillium sp. TKR2462 strain (hereinafter simply referred to as TKR2462 strain).
The TKR2462 strain is a new strain not described in the literature, and has been isolated and identified by the present inventors for the first time, and has a characteristic of producing TKR2462 advantageously.
Hereinafter, the mycological properties of the TKR2462 strain will be described in detail.
Table 1 shows the color tone of colonies (hereinafter also referred to as “communities”) in the TKR2462 strain. The color tone in the table is based on the color name according to Japanese Industrial Standard JIS Z8102 (1985), which is inoculated into the medium, cultured at 25 ° C., and observed 7 days later.
[0008]
[Table 1]

[0009]
The TKR2462 strain grows well on potato dextrose agar medium, Czapek agar medium, Sabouraud agar medium, etc., the surface of the colony is velvety, and the center is slightly raised. The conidia of the TKR2462 strain has a smooth surface of 90 to 270 × 1.8 to 3.0 μm, and almost forms a bicyclic biosymmetric penicillary. Metre is 12.0 to 14.0 × 2.8 to 3.2 μm, 2 to 4 are clustered, and phialide is 9.0 to 10.0 × 1.8 to 2.4 μm in a ring shape. The conidia are smooth to spherical and subspherical, and their size is 2.2 to 3.2 × 2.4 to 4.0 μm.
[0010]
Among the mycological properties of the TKR2462 strain, the physiological properties are as shown below.
Growth temperature range: The growth possible temperature range is 10-30 ° C, and the optimum growth temperature is around 25 ° C.
Growth pH range: The viable pH range is pH3 to pH9, and the optimum growth pH is pH5 to 7.
[0011]
The bacterial species having the above-mentioned mycological characteristics are described by Carlos Ramirez, Manual and atlas of the Penicillia, Elsevier Biomedical The strain TKR2462 can be identified as a strain belonging to the genus Penicillium by searching for the species of the genus Penicillium described in documents such as Press (1982).
However, no strains belonging to the genus Penicillium that have the ability to produce TKR2462 have been reported so far. Therefore, the present inventors have designated this as a new strain and named it Penicillium sp. TKR2462 (Penicillium sp. TKR2462) and labeled it as Penicillium sp. TKR2462. Deposited with the Institute of Industrial Technology under the deposit number FERM P-17364.
[0012]
In the present invention, in addition to the TKR2462 strain described above, natural or artificial mutants of the TKR2462 strain, other species belonging to the genus Penicillium, etc., and microorganisms capable of producing TKR2462 can be used.
In the present invention, TKR2462 is produced by inoculating and culturing a strain having TKR2462 producing ability in a nutrient source-containing medium. Among nutrient sources, examples of the carbon source include glucose, fructose, saccharose, starch, dextrin, glycerin, molasses, starch syrup, fats and oils, and organic acids. Examples of nitrogen sources include soy flour, cottonseed flour, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract, meat extract, germ, urea, amino acid, ammonium salt and other organic nitrogen compounds, inorganic nitrogen compounds, and the like. it can. Examples of the salts include inorganic salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, and phosphates. These may be used alone or in appropriate combination.
[0013]
If necessary, the above nutrient source medium contains heavy metals such as iron, copper, zinc and cobalt salts; vitamins such as biotin and vitamin B ₁ ; An organic substance, an inorganic substance, or the like that promotes can be appropriately added. Furthermore, an antifoaming agent such as silicone oil and polyalkylene glycol ether, a surfactant and the like can be added as necessary.
[0014]
When culturing the strain producing TKR2462 in the above nutrient source-containing medium, a method generally used when antibiotic production is carried out by culturing microorganisms can be employed, but a liquid culture method, particularly, The shaking or deep aeration stirring culture method can be preferably used.
The culture is preferably performed at 15 to 25 ° C., and the pH of the medium is usually pH 3 to 8, but is preferably around pH 5. The culture period is usually 3 to 8 days, and a sufficient production amount can be obtained.
TKR2462 produced by the above culture method is contained in the culture solution and the cells and accumulated in the culture. In the present invention, TKR2462 accumulated in the culture can be separated from the culture using the physicochemical properties of these antifungal substances, and then further purified and obtained as necessary.
Separation from the culture can be performed by extracting the entire culture with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, butanol, methyl isobutyl ketone, and the like. In addition, the culture can be separated into a culture solution and cells by filtration or centrifugation, and then separated from each of the culture solution and the cells.
[0015]
In order to separate TKR2462 from the culture solution, it is possible to employ a method of extracting with the above-mentioned non-hydrophilic organic solvent. Alternatively, the culture solution is brought into contact with an adsorbent carrier and TKR2462 in the culture solution is adsorbed onto the carrier. Thereafter, a method of eluting with a solvent may be employed. Examples of the carrier include activated carbon, powdered cellulose, and an adsorptive resin. As the solvent, one or a combination of two or more can be used as appropriate depending on the type and nature of the carrier, for example, a combination of water-containing organic solvents such as water-containing acetone and water-containing alcohols. Etc.
In order to separate TKR2462 from cells, a method of extracting with a hydrophilic organic solvent such as acetone can be employed.
[0016]
In the present invention, as described above, the crude extract of TKR2462 thus separated from the culture can be subjected to a further purification step as necessary.
Purification can be performed by a method commonly used for separation and purification of fat-soluble antibiotics. Examples of such a method include column chromatography using a carrier such as silica gel, activated alumina, activated carbon, and adsorbent resin. Method, high performance liquid chromatography method and the like. When the column chromatography method using silica gel as a carrier is employed, examples of the elution solvent include chloroform, ethyl acetate, methanol, acetone, water and the like, and these can be used in combination of two or more. .
When employing the high performance liquid chromatography method, examples of the carrier include chemically bonded silica gel bonded with octadecyl group, octyl group, phenyl group, etc .; polystyrene-based porous polymer gel, etc. For example, an aqueous solution of a water-soluble organic solvent such as water-containing methanol or water-containing acetonitrile can be used.
[0017]
The microorganism having the ability to produce TKR2462 of the present invention produces TKR2462 inside or outside the cell. Therefore, the microorganism of the present invention can be used as an active ingredient of an agricultural and horticultural medicine if it is used with a nutrient medium suitable for production of TKR2462 if necessary. Furthermore, when a microorganism having the ability to produce TKR2462 of the present invention is subjected to a known sterilization method, for example, heat sterilization, ethylene oxide gas sterilization, or ultraviolet sterilization, the treated product has lost its ability to grow as a microorganism. TKR2462 is retained in the treated cells. Therefore, microorganisms having TKR2462 production ability and / or processed products thereof can be used as active ingredients of agricultural and horticultural drugs for the purpose of preventing or treating fungal diseases of plants.
[0018]
The TKR2462 of the present invention can be used as it is or as a pharmacologically acceptable salt thereof in a medicament for treating fungal infections. The salt is not particularly limited as long as it is pharmacologically acceptable. For example, salts of mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid; formic acid, Salts of organic acids such as acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, camphorsulfonic acid; sodium, Examples thereof include salts of alkali metals such as potassium and calcium or alkaline earth metals.
[0019]
When the TKR2462 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is administered as a pharmaceutical, the TKR2462 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is used as it is or as a pharmaceutically acceptable non-toxic and non-toxic. It is administered to animals including humans as a pharmaceutical composition containing, for example, 0.1-99.5%, preferably 0.5-90% in an active carrier. Examples of such carriers include solid, semi-solid or liquid diluents, fillers or other formulation aids, and one or more of these can be used.
The pharmaceutical composition is preferably administered in a dosage unit form, and can be made into a dosage form suitable for the administration method by a method known per se. For example, oral administration, tissue administration, topical administration (transdermal administration) Etc.) or rectally.
Oral administration can be performed in a solid, powder or liquid dosage unit, for example, powders, powders, tablets, dragees, capsules, drops, sublingual agents, other dosage forms, and the like.
Parenteral administration can be performed, for example, by using a liquid dosage unit form for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection such as a solution or suspension. These are a suspension or dissolution of a certain amount of TKR2462 of the present invention, or a pharmacologically acceptable salt thereof, in a non-toxic liquid carrier suitable for injection purposes, such as an aqueous or oily medium. And then sterilizing the suspension or solution.
Topical administration (transdermal administration etc.) can be performed by using forms of external preparations such as liquids, creams, powders, pastes, gels, ointments and the like. These include a certain amount of TKR2462 of the present invention, or a pharmacologically acceptable salt thereof, a fragrance, a colorant, a filler, a surfactant, a moisturizer, an emollient that is suitable for the purpose of external preparation. Manufactured by combining with one or more of agents, gelling agents, carriers, preservatives, stabilizers and the like.
For rectal administration, a certain amount of TKR2462 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof, for example, a higher melting point such as higher esters such as myristyl palmitate, polyethylene glycol, cocoa butter, a mixture thereof, etc. Can be carried out using a suppository mixed in the solid.
[0020]
When TKR2462 of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is administered as a pharmaceutical, the dose as an antifungal agent takes into account the patient's condition such as age and weight, route of administration, nature and degree of disease, etc. Although it is desirable to adjust the above, generally, for humans, the amount of the active ingredient of the present invention is 10 to 2000 mg per day for adults, and it is desirable without serious side effects in this range. Can be obtained. The administration can be divided into several times a day.
[0021]
Moreover, TKR2462 of the present invention can be used as an active ingredient of an agricultural or horticultural agent as it is or as a salt thereof. Furthermore, as described above, the microorganisms having the ability to produce TKR2462 of the present invention and / or processed products thereof can also be used as active ingredients of agricultural and horticultural agents. In addition, the agricultural and horticultural medicine of the present invention only needs to contain at least one component selected from the above active ingredients, and may contain other active ingredients.
Other active ingredients include, for example, JP-A-4-45792, JP-A-9-25286, JP-A-9-249680, WO95 / 18147, WO96 / 28456, WO97 / 26367, WO97 / 34012, WO98 / 21196, WO98 / 23767. , WO98 / 56755 and PCT / JP98 / 05797, antibiotics, microorganisms capable of producing antibiotics or processed products thereof, and compounds described in WO99 / 1289. These antibiotics, microorganisms capable of producing antibiotics or processed products thereof, or the above compounds can be used alone as active ingredients of agricultural and horticultural drugs.
[0022]
The active ingredients can be used as they are for the agricultural and horticultural agents in the present invention, but usually they are used as preparations in various dosage forms such as powders, wettable powders, granules, emulsions, etc., together with formulation adjuvants. . At this time, one or more active ingredients are contained in the preparation in an amount of 0.1 to 95% by weight, preferably 0.5 to 90% by weight, more preferably 2 to 70% by weight. Examples of carriers, diluents, and surfactants used as formulation adjuvants include talc, kaolin, bentonite, diatomaceous earth, white carbon, clay, etc. as solid carriers, liquid diluents such as water, xylene, toluene, chlorobenzene, Cyclohexane, cyclohexanone, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, N-methylpyrrolidone alcohol and the like are listed. Surfactants should be used properly depending on their effects, and as emulsifiers, polyoxyethylene alkyl aryl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate Examples of the dispersant include lignin sulfonate and dibutyl naphthalene sulfonate, and examples of the lubricant include alkyl sulfonate and alkylphenyl sulfonate.
[0023]
The above preparations include those that are used as they are and those that are diluted to a predetermined concentration with a diluent such as water. The concentration of the compound of the present invention when diluted is preferably in the range of 0.001 to 1.0%. The amount of the compound of the present invention is 5 to 5000 g, preferably 5 to 500 g, more preferably 50 to 500 g, per 1 ha of agricultural or horticultural land such as fields, fields, orchards, and greenhouses. Since these use concentrations and amounts vary depending on the dosage form, use period, use method, use place, target crop, etc., they are not limited to the above ranges. The agricultural and horticultural chemicals in the present invention can also be used in combination with other agricultural and horticultural chemicals such as fungicides, insecticides, acaricides, herbicides and the like.
[0024]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
One platinum loop from the slope culture of TKR2462 strain (FERM P-17364) is inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of liquid medium (Diffco potato dextrose broth 2.4% (w / v)) at 25 ° C. The seed culture solution was obtained by shaking for 3 days. Nine 500 ml Erlenmeyer flasks containing 125 ml of the above liquid medium were inoculated with 1.0 ml of the seed culture solution, and cultured with shaking (shaking 220 rpm) at 25 ° C. for 15 days. The culture solution thus obtained was centrifuged and separated into a supernatant and cells.
After 1 liter of methanol was added to the obtained cells and mixed well, extraction operation was performed, followed by concentration under reduced pressure. 300 ml each of water and ethyl acetate were added to the resulting residue and mixed well, followed by extraction with ethyl acetate. The extract was concentrated under reduced pressure to obtain 70.5 mg of a residue.
This was dissolved in 1.6 ml of a 1: 1 mixture of acetonitrile and methanol and subjected to high performance liquid chromatography to obtain an active fraction. By concentrating this fraction under reduced pressure, 13.6 mg of a purified product of TKR2462 was obtained as a yellow powder. The conditions for high performance liquid chromatography were as follows.
Equipment: LC8A (manufactured by Shimadzu Corporation)
Column: YMC pack C18 (2.0cm x 25cm) (made by YMC)
Mobile phase: 70% (v / v) acetonitrile / water with 0.05% trifluoroacetic acid
Example 2
The physicochemical properties of TKR2462 obtained in Example 1 were measured as follows.
A JMS-DX302 type mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.) was used for mass spectrometry. ^For the measurement of ¹ H-NMR spectrum (in deuterated methanol, standard substance: tetramethylsilane) and ¹³ C-NMR spectrum (in deuterated methanol, standard substance: deuterated methanol), JNM-A500 nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL) Used). A UV-250 self-recording spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for ultraviolet absorption spectrum analysis (in methanol). A 270-30 infrared spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) was used for infrared absorption spectrum analysis (KBr method).
(1) The purified yellow powder obtained by mass spectrometry high-performance liquid chromatography and concentrating the obtained active fraction under reduced pressure was measured by mass spectrometry using FAB-MS measurement, and m / z 607 [M + H] ⁺ .
(2) Ultraviolet absorption spectrum high-performance liquid chromatography, and the obtained active fraction was concentrated under reduced pressure. The results of ultraviolet absorption spectrum measurement in methanol of the purified yellow powder were as follows. .
UV (nm) (E): 214sh (228), 244 (540), 268 (253), 277sh (198),
300sh (80), 396 (76).
The ultraviolet gland absorption spectrum is shown in FIG.
[0026]
(3) Infrared absorption spectrum The result of infrared spectrum measurement by KBr method of the purified yellow powder obtained by high-pressure liquid chromatography and concentration of the obtained active fraction under reduced pressure is as follows.
IR (KBr) (cm ⁻¹ ): 3460, 1690, 1650, 1560, 1330, 1270, 1230, 1150, 1100, 1060, 1020.
The infrared absorption spectrum is shown in FIG.
In addition, the solubility of this substance in various solvents was soluble in chloroform and hardly soluble in hexane, methanol, and water.
The purified yellow powder obtained by high-performance liquid chromatography and concentrating the obtained active fraction under reduced pressure has a ¹ H-NMR spectrum shown in FIG. 3 and a ¹³ C-NMR spectrum shown in FIG. Had.
From the above analysis results, it was found that the purified yellow powder obtained by high-performance liquid chromatography and concentrating the obtained active fraction under reduced pressure was TKR2462.
The TKR2462 was subjected to analysis by reversed phase partition high performance liquid chromatography (HPLC) using an LC-10A type high performance liquid chromatography apparatus (manufactured by Shimadzu Corporation). The conditions for high performance liquid chromatography were as follows.
Column: CAPCELL PAK C ₁₈ (6mm x 150mm) (made by Shiseido)
Mobile phase: 50% (v / v) acetonitrile / water column containing 0.05% trifluoroacetic acid Temperature: 40 ° C
Detection UV wavelength: 220nm
As a result, it was revealed that the TKR2462 was eluted at the position shown in FIG.
[0027]
Example 3
The biological properties of TKR2462 obtained in Example 1 were measured as follows.
The obtained TKR2462 was used to examine antibacterial spectra against various microorganisms. The concentration was determined as the minimum growth inhibitory concentration (μg / ml) by the liquid medium dilution method. The results are shown in Table 2. In addition, the minimum concentration that partially inhibits the growth of the fungus was determined as a semi-inhibitory concentration (μg / ml), and is also shown in parentheses in Table 2. In the table, YNBG represents a medium containing 0.67% yeast nitrogen base (Difco) and 1.0% glucose.
[0028]
[Table 2]

[0029]
From the results in Table 2, it was found that the antifungal substance TKR2462 of the present invention has antibacterial activity against pathogenic fungi such as Candida albicans and Candida kefir.
The obtained TKR2462 was administered intraperitoneally to ICR mice at 50 mg / kg, but no toxicity was observed.
[0030]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, an antifungal substance TKR2462 useful as a preventive or therapeutic agent for human, animal and plant fungal diseases and a method for producing the same can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of an antifungal substance TKR2462. The horizontal axis indicates the wavelength (nm).
FIG. 2 is a graph showing an infrared absorption spectrum of an antifungal substance TKR2462. The horizontal axis indicates the wave number (cm ⁻¹ ).
FIG. 3 is a diagram showing a ¹ H-NMR spectrum of an antifungal substance TKR2462. The horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm).
FIG. 4 is a diagram showing a ¹³ C-NMR spectrum of an antifungal substance TKR2462. The horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm).
FIG. 5 is a diagram showing the elution position of antifungal substance TKR2462 by HPLC. The vertical axis represents relative ultraviolet absorption intensity, and the horizontal axis represents retention time (minutes).

Claims (5)

Antibiotic TKR2462 or a salt thereof having the following physicochemical properties (1), (2), (3) , (4), (5) and (6) :
(1) Mass spectrometry: FAB-MS m / z 607 [M + H] ⁺ ;
(2) UV absorption spectrum (in methanol): The main absorption wavelengths (nm) are 214sh, 244, 268, 277sh, 300sh, 396, and E is 228, 540, 253, 198, 80, 76, respectively;
(3) Infrared absorption spectrum (KBr method): Major absorption wave numbers (cm ⁻¹ ) are 3460, 1690, 1650, 1560, 1330, 1270, 1230, 1150, 1100, 1060, 1020 as follows:
(4) Solubility: Soluble in chloroform. Poorly soluble in hexane, methanol, water ;
(5) shows the ¹ H-NMR spectrum shown in FIG. 3 ;
(6) The ¹³ C-NMR spectrum shown in FIG. 4 is shown .   A method for producing an antibiotic TKR2462, which is a strain belonging to the genus Penicillium, comprising culturing a strain capable of producing the antibiotic TKR2462, and isolating the antibiotic TKR2462 from the culture. Penicillium SP ( Penicillium sp. ) TKR2462 ( FERM P-17364 ), And antibiotics TKR2462 A natural or artificial mutant thereof having a production ability. The processed product of the microorganism according to claim 3. Antibiotic according to claim 1 TKR2462 And an antifungal agent comprising, as an active ingredient, at least one selected from the group consisting of a salt thereof, a microorganism according to claim 3, and a processed product according to claim 4.

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