JP4264183B2

JP4264183B2 - Nucleic acid detection method

Info

Publication number: JP4264183B2
Application number: JP2000103176A
Authority: JP
Inventors: 琢而須崎; 寛之衣斐; 西矢　　芳昭; 延男筒井; 佳宏山本
Original assignee: CITY OF KYOTO; Horiba Ltd; Toyobo Co Ltd
Current assignee: CITY OF KYOTO; Horiba Ltd; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2000-04-05
Filing date: 2000-04-05
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2020-04-05
Also published as: JP2001286298A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸（ＮＡ）を検出する従来の手法として螢光法がある。この螢光法は、スライドガラスの表面に数百〜数万種類のプローブ核酸（固相プローブ）を固定して設け、このプローブ核酸に螢光物質で標識処理したターゲット核酸（液相プローブ）を試料として供給して、相補的な核酸どうしをハイブリダイズ（対合）させ、ハイブリダイズしなかったターゲット核酸を流し去り、プローブ核酸とターゲット核酸とがハイブリダイズして生成された複合体の螢光を、螢光レーザ顕微鏡やＣＣＤカメラからなる光学系およびこれに接続されたコンピュータなどを備えた装置を用いて検出して、その場所を特定するというものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記螢光法においては、発生する螢光の強度が微弱であり、その光を検出することが困難であるため、螢光レーザ顕微鏡として大がかりかつ高価なものを用いる必要があるとともに、検出信号の飽和によって定量性が低下するといった問題がある。
【０００４】
この発明は、上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を高感度かつ迅速にしかも安価な構成によって測定することができる核酸の検出方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、この発明の核酸の検出方法は、複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面上に載置し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしている（請求項１）。
【０００６】
上記核酸の検出方法においては、複数のプローブ核酸を樹脂製メンブレン上における位置とセンサ面における載置位置とを対応させておく。そして、センサ面上において酵素、好ましくは酸化還元酵素と基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを、二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面によって検出するようにしているので、どの位置のプローブ核酸においてｐＨが変化したかを把握することができ、これにより、ターゲット核酸を検出することができる。
【０００７】
したがって、従来の螢光法のように高価かつ大がかりな光学系を用いる必要がなく、安価かつ簡単な構成で核酸を検出することができる。そして、加える基質の量を適宜加減することにより、水素イオンの増加または減少量を調整することができ、高感度検出が可能になる。
【０００８】
また、上記核酸の検出方法においては、プローブ核酸をナイロンなどの樹脂製メンブレン上に固定し、これにターゲット核酸を加えるようにしているので、樹脂製メンブレンを取り替えるだけで、二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面については再利用が可能である。したがって、ランニングコストが安くなる。
【０００９】
さらに、上記核酸の検出方法においては、水素イオンを二次元ｐＨ分布測定装置のセンサ面によって検出するようにしており、その経時変化を把握することができる。
【００１０】
なお、前記プローブ核酸とターゲット核酸の組み合わせとしては、
プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡ
プローブＲＮＡとターゲットＲＮＡ
プローブＤＮＡとターゲットＲＮＡ
プローブＲＮＡとターゲットＤＮＡ
がある。
【００１１】
そして、上記核酸の検出方法において、請求項２に記載してあるように、単鎖状のターゲット核酸を酵素、好ましくは酸化還元酵素によって予め標識処理しておいてもよい。
【００１２】
また、上記核酸の検出方法において、請求項３または４に記載してあるように、センサ面上にプローブ核酸を直に固定し、このプローブ核酸にターゲット核酸を試料として加えるようにしてもよい。
【００１３】
さらに、上記核酸の検出方法において、請求項６に記載してあるように、複合体に基質を加える際、補酵素、補欠分子または金属イオンなどのコファクターも加えるようにしてもよい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。図１および図２は、この発明の第１の実施の形態を示す。まず、図１は、この発明の核酸の検出方法を実施するための装置の一例を示すもので、この図において、１は二次元ｐＨ分布測定装置、２はこの装置の上部に形成される平面視矩形状のセンサ面で、例えば２ｃｍ×２ｃｍ程度の大きさを有し、複数のｐＨセンサ素子２ａよりなり、ｐＨの二次元分布を検出できるように構成されている。この二次元ｐＨ分布測定装置としては、例えば特開平１０−３３２４２３号公報に示すように、特に、図６に示すようなＣＣＤを用いたｐＨの二次元分布を測定する二次元ｐＨ分布測定装置（化学ＣＣＤ装置）がある。この化学ＣＣＤ装置は、水素イオン濃度（ｐＨ）に対応して深さを変化するように構成されたポテンシャル井戸をセンサ素子として複数個二次元的に配置し、これらのポテンシャル井戸に電荷を注入して、ｐＨの大きさをこのポテンシャル井戸の大きさに応じた電荷に変換するように構成したものである。
【００１５】
そして、図１において、３は化学ＣＣＤ装置１からの出力信号を処理し、画像出力することができるコンピュータなどの画像出力装置で、センサ面２におけるｐＨ分布を二次元的に表示するカラーディスプレイ４を備えている。
【００１６】
次に、上記化学ＣＣＤ装置１を用いた核酸の検出方法の一例を、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの組み合わせを例に挙げて、図２をも参照しながら説明する。なお、図１の矢印Ｘは、処理プロセスの進行方向を示している。
【００１７】
まず、プローブＤＮＡ（固相プローブ）５とするＤＮＡをＰＣＲ増幅して採取する（図２中の符号Ａ参照）。
【００１８】
前記増幅された複数の互いに異なるプローブＤＮＡ５を、マイクロアレイヤー（スポッター）を用いてナイロンメンブレン６上にプロットし、ＵＶクロスリンカーで固定する（図２中の符号Ｂ参照）。ここで用いるナイロンメンブレン６は、例えば厚み数十〜数百μｍで、センサ面２とほぼ同じ大きさである。そして、複数のプローブＤＮＡ５を固定したナイロンメンブレン６を化学ＣＣＤ装置１のセンサ面２上に載置する（図２中の符号Ｄ参照）。この場合、ナイロンメンブレン６上に設けられた複数のプローブＤＮＡ５の載置位置は、画像出力装置３のメモリ内にデータとして記憶しておく。なお、４ａは、センサ面２を構成する複数のセンサ素子に対応する位置を示しており、この各位置に対応するようにプローブＤＮＡ５が位置している。
【００１９】
一方、ターゲットＤＮＡ（液相プローブ）８は、二重らせん構造のＤＮＡ７を熱またはアルカリ処理して単鎖状とするか、あるいは、直接単鎖状のＤＮＡを化学合成して作成する。その前後のいずれかにおいて標識処理を行う。具体的には、二重らせん構造のＤＮＡ７にポリメラーゼ反応を利用してビオチンなどのリンク剤９が結合したヌクレオチドを取り込ませて標識処理した後、熱またはアルカリで処理して単鎖状のターゲットＤＮＡ８とする。あるいは、単鎖状のＤＮＡを化学合成する際に末端をビオチンまたはジゴキシゲニンなどのリンク剤９によって標識処理しターゲットＤＮＡ８とする。あるいは、二重らせん構造のＤＮＡ７を熱またはアルカリで処理して単鎖状のターゲットＤＮＡ８とし、各ターゲットＤＮＡ８の末端をビオチンまたはジゴキシゲニンなどのリンク剤９によって標識処理し（図２中の符号Ｃ参照）、これを試料とする。
【００２０】
前記標識処理したターゲットＤＮＡ８を試料としてナイロンメンブレン６上に供給して、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとをハイブリダイゼーション操作を行う（図２中の符号Ｄ参照）。このとき、いくつかのターゲットＤＮＡ８は、プローブＤＮＡ５とハイブリダイズし、複合体１０を形成する。そして、洗浄液によってナイロンメンブレン６上を洗浄し、プローブＤＮＡ５と複合体１０を形成しなかったターゲットＤＮＡ８’を除去する（図２中の符号Ｄ参照）。
【００２１】
次いで、ビオチン化酵素（好ましくはビオチン化ベルオキシダーゼ）あるいはアビジン、ビオチン化酵素（好ましくはビオチン化ベルオキシダーゼ）を用いたＡＢＣ法により、あるいは、酵素標識抗ジゴキシゲニン抗体（好ましくは抗ジゴキシゲニン−ポリペルオキシダーゼ抗体）を用いた方法により、前記プローブＤＮＡ５とターゲットＤＮＡ８との複合体１０を、例えばペルオキシダーゼやグルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素１１で標識処理する（図２中の符号Ｅ参照）。なお、符号１１’は余剰の酸化還元酵素である。
【００２２】
そして、前記酸化還元酵素１１によって標識処理した複合体１０に、例えば過酸化水素とフェノール誘導体あるいはグルコースなどの基質１２を加え、酸化還元酵素と基質（必要によっては補酵素や金属イオンなどのコファクター）とによって酸化還元反応を起こさせる（図２中の符号Ｆ参照）。そして、この酸化還元反応によってＨ⁺イオン１３が生じ、このＨ⁺イオン１３は、センサ面２によって検出される。化学ＣＣＤ装置１では、センサ面２における各センサ素子におけるｐＨに関連した信号が１次データとして画像出力装置３に送られ、これを二次元情報に変換することにより、ディスプレイ４上において，ｐＨが変化した場所の色が変化してカラー表示され、コンピュータ処理により、ターゲットＤＮＡ８の塩基配列などが判断できる。また、複合体１０となったＤＮＡの位置を目視によっても確認することができ、試料中に含まれるターゲットＤＮＡ８を確認することができる。なお、図２において、４ａはｐＨが変化した部分を示し、また、１２’は余剰の基質を示している。
【００２３】
上述のように、この発明の核酸の検出方法においては、従来の螢光法のように高価かつ大がかりな光学系を用いる必要がなく、安価かつ簡単な構成で核酸を検出することができる。そして、加える基質の量を適宜加減することにより、Ｈ⁺イオン１３の発生量を調整することができ、高感度検出が可能になる。
【００２４】
また、上記核酸の検出方法においては、プローブＤＮＡ５をナイロンメンブレン６上に固定し、これにターゲットＤＮＡ８を加えるようにしているので、ナイロンメンブレン６を取り替えるだけで、センサ面２、すなわち、化学ＣＣＤ装置１については再利用が可能である。したがって、ランニングコストが安くなる。
【００２５】
さらに、上記核酸の検出方法においては、ｐＨ変化を化学ＣＣＤ装置１のセンサ面２によって検出するようにしており、その経時変化を把握することができる。
【００２６】
図３は、この発明の第２の実施の形態を示し、この実施の形態においては、プローブＤＮＡ５を化学ＣＣＤ装置１のセンサ面２上に直接固定している。この第２の実施の形態におけるプローブＤＮＡ５の採取方法や固定方法やその後の処理は、第１の実施の形態における方法および処理と同様であるので、その詳細な説明を省略する。なお、図中の６ｂはセンサ面２を構成する複数のセンサ素子に対応する固定位置を示している。
【００２７】
上述の第１および第２の実施の形態においては、複合体１０を酸化還元酵素１１によって標識処理していたが、これに代えて、図４に示す実施の形態のように、ターゲットＤＮＡ８を酸化還元酵素１１によって標識処理してもよい。
【００２８】
上述の実施の形態は、いずれもＤＮＡについての検出方法であったが、この発明の核酸の検出方法は、ＲＮＡについても同様に適用することができ、この場合、ＲＮＡを逆転写反応を行ってターゲットＤＮＡやプローブＤＮＡを形成すればよく、後の操作は、上記各実施の形態と同様である。また、ＲＮＡをプローブＲＮＡとしてナイロンメンブレン６上あるいはセンサ面２上に固定することもできる。
【００２９】
上記実施の形態においては、ｐＨの変化を化学ＣＣＤ装置１によって検出するようにしていたが、この発明はこれに限られるものではなく、種々の二次元ｐＨ分布測定装置を用いることができる。例えば、特開平８−２１３５８０号公報や特開平８−３２０３０５号公報などに記載されている二次元ｐＨ分布測定装置や、特公平５−３３４４５号公報に記載されているＣＭＯＳ型センサ、あるいは、プローブＤＮＡ５の数が少ない場合には、実開平４−２４０６１号公報に記載されているＩＳＦＥＴアレイを用いることができる。さらに、ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ６１（１９９９）１５４−１６２に記載されているように、複数のセンサ電極を設け、各電極に電圧を加えてピロール付加したプローブＤＮＡを、各電極に固定するようにしてもよい。この場合、電極の横にｐＨセンサを設ける必要がある。
【００３０】
また、基質１２と酸化還元反応を起こす酸化還元酵素１１として、グルコースディヒドロゲナーゼなどの脱水素酵素を用いてもよく、さらに、複合体１０に基質１２を加える際、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨなどの補酵素も加えるようにしてもよい。
【００３１】
さらに、ナイロンメンブレン６に代えて、ニトロセルロースのような他の樹脂製メンブレンを用いるようにしてもよい。
【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明の核酸の検出方法によれば、ＤＮＡなどの核酸を高感度かつ迅速にしかも安価な構成によって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の核酸の検出方法を実施する装置の全体構成を概略的に示す図である。
【図２】前記核酸の検出方法における操作手順の一例を説明するための図である。
【図３】この発明の他の実施の形態を示す図である。
【図４】この発明の核酸の検出方法における操作手順の他の例を説明するための図である。
【符号の説明】
１…二次元ｐＨ分布測定装置、２…センサ面、５…プローブ核酸、６…樹脂製メンブレン、８…ターゲット核酸、１０…複合体、１１…酵素、１２…基質、１３…水素イオン。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid such as DNA or RNA.
[0002]
[Prior art]
As a conventional technique for detecting nucleic acids (NA) such as DNA and RNA, there is a fluorescence method. In this fluorescent method, hundreds to tens of thousands of probe nucleic acids (solid phase probes) are fixed on the surface of a slide glass, and target nucleic acids (liquid phase probes) labeled with a fluorescent substance are applied to the probe nucleic acids. Supplied as a sample, complementary nucleic acids are hybridized (paired), unhybridized target nucleic acid is washed away, and the complex formed by hybridization of probe nucleic acid and target nucleic acid Is detected using an apparatus including an optical system including a fluorescent laser microscope and a CCD camera and a computer connected to the optical system, and the location is specified.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the above-described fluorescence method, since the intensity of the generated fluorescence is weak and it is difficult to detect the light, it is necessary to use a large and expensive fluorescence laser microscope, There is a problem that the quantitativeness is lowered due to signal saturation.
[0004]
The present invention has been made in consideration of the above-mentioned matters, and an object of the present invention is to provide a nucleic acid detection method capable of measuring nucleic acids such as DNA and RNA with high sensitivity, speed and low cost. It is.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above-described object, the nucleic acid detection method of the present invention comprises placing a resin membrane on which a plurality of probe nucleic acids are immobilized on the sensor surface of a two-dimensional pH distribution measuring device, and taking a single-stranded target nucleic acid as a sample. As a result, the probe nucleic acid and the target nucleic acid are hybridized with each other, and a complex of the probe nucleic acid and the target nucleic acid is then labeled with an enzyme that reacts with the substrate to increase or decrease hydrogen ions , the labeled treated with the substrate is added to the complex, to cause a reaction by the said and the enzyme substrate, and the hydrogen ions to increase or decrease by the reaction to be detected by the sensor surface (claim 1) .
[0006]
In the nucleic acid detection method, a plurality of probe nucleic acids are associated with positions on the resin membrane and mounting positions on the sensor surface. Then, a reaction is caused on the sensor surface by an enzyme, preferably an oxidoreductase and a substrate, and hydrogen ions that increase or decrease due to this reaction are detected by the sensor surface of the two-dimensional pH distribution measuring device. The position of the probe nucleic acid at which position the pH has changed can be ascertained, whereby the target nucleic acid can be detected.
[0007]
Therefore, it is not necessary to use an expensive and large-scale optical system unlike the conventional fluorescence method, and nucleic acid can be detected with an inexpensive and simple configuration. Then, by appropriately adjusting the amount of substrate to be added, the amount of increase or decrease of hydrogen ions can be adjusted, and highly sensitive detection becomes possible.
[0008]
In the nucleic acid detection method, the probe nucleic acid is fixed on a resin membrane such as nylon, and the target nucleic acid is added thereto. Therefore, the two-dimensional pH distribution measuring device can be obtained simply by replacing the resin membrane. These sensor surfaces can be reused. Therefore, the running cost is reduced.
[0009]
Furthermore, in the above-described nucleic acid detection method, hydrogen ions are detected by the sensor surface of the two-dimensional pH distribution measuring device, and the change with time can be grasped.
[0010]
In addition, as a combination of the probe nucleic acid and the target nucleic acid,
Probe DNA and target DNA
Probe RNA and target RNA
Probe DNA and target RNA
Probe RNA and target DNA
There is.
[0011]
In the nucleic acid detection method, as described in claim 2, the single-stranded target nucleic acid may be preliminarily labeled with an enzyme, preferably an oxidoreductase.
[0012]
In the nucleic acid detection method, as described in claim 3 or 4, the probe nucleic acid may be directly fixed on the sensor surface, and the target nucleic acid may be added to the probe nucleic acid as a sample.
[0013]
Furthermore, in the method for detecting a nucleic acid, as described in claim 6, when a substrate is added to the complex, a cofactor such as a coenzyme, a prosthetic molecule, or a metal ion may be added.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. 1 and 2 show a first embodiment of the present invention. First, FIG. 1 shows an example of an apparatus for carrying out the nucleic acid detection method of the present invention. In this figure, 1 is a two-dimensional pH distribution measuring apparatus, and 2 is a plane formed on the upper part of the apparatus. A rectangular sensor surface has a size of about 2 cm × 2 cm, for example, and is composed of a plurality of pH sensor elements 2 a so that a two-dimensional pH distribution can be detected. As this two-dimensional pH distribution measuring device, for example, as shown in Japanese Patent Laid-Open No. 10-332423, a two-dimensional pH distribution measuring device for measuring a two-dimensional pH distribution using a CCD as shown in FIG. Chemical CCD device). In this chemical CCD device, a plurality of potential wells configured to change the depth according to the hydrogen ion concentration (pH) are two-dimensionally arranged as sensor elements, and charges are injected into these potential wells. Thus, the pH is converted into charges corresponding to the size of the potential well.
[0015]
In FIG. 1, reference numeral 3 denotes an image output device such as a computer that can process an output signal from the chemical CCD device 1 and output an image. The color display 4 displays the pH distribution on the sensor surface 2 two-dimensionally. It has.
[0016]
Next, an example of a method for detecting a nucleic acid using the chemical CCD apparatus 1 will be described with reference to FIG. 2, taking a combination of probe DNA and target DNA as an example. In addition, the arrow X of FIG. 1 has shown the advancing direction of the process.
[0017]
First, DNA to be probe DNA (solid phase probe) 5 is collected by PCR amplification (see symbol A in FIG. 2).
[0018]
The plurality of amplified probe DNAs 5 are plotted on a nylon membrane 6 using a microarrayer (spotter) and fixed with a UV crosslinker (see symbol B in FIG. 2). The nylon membrane 6 used here has, for example, a thickness of several tens to several hundreds of μm and is approximately the same size as the sensor surface 2. Then, a nylon membrane 6 on which a plurality of probe DNAs 5 are fixed is placed on the sensor surface 2 of the chemical CCD device 1 (see reference sign D in FIG. 2). In this case, the mounting positions of the plurality of probe DNAs 5 provided on the nylon membrane 6 are stored as data in the memory of the image output device 3. In addition, 4a has shown the position corresponding to the several sensor element which comprises the sensor surface 2, and probe DNA5 is located so that it may correspond to each of these positions.
[0019]
On the other hand, the target DNA (liquid phase probe) 8 is prepared by heat- or alkali-treating the DNA 7 having a double helix structure into a single strand, or by directly chemically synthesizing a single-stranded DNA. Labeling is performed either before or after that. Specifically, the DNA 7 having a double helix structure is incorporated with a nucleotide bonded with a linking agent 9 such as biotin using a polymerase reaction and labeled, and then treated with heat or alkali to form a single-stranded target DNA 8. And Alternatively, when chemically synthesizing single-stranded DNA, the end is labeled with a linking agent 9 such as biotin or digoxigenin to obtain target DNA 8. Alternatively, DNA 7 having a double helix structure is treated with heat or alkali to form a single-stranded target DNA 8, and the end of each target DNA 8 is labeled with a linking agent 9 such as biotin or digoxigenin (see symbol C in FIG. 2). ), This is taken as a sample.
[0020]
The labeled target DNA 8 is supplied as a sample onto the nylon membrane 6, and the probe DNA and the target DNA are hybridized (see symbol D in FIG. 2). At this time, some target DNAs 8 hybridize with the probe DNA 5 to form a complex 10. Then, the nylon membrane 6 is washed with a washing solution to remove the target DNA 8 ′ that did not form the complex 10 with the probe DNA 5 (see symbol D in FIG. 2).
[0021]
Subsequently, an ABC method using biotinylated enzyme (preferably biotinylated veroxidase) or avidin, biotinylated enzyme (preferably biotinylated veroxidase), or enzyme-labeled anti-digoxigenin antibody (preferably anti-digoxigenin-polyperoxidase antibody) ) Is used to label the complex 10 of the probe DNA 5 and the target DNA 8 with an oxidoreductase 11 such as peroxidase or glucose oxidase (see symbol E in FIG. 2). Note that reference numeral 11 ′ is a surplus oxidoreductase.
[0022]
Then, a substrate 12 such as hydrogen peroxide and a phenol derivative or glucose is added to the complex 10 labeled with the oxidoreductase 11, for example, and a oxidoreductase and a substrate (if necessary, a cofactor such as a coenzyme or a metal ion). ) To cause an oxidation-reduction reaction (see symbol F in FIG. 2). Then, H ⁺ ions 13 are generated by this oxidation-reduction reaction, and these H ⁺ ions 13 are detected by the sensor surface 2. In the chemical CCD device 1, a signal related to pH in each sensor element on the sensor surface 2 is sent as primary data to the image output device 3, and this is converted into two-dimensional information. The color of the changed location is changed and displayed in color, and the base sequence of the target DNA 8 can be determined by computer processing. In addition, the position of the DNA that has become the complex 10 can be confirmed by visual observation, and the target DNA 8 contained in the sample can be confirmed. In FIG. 2, 4a represents a portion where the pH has changed, and 12 ′ represents an excess substrate.
[0023]
As described above, in the method for detecting a nucleic acid of the present invention, it is not necessary to use an expensive and large-scale optical system unlike the conventional fluorescence method, and the nucleic acid can be detected with an inexpensive and simple configuration. Then, by appropriately adjusting the amount of the substrate to be added, the generation amount of H ⁺ ions 13 can be adjusted, and highly sensitive detection becomes possible.
[0024]
In the nucleic acid detection method, the probe DNA 5 is fixed on the nylon membrane 6 and the target DNA 8 is added thereto. Therefore, the sensor surface 2, that is, the chemical CCD device can be obtained simply by replacing the nylon membrane 6. 1 can be reused. Therefore, the running cost is reduced.
[0025]
Further, in the nucleic acid detection method, the pH change is detected by the sensor surface 2 of the chemical CCD device 1, and the change with time can be grasped.
[0026]
FIG. 3 shows a second embodiment of the present invention. In this embodiment, the probe DNA 5 is directly fixed on the sensor surface 2 of the chemical CCD apparatus 1. Since the method for collecting and immobilizing the probe DNA 5 and the subsequent processing in the second embodiment are the same as the method and processing in the first embodiment, detailed description thereof is omitted. In addition, 6b in the figure has shown the fixed position corresponding to the several sensor element which comprises the sensor surface 2. FIG.
[0027]
In the first and second embodiments described above, the complex 10 is labeled with the oxidoreductase 11, but instead, the target DNA 8 is oxidized as in the embodiment shown in FIG. It may be labeled with the reductase 11.
[0028]
The above embodiments are all detection methods for DNA, but the nucleic acid detection method of the present invention can be applied to RNA as well. In this case, the RNA is subjected to a reverse transcription reaction. What is necessary is just to form target DNA and probe DNA, and subsequent operation is the same as that of said each embodiment. Alternatively, RNA can be immobilized on nylon membrane 6 or sensor surface 2 as probe RNA.
[0029]
In the above embodiment, the change in pH is detected by the chemical CCD device 1, but the present invention is not limited to this, and various two-dimensional pH distribution measuring devices can be used. For example, a two-dimensional pH distribution measuring device described in JP-A-8-213580 and JP-A-8-320305, a CMOS sensor or a probe described in JP-B-5-33445 When the number of DNAs 5 is small, an ISFET array described in Japanese Utility Model Laid-Open No. 4-24061 can be used. Further, as described in Sensors and Actuators B61 (1999) 154-162, a plurality of sensor electrodes may be provided, and probe DNAs to which pyrrole is applied by applying a voltage to each electrode may be fixed to each electrode. Good. In this case, it is necessary to provide a pH sensor beside the electrode.
[0030]
Further, a dehydrogenase such as glucose dihydrogenase may be used as the oxidoreductase 11 that causes an oxidation-reduction reaction with the substrate 12. Further, when the substrate 12 is added to the complex 10, NAD, NADP, NADH, NADPH, etc. May also be added.
[0031]
Furthermore, instead of the nylon membrane 6, another resin membrane such as nitrocellulose may be used.
[0032]
【The invention's effect】
As described above, according to the nucleic acid detection method of the present invention, nucleic acids such as DNA can be measured with high sensitivity, speed, and low cost.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing the overall configuration of an apparatus for carrying out the nucleic acid detection method of the present invention.
FIG. 2 is a diagram for explaining an example of an operation procedure in the nucleic acid detection method.
FIG. 3 is a diagram showing another embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a diagram for explaining another example of the operation procedure in the nucleic acid detection method of the present invention.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Two-dimensional pH distribution measuring apparatus, 2 ... Sensor surface, 5 ... Probe nucleic acid, 6 ... Resin membrane, 8 ... Target nucleic acid, 10 ... Complex, 11 ... Enzyme, 12 ... Substrate, 13 ... Hydrogen ion.

Claims

A resin membrane on which a plurality of probe nucleic acids are immobilized is placed on the sensor surface of a two-dimensional pH distribution measuring device, and a single-stranded target nucleic acid is supplied onto the membrane as a sample to hybridize the probe nucleic acid and target nucleic acid. is soy, then produce a complex of the probe nucleic acid and a target nucleic acid reacts with the substrate labeled enzymatically processed to increase or decrease the hydrogen ions, and the substrate was added to the labeled treated complex, and the enzyme A method for detecting a nucleic acid, wherein a reaction is caused by the substrate, and hydrogen ions that increase or decrease by the reaction are detected by the sensor surface.

A single-stranded target nucleic acid labeled with an enzyme that increases or decreases hydrogen ions by reacting with a substrate is placed on the sensor surface of a two-dimensional pH distribution measuring device, with a plurality of probe nucleic acids immobilized on the sensor surface. supplied on a membrane as the sample and a probe nucleic acid and a target nucleic acid is hybridized, then the resulting addition of the substrate to the complex of the probe nucleic acid and a target nucleic acid, to cause a reaction by the said and the enzyme substrate A method for detecting a nucleic acid, wherein hydrogen ions that increase or decrease due to this reaction are detected by the sensor surface.

A plurality of probe nucleic acids are immobilized on the sensor surface of the two-dimensional pH distribution measuring device, a single-stranded target nucleic acid is supplied as a sample on the sensor surface, and the probe nucleic acid and the target nucleic acid are hybridized. the complex of the probe nucleic acid and a target nucleic acid reacts with the substrate labeled enzymatically processed to increase or decrease the hydrogen ion, the addition of the substrate to the labeled treated complex, the reaction by the said and the enzyme substrate A method for detecting a nucleic acid, characterized in that hydrogen ions that are caused to increase and decrease by this reaction are detected by the sensor surface.

Multiple probe nucleic acids are immobilized on the sensor surface of a two-dimensional pH distribution measurement device, and a single-stranded target nucleic acid labeled with an enzyme that reacts with a substrate to increase or decrease hydrogen ions is supplied as a sample onto the sensor surface. to, a probe nucleic acid and a target nucleic acid is hybridized, by adding the substrate to its complex with time resulting probe nucleic acid and a target nucleic acid, to cause a reaction by the said and the enzyme substrate, or increased by this reaction A method for detecting a nucleic acid, wherein hydrogen ions that decrease are detected by the sensor surface.

The method for detecting a nucleic acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the enzyme is an oxidoreductase.

The method for detecting a nucleic acid according to any one of claims 1 to 5, wherein a cofactor such as a coenzyme, a prosthetic molecule or a metal ion is also added when the substrate is added to the complex.