JP4273293B2 - Ｇｒｆ作用の阻害による新規抗自己免疫疾患剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
Ｇｒｆ作用の阻害による新規抗自己免疫疾患剤、及びそのスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4273293B2 JP4273293B2 JP2002143221A JP2002143221A JP4273293B2 JP 4273293 B2 JP4273293 B2 JP 4273293B2 JP 2002143221 A JP2002143221 A JP 2002143221A JP 2002143221 A JP2002143221 A JP 2002143221A JP 4273293 B2 JP4273293 B2 JP 4273293B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- grf
- growth hormone
- receptor
- releasing factor
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗自己免疫疾患剤、すなわち自己免疫疾患の予防剤または治療剤に関する。さらに本発明は、抗自己免疫疾患剤の新規有効成分を探索し取得するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ、多発性硬化症、及び全身性エリテマトーデスなどは一見異なった病態を示すが、いずれも病変部位に炎症が認められる疾患である。これらの疾患は、本来自己以外の外来異物を認識するはずの抗体が、自己の組織や細胞の抗原、すなわち自己抗原と反応して生じる自己免疫現象が病因となって生じる自己免疫疾患であると考えられている。
【０００３】
自己抗原に対する抗体や自己反応性Ｔ細胞は通常健常人にも見られることが知られており、これらが存在するだけでは自己免疫疾患に至らない。これは、通常自己抗原に対する免疫反応には免疫学的寛容(トレランス)の状態が成立しているからである。これに対して、自己免疫疾患患者では、自己抗原に対する上記トレランスが何らかの原因で破綻していると考えられている。その要因としては抗原に関与するもの、抗原提示に関与するもの、及びトレランスの制御に関与するものなどが考えられているが、不明な点が多く、未だそのメカニズムは解明されていない。
【０００４】
ところで成長ホルモン放出因子（growth hormone-releasing factor；GRF）（成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone, GHRH)とも呼ばれる）（以下、単に「ＧＲＦ」ともいう。）は、視床下部より分泌される４４個のアミノ酸よりなるペプチドホルモンである。当該ＧＲＦは、その受容体（growth hormone-releasing factor receptor；GRFR、以下「ＧＲＦ受容体」ともいう）に結合し、Ｇタンパクの活性化を介して細胞内サイクリックＡＭＰ（以下、単に「cAMP」ともいう）濃度を上昇させ、結果として下垂体から成長ホルモン（GH）の放出を促進する作用を有している。またＧＲＦは、前記のような経路の他に、副経路として、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることによりProtein Kinase A（PKA）を活性化し、細胞内へのカルシウム流入を増加させることにより成長ホルモンの放出を促進する作用も有している。
【０００５】
以上のようにＧＲＦは、成長ホルモンの放出（分泌）との関連性がよく知られているホルモンであり、従来より、成長ホルモンの分泌能を検査し、下垂体性小人症や原発性甲状腺機能低下症を診断するための検査薬として使用されている。しかしながら、当該ＧＲＦと自己免疫疾患との関連は、全く知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規な作用機序に基づく抗自己免疫疾患剤を提供することである。さらに本発明は、かかる抗自己免疫疾患剤の有効成分となる候補物質を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、自己免疫疾患の一つである多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（以下、単に「EAE」ともいう。）の発症に対する成長ホルモン放出因子（GRF）の影響について検討していたところ、ＧＲＦの作用を阻害することによってＥＡＥの発症が有意に抑制できるという新たな知見を見いだした。
具体的には、ＧＲＦ受容体（GRFR）遺伝子を人為的に欠損させたホモ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/lit）（ＧＲＦＲホモ欠損マウス）及びヘテロ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/+）（ＧＲＦＲヘテロ欠損マウス）に対して実験的にＥＡＥ発症を誘導したところ、ＧＲＦＲホモ欠損マウスは全観察期間を通して全くＥＡＥを発症せず、またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスについても野生型マウスと比較してＥＡＥの発症が有意に抑制されるという結果が得られた。また、ＧＲＦ受容体に対する公知のＧＲＦアンタゴニストをEAEマウス（EAE発症誘導マウス）に投与したところ、ＥＡＥ発症を実験的に誘導してもＥＡＥを発症せず、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害することによりＥＡＥの発症が有意に抑制できることを確認した。
【０００８】
本発明者は、上記の知見、すなわちＧＲＦが自己免疫疾患の発症と関連していること、そして当該ＧＲＦの作用を阻害することによって自己免疫疾患の発症が抑制できるという知見から、ＧＲＦ阻害作用を有する物質が自己免疫疾患の予防剤または治療剤として有効に利用できるとの確信を得た。本発明はかかる知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
項１． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤。
項２． 成長ホルモン放出因子阻害作用が、成長ホルモン放出因子受容体（GRF受容体）を介した成長ホルモン放出因子（GRF）の作用を阻害する作用である、請求項１記載の抗自己免疫疾患剤。
項３． 成長ホルモン放出因子阻害作用が、ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する作用である、項２記載の抗自己免疫疾患剤。
項４． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質がＧＲＦのペプチドアナログである、項３記載の抗自己免疫疾患剤。
項５． 成長ホルモン放出因子阻害作用が、ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用であるか、あるいはＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用である、項１に記載の抗自己免疫疾患剤。
項６． 自己免疫疾患が多発性硬化症または慢性関節リウマチ症である、項１乃至５のいずれかに記載の抗自己免疫疾患剤。
項７． 被験物質の中から成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を探索する工程を有する、抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法。
項８． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用の阻害を指標として探索することを特徴とする項７に記載のスクリーニング方法。
項９． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害を指標として探索することを特徴とする項８に記載のスクリーニング方法。
項１０． 下記の工程（i）、(ii)及び(iii)を含む項９に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法：
(i) 被験物質の存在下で、ＧＲＦ受容体若しくはそのホモログ（以下、「ＧＲＦ受容体等」という）とＧＲＦ若しくはそのホモログ（以下、「ＧＲＦ等」という）とを接触させる工程、
(ii) 上記ＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させることによって得られるＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を低下させる被験物質を選択する工程。
項１１． 項１０に記載の工程(i)、(ii)及び(iii)に更に：
(iv) 上記(iii)で選択された被験物質の中から、更にＧＲＦと同様の作用を生じない被験物質を選択する工程
を含む、項１０に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法。
項１２． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体の発現阻害を指標として探索することを特徴とする項７に記載のスクリーニング方法。
項１３． 下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む項１２に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質をＧＲＦ受容体を発現可能な細胞と接触させる工程、
（ii）被験物質を接触させた細胞のＧＲＦ受容体の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない上記に対応するＧＲＦ受容体を発現可能な細胞（対照細胞）のＧＲＦ受容体の発現量（対照発現量）と比較する工程、
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量に比してＧＲＦ受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程。
項１４． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦの発現又は分泌の阻害を指標として探索することを特徴とする項７に記載のスクリーニング方法。
項１５． 下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む項１４に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質をＧＲＦを発現可能な細胞と接触させる工程、
（ii）被験物質を接触させた上記細胞のＧＲＦの発現量または分泌量を測定し、該発現量または分泌量を、被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞のＧＲＦの発現量（対照発現量）又は分泌量（対照分泌量）と比較する工程、
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量または対照分泌量に比してＧＲＦの発現量または分泌量を低下させる被験物質を選択する工程。
項１６． 抗自己免疫疾患剤が多発性硬化症または慢性関節リウマチの予防または治療薬である、項７乃至１５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項１７． 項７乃至１６いずれか記載のスクリーニング方法により得られる成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤。
項１８． 有効量の成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を含有する抗自己免疫疾患剤。
項１９． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を含有する抗自己免疫疾患剤を有効量、自己免疫疾患に罹患した被験者に投与することからなる、自己免疫疾患の予防または治療方法。
項２０． 自己免疫疾患が多発性硬化症または慢性関節リウマチである、項１９に記載の自己免疫疾患の予防または治療方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１１】
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書においてＤＮＡとは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１３】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
Ｉ．抗自己免疫疾患剤
前述するように、本発明者は成長ホルモン放出因子（GRF）の作用を阻害することによって自己免疫疾患の発症を抑制乃至は遅延することができることを見いだした。このことから、成長ホルモン放出因子（GRF）の作用を阻害する物質は、自己免疫疾患の予防または治療に有効に利用できると考えられる。本発明の抗自己免疫疾患剤は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、ＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効成分とすることを特徴とする。
【００１６】
一般に「自己免疫疾患」は、自己の組織を構成する成分に反応する抗体あるいはリンパ球が、体内で持続的に産生されることによって組織障害をきたす疾患であり、大別すると下記に掲げる臓器特異的自己免疫疾患と臓器非特異的自己免疫疾患の２つに分類することができる。
【００１７】
(1) 臓器特異的自己免疫疾患：橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重傷筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群。
【００１８】
(2)臓器非特異的自己免疫疾患：慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病。
【００１９】
本発明はこれらの「自己免疫疾患」を任意に対象とするものである。好ましくは「実験的自己免疫性脳脊髄炎」と同一若しくは類似のメカニズムによって発症する自己免疫疾患を対象とすることができる。かかる自己免疫疾患として、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスを例示することができる。より好ましくは多発性硬化症及び慢性関節リウマチであり、特に好ましくは多発性硬化症である。
【００２０】
また本発明の「抗自己免疫疾患剤」とは、上記各種の自己免疫疾患に対して、その発症を阻害若しくは抑制する作用、その発症を遅延させる作用、発症後その症状を軽減若しくは改善する作用、または疾患を治癒する作用のいずれか少なくとも１つの作用を有するものである。その意味で、本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患予防剤、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患改善剤、または自己免疫疾患治療剤と言い換えることもできる。中でも本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患の発症を阻害若しくは抑制する作用、または発症を遅延させる作用に優れており、自己免疫疾患予防剤として特に有効に使用することができる。
【００２１】
ここで本発明が対象とする「成長ホルモン放出因子（growth hormone-releasing factor：ＧＲＦ）」とは、「従来の技術」の欄に記載されるようにＧＲＦ受容体に結合することによって下垂体からの成長ホルモン（GH）放出を促進する作用を有する視床下部ホルモンの一つである。その意味で成長ホルモン放出ホルモン（growth hormone-releasing hormone、GHRH）とも呼ばれる。
【００２２】
その塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank アクセッション番号：NM 021081（塩基配列：配列番号１）, NP 066567（アミノ酸配列：配列番号２），NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, 及びM 31654などに記載されている。
【００２３】
本発明において「ＧＲＦ阻害作用」とは、その作用機序の別を問うことなく、上記ＧＲＦの機能発現を阻害する作用を広く意味するものである。なお、ここで「ＧＲＦの機能発現を阻害する作用」には、ＧＲＦの蛋白質合成（ＧＲＦの遺伝子発現を含む）や分泌を阻害する作用、及び発現したＧＲＦのＧＲＦ受容体を介した作用（シグナル伝達）を阻害する作用が包含される。本明細書では、このようなＧＲＦの機能発現の阻害を単にＧＲＦ作用阻害またはＧＲＦの阻害ということもある。
【００２４】
これらのＧＲＦ阻害作用は、具体的には １) ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用（シグナル伝達）を阻害する作用、２) ＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用、及び３) ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用に大別することができる。
【００２５】
なお、本発明の「ＧＲＦ阻害作用を有する物質」は、上記に掲げる阻害作用のいずれか少なくとも１つの作用を有する物質であればよく、その形態や性状の別を何ら問うものではない。また、本発明の「ＧＲＦ阻害作用を有する物質」は、少なくともヒトＧＲＦに対して阻害作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦに対する阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００２６】
以下、ＧＲＦ阻害作用を有する物質について、具体的に説明する。
【００２７】
１）ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する物質
後述の実施例に示すように、ＧＲＦ受容体を欠損させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されること、及びＧＲＦ受容体に対してＧＲＦとＧＲＦアンタゴニストを競合させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されることが判明した。この知見は、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する物質、言い換えればＧＲＦのＧＲＦ受容体を介したシグナル伝達を阻害する物質は自己免疫疾患に対して抑制的に働き、抗自己免疫疾患剤の有効成分となりえることを裏付けるものである。
【００２８】
ここでＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する物質は、その作用部位に応じて下記の(1) ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する物質、及び(2) ＧＲＦ受容体の下流のシグナル伝達系に作用してＧＲＦの細胞内シグナル伝達を阻害する物質、に分類することができる。
【００２９】
(1) ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する物質
ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害することにより、ＧＲＦ受容体に対するＧＲＦの作用（シグナル伝達）を阻害することができる。かかる結合阻害作用を有する物質としては具体的には、▲１▼ ＧＲＦ受容体に結合することにより、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質、または、▲２▼ ＧＲＦに結合することにより、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質を挙げることができる。なお、▲１▼の物質は、いわゆるＧＲＦ受容体に対してＧＲＦのアンタゴニストとしての作用を有するものであり、自らＧＲＦ受容体に結合してもそれ自体がＧＲＦと質的且つ量的に同じ作用（シグナル伝達）を発揮しないことが必要である。ここで、「ＧＲＦと同じ作用を発揮しない」とは、ＧＲＦと質的に同じ作用を発揮しない場合（ＧＲＦ機能の喪失）だけでなく、仮にＧＲＦと質的に同じ作用を発揮する場合であっても量的にＧＲＦの作用よりも低減された作用を発揮する場合も含まれる。
【００３０】
▲１▼ ＧＲＦ受容体に結合して、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質かかる物質としては、具体的にはＧＲＦ受容体に結合する結合ドメイン（Science, Vol.218, 585(1982)、Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 123, 854(1984)）を有しＧＲＦの機能を欠損したＧＲＦ改変体や、抗ＧＲＦ受容体抗体等を例示することができる。なお、当該ＧＲＦ受容体に結合する物質は、少なくともヒトＧＲＦ受容体に対して結合性を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体に対する結合性の有無は、特に制限されない。
【００３１】
ここで、上記ＧＲＦ改変体としては、ＧＲＦ受容体への結合ドメインだけを有するＧＲＦの改変蛋白質〔または改変オリゴ（ポリ）ペプチド〕、またはＧＲＦ受容体への結合ドメイン以外の領域のアミノ酸配列を人為的に任意の数、欠失させるか、他のアミノ酸で置換または挿入（付加）することによって、ＧＲＦの機能を喪失してなるＧＲＦの改変蛋白質〔または改変オリゴ（ポリ）ペプチド〕を例示することができる。また、ＧＲＦ改変体は、前述するように少なくともヒトＧＲＦ受容体と結合して該受容体へのヒトＧＲＦの結合を阻害するものであって、且つそれ自体がＧＲＦと同じ作用を発揮しないものであれば、その由来は特に制限されるものではない。
【００３２】
なお、例えばＧＲＦ受容体に対するヒトＧＲＦの結合ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、上記文献に示されるように公知である。よって、ヒトＧＲＦの結合ドメインからなるＧＲＦ改変体は、これらの情報並びに下記の改変方法から当業者であれば容易に取得することができる。
【００３３】
また、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合ドメイン以外のアミノ酸領域を人為的に改変する方法も、当業者に公知の手法であり、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書を参考にして行うことができる。具体的には、サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987) ;同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」,日本製化学会編, p.105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983) 〕、及びこれらの手法を任意に組み合わせることによって実施することができる。
【００３４】
なお、改変したＧＲＦ蛋白質〔オリゴ（ポリ）ペプチド〕（ＧＲＦ改変体）が、ＧＲＦと同じ作用を発揮しないか否かは、該ＧＲＦ改変体を動物に投与してＧＨ分泌能を測定することによって評価することができる。
【００３５】
また、▲１▼の物質として例示される抗ＧＲＦ受容体抗体としては、具体的にはＧＲＦ受容体の細胞外ドメイン（Nature,Vol.360,p765-768(1992)）に対する抗体を例示することができる。なお、当該抗ＧＲＦ受容体抗体は、少なくともヒトＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを認識して結合するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体の細胞外ドメインへの認識能や結合能の有無は、特に制限されない。
【００３６】
当該抗ＧＲＦ受容体抗体は、ヒトＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを有する蛋白質を免疫抗原として常法に従って調製することができ、モノクローナル抗体であってもまたポリクローナル抗体であってもよい。具体的には、これらの抗体は、例えば“Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)”や“Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 12-11.13”等の基本書を参考にして容易に作製することができる。ここでヒトＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを有する蛋白質の取得は、上記文献（Nature）に記載される当該蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列の情報から当業者であれば容易に取得することができる。
【００３７】
さらに▲１▼の物質には、その他の蛋白質やペプチド、又は低分子化合物なども含まれる。
【００３８】
このうちペプチドとしては、具体的には、ヒトＧＲＦ受容体に結合して当該受容体に対するヒトＧＲＦの結合を阻害する作用を有する、ＧＲＦのペプチドアナログを例示することができる。当該ＧＲＦのペプチドアナログは、それ自身はＧＲＦと同じ作用を持たず、ヒトＧＲＦ受容体と結合してヒトＧＲＦに対する拮抗作用を有する、いわゆるＧＲＦのアンタゴニストである。なお、かかるＧＲＦのペプチドアナログは、少なくともヒトＧＲＦ受容体に対して結合能を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体への結合能の有無、ならびにペプチドの由来の別は、特に制限されない。
【００３９】
かかるＧＲＦのペプチドアナログとしては、具体的にはMZ-4-71 ([Ibu0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGHRH-(1-28)Agm)、MZ-4-169 ([Nac0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGHRH-(1-29)NH2)、あるいはMZ-4-181 ([Nac0-His1,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGHRH-(1-29)NH2)（以上、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, p.12298-12302(1994)）、MZ-5-156 ([PhAc0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGH-RH(1-28)Agm)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.96, p.226-231(1999))、またはJV-1-36 ([PhAc0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Arg9,Abu15,Nle27,D-Arg28,Har29]hGH-RH(1-29)NH2)、JV-1-38([PhAc0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Har9,Tyr(Me)10,Abu15,Nle27,D-Arg28,Har29]hGH-RH(1-29)NH2)、JV-1-42 ([PhAc0-His1,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Arg9,Abu15,Nle27,D-Arg28,Har29]hGH-RH(1-29)NH2)（以上、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.97, p.1218-1223(2000)）などが例示される。また、国際公開公報 WO95/16707（特に請求項１〜20）、あるいはWO91/16923（特に請求項16）に記載のペプチドアナログを挙げることもできる。
【００４０】
また、ＧＲＦ受容体に結合してＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する作用を有する低分子化合物は、公知の低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００４１】
▲２▼ ＧＲＦに結合して、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質
当該物質として抗ＧＲＦ抗体を例示することができる。ここで抗ＧＲＦ抗体は、具体的にはＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメイン（Science, Vol.218, 585 (1982)、Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.123, 854 (1984)）に対する抗体が挙げられる。なお、かかる抗ＧＲＦ抗体は、少なくともヒトＧＲＦの受容体結合ドメインを認識し結合するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦへの結合能の有無、ならびに製造原料として用いる抗原（蛋白質、ポリペプチド）の由来の別は、特に制限されない。
【００４２】
当該抗ＧＲＦ抗体は、ヒトＧＲＦの受容体結合ドメインを有するポリペプチド又は蛋白質を免疫抗原として常法に従って調製することができ、モノクローナル抗体であってもまたポリクローナル抗体であってもよい。具体的には、これらの抗体は、前述する各種の基本書を参考にして容易に作製することができる。
【００４３】
ここでヒトＧＲＦの受容体結合ドメインを有する蛋白質の取得は、上記文献（Science, BBRC）に記載される当該受容体結合ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列の情報から当業者であれば容易に取得することができる。さらに▲２▼の物質には、蛋白質やペプチド、又は低分子化合物などが含まれる。
【００４４】
ＧＥＲに直接結合して、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する作用を有する例えば低分子化合物は、公知の低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００４５】
(2)ＧＲＦの細胞内シグナル伝達を阻害する物質
「従来の技術」の欄に記述するように、ＧＲＦはその受容体（ＧＲＦ受容体）に結合すると、Ｇタンパクの活性化を引き起こし、該活性化を介してｃＡＭＰ濃度を上昇させ、結果として下垂体からの成長ホルモン（GH）の放出を促進する作用を有している。またＧＲＦは、前記の経路の他に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることによりProtein Kinase Aを活性化し、細胞内へのカルシウム流入を増加させて成長ホルモンの放出を促進する作用も有している。
【００４６】
従って、これらのＧＲＦの受容体結合後の細胞内におけるシグナル伝達（ＧＲＦ受容体の下流でのシグナル伝達）を阻害することによって結果としてＧＲＦの作用を阻害することのできる物質も、本発明のＧＲＦ阻害作用を有する物質に含まれる。
【００４７】
当該物質としては、ＧＲＦの細胞内シグナル伝達に係わる各種因子の発現や作用を誘導（亢進）又は抑制することにより、結果的に上記ＧＲＦの作用を実質上阻害して、終局的に成長ホルモン放出促進作用を阻害することのできる物質を例示することができる。
【００４８】
具体的には、例えばＧＲＦ受容体に共役するＧタンパクの発現や作用（活性化）を抑制するようなタンパク質やペプチド、低分子化合物などを挙げることができる。
【００４９】
２）ＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質
後述の実施例に示すように、ＧＲＦ受容体を欠損させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されることが判明した。この知見は、ＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質は、自己免疫疾患に対して抑制的に働き、抗自己免疫疾患剤の有効成分となりえることを裏付けるものである。
【００５０】
ＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質としては、作用機序の別を問わず、結果としてＧＲＦ受容体としての機能を有する蛋白質の産生を阻害する作用を有するものであればよい。例えば、ＧＲＦ受容体遺伝子の複製、転写または翻訳等の任意の過程を阻害することによって核酸レベルでのＧＲＦ受容体（蛋白質）の合成を阻止する作用を有するアンチセンス分子を挙げることができる。
【００５１】
なお、ここで対象とする阻害物質は、少なくともヒトＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体に対する発現阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００５２】
具体的には、ＧＲＦ受容体遺伝子（GenBank アクセッション番号：NM 000823[配列番号３], AY 008835, AY 008834, AF 184896, AB 022597, AB 022596, L 07380, L 07379などを参照）に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５３】
なお、上記アンチセンス分子は、上記ＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列に対して100％相補的な配列を有するポリヌクレオチドである必要はなく、ストリンジェントな条件で、ヒトＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその改変物〔例えば、修飾ポリ（オリゴ）ヌクレオチドやペプチド核酸等、公知の手法によって設計されるアンチセンス分子を含む〕であってもよい。かかるものとしては、具体的には上記ＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列の相補配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものを挙げることができる。
【００５４】
またＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質には、蛋白質、ペプチド、及び低分子化合物等も含まれる。ヒトＧＥＲ受容体の発現を阻害する作用を有する、例えば低分子化合物は、公知の低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００５５】
３）ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する物質
後述の実施例に示すように、ＧＲＦ受容体を欠損させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されること、及びＧＲＦ受容体に対してＧＲＦとＧＲＦアンタゴニストとを競合させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されることが判明した。この知見は、ＧＲＦの生成を阻害する物質、すなわちＧＲＦの発現または分泌を阻害する物質は、自己免疫疾患に対して抑制的に働き、抗自己免疫疾患剤の有効成分となりえることを裏付けるものである。
【００５６】
ＧＲＦの発現を阻害する物質としては、作用機序の別を問わず、結果としてＧＲＦとしての機能を有する蛋白質の産生を阻害する作用を有するものであればよい。例えば、ＧＲＦ遺伝子の複製、転写または翻訳等の任意の過程を阻害することによって核酸レベルでのＧＲＦ（蛋白質）の合成を阻止する作用を有するアンチセンス分子を挙げることができる。
【００５７】
なお、ここで対象とするＧＲＦ発現阻害物質は、少なくともヒトＧＲＦの発現を阻害する作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦに対する発現阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００５８】
具体的には、ＧＲＦ遺伝子（GenBank アクセッション番号：NM 021081［配列番号１］，NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, 及びM 31654などを参照）に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５９】
なお、上記アンチセンス分子は、上記ＧＲＦ遺伝子の塩基配列に対して100％相補的な配列を有するポリヌクレオチドである必要はなく、ストリンジェントな条件で、ヒトＧＲＦ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその改変物であってもよい。かかるものとしては、具体的には上記ＧＲＦ遺伝子の塩基配列の相補配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものを挙げることができる。
【００６０】
またＧＲＦの発現または分泌を阻害する物質には、蛋白質、ペプチド、及び低分子化合物等も含まれる。ＧＥＲの発現または分泌を阻害する作用を有する例えば低分子化合物は、低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００６１】
以上説明するＧＲＦ阻害作用を有する物質は、抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。また抗自己免疫疾患剤の有効成分は、上記に具体的に掲げる物質に特に限定されることなく、下記に記載する本発明のスクリーング方法によって取得することも可能である。
【００６２】
従って、本発明が対象とする抗自己免疫疾患剤には、上記のＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効量含有する製剤、並びに下記に記載するスクリーング方法によって取得されるＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効量含有する製剤がいずれも包含される。なお、ここでＧＲＦ阻害作用を有する物質の有効量は、それを含有する抗自己免疫疾患剤が結果としてＧＲＦ阻害効果を発揮するようなＧＲＦ阻害作用物質の配合量であればよく、特に制限されるものではない。また抗自己免疫疾患剤は、ＧＲＦ阻害作用物質以外に薬学的に許容される担体や各種の添加剤を含有していてもよい。
【００６３】
かかる担体や添加剤の種類、抗自己免疫疾患剤の形態、並びに抗自己免疫疾患剤の用法（投与形態、投与方法、投与量）については、後述の(III)の欄で詳細に説明する。
【００６４】
II ．抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明者は、後述する実施例に示すように、ＧＲＦの機能発現を阻害することによって自己免疫疾患の発症を抑制することができるという新たな知見を取得した。このことから、ＧＲＦ阻害作用を有する物質は抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用と考えられる。本発明のスクリーニング方法は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を探索することによって、抗自己免疫疾患剤の有効成分を取得しようとするものである。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法が対象とする「ＧＲＦ阻害作用を有する物質」は、結果としてＧＲＦの機能発現（機能発揮、作用）を阻害し得る物質であればよく、その作用機序を特に限定するものではない。ＧＲＦ阻害作用として、具体的には、１）ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用（シグナル伝達）を阻害する作用、２）ＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用、及び３）ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用を挙げることができる。また上記１）の阻害作用には、(1)ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する作用、及び(2)ＧＲＦの細胞内シグナル伝達を阻害する作用が含まれる。ＧＲＦ阻害作用を有する物質は、かかるＧＲＦ阻害作用の少なくとも１つを有するものであればよい。
【００６６】
抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得る候補物質としては、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物（低分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質となりえる物質または該物質を含む試料（これらを総称して「被験物質」という）を対象として実施することができる。なお、候補物質を含む試料（被験物質）には、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、及び菌体成分が含まれる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法は、かかる被験物質の中から上記に掲げるＧＲＦ阻害作用を指標として上記ＧＲＦ阻害作用の少なくとも１つを有する物質を探索することによって実施される。斯くして選別取得される被験物質は、抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。
【００６８】
以下、本発明のスクリーニング方法を、指標とするＧＲＦ阻害作用毎に具体的に説明する。
【００６９】
１）ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する作用を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用（シグナル伝達）に対する阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【００７０】
ここで探索の指標とする「ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用に対する阻害」としては、(1)ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害、(2)ＧＲＦの細胞内シグナル伝達の阻害を挙げることができる。
【００７１】
(1)ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【００７２】
当該スクリーニング方法は、特に制限されず当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能であるが、一例として、ＧＲＦ受容体にＧＲＦを接触させた場合と、ＧＲＦ受容体にＧＲＦ及び被験物質を接触させた場合とで、ＧＲＦ受容体に対するＧＲＦの結合性を比較し評価することを含むスクリーニング方法を挙げることができる。当該スクリーニング方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる。
被験物質の存在下で、ＧＲＦ受容体若しくはＧＲＦ受容体ホモログ（これらを纏めて「ＧＲＦ受容体等」ともいう）とＧＲＦ若しくはＧＲＦホモログ（これらを纏めて「ＧＲＦ等」ともいう）とを接触させる工程、
上記ＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させることによって得られるＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
上記(ii)の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を低下させる被験物質を選択する工程。
【００７３】
この場合、ＧＲＦ受容体若しくはＧＲＦ受容体ホモログ（ＧＲＦ受容体等）とＧＲＦ若しくはＧＲＦホモログ（ＧＲＦ等）との結合阻害は、▲１▼ＧＲＦ受容体等に結合することによって、ＧＲＦ等のＧＲＦ受容体等への結合を阻害する態様のものであってもよいし、▲２▼ＧＲＦ等に結合することによって、ＧＲＦ等のＧＲＦ受容体等への結合を阻害する態様のものであってもよく、その別を特に問うものではない。但し、この場合、とりわけ▲１▼の態様の場合は、ＧＲＦ受容体等に結合してもＧＲＦと同じ作用を発揮しない被験物質を選択することが必要である。このため、上記のスクリーニング方法で選別された被験物質は更に、下記：
(iv)上記(iii)で選択された被験物質の中から、更にＧＲＦと同じ作用を発揮しない被験物質を選択する工程に供することが好ましい。
【００７４】
なお、ここで、「ＧＲＦと同じ作用を発揮しない」とは、ＧＲＦと質的に同じ作用を発揮しない場合（ＧＲＦ機能の喪失）だけでなく、仮にＧＲＦと質的に同じ作用を発揮する場合であっても量的にＧＲＦの作用よりも低減された作用を発揮する場合も含まれる。
【００７５】
上記の選択方法は、特に制限されないが、具体的な方法としては、例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, p12298-12302 (1994) に記載される in vitro系 あるいは in vivo系の方法を挙げることができる。
【００７６】
上記本発明のスクリーニング方法で用いられるＧＲＦ受容体は、天然物であっても、合成品であってもまた組換え体であっても良い。また当該ＧＲＦ受容体はヒト由来のものであることが好ましいが、マウスなどヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体も同様に使用できる。
【００７７】
また、上記スクリーニング方法において、ＧＲＦ受容体に代えてＧＲＦとの結合能を保有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチド（例えば、ＧＲＦとの結合能を有するＧＲＦ受容体の変異体や誘導体）を用いることもできる。なお、本発明において、これらを「ＧＲＦ受容体ホモログ」と称する。例えばかかるＧＲＦ受容体の変異体としては、上記公知のＧＲＦ受容体（GenBankアクセッション番号：NM 000823［塩基配列：配列番号３］, NP 000814［アミノ酸配列：配列番号４］, AY 008835, AY 008834, AF 184896, AB 022597, AB 022596, L 07380, L 07379）に関して天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体及び人為的にＧＲＦ受容体のアミノ酸配列の一部が欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。
【００７８】
また本発明のスクリーニング方法に使用されるＧＲＦ受容体は、必ずしもその全アミノ酸配列を保持する必要はなく、少なくともＧＲＦとの結合部位、例えばＧＲＦ受容体の細胞外ドメイン(Nature, vol. 360, p.765-768, (1992))を有していれば良い。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、前記のＧＲＦ受容体に代えて、少なくともＧＲＦとの結合領域（例えばＧＲＦ受容体の細胞外ドメイン）を有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドを用いることもできる。本発明でいう「ＧＲＦ受容体ホモログ」には、このような蛋白質または（ポリ）ペプチドもまた包含される。更に、上記ＧＲＦ受容体の細胞外ドメインは、ＧＲＦとの結合能が維持されている限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失するか、他のアミノ酸残基によって置換、付加または挿入等されていてもよく、かかる改変されたＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを有する蛋白質または（ポリ）ペプチドも本発明でいう「ＧＲＦ受容体ホモログ」に包含される。
【００７９】
ＧＲＦ受容体の取得方法としては、以下の方法を例示することができる。
まず、ヒトまたは各種生物種に由来するＧＲＦ受容体のアミノ酸配列情報及びそれをコードする塩基配列情報（GenBankアクセッション番号：NM 000823［塩基配列：配列番号３］, NP 000814［アミノ酸配列：配列番号４］, AY 008835, AY 008834, AF 184896, AB 022597, AB 022596, L 07380, L 07379）をもとに、常法に従ってプローブ又はＰＣＲ用のプライマーを作成し、ヒト又は各種生物の脳下垂体前葉細胞由来のｃＤＮＡライブラリー等をクローニングすることによってＧＲＦ受容体をコードするｃＤＮＡを取得する。これらのクローニングは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
【００８０】
次いで調製したＧＲＦ受容体のｃＤＮＡを、ｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-199(1991)）、またはｐｃＤＮＡ1.1、ｐｃＤＮＡ3.1誘導体（いずれもインビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、得られた組換えベクターを適当な宿主に導入し培養することにより、導入したＧＲＦ受容体のｃＤＮＡによってコードされるＧＲＦ受容体蛋白質を細胞表面に発現させた形質転換細胞を作製することができる。
【００８１】
なお、ここで宿主としては、一般的に宿主細胞として広く普及している哺乳動物細胞株であるＬ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＢＡＬＢ/ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）や、ＣＯＳ細胞などが好ましいが、これに限定されることなく、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞などを用いることも可能である。また、前記ＧＲＦ受容体発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の導入方法であればどのような方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（J.Virol.,52, 456-467 (1973)）、ＬＴ-１（Panvera社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社製）を用いる方法などが挙げられる。次いで得られた形質転換細胞からＧＲＦ受容体を常法に従って単離する。具体的には、例えば R. G. Shorrら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2778-2782 (1982)、J. Biol. Chem. 257, 12341-12350(1982))の方法に従って、上記形質転換細胞を適当な可溶化剤（β-D-オクチルグルコシドなど）で可溶化することによりＧＲＦ受容体を含む粗抽出液を調製することができる。さらに該粗抽出液からＧＲＦ受容体を精製するには、例えばJ. L. Benovicら (Biochem., 23, 4510-4518 (1984))の方法などの当該技術分野における常法（例えば、抗ＧＲＦ受容体抗体を付けたアフィニティーカラムの使用など）を用いることができる。
【００８２】
またＧＲＦ受容体の変異体（ＧＲＦ受容体の改変されたアミノ酸配列を有する変異体）（ＧＲＦ受容体ホモログ）は、ＧＲＦ受容体のアミノ酸配列やそれをコードする塩基配列の情報に基づいて、サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987) ;同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」,日本製化学会編, p.105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983) 〕、及びこれらの手法を任意に組み合わせることによって調製することができる。
【００８３】
さらにＧＲＦ受容体の細胞外ドメインのみを有するＧＲＦ受容体ホモログは、前述するＧＲＦ受容体の調製方法において、ＧＲＦ受容体のｃＤＮＡに代えてＧＲＦ受容体の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを用いて上記と同様にして形質転換細胞を作製することによって調製することができる。この場合は、形質転換細胞の培養上清中に当該ＧＲＦ受容体ホモログを分泌させることができる。この場合、例えば、抗ＧＲＦ受容体抗体またはＧＲＦ受容体の細胞外ドメインに対する抗体を付けたアフィニティーカラムを使用することによって、培養上清から当該ＧＲＦ受容体ホモログを単離精製することができる。また、ペプチドタグを付加した状態で細胞外ドメインが発現生成されるように発現系を構築することによって、該タグに親和性のある物質を付けたカラムを用いて、形質転換細胞の培養上清から当該ＧＲＦ受容体ホモログを単離精製することができる。
【００８４】
なお、ここでＧＲＦ受容体の「細胞外ドメイン」をコードするｃＤＮＡの塩基配列は 前述するようにNature,Vol.360,765-768(1992) に記載されており、その取得も当業者であれば容易に行うことができる。さらに、当該「細胞外ドメイン」のアミノ酸配列の改変も前述する当業界における公知の方法に従って容易に行うことができる。また、このようにして改変されたＧＲＦ受容体（ＧＲＦ受容体ホモログ）について、ＧＲＦとの結合能の有無は、標識したＧＲＦと前記改変されたＧＲＦ受容体との結合量を、標識したＧＲＦと天然型ＧＲＦ受容体との結合量と比較することによって評価することができる。
【００８５】
なお、本発明のスクリーニング方法で用いられるＧＲＦ受容体またはＧＲＦ受容体ホモログ（ＧＲＦ受容体等）は、単離もしくは更に精製されたＧＲＦ受容体等であってもよいが、それらに限定されない。例えば、単離されたＧＲＦ受容体等に代えて、ＧＲＦ受容体等を発現した細胞を用いても良いし、またＧＲＦ受容体等を有する細胞膜を用いてもよい。
【００８６】
ＧＲＦ受容体等を発現した細胞としては、前述するＧＲＦ受容体等のｃＤＮＡを有するベクターを適当な宿主に導入し、培養することによって調製される形質転換細胞を挙げることができる。当該培養形質転換細胞はＧＲＦ受容体等を細胞表面に発現しているため、そのまま本発明のスクリーニング方法に用いることができる。
【００８７】
またＧＲＦ受容体等を有する細胞膜は、上記の形質転換細胞から調製することができる。調製方法の一例として下記の方法を挙げることができる。まず、上記の培養形質転換細胞に低張ホモジネートバッファー（10mM トリス−塩酸緩衝液、1mM EDTA、0.5mM PMSF（phenylmethanesulfonyl fluoride）若しくは1mM AEBSF、5μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン；pH7.4）を添加し、４℃で３０分間程度静置して細胞を低張破壊した後、ピペッティングでホモジナイズし、４℃で50,000×ｇ、３０分間遠心分離することにより、細胞膜画分の沈殿物を得る。そして、この沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理食塩水（トリス−塩酸緩衝液、154mMの塩化ナトリウム；pH7.4）に懸濁することにより、細胞膜画分を得ることができる。
【００８８】
その他、例えば F. Pietri-Rouxelらの方法（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179(1997)）などにより、培養形質転換細胞から細胞膜画分を得ることもできる。
【００８９】
本発明のスクリーニング方法で用いられるＧＲＦは、天然物、合成品及び組換え体の別を問わない。また当該ＧＲＦはヒト由来のものであることが好ましいが、マウスなどのヒト以外の哺乳類や他の生物種由来のＧＲＦも同様に使用できる。また、ＧＲＦに代えてＧＲＦ受容体との結合能を保有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチド（例えば、ＧＲＦ受容体との結合能を有するＧＲＦの変異体や誘導体）を用いることもできる。なお、本発明においてこれらを「ＧＲＦホモログ」と称する。例えばかかるＧＲＦの変異体としては、ＧＲＦの天然に存在するアレル変異体や天然に存在しない変異体、及び人為的にＧＲＦのアミノ酸配列の一部が欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。
【００９０】
また本発明のスクリーニング方法に使用されるＧＲＦは、必ずしもその全アミノ酸配列を保持する必要はなく、少なくともＧＲＦのＧＲＦ受容体に対する結合部位を有していれば良い。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、ＧＲＦに代えて、少なくともＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメイン（Science，Vol.218, 585 (1982); Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.123, 854 (1984)）を有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドを用いることもできる。本発明でいう「ＧＲＦホモログ」には、このような蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドも包含される。また、上記ＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメインは、ＧＲＦ受容体との結合能が維持されている限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失するか、他のアミノ酸によって置換、付加または挿入等されていてもよく、かかる改変されたＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメインを有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドも本発明でいう「ＧＲＦホモログ」に包含される。
【００９１】
ＧＲＦは、基本的に44アミノ酸からなる蛋白質である。よって、ヒトまたは各種生物に由来するＧＲＦのアミノ酸配列情報（GenBankアクセッション番号：NP 066567［配列番号２］, NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, M 31654）に基づいて、通常のペプチド合成法に準じて合成することができる。例えば、ペプチドの合成は文献〔ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991〕などに記載されている方法を参考にして実施することができる。また、ペプチド合成法によれば前述するＧＲＦホモログも容易に調製することができる。
【００９２】
また、ＧＲＦまたはＧＲＦホモログは、ＧＲＦの遺伝子情報（GenBankアクセッション番号：NM 021081［配列番号１］, NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, M 31654）に基づいて、前述するＧＲＦ受容体またはＧＲＦ受容体ホモログの調製方法に準じて、遺伝子工学的に作製することもできる。なおこの場合、ＧＲＦのｃＤＮＡのクローニングは、ヒト又はヒト以外の哺乳類のＧＲＦ産生腫瘍細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを対象として実施することができる。
【００９３】
さらにＧＲＦは商業的に入手できるものを利用してもよい。ＧＲＦは例えば住友製薬株式会社（日本）から入手することができる。
【００９４】
ＧＦＲまたはＧＲＦホモログは、そのままで用いてもよいし、任意の標識物質で標識されたものを用いることもできる。ここで標識物質としては、放射性同位体（例えば、125Ｉ等）、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、マーカータンパク質、またはペプチドタグなどを例示することができる。マーカータンパク質としては、例えばアルカリフォスファターゼ（Cell 63,185-194 (1990)）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、またはＨＲＰ(Horse radish peroxidase)などの従来公知のマーカータンパク質を挙げることができる。またペプチドタグとしては、例えばＭｙｃタグ（Glu-Gln-Lys-Lue-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Ile：配列番号５）、Ｈｉｓタグ（His-His-His-His-His-His：配列番号６）、ＦＬＡＧタグ（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp：配列番号７）などの従来公知のペプチドタグを挙げることができる。
【００９５】
上記本発明のスクリーニング方法(1)の工程（ｉ）において、被験物質の存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させる条件は、被験物質の非存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とが結合する条件であれば特に制限されない。また、単離されたＧＲＦ受容体等に代えて、ＧＲＦ受容体等を発現した細胞またはＧＲＦ受容体等を有する細胞膜を用いる場合も、当該細胞または細胞膜上に存在するＧＲＦ受容体等がＧＲＦ等と接触して両者が結合する条件であればよい。具体的には、細胞の場合は、通常の生存可能な培養条件下、または細胞膜の場合はトリス-塩酸緩衝生理食塩水などの生理的条件下を例示することができる。
【００９６】
抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質の選別は、例えば上記条件でＧＲＦ受容体等（ＧＲＦ受容体等を発現した細胞またはその細胞膜の上に存在するＧＲＦ受容体等を含む）とＧＲＦ等とを接触させて両者の結合を阻害する物質を探索することによって実施できる。具体的には、被験物質の存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させた場合のＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量が、被験物質の非存在下で上記と同様に接触させた場合に得られるＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量（対照結合量）よりも低下することを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。なお、ここでいう低下には、対照結合量と対比するまでもなく、ＧＲＦ等のＧＲＦ受容体等に対する結合が完全に阻害されて両者が結合しない場合、すなわちＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量が実質的にゼロの場合も包含される。
【００９７】
ＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量は、例えばＧＲＦ等に対する抗体を用いたウエスタンブロット法などの公知の方法により定量することができる。また、ＧＲＦ等として前述の標識ＧＲＦ等を用いる場合は、使用した標識物質に応じた測定方法（例えば、放射線測定法、蛍光検出法など）により、ＧＲＦ受容体等に結合したＧＲＦ等の量を定量することもできる。
【００９８】
(2) ＧＲＦの細胞内シグナル伝達の阻害を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦの細胞内シグナル伝達の阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【００９９】
当該方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる：
(i) 被験物質の存在下で、ＧＲＦ受容体またはそのホモログ(ＧＲＦ受容体等)を発現した細胞とＧＲＦまたはそのホモログ（ＧＲＦ等と）を接触させる工程、
(ii) 上記細胞のＧＲＦに起因する細胞内シグナル伝達物質の発現量または活性を測定し、当該発現量または活性を、被験物質非存在下でＧＲＦ受容体等を発現した細胞とＧＲＦ等とを接触させることによって得られる上記に対応する発現量または活性（対照発現量または対照活性）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の結果に基づいて、対照発現量または対照活性に比して発現量または活性を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１００】
２）ＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体の発現に対する阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【０１０１】
当該スクリーニング方法は、特に制限されず当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能であるが、一例として、ＧＲＦ受容体を発現可能な細胞に被験物質を接触させた場合と被験物質を接触させない場合とで、当該細胞のＧＲＦ受容体の発現量を比較し評価することを含むスクリーニング方法を挙げることができる。当該スクリーニング方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる。
(i) 被験物質をＧＲＦ受容体を発現可能な細胞と接触させる工程、
(ii) 被験物質を接触させた細胞のＧＲＦ受容体の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞のＧＲＦ受容体の発現量（対照発現量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量に比してＧＲＦ受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１０２】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組換え体の別を問わず、ＧＲＦ受容体を発現し得る細胞であればよい。またＧＲＦ受容体の由来も特に制限されず、ヒト由来のものであっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類や他の生物種に由来するものであってもよい。かかる細胞として、具体的にはＧＲＦ受容体をコードする遺伝子（DNA）を有する脳下垂体前葉細胞（ヒト及びその他の生物種由来のものを含む）、単離調製された初代脳下垂体前葉培養細胞を挙げることができる。また、前述する方法等によりＧＲＦ受容体のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入して調製される形質転換細胞を用いることもできる。また、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【０１０３】
上記本発明のスクリーニング方法２）の工程（ｉ）において、被験物質とＧＲＦ受容体発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つＧＲＦ受容体の遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐH、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【０１０４】
抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＧＲＦ受容体発現可能細胞とを接触させて、ＧＲＦ受容体の発現量を抑制する物質を探索することによって実施できる。具体的には、被験物質存在下でＧＲＦ受容体発現可能細胞を培養した場合のＧＲＦ受容体の発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するＧＲＦ受容体発現可能細胞を培養した場合に得られるＧＲＦ受容体の発現量（対照発現量）よりも低下することを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。なお、ここでいう低下には、対照発現量と対比するまでもなく、ＧＲＦ受容体が全く発現しない場合（ＧＲＦ受容体遺伝子（ｍＲＮＡ）が全く発現しない場合、ＧＲＦ受容体タンパクが全く生成しない場合）、すなわちＧＲＦ受容体の発現量が実質的にゼロの場合も包含される。
【０１０５】
上記のスクリーニング方法２）の工程(ii)において、ＧＲＦ受容体の発現量は、ＧＲＦ受容体遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定するか、またはＧＲＦ受容体タンパクの生成量を測定することによって評価することができる。また、ＧＲＦ受容体の発現量を測定する方法は、直接これらの遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量や蛋白質生成量を測定する方法でなくても、これらを反映する方法であればよい。すなわち、工程(ii)においてＧＲＦ受容体の発現量を測定するとは、直接的または間接的な方法の別を問わず、ＧＲＦ受容体遺伝子の発現量やＧＲＦ受容体蛋白質の生成量が評価できる方法の実施を広く包含するものである。
【０１０６】
具体的には、ＧＲＦ受容体の発現量の測定（検出および定量）は、ＧＲＦ受容体発現可能細胞のＧＲＦ受容体ｍＲＮＡの発現量を当該ＧＲＦ受容体ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド等を利用してノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法などの公知の方法やＤＮＡアレイを利用して測定したり、またＧＲＦ受容体発現可能細胞の細胞表面に発現したＧＲＦ受容体のタンパク量を抗ＧＲＦ受容体抗体を利用してウエスタンブロット法等の公知の方法を行うことによって実施することができる。また、ＧＲＦ受容体の発現量の測定（検出及び定量）は、ＧＲＦ受容体遺伝子制御領域〔例えば、ＧＲＦ受容体のプロモーター（Genbank Accession number:AF267729, AF121969, AF127135など）の下流領域〕に、例えばルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子等のマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、当該マーカー遺伝子由来の蛋白質の活性を測定することによっても実施することができる。本発明のＧＲＦ受容体の発現量を指標とした抗自己免疫疾患剤の有効成分（標的物質）のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。なお、融合遺伝子の作成及びマーカー遺伝子由来の活性測定は、公知の方法で行うことができる。
【０１０７】
３）ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦの発現または分泌に対する阻害作用を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【０１０８】
当該スクリーニング方法は、特に制限されず当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能であるが、一例として、ＧＲＦを発現可能な細胞に被験物質を接触させた場合と被験物質を接触させない場合とで、当該細胞のＧＲＦの発現量または分泌量を比較し評価することを含むスクリーニング方法を挙げることができる。当該スクリーニング方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる。
(i) 被験物質をＧＲＦを発現可能な細胞を接触させる工程、
(ii) 被験物質を接触させたＧＲＦ発現可能細胞のＧＲＦの発現量または分泌量を測定し、該発現量または分泌量を被験物質を接触させない上記に対応するＧＲＦ発現可能細胞（対照細胞）のＧＲＦの発現量または分泌量（対照発現量または対照分泌量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量または対照分泌量に比してＧＲＦの発現量または分泌量を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１０９】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組換え体の別を問わず、ＧＲＦを発現し得る細胞であればよい。またＧＲＦの由来も特に制限されず、ヒト由来のものであっても、マウスなどヒト以外の哺乳類や他の生物種に由来するものであってもよい。かかる細胞として、具体的にはＧＲＦをコードする遺伝子を有する腫瘍細胞（ヒト及びその他の生物種由来のものを含む）、単離調製された初代腫瘍培養細胞を挙げることができる。また、前述する方法等によりＧＲＦのｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入して調製される形質転換細胞を用いることもできる。また、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【０１１０】
上記本発明のスクリーニング方法３）の工程（ｉ）において、被験物質とＧＲＦ発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つＧＲＦ遺伝子（ｍＲＮＡ）が発現し得培養条件（温度、ｐH、培地組成など）、または生成したＧＲＦタンパクが分泌し得る培養条件（温度、ｐH、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【０１１１】
抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＧＲＦ発現可能細胞とを接触させて、ＧＲＦの発現量または分泌量を抑制する物質を探索することによって実施できる。具体的には、被験物質存在下でＧＲＦ発現可能細胞を培養した場合のＧＲＦの発現量または分泌量が、被験物質非存在下で上記に対応するＧＲＦ発現可能細胞を培養した場合に得られるＧＲＦの発現量または分泌量（対照発現量または対照分泌量）よりも低下することを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。なお、ここでいう低下には、対照発現量または対照分泌量と対比するまでもなく、ＧＲＦが全く発現しない場合（ＧＲＦ遺伝子（ｍＲＮＡ）が全く発現しない場合、ＧＲＦタンパクが全く生成しない場合）やＧＲＦタンパクが全く分泌されない場合、すなわちＧＲＦの発現量または分泌量が実質的にゼロの場合も包含される。
【０１１２】
上記のスクリーニング方法３）の工程(ii)において、ＧＲＦの発現量は、ＧＲＦ遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定するか、またはＧＲＦ蛋白質の生成量を測定することによって評価することができる。またＧＲＦの分泌量は、ＧＲＦ発現可能細胞を培養して得られる培養液（培養上清）中に含まれるＧＲＦ蛋白質量を測定することによって評価することができる。また、ＧＲＦの発現量またはＧＲＦの分泌量を測定する方法は、直接これらの遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量や蛋白質生成量を測定したり、また培養上清中のＧＲＦ蛋白質量を測定する方法でなくても、これらを反映する方法であればよい。すなわち、工程(ii)においてＧＲＦの発現量または分泌量を測定するとは、直接的または間接的な方法の別を問わず、ＧＲＦ遺伝子の発現量やＧＲＦ蛋白質の生成量または培養上清中に放出されるＧＲＦ蛋白質量が評価できる方法の実施を広く包含するものである。
【０１１３】
ＧＲＦの発現量の測定（検出および定量）は、ＧＲＦ発現可能細胞のＧＲＦｍＲＮＡの発現量を、当該ＧＲＦｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド等を利用してノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法などの公知の方法やＤＮＡアレイを利用して測定したり、またＧＲＦ発現可能細胞の細胞表面に発現したＧＲＦ生成量を抗ＧＲＦ抗体を利用してウエスタンブロット法等の公知の方法で測定することによって実施することができる。また、ＧＲＦの発現量の測定（検出及び定量）は、ＧＲＦ遺伝子制御領域〔例えば、ＧＲＦのプロモーター（Genbank Accession number:U10153など）の下流領域〕に、例えば前述する各種レポーター遺伝子等のマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来の蛋白質の活性を測定することによっても実施することができる。本発明のＧＲＦの発現量を指標とした抗自己免疫疾患剤の有効成分（標的物質）のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。なお、融合遺伝子の作成及びマーカー遺伝子由来の活性測定は、公知の方法で行うことができる。
【０１１４】
またＧＲＦの分泌量の測定（検出および定量）は、ＧＲＦ発現可能細胞を培養し、得られる培養上清中に含まれるＧＲＦ蛋白質量を、例えば抗ＧＲＦ抗体を利用してウエスタンブロット法等の公知の方法で測定することによって実施することができる。
【０１１５】
以上説明した、１)の（1）及び(2)、２）並びに３）のスクリーニング方法によって被験物質の中から選別された候補物質は、更に、例えばヒトの各種の自己免疫疾患を模倣した病態モデル動物を用いた薬効試験や安全性試験に供することにより、より一層実用的な抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得することができる。
【０１１６】
より具体的には、得られた候補物質について、多発性硬化症の病態モデル動物（例えばEAE発症誘導マウス）を用いた薬効試験を行うことにより、当該候補物質について多発性硬化症に対する抑制効果（予防効果、治療効果）を評価することができる。また、得られた候補物質について、慢性関節リウマチの病態モデル動物（例えばコラーゲン誘導性関節炎 [Trentham DE,Townes AS,Kang AH:Autoimunity to typeII collagens:An experimental model of arthritis J Exp Med 146:857-868,1977]、抗原誘導性関節炎、またはアジュバント誘導性関節炎[Pearson CM：Development of arthritis,periarthritis and periotitis in rats given adjuvant.Proc Soc Expe Biolo Med 91:95-101,1956]のいずれかのマウス）を用いた薬効試験を行うことにより、当該候補物質について慢性関節リウマチに対する抑制効果（予防効果、治療効果）を評価することができる。このようにして選別、取得された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１１７】
以上のような本発明のスクリーニング方法を用いて選択されるＧＲＦ阻害作用を有する物質は、前述の如き抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。ここで自己免疫疾患としては、具体的には本明細書の第Ｉ章に記載する各種の疾病を任意に挙げることができるが、特に本発明が対象とするＧＲＦ阻害作用物質は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデス、好ましくは多発性硬化症、及び慢性関節リウマチに対して有効に使用することができる。
【０１１８】
本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、各種の自己免疫疾患に対して、その発症を阻害若しくは抑制する作用、その発症を遅延させる作用、発症後その症状を軽減若しくは改善する作用、または疾患を治癒する作用のいずれか少なくとも１つの作用を有するものである。その意味で、上記の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患予防剤、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患改善剤、または自己免疫疾患治療剤と言うこともでき、よって本発明のスクリーニング方法は、これらの有効成分の探索方法でありえる。
【０１１９】
本発明は、上記のスクリーニング方法により得られるＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤を提供するものである。
【０１２０】
III ．抗自己免疫疾患剤の用法について
以下、本発明のＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤の投与形態、投与方法及び投与量等につき説明する。
【０１２１】
1) ＧＲＦ阻害作用を有する物質が低分子化合物、ペプチド又は蛋白質の形態である場合
ＧＲＦ阻害作用を有する物質が低分子化合物、ペプチドまたは抗体などの蛋白質である場合は、これらの物質について通常用いられる一般的な医薬組成物（医薬製剤）の形態に調製することができ、その形態に応じて経口または非経口的に投与することができる。一般的には以下のような投与形態、及び投与方法が挙げられる。
【０１２２】
投与形態としては、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤及びカプセル剤等の固形製剤や、溶液、懸濁液、乳液、シロップ及びエリキシルなどの液剤などの形態を挙げることができる。これらの各種形態は、投与経路に応じて経口投与剤の他、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤（坐剤）、舌下剤、経膣剤、注射剤（経静脈、経動脈、経筋肉、皮下、皮内）や点滴剤等の非経口投与剤に分類することができる。例えば、経口投与剤としては、例えば錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、乳液、及びシロップ等が、又は直腸投与剤や経膣剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤などの形態を採ることができる。経皮剤としては、例えばローション等の液剤の他、クリームや軟膏等の半固形剤の形態を採ることもできる。
【０１２３】
注射剤としては、例えば溶液、懸濁液または乳剤等の形態を採ることができ、具体的には無菌処理した水、水−プロピレングリコール溶液、緩衝化液、０.４重量％濃度の生理食塩水等を例示することができる。さらに注射剤は、液剤に調製した後、凍結処理又は凍結乾燥処理されていてもよく、これにより保存することができる。後者の凍結乾燥処理で調製される凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【０１２４】
上記の医薬組成物（医薬製剤）の形態には、当該分野で行われている通常の手法により、ＧＲＦ阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を配合することによって調製される。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤及び分散剤などを例示することができる。また、さらに当該分野において通常用いられる添加剤を配合することもできる。かかる添加剤は、調製する医薬組成物の形態に応じて、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、香料、着色料、張度調節剤、キレート剤、界面活性剤などの中から適宜選択して用いることができる。
【０１２５】
このような形態を有する医薬組成物は、目的とする疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内または筋肉内に投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与してもよいし、また経口投与や直腸投与も可能である。
【０１２６】
これらの医薬組成物の投与量や投与回数は、投与形態、患者の疾患やその症状、患者の年齢や体重等によって異なり、一概に規定することができないが、通常は成人に対し１日あたり有効成分の量として約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。
【０１２７】
２ ) ＧＲＦ阻害作用を有する物質がポリヌクレオチドの形態である場合
ＧＲＦ阻害作用を有する物質が、ＧＲＦ遺伝子やＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド等のようにポリヌクレオチドの形態を有するものである場合は、遺伝子治療剤または予防剤の形態を採ることができる。近年、種々の遺伝子を用いた遺伝子治療の報告がなされており、遺伝子治療は技術的にも確立された技術となっている。
【０１２８】
遺伝子治療剤は、ベクターに目的のポリヌクレオチドを導入して調製したり、また当該ベクターで適当な細胞を形質転換することによっても調製できる。ここで、患者への投与形態は、上記目的のポリヌクレオチドを導入するベクターとして(1)非ウイルスベクターを用いた場合と、(2)ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別される。ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合と非ウイルスベクターを用いる場合について、遺伝子治療剤の調製法及び投与法は実験手引書に詳しく解説されている（例えば、「別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術」, 羊土社,1996、別冊実験医学：「遺伝子導入＆発現解析実験法」, 羊土社, 1997、「日本遺伝子治療学会編 遺伝子治療開発研究ハンドブック」、エヌ・ティー・エス、1999など）。以下、用いるベクター毎に遺伝子治療剤の調製法及び投与法を具体的に説明する。
【０１２９】
（1）ベクターとして非ウイルスベクターを用いる場合
非ウイルスベクターとしては、生体内、好ましくはヒト生体内で目的のポリペプチドや蛋白質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現させることのできる任意の発現ベクターを用いることができる。特に制限されないが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200(1991)）や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ（以上、インビトロゲン社、ストラタジーン社）などが挙げられる。
【０１３０】
患者へのポリヌクレオチドの導入は、これらの非ウイルスベクター（発現ベクター）に常法に従って目的とするポリヌクレオチドを導入し、得られた組換え発現ベクターを投与することによって行うことができる。これにより、目的とするポリヌクレオチドを被験者の細胞や組織に導入することができる。
【０１３１】
より具体的には、細胞へのポリヌクレオチド導入法としては、リン酸−カルシウム共沈法や、微小ガラス管を用いたＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の直接注入法などが挙げられる。
【０１３２】
また、組織へのポリヌクレオチド導入法としては、内包型リポソーム（internal type liposome）または静電気型リポソーム（electrostatic type liposome）によるポリヌクレオチド導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（HVJ-AVEリポソーム法）、レセプター介在性ポリヌクレオチド導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにポリヌクレオチドを細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等の方法を例示することができる。
【０１３３】
（2）ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルスやレトロウイルスに由来するベクター等が挙げられる。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスのベクターを挙げることができる。中でもアデノウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも感染効率がはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクターを用いることが好ましい。
【０１３４】
患者へのポリヌクレオチドの導入は、これらのウイルスベクターに常法に従って目的とするポリヌクレオチドを導入し、得られた組換えウイルスを所望の細胞に感染させることによって行うことができる。これにより、細胞内に目的とするポリヌクレオチドを導入することが可能である。
【０１３５】
このようにして調製される遺伝子治療剤の患者への投与方法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するin vivo法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞をヒト体内に戻すex vivo法がある（「日経サイエンス」,1994年4月号,20-45頁；「月刊薬事」,36(1)，23-48,1994；「実験医学増刊」,12(15),1994；「日本遺伝子治療学会編 遺伝子治療開発研究ハンドブック」,エヌ・ティー・エス,1999）。本発明が対象とする自己免疫疾患のうち、全身性自己免疫疾患の予防または治療のために用いる場合は、in vivo法により体内に導入することが好ましい。
【０１３６】
In vivo法による投与は、目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。
【０１３７】
遺伝子治療剤の形態としては、上記の各投与形態に応じて種々の製剤形態を採用することができる。例えば注射剤の形態を有する場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えばＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等の溶剤に有効成分となるポリヌクレオチドを溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤及び遠心分離濃縮凍結剤などの各種のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【０１３８】
また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。
【０１３９】
遺伝子治療剤中のポリヌクオチドの含量は、治療対象とする疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、各々のポリヌクレオチドとして約０．０００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．００１〜約１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【０１４０】
また、前述する本発明は抗自己免疫疾患剤を用いる自己免疫疾患の予防方法または治療方法である。当該方法は、自己免疫疾患に罹患した被験者（自己免疫疾患患者）に本発明の抗自己免疫疾患剤を有効量投与することによって実施することができる。ここで自己免疫疾患としては、第Ｉ章に記載する各種の自己免疫疾患を挙げることができる。好ましくは多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスであり、より好ましくは多発性硬化症、慢性関節リウマチである。
【０１４１】
また、自己免疫疾患に罹患した被験者には、自己免疫疾患の具体的な病態を発症している被験者だけでなく、発症していない場合であっても潜在的に自己免疫疾患の発症の可能性を有している被験者も含まれる。従って、本発明でいう自己免疫疾患の予防には、自己免疫疾患に罹患した被験者について自己免疫疾患の発症を予防すること、発症程度を抑制することが包含される。また、本発明でいう自己免疫疾患の治療には、自己免疫疾患に罹患した被験者について発症した自己免疫疾患の病態（症状）を緩和ないしは改善することが包含される。
【０１４２】
抗自己免疫疾患剤の投与形態、投与方法、及び投与量については、前述の通りである。
【０１４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【０１４４】
実施例１ 成長ホルモン放出因子受容体（GRFR）遺伝子の欠損が実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症に与える影響の検討
自己免疫疾患の発症に対する成長ホルモン放出因子（GRF）の関与を調べるため、ＧＲＦ受容体遺伝子を欠損したマウスについて、ヒトの多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症の有無を検討した。実験方法と結果を以下に示す。
【０１４５】
＜実験方法＞
実験には、ＧＲＦＲ遺伝子ホモ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/lit）、ＧＲＦＲ遺伝子ヘテロ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/+）および対照として野生型マウス（C57BL/6J）（全てメス、いずれもThe Jackson Laboratoryより購入）を用いた。マウスはいずれも５週齢のものを購入し、毎日午前８時から午後８時まで照明を点灯し、水および固形飼料（CE-2；日本クレア）を自由に摂取できるようにして飼育した。
【０１４６】
これらのマウス（各群５匹づつ、合計１５匹）に人為的に実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症を誘導させた。具体的には、これらの各マウスに、生理食塩水(大塚製薬（株）製)に溶解した２mg/mlのミエリンオリゴデンドロサイトグリコプロテイン（MOG）35-55合成ペプチド（アミノ酸配列：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys：配列番号８）（アコード社製）の溶液と完全フロイントアジュバント（CFA）(ディフコ社製)を１：１に混合したエマルジョンを、100μｌずつ大腿部皮下に感作し、感作直後および２日後に生理食塩水(大塚製薬（株）製)に溶解した200ngの百日咳毒素(リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ社製)を腹腔内投与して、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を惹起させた。なお、すべてのマウスは上記実験期間中も含めて全飼育期間を通じて飼料と水を自由に摂取出来るようにした。
【０１４７】
２７日間にわたり、毎日体重を測定し、ＥＡＥ症状を観察して、以下の基準に基づいてＥＡＥ症状のスコアを記録した。
【０１４８】
[ＥＡＥ症状のスコア]
０：無症状、１：尾の麻痺、２：弱い後ろ足の麻痺、３：中程度から強度の後ろ足の麻痺あるいは弱い前足の麻痺、またはその両方、４：完全な後ろ足の麻痺あるいは中程度から強度の前足の麻痺、またはその両方、５：四肢の麻痺あるいは死戦期にある、６：死亡。
【０１４９】
＜結果＞
得られたＥＡＥ症状のスコアの平均値の推移を図１(Ａ)示す。その結果、ＧＲＦＲホモ欠損マウスでは、全観察期間(27日間)を通じて実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症（スコア１）が認められなかった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスについても、野生型マウスに比較してＥＡＥスコアの有意な低下が認められた。
【０１５０】
またＥＡＥの発症率の推移を図１（Ｂ）に示す。その結果、ＧＲＦＲホモ欠損マウスの発症率は全観察期間（27日間）を通じて０であった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスも野生型マウスに比較して発症率が低く抑えられた。これらの結果から、ＧＲＦＲ遺伝子の欠損によりＥＡＥの発症が強く抑制されることが明らかとなった。
【０１５１】
実施例２ 成長ホルモン放出因子（GRF）アンタゴニストの投与が実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症に与える影響の検討
ＧＲＦアンタゴニストの投与が自己免疫疾患の発症に与える影響を調べるため、ヒトの多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を用いて検討を行った。実験方法と結果を以下に示す。
【０１５２】
＜実験方法＞
実験には野生型マウス（PLSJLF1/J）（雌、The Jackson Laboratoryより購入）を用いた。マウスは５週齢で購入し、毎日午前８時から午後８時まで照明を点灯し、水および固形飼料（CE-2；日本クレア）を自由に摂取できるようにして飼育した。まずこれらのマウス（合計１０匹）に、生理食塩水(大塚製薬（株）製)に溶解した2mg/mlのウサギミエリン塩基性タンパク質(MBP)(シグマ社製)と完全フロイントアジュバント（CFA）(ディフコ社)を１：１に混合したエマルジョンを、100μｌずつ大腿部皮下に感作し、感作の直後および2日後に生理食塩水に溶解した200ngの百日咳毒素(リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ社製)を腹腔内投与して、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を惹起させた。次いで、GRFアンタゴニストの投与は以下の手順に従って行った。ＭＢＰ感作と百日咳毒素の投与を行ったマウス（計１０匹）を２群に分け、１群（５匹）には、マウス１匹あたり30μgのＧＲＦアンタゴニスト（MZ-4-71：米国カルビオケムノバビオケム社製）をＭＢＰ感作後８日目から１５日目まで毎日１回、頚背部皮下部に投与した（ＧＲＦアンタゴニスト(MZ-4-71)投与群）。もう１群（５匹）には、対照として同量の生理食塩水を同様にＭＢＰ感作後８日目から１５日目まで毎日１回、頚背部皮下部に投与した（生理食塩水投与群）。なお、すべてのマウスは上記実験時間を含む全飼育期間を通じて飼料と水を自由に摂取出来るようにした。毎日体重を測定し、ＥＡＥ症状を観察して、下記の基準に基づいてＥＡＥ症状のスコアを記録した。
【０１５３】
＜ＥＡＥ症状のスコア＞
０：無症状、１：尾の麻痺、２：弱い後ろ足の麻痺、３：中程度から強度の後ろ足の麻痺あるいは弱い前足の麻痺、またはその両方、４：完全な後ろ足の麻痺あるいは中程度から強度の前足の麻痺、またはその両方、５：四肢の麻痺あるいは死戦期にある、６：死亡。
【０１５４】
＜結果＞
結果を図２に示す。図２(Ａ)にはＥＡＥスコアの平均値の推移を示す。ＧＲＦアンタゴニスト（MZ-4-71）投与群では、生理食塩水投与群と比較してＥＡＥスコアの低下が認められた。 図２（Ｂ）にはＥＡＥの発症率の推移を示した。ＧＲＦアンタゴニスト（MZ-4-71）投与群は、生理食塩水投与群に比較してＥＡＥ発症の開始に遅延が認められた。これらの結果から、ＧＲＦアンタゴニストの投与によりＥＡＥの発症が抑制されることが明らかとなった。
【０１５５】
実施例３ ＧＲＦ受容体（GRFR）発現細胞を用いた抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング
ＧＲＦ受容体のｃＤＮＡを含有する発現ベクターを用いて、常法によりＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞を形質転換し、ＧＲＦ受容体を細胞表面に安定に発現する形質転換細胞を取得する。または常法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, p12298-12302 (1994)を参照）によりラット脳下垂体前葉細胞を単離・調製する。他方、ＧＲＦ（住友製薬（株）製）を常法によりビオチンまたはラジオアイソトープ（125Ｉ）などで標識する。
【０１５６】
次に、前記ＧＲＦ受容体発現細胞（形質転換細胞、またはラット脳下垂体前葉細胞）に対して、(i)標識ＧＲＦ、又は(ii)標識ＧＲＦ及び被験物質を添加し、所定時間後、これら(i)の反応系及び(ii)の反応系における標識ＧＲＦのＧＲＦ受容体発現細胞への結合性を測定し、両者を比較する。(ii)の反応系において、結合性が認められないか、または(i)の反応系における結合性と比較して結合性が低くなる被験物質を、抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質として選択する。
【０１５７】
また得られた候補物質は、さらにＧＲＦ阻害作用を検出する別のスクリーニング系、およびＥＡＥモデル動物に対する投与実験などに供される。これにより、前記候補物質について抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得ることを確認することができる。
【０１５８】
実施例４ ＧＲＦ発現可能細胞を用いた抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング
ＧＲＦ産生腫瘍細胞に対し（i）被験物質を添加しない群と、（ii）被験物質を添加した群を準備する。各群について一定期間培養し、次いで細胞を回収して常法により溶解し、ノーザンブロット解析によりＧＲＦのｍＲＮＡの発現量を比較する。あるいは、細胞培養上清を回収し、ウエスタンブロット解析により、培養液中に分泌されたＧＲＦのタンパク量を比較する。これらのスクリーニングにより、(ii)の群についてＧＲＦ発現またはＧＲＦ分泌が認められない場合、または(ii)の群のＧＲＦ発現量またはＧＲＦ分泌量が、(i)の群で得られる結果よりも少ない場合、(ii)に用いた被験物質を抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質として選択する。
【０１５９】
また得られた候補物質は、さらにＧＲＦ阻害作用を検出する別のスクリーニング系、およびＥＡＥモデル動物に対する投与実験などに供される。これにより、前記候補物質について抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得ることを確認することができる。
【０１６０】
【発明の効果】
本発明により、ＧＲＦ阻害作用という新たな作用メカニズムに基づく新規な抗自己免疫疾患剤を提供することができる。さらに本発明により、ＧＲＦ阻害作用という新たな作用メカニズムに基づいて効果を発揮する抗自己免疫疾患剤の有効成分を取得するためのスクリーニング方法が提供される。本発明のＧＲＦ阻害作用を指標としたスクリーニング方法によれば、新たな作用メカニズムに基づいて自己免疫疾患の発症を予防したり治療することのできる有効成分を取得することが可能である。よって、本発明のスクリーニング方法は、自己免疫疾患の予防または治療に有効な新規薬剤の開発に好適に利用することができる。
【０１６１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１における実験結果を示す図である。具体的には、ＥＡＥ発症に対するＧＲＦの関与について検討するため、ＧＲＦＲ遺伝子ホモ欠損マウス（―□―）、ＧＲＦＲヘテロ欠損マウス（―△―）、および対照として用いた野生型マウス（―●―）のそれぞれについて、人為的に誘導したＥＡＥ発症の有無を示したグラフである。
図中(Ａ)にはＥＡＥスコアの平均値の推移を示す。野生型マウスでは感作後16日目からＥＡＥの発症（スコア１）が見られ始め、感作後25日目にはスコアが１.２に達した。一方ＧＲＦＲホモ欠損マウスにおいては全観察期間（27日間）を通じて全く発症が認められなかった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスではＥＡＥは発症したものの、その平均スコア値は野生型マウスの平均スコア値に比較して著しく低かった。図中（Ｂ）にはＥＡＥ発症率の推移を示す。ＧＲＦＲホモ欠損マウスは全観察期間を通じて発症率が０であった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスは野生型マウスと比較してＥＡＥの発症率は著しく低かった。
【図２】 図２は、PLSJLF1マウスにMBPの感作と百日咳毒素の投与によりEAE発症を誘導し、GRFアンタゴニストであるMZ-4-71投与のEAE発症に対する影響を検討した結果を示したグラフである。
図中（Ａ）にはEAEスコアの平均の推移を示した。図中、黒い太線で示した期間はMZ-4-71または対照として生理食塩水を投与した期間を示す。生理食塩水投与群では感作後12日目から発症が見られ、感作後16日目にはスコアの平均値は4.2に達した。一方、MZ-4-71投与群では感作後11日目から発症が認められたが、感作後13日目に平均スコアが0.3に達した後に一旦寛解が導入され、感作後17日目にはすべてのマウスが寛解となり、平均スコアは0になった。感作後20日目から再発が見られたが、その後の観察期間中を通じて平均スコアの最大値は2.2（感作後23日目）にとどまった。これらの結果から、GRFアンタゴニストの投与によってEAE発症が抑制されることが示された。図中（Ｂ）には発症率の推移を示した。図中、黒い太線で示した期間はMZ-4-71または対照として生理食塩水を投与した期間を示す。生理食塩水投与群では、感作後12日目から13日目に急速な発症が見られ、感作後13日目には発症率が80%に達した。一方、MZ-4-71投与群では発症は緩慢に開始し、感作後26日目の時点でも発症率は60%にとどまった。これらの結果から、発症率の点からもGRFアンタゴニストの投与によってEAE発症が抑制されることが示された。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗自己免疫疾患剤、すなわち自己免疫疾患の予防剤または治療剤に関する。さらに本発明は、抗自己免疫疾患剤の新規有効成分を探索し取得するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ、多発性硬化症、及び全身性エリテマトーデスなどは一見異なった病態を示すが、いずれも病変部位に炎症が認められる疾患である。これらの疾患は、本来自己以外の外来異物を認識するはずの抗体が、自己の組織や細胞の抗原、すなわち自己抗原と反応して生じる自己免疫現象が病因となって生じる自己免疫疾患であると考えられている。
【０００３】
自己抗原に対する抗体や自己反応性Ｔ細胞は通常健常人にも見られることが知られており、これらが存在するだけでは自己免疫疾患に至らない。これは、通常自己抗原に対する免疫反応には免疫学的寛容(トレランス)の状態が成立しているからである。これに対して、自己免疫疾患患者では、自己抗原に対する上記トレランスが何らかの原因で破綻していると考えられている。その要因としては抗原に関与するもの、抗原提示に関与するもの、及びトレランスの制御に関与するものなどが考えられているが、不明な点が多く、未だそのメカニズムは解明されていない。
【０００４】
ところで成長ホルモン放出因子（growth hormone-releasing factor；GRF）（成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone, GHRH)とも呼ばれる）（以下、単に「ＧＲＦ」ともいう。）は、視床下部より分泌される４４個のアミノ酸よりなるペプチドホルモンである。当該ＧＲＦは、その受容体（growth hormone-releasing factor receptor；GRFR、以下「ＧＲＦ受容体」ともいう）に結合し、Ｇタンパクの活性化を介して細胞内サイクリックＡＭＰ（以下、単に「cAMP」ともいう）濃度を上昇させ、結果として下垂体から成長ホルモン（GH）の放出を促進する作用を有している。またＧＲＦは、前記のような経路の他に、副経路として、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることによりProtein Kinase A（PKA）を活性化し、細胞内へのカルシウム流入を増加させることにより成長ホルモンの放出を促進する作用も有している。
【０００５】
以上のようにＧＲＦは、成長ホルモンの放出（分泌）との関連性がよく知られているホルモンであり、従来より、成長ホルモンの分泌能を検査し、下垂体性小人症や原発性甲状腺機能低下症を診断するための検査薬として使用されている。しかしながら、当該ＧＲＦと自己免疫疾患との関連は、全く知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規な作用機序に基づく抗自己免疫疾患剤を提供することである。さらに本発明は、かかる抗自己免疫疾患剤の有効成分となる候補物質を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、自己免疫疾患の一つである多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（以下、単に「EAE」ともいう。）の発症に対する成長ホルモン放出因子（GRF）の影響について検討していたところ、ＧＲＦの作用を阻害することによってＥＡＥの発症が有意に抑制できるという新たな知見を見いだした。
具体的には、ＧＲＦ受容体（GRFR）遺伝子を人為的に欠損させたホモ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/lit）（ＧＲＦＲホモ欠損マウス）及びヘテロ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/+）（ＧＲＦＲヘテロ欠損マウス）に対して実験的にＥＡＥ発症を誘導したところ、ＧＲＦＲホモ欠損マウスは全観察期間を通して全くＥＡＥを発症せず、またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスについても野生型マウスと比較してＥＡＥの発症が有意に抑制されるという結果が得られた。また、ＧＲＦ受容体に対する公知のＧＲＦアンタゴニストをEAEマウス（EAE発症誘導マウス）に投与したところ、ＥＡＥ発症を実験的に誘導してもＥＡＥを発症せず、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害することによりＥＡＥの発症が有意に抑制できることを確認した。
【０００８】
本発明者は、上記の知見、すなわちＧＲＦが自己免疫疾患の発症と関連していること、そして当該ＧＲＦの作用を阻害することによって自己免疫疾患の発症が抑制できるという知見から、ＧＲＦ阻害作用を有する物質が自己免疫疾患の予防剤または治療剤として有効に利用できるとの確信を得た。本発明はかかる知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
項１． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤。
項２． 成長ホルモン放出因子阻害作用が、成長ホルモン放出因子受容体（GRF受容体）を介した成長ホルモン放出因子（GRF）の作用を阻害する作用である、請求項１記載の抗自己免疫疾患剤。
項３． 成長ホルモン放出因子阻害作用が、ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する作用である、項２記載の抗自己免疫疾患剤。
項４． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質がＧＲＦのペプチドアナログである、項３記載の抗自己免疫疾患剤。
項５． 成長ホルモン放出因子阻害作用が、ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用であるか、あるいはＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用である、項１に記載の抗自己免疫疾患剤。
項６． 自己免疫疾患が多発性硬化症または慢性関節リウマチ症である、項１乃至５のいずれかに記載の抗自己免疫疾患剤。
項７． 被験物質の中から成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を探索する工程を有する、抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法。
項８． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用の阻害を指標として探索することを特徴とする項７に記載のスクリーニング方法。
項９． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害を指標として探索することを特徴とする項８に記載のスクリーニング方法。
項１０． 下記の工程（i）、(ii)及び(iii)を含む項９に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法：
(i) 被験物質の存在下で、ＧＲＦ受容体若しくはそのホモログ（以下、「ＧＲＦ受容体等」という）とＧＲＦ若しくはそのホモログ（以下、「ＧＲＦ等」という）とを接触させる工程、
(ii) 上記ＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させることによって得られるＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を低下させる被験物質を選択する工程。
項１１． 項１０に記載の工程(i)、(ii)及び(iii)に更に：
(iv) 上記(iii)で選択された被験物質の中から、更にＧＲＦと同様の作用を生じない被験物質を選択する工程
を含む、項１０に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法。
項１２． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体の発現阻害を指標として探索することを特徴とする項７に記載のスクリーニング方法。
項１３． 下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む項１２に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質をＧＲＦ受容体を発現可能な細胞と接触させる工程、
（ii）被験物質を接触させた細胞のＧＲＦ受容体の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない上記に対応するＧＲＦ受容体を発現可能な細胞（対照細胞）のＧＲＦ受容体の発現量（対照発現量）と比較する工程、
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量に比してＧＲＦ受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程。
項１４． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、ＧＲＦの発現又は分泌の阻害を指標として探索することを特徴とする項７に記載のスクリーニング方法。
項１５． 下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む項１４に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質をＧＲＦを発現可能な細胞と接触させる工程、
（ii）被験物質を接触させた上記細胞のＧＲＦの発現量または分泌量を測定し、該発現量または分泌量を、被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞のＧＲＦの発現量（対照発現量）又は分泌量（対照分泌量）と比較する工程、
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量または対照分泌量に比してＧＲＦの発現量または分泌量を低下させる被験物質を選択する工程。
項１６． 抗自己免疫疾患剤が多発性硬化症または慢性関節リウマチの予防または治療薬である、項７乃至１５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項１７． 項７乃至１６いずれか記載のスクリーニング方法により得られる成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤。
項１８． 有効量の成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を含有する抗自己免疫疾患剤。
項１９． 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を含有する抗自己免疫疾患剤を有効量、自己免疫疾患に罹患した被験者に投与することからなる、自己免疫疾患の予防または治療方法。
項２０． 自己免疫疾患が多発性硬化症または慢性関節リウマチである、項１９に記載の自己免疫疾患の予防または治療方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１１】
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書においてＤＮＡとは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１３】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
Ｉ．抗自己免疫疾患剤
前述するように、本発明者は成長ホルモン放出因子（GRF）の作用を阻害することによって自己免疫疾患の発症を抑制乃至は遅延することができることを見いだした。このことから、成長ホルモン放出因子（GRF）の作用を阻害する物質は、自己免疫疾患の予防または治療に有効に利用できると考えられる。本発明の抗自己免疫疾患剤は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、ＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効成分とすることを特徴とする。
【００１６】
一般に「自己免疫疾患」は、自己の組織を構成する成分に反応する抗体あるいはリンパ球が、体内で持続的に産生されることによって組織障害をきたす疾患であり、大別すると下記に掲げる臓器特異的自己免疫疾患と臓器非特異的自己免疫疾患の２つに分類することができる。
【００１７】
(1) 臓器特異的自己免疫疾患：橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重傷筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群。
【００１８】
(2)臓器非特異的自己免疫疾患：慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病。
【００１９】
本発明はこれらの「自己免疫疾患」を任意に対象とするものである。好ましくは「実験的自己免疫性脳脊髄炎」と同一若しくは類似のメカニズムによって発症する自己免疫疾患を対象とすることができる。かかる自己免疫疾患として、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスを例示することができる。より好ましくは多発性硬化症及び慢性関節リウマチであり、特に好ましくは多発性硬化症である。
【００２０】
また本発明の「抗自己免疫疾患剤」とは、上記各種の自己免疫疾患に対して、その発症を阻害若しくは抑制する作用、その発症を遅延させる作用、発症後その症状を軽減若しくは改善する作用、または疾患を治癒する作用のいずれか少なくとも１つの作用を有するものである。その意味で、本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患予防剤、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患改善剤、または自己免疫疾患治療剤と言い換えることもできる。中でも本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患の発症を阻害若しくは抑制する作用、または発症を遅延させる作用に優れており、自己免疫疾患予防剤として特に有効に使用することができる。
【００２１】
ここで本発明が対象とする「成長ホルモン放出因子（growth hormone-releasing factor：ＧＲＦ）」とは、「従来の技術」の欄に記載されるようにＧＲＦ受容体に結合することによって下垂体からの成長ホルモン（GH）放出を促進する作用を有する視床下部ホルモンの一つである。その意味で成長ホルモン放出ホルモン（growth hormone-releasing hormone、GHRH）とも呼ばれる。
【００２２】
その塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank アクセッション番号：NM 021081（塩基配列：配列番号１）, NP 066567（アミノ酸配列：配列番号２），NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, 及びM 31654などに記載されている。
【００２３】
本発明において「ＧＲＦ阻害作用」とは、その作用機序の別を問うことなく、上記ＧＲＦの機能発現を阻害する作用を広く意味するものである。なお、ここで「ＧＲＦの機能発現を阻害する作用」には、ＧＲＦの蛋白質合成（ＧＲＦの遺伝子発現を含む）や分泌を阻害する作用、及び発現したＧＲＦのＧＲＦ受容体を介した作用（シグナル伝達）を阻害する作用が包含される。本明細書では、このようなＧＲＦの機能発現の阻害を単にＧＲＦ作用阻害またはＧＲＦの阻害ということもある。
【００２４】
これらのＧＲＦ阻害作用は、具体的には １) ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用（シグナル伝達）を阻害する作用、２) ＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用、及び３) ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用に大別することができる。
【００２５】
なお、本発明の「ＧＲＦ阻害作用を有する物質」は、上記に掲げる阻害作用のいずれか少なくとも１つの作用を有する物質であればよく、その形態や性状の別を何ら問うものではない。また、本発明の「ＧＲＦ阻害作用を有する物質」は、少なくともヒトＧＲＦに対して阻害作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦに対する阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００２６】
以下、ＧＲＦ阻害作用を有する物質について、具体的に説明する。
【００２７】
１）ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する物質
後述の実施例に示すように、ＧＲＦ受容体を欠損させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されること、及びＧＲＦ受容体に対してＧＲＦとＧＲＦアンタゴニストを競合させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されることが判明した。この知見は、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する物質、言い換えればＧＲＦのＧＲＦ受容体を介したシグナル伝達を阻害する物質は自己免疫疾患に対して抑制的に働き、抗自己免疫疾患剤の有効成分となりえることを裏付けるものである。
【００２８】
ここでＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する物質は、その作用部位に応じて下記の(1) ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する物質、及び(2) ＧＲＦ受容体の下流のシグナル伝達系に作用してＧＲＦの細胞内シグナル伝達を阻害する物質、に分類することができる。
【００２９】
(1) ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する物質
ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害することにより、ＧＲＦ受容体に対するＧＲＦの作用（シグナル伝達）を阻害することができる。かかる結合阻害作用を有する物質としては具体的には、▲１▼ ＧＲＦ受容体に結合することにより、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質、または、▲２▼ ＧＲＦに結合することにより、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質を挙げることができる。なお、▲１▼の物質は、いわゆるＧＲＦ受容体に対してＧＲＦのアンタゴニストとしての作用を有するものであり、自らＧＲＦ受容体に結合してもそれ自体がＧＲＦと質的且つ量的に同じ作用（シグナル伝達）を発揮しないことが必要である。ここで、「ＧＲＦと同じ作用を発揮しない」とは、ＧＲＦと質的に同じ作用を発揮しない場合（ＧＲＦ機能の喪失）だけでなく、仮にＧＲＦと質的に同じ作用を発揮する場合であっても量的にＧＲＦの作用よりも低減された作用を発揮する場合も含まれる。
【００３０】
▲１▼ ＧＲＦ受容体に結合して、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質かかる物質としては、具体的にはＧＲＦ受容体に結合する結合ドメイン（Science, Vol.218, 585(1982)、Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 123, 854(1984)）を有しＧＲＦの機能を欠損したＧＲＦ改変体や、抗ＧＲＦ受容体抗体等を例示することができる。なお、当該ＧＲＦ受容体に結合する物質は、少なくともヒトＧＲＦ受容体に対して結合性を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体に対する結合性の有無は、特に制限されない。
【００３１】
ここで、上記ＧＲＦ改変体としては、ＧＲＦ受容体への結合ドメインだけを有するＧＲＦの改変蛋白質〔または改変オリゴ（ポリ）ペプチド〕、またはＧＲＦ受容体への結合ドメイン以外の領域のアミノ酸配列を人為的に任意の数、欠失させるか、他のアミノ酸で置換または挿入（付加）することによって、ＧＲＦの機能を喪失してなるＧＲＦの改変蛋白質〔または改変オリゴ（ポリ）ペプチド〕を例示することができる。また、ＧＲＦ改変体は、前述するように少なくともヒトＧＲＦ受容体と結合して該受容体へのヒトＧＲＦの結合を阻害するものであって、且つそれ自体がＧＲＦと同じ作用を発揮しないものであれば、その由来は特に制限されるものではない。
【００３２】
なお、例えばＧＲＦ受容体に対するヒトＧＲＦの結合ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、上記文献に示されるように公知である。よって、ヒトＧＲＦの結合ドメインからなるＧＲＦ改変体は、これらの情報並びに下記の改変方法から当業者であれば容易に取得することができる。
【００３３】
また、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合ドメイン以外のアミノ酸領域を人為的に改変する方法も、当業者に公知の手法であり、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書を参考にして行うことができる。具体的には、サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987) ;同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」,日本製化学会編, p.105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983) 〕、及びこれらの手法を任意に組み合わせることによって実施することができる。
【００３４】
なお、改変したＧＲＦ蛋白質〔オリゴ（ポリ）ペプチド〕（ＧＲＦ改変体）が、ＧＲＦと同じ作用を発揮しないか否かは、該ＧＲＦ改変体を動物に投与してＧＨ分泌能を測定することによって評価することができる。
【００３５】
また、▲１▼の物質として例示される抗ＧＲＦ受容体抗体としては、具体的にはＧＲＦ受容体の細胞外ドメイン（Nature,Vol.360,p765-768(1992)）に対する抗体を例示することができる。なお、当該抗ＧＲＦ受容体抗体は、少なくともヒトＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを認識して結合するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体の細胞外ドメインへの認識能や結合能の有無は、特に制限されない。
【００３６】
当該抗ＧＲＦ受容体抗体は、ヒトＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを有する蛋白質を免疫抗原として常法に従って調製することができ、モノクローナル抗体であってもまたポリクローナル抗体であってもよい。具体的には、これらの抗体は、例えば“Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)”や“Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 12-11.13”等の基本書を参考にして容易に作製することができる。ここでヒトＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを有する蛋白質の取得は、上記文献（Nature）に記載される当該蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列の情報から当業者であれば容易に取得することができる。
【００３７】
さらに▲１▼の物質には、その他の蛋白質やペプチド、又は低分子化合物なども含まれる。
【００３８】
このうちペプチドとしては、具体的には、ヒトＧＲＦ受容体に結合して当該受容体に対するヒトＧＲＦの結合を阻害する作用を有する、ＧＲＦのペプチドアナログを例示することができる。当該ＧＲＦのペプチドアナログは、それ自身はＧＲＦと同じ作用を持たず、ヒトＧＲＦ受容体と結合してヒトＧＲＦに対する拮抗作用を有する、いわゆるＧＲＦのアンタゴニストである。なお、かかるＧＲＦのペプチドアナログは、少なくともヒトＧＲＦ受容体に対して結合能を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体への結合能の有無、ならびにペプチドの由来の別は、特に制限されない。
【００３９】
かかるＧＲＦのペプチドアナログとしては、具体的にはMZ-4-71 ([Ibu0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGHRH-(1-28)Agm)、MZ-4-169 ([Nac0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGHRH-(1-29)NH2)、あるいはMZ-4-181 ([Nac0-His1,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGHRH-(1-29)NH2)（以上、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, p.12298-12302(1994)）、MZ-5-156 ([PhAc0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Abu15,Nle27]hGH-RH(1-28)Agm)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.96, p.226-231(1999))、またはJV-1-36 ([PhAc0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Arg9,Abu15,Nle27,D-Arg28,Har29]hGH-RH(1-29)NH2)、JV-1-38([PhAc0,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Har9,Tyr(Me)10,Abu15,Nle27,D-Arg28,Har29]hGH-RH(1-29)NH2)、JV-1-42 ([PhAc0-His1,D-Arg2,Phe(4-Cl)6,Arg9,Abu15,Nle27,D-Arg28,Har29]hGH-RH(1-29)NH2)（以上、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.97, p.1218-1223(2000)）などが例示される。また、国際公開公報 WO95/16707（特に請求項１〜20）、あるいはWO91/16923（特に請求項16）に記載のペプチドアナログを挙げることもできる。
【００４０】
また、ＧＲＦ受容体に結合してＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する作用を有する低分子化合物は、公知の低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００４１】
▲２▼ ＧＲＦに結合して、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する物質
当該物質として抗ＧＲＦ抗体を例示することができる。ここで抗ＧＲＦ抗体は、具体的にはＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメイン（Science, Vol.218, 585 (1982)、Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.123, 854 (1984)）に対する抗体が挙げられる。なお、かかる抗ＧＲＦ抗体は、少なくともヒトＧＲＦの受容体結合ドメインを認識し結合するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦへの結合能の有無、ならびに製造原料として用いる抗原（蛋白質、ポリペプチド）の由来の別は、特に制限されない。
【００４２】
当該抗ＧＲＦ抗体は、ヒトＧＲＦの受容体結合ドメインを有するポリペプチド又は蛋白質を免疫抗原として常法に従って調製することができ、モノクローナル抗体であってもまたポリクローナル抗体であってもよい。具体的には、これらの抗体は、前述する各種の基本書を参考にして容易に作製することができる。
【００４３】
ここでヒトＧＲＦの受容体結合ドメインを有する蛋白質の取得は、上記文献（Science, BBRC）に記載される当該受容体結合ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列の情報から当業者であれば容易に取得することができる。さらに▲２▼の物質には、蛋白質やペプチド、又は低分子化合物などが含まれる。
【００４４】
ＧＥＲに直接結合して、ＧＲＦのＧＲＦ受容体への結合を阻害する作用を有する例えば低分子化合物は、公知の低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００４５】
(2)ＧＲＦの細胞内シグナル伝達を阻害する物質
「従来の技術」の欄に記述するように、ＧＲＦはその受容体（ＧＲＦ受容体）に結合すると、Ｇタンパクの活性化を引き起こし、該活性化を介してｃＡＭＰ濃度を上昇させ、結果として下垂体からの成長ホルモン（GH）の放出を促進する作用を有している。またＧＲＦは、前記の経路の他に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることによりProtein Kinase Aを活性化し、細胞内へのカルシウム流入を増加させて成長ホルモンの放出を促進する作用も有している。
【００４６】
従って、これらのＧＲＦの受容体結合後の細胞内におけるシグナル伝達（ＧＲＦ受容体の下流でのシグナル伝達）を阻害することによって結果としてＧＲＦの作用を阻害することのできる物質も、本発明のＧＲＦ阻害作用を有する物質に含まれる。
【００４７】
当該物質としては、ＧＲＦの細胞内シグナル伝達に係わる各種因子の発現や作用を誘導（亢進）又は抑制することにより、結果的に上記ＧＲＦの作用を実質上阻害して、終局的に成長ホルモン放出促進作用を阻害することのできる物質を例示することができる。
【００４８】
具体的には、例えばＧＲＦ受容体に共役するＧタンパクの発現や作用（活性化）を抑制するようなタンパク質やペプチド、低分子化合物などを挙げることができる。
【００４９】
２）ＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質
後述の実施例に示すように、ＧＲＦ受容体を欠損させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されることが判明した。この知見は、ＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質は、自己免疫疾患に対して抑制的に働き、抗自己免疫疾患剤の有効成分となりえることを裏付けるものである。
【００５０】
ＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質としては、作用機序の別を問わず、結果としてＧＲＦ受容体としての機能を有する蛋白質の産生を阻害する作用を有するものであればよい。例えば、ＧＲＦ受容体遺伝子の複製、転写または翻訳等の任意の過程を阻害することによって核酸レベルでのＧＲＦ受容体（蛋白質）の合成を阻止する作用を有するアンチセンス分子を挙げることができる。
【００５１】
なお、ここで対象とする阻害物質は、少なくともヒトＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体に対する発現阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００５２】
具体的には、ＧＲＦ受容体遺伝子（GenBank アクセッション番号：NM 000823[配列番号３], AY 008835, AY 008834, AF 184896, AB 022597, AB 022596, L 07380, L 07379などを参照）に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５３】
なお、上記アンチセンス分子は、上記ＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列に対して100％相補的な配列を有するポリヌクレオチドである必要はなく、ストリンジェントな条件で、ヒトＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその改変物〔例えば、修飾ポリ（オリゴ）ヌクレオチドやペプチド核酸等、公知の手法によって設計されるアンチセンス分子を含む〕であってもよい。かかるものとしては、具体的には上記ＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列の相補配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものを挙げることができる。
【００５４】
またＧＲＦ受容体の発現を阻害する物質には、蛋白質、ペプチド、及び低分子化合物等も含まれる。ヒトＧＥＲ受容体の発現を阻害する作用を有する、例えば低分子化合物は、公知の低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００５５】
３）ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する物質
後述の実施例に示すように、ＧＲＦ受容体を欠損させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されること、及びＧＲＦ受容体に対してＧＲＦとＧＲＦアンタゴニストとを競合させることによって自己免疫疾患の発症が抑制されることが判明した。この知見は、ＧＲＦの生成を阻害する物質、すなわちＧＲＦの発現または分泌を阻害する物質は、自己免疫疾患に対して抑制的に働き、抗自己免疫疾患剤の有効成分となりえることを裏付けるものである。
【００５６】
ＧＲＦの発現を阻害する物質としては、作用機序の別を問わず、結果としてＧＲＦとしての機能を有する蛋白質の産生を阻害する作用を有するものであればよい。例えば、ＧＲＦ遺伝子の複製、転写または翻訳等の任意の過程を阻害することによって核酸レベルでのＧＲＦ（蛋白質）の合成を阻止する作用を有するアンチセンス分子を挙げることができる。
【００５７】
なお、ここで対象とするＧＲＦ発現阻害物質は、少なくともヒトＧＲＦの発現を阻害する作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦに対する発現阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００５８】
具体的には、ＧＲＦ遺伝子（GenBank アクセッション番号：NM 021081［配列番号１］，NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, 及びM 31654などを参照）に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５９】
なお、上記アンチセンス分子は、上記ＧＲＦ遺伝子の塩基配列に対して100％相補的な配列を有するポリヌクレオチドである必要はなく、ストリンジェントな条件で、ヒトＧＲＦ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその改変物であってもよい。かかるものとしては、具体的には上記ＧＲＦ遺伝子の塩基配列の相補配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものを挙げることができる。
【００６０】
またＧＲＦの発現または分泌を阻害する物質には、蛋白質、ペプチド、及び低分子化合物等も含まれる。ＧＥＲの発現または分泌を阻害する作用を有する例えば低分子化合物は、低分子化合物ライブラリー（例えば、ChemBridge Research Laboratories社の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００６１】
以上説明するＧＲＦ阻害作用を有する物質は、抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。また抗自己免疫疾患剤の有効成分は、上記に具体的に掲げる物質に特に限定されることなく、下記に記載する本発明のスクリーング方法によって取得することも可能である。
【００６２】
従って、本発明が対象とする抗自己免疫疾患剤には、上記のＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効量含有する製剤、並びに下記に記載するスクリーング方法によって取得されるＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効量含有する製剤がいずれも包含される。なお、ここでＧＲＦ阻害作用を有する物質の有効量は、それを含有する抗自己免疫疾患剤が結果としてＧＲＦ阻害効果を発揮するようなＧＲＦ阻害作用物質の配合量であればよく、特に制限されるものではない。また抗自己免疫疾患剤は、ＧＲＦ阻害作用物質以外に薬学的に許容される担体や各種の添加剤を含有していてもよい。
【００６３】
かかる担体や添加剤の種類、抗自己免疫疾患剤の形態、並びに抗自己免疫疾患剤の用法（投与形態、投与方法、投与量）については、後述の(III)の欄で詳細に説明する。
【００６４】
II ．抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明者は、後述する実施例に示すように、ＧＲＦの機能発現を阻害することによって自己免疫疾患の発症を抑制することができるという新たな知見を取得した。このことから、ＧＲＦ阻害作用を有する物質は抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用と考えられる。本発明のスクリーニング方法は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を探索することによって、抗自己免疫疾患剤の有効成分を取得しようとするものである。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法が対象とする「ＧＲＦ阻害作用を有する物質」は、結果としてＧＲＦの機能発現（機能発揮、作用）を阻害し得る物質であればよく、その作用機序を特に限定するものではない。ＧＲＦ阻害作用として、具体的には、１）ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用（シグナル伝達）を阻害する作用、２）ＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用、及び３）ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用を挙げることができる。また上記１）の阻害作用には、(1)ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合を阻害する作用、及び(2)ＧＲＦの細胞内シグナル伝達を阻害する作用が含まれる。ＧＲＦ阻害作用を有する物質は、かかるＧＲＦ阻害作用の少なくとも１つを有するものであればよい。
【００６６】
抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得る候補物質としては、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物（低分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質となりえる物質または該物質を含む試料（これらを総称して「被験物質」という）を対象として実施することができる。なお、候補物質を含む試料（被験物質）には、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、及び菌体成分が含まれる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法は、かかる被験物質の中から上記に掲げるＧＲＦ阻害作用を指標として上記ＧＲＦ阻害作用の少なくとも１つを有する物質を探索することによって実施される。斯くして選別取得される被験物質は、抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。
【００６８】
以下、本発明のスクリーニング方法を、指標とするＧＲＦ阻害作用毎に具体的に説明する。
【００６９】
１）ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用を阻害する作用を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用（シグナル伝達）に対する阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【００７０】
ここで探索の指標とする「ＧＲＦ受容体を介したＧＲＦの作用に対する阻害」としては、(1)ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害、(2)ＧＲＦの細胞内シグナル伝達の阻害を挙げることができる。
【００７１】
(1)ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦとＧＲＦ受容体との結合阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【００７２】
当該スクリーニング方法は、特に制限されず当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能であるが、一例として、ＧＲＦ受容体にＧＲＦを接触させた場合と、ＧＲＦ受容体にＧＲＦ及び被験物質を接触させた場合とで、ＧＲＦ受容体に対するＧＲＦの結合性を比較し評価することを含むスクリーニング方法を挙げることができる。当該スクリーニング方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる。
被験物質の存在下で、ＧＲＦ受容体若しくはＧＲＦ受容体ホモログ（これらを纏めて「ＧＲＦ受容体等」ともいう）とＧＲＦ若しくはＧＲＦホモログ（これらを纏めて「ＧＲＦ等」ともいう）とを接触させる工程、
上記ＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させることによって得られるＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
上記(ii)の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を低下させる被験物質を選択する工程。
【００７３】
この場合、ＧＲＦ受容体若しくはＧＲＦ受容体ホモログ（ＧＲＦ受容体等）とＧＲＦ若しくはＧＲＦホモログ（ＧＲＦ等）との結合阻害は、▲１▼ＧＲＦ受容体等に結合することによって、ＧＲＦ等のＧＲＦ受容体等への結合を阻害する態様のものであってもよいし、▲２▼ＧＲＦ等に結合することによって、ＧＲＦ等のＧＲＦ受容体等への結合を阻害する態様のものであってもよく、その別を特に問うものではない。但し、この場合、とりわけ▲１▼の態様の場合は、ＧＲＦ受容体等に結合してもＧＲＦと同じ作用を発揮しない被験物質を選択することが必要である。このため、上記のスクリーニング方法で選別された被験物質は更に、下記：
(iv)上記(iii)で選択された被験物質の中から、更にＧＲＦと同じ作用を発揮しない被験物質を選択する工程に供することが好ましい。
【００７４】
なお、ここで、「ＧＲＦと同じ作用を発揮しない」とは、ＧＲＦと質的に同じ作用を発揮しない場合（ＧＲＦ機能の喪失）だけでなく、仮にＧＲＦと質的に同じ作用を発揮する場合であっても量的にＧＲＦの作用よりも低減された作用を発揮する場合も含まれる。
【００７５】
上記の選択方法は、特に制限されないが、具体的な方法としては、例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, p12298-12302 (1994) に記載される in vitro系 あるいは in vivo系の方法を挙げることができる。
【００７６】
上記本発明のスクリーニング方法で用いられるＧＲＦ受容体は、天然物であっても、合成品であってもまた組換え体であっても良い。また当該ＧＲＦ受容体はヒト由来のものであることが好ましいが、マウスなどヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するＧＲＦ受容体も同様に使用できる。
【００７７】
また、上記スクリーニング方法において、ＧＲＦ受容体に代えてＧＲＦとの結合能を保有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチド（例えば、ＧＲＦとの結合能を有するＧＲＦ受容体の変異体や誘導体）を用いることもできる。なお、本発明において、これらを「ＧＲＦ受容体ホモログ」と称する。例えばかかるＧＲＦ受容体の変異体としては、上記公知のＧＲＦ受容体（GenBankアクセッション番号：NM 000823［塩基配列：配列番号３］, NP 000814［アミノ酸配列：配列番号４］, AY 008835, AY 008834, AF 184896, AB 022597, AB 022596, L 07380, L 07379）に関して天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体及び人為的にＧＲＦ受容体のアミノ酸配列の一部が欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。
【００７８】
また本発明のスクリーニング方法に使用されるＧＲＦ受容体は、必ずしもその全アミノ酸配列を保持する必要はなく、少なくともＧＲＦとの結合部位、例えばＧＲＦ受容体の細胞外ドメイン(Nature, vol. 360, p.765-768, (1992))を有していれば良い。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、前記のＧＲＦ受容体に代えて、少なくともＧＲＦとの結合領域（例えばＧＲＦ受容体の細胞外ドメイン）を有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドを用いることもできる。本発明でいう「ＧＲＦ受容体ホモログ」には、このような蛋白質または（ポリ）ペプチドもまた包含される。更に、上記ＧＲＦ受容体の細胞外ドメインは、ＧＲＦとの結合能が維持されている限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失するか、他のアミノ酸残基によって置換、付加または挿入等されていてもよく、かかる改変されたＧＲＦ受容体の細胞外ドメインを有する蛋白質または（ポリ）ペプチドも本発明でいう「ＧＲＦ受容体ホモログ」に包含される。
【００７９】
ＧＲＦ受容体の取得方法としては、以下の方法を例示することができる。
まず、ヒトまたは各種生物種に由来するＧＲＦ受容体のアミノ酸配列情報及びそれをコードする塩基配列情報（GenBankアクセッション番号：NM 000823［塩基配列：配列番号３］, NP 000814［アミノ酸配列：配列番号４］, AY 008835, AY 008834, AF 184896, AB 022597, AB 022596, L 07380, L 07379）をもとに、常法に従ってプローブ又はＰＣＲ用のプライマーを作成し、ヒト又は各種生物の脳下垂体前葉細胞由来のｃＤＮＡライブラリー等をクローニングすることによってＧＲＦ受容体をコードするｃＤＮＡを取得する。これらのクローニングは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
【００８０】
次いで調製したＧＲＦ受容体のｃＤＮＡを、ｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-199(1991)）、またはｐｃＤＮＡ1.1、ｐｃＤＮＡ3.1誘導体（いずれもインビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、得られた組換えベクターを適当な宿主に導入し培養することにより、導入したＧＲＦ受容体のｃＤＮＡによってコードされるＧＲＦ受容体蛋白質を細胞表面に発現させた形質転換細胞を作製することができる。
【００８１】
なお、ここで宿主としては、一般的に宿主細胞として広く普及している哺乳動物細胞株であるＬ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＢＡＬＢ/ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）や、ＣＯＳ細胞などが好ましいが、これに限定されることなく、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞などを用いることも可能である。また、前記ＧＲＦ受容体発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の導入方法であればどのような方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（J.Virol.,52, 456-467 (1973)）、ＬＴ-１（Panvera社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社製）を用いる方法などが挙げられる。次いで得られた形質転換細胞からＧＲＦ受容体を常法に従って単離する。具体的には、例えば R. G. Shorrら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2778-2782 (1982)、J. Biol. Chem. 257, 12341-12350(1982))の方法に従って、上記形質転換細胞を適当な可溶化剤（β-D-オクチルグルコシドなど）で可溶化することによりＧＲＦ受容体を含む粗抽出液を調製することができる。さらに該粗抽出液からＧＲＦ受容体を精製するには、例えばJ. L. Benovicら (Biochem., 23, 4510-4518 (1984))の方法などの当該技術分野における常法（例えば、抗ＧＲＦ受容体抗体を付けたアフィニティーカラムの使用など）を用いることができる。
【００８２】
またＧＲＦ受容体の変異体（ＧＲＦ受容体の改変されたアミノ酸配列を有する変異体）（ＧＲＦ受容体ホモログ）は、ＧＲＦ受容体のアミノ酸配列やそれをコードする塩基配列の情報に基づいて、サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987) ;同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」,日本製化学会編, p.105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983) 〕、及びこれらの手法を任意に組み合わせることによって調製することができる。
【００８３】
さらにＧＲＦ受容体の細胞外ドメインのみを有するＧＲＦ受容体ホモログは、前述するＧＲＦ受容体の調製方法において、ＧＲＦ受容体のｃＤＮＡに代えてＧＲＦ受容体の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを用いて上記と同様にして形質転換細胞を作製することによって調製することができる。この場合は、形質転換細胞の培養上清中に当該ＧＲＦ受容体ホモログを分泌させることができる。この場合、例えば、抗ＧＲＦ受容体抗体またはＧＲＦ受容体の細胞外ドメインに対する抗体を付けたアフィニティーカラムを使用することによって、培養上清から当該ＧＲＦ受容体ホモログを単離精製することができる。また、ペプチドタグを付加した状態で細胞外ドメインが発現生成されるように発現系を構築することによって、該タグに親和性のある物質を付けたカラムを用いて、形質転換細胞の培養上清から当該ＧＲＦ受容体ホモログを単離精製することができる。
【００８４】
なお、ここでＧＲＦ受容体の「細胞外ドメイン」をコードするｃＤＮＡの塩基配列は 前述するようにNature,Vol.360,765-768(1992) に記載されており、その取得も当業者であれば容易に行うことができる。さらに、当該「細胞外ドメイン」のアミノ酸配列の改変も前述する当業界における公知の方法に従って容易に行うことができる。また、このようにして改変されたＧＲＦ受容体（ＧＲＦ受容体ホモログ）について、ＧＲＦとの結合能の有無は、標識したＧＲＦと前記改変されたＧＲＦ受容体との結合量を、標識したＧＲＦと天然型ＧＲＦ受容体との結合量と比較することによって評価することができる。
【００８５】
なお、本発明のスクリーニング方法で用いられるＧＲＦ受容体またはＧＲＦ受容体ホモログ（ＧＲＦ受容体等）は、単離もしくは更に精製されたＧＲＦ受容体等であってもよいが、それらに限定されない。例えば、単離されたＧＲＦ受容体等に代えて、ＧＲＦ受容体等を発現した細胞を用いても良いし、またＧＲＦ受容体等を有する細胞膜を用いてもよい。
【００８６】
ＧＲＦ受容体等を発現した細胞としては、前述するＧＲＦ受容体等のｃＤＮＡを有するベクターを適当な宿主に導入し、培養することによって調製される形質転換細胞を挙げることができる。当該培養形質転換細胞はＧＲＦ受容体等を細胞表面に発現しているため、そのまま本発明のスクリーニング方法に用いることができる。
【００８７】
またＧＲＦ受容体等を有する細胞膜は、上記の形質転換細胞から調製することができる。調製方法の一例として下記の方法を挙げることができる。まず、上記の培養形質転換細胞に低張ホモジネートバッファー（10mM トリス−塩酸緩衝液、1mM EDTA、0.5mM PMSF（phenylmethanesulfonyl fluoride）若しくは1mM AEBSF、5μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン；pH7.4）を添加し、４℃で３０分間程度静置して細胞を低張破壊した後、ピペッティングでホモジナイズし、４℃で50,000×ｇ、３０分間遠心分離することにより、細胞膜画分の沈殿物を得る。そして、この沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理食塩水（トリス−塩酸緩衝液、154mMの塩化ナトリウム；pH7.4）に懸濁することにより、細胞膜画分を得ることができる。
【００８８】
その他、例えば F. Pietri-Rouxelらの方法（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179(1997)）などにより、培養形質転換細胞から細胞膜画分を得ることもできる。
【００８９】
本発明のスクリーニング方法で用いられるＧＲＦは、天然物、合成品及び組換え体の別を問わない。また当該ＧＲＦはヒト由来のものであることが好ましいが、マウスなどのヒト以外の哺乳類や他の生物種由来のＧＲＦも同様に使用できる。また、ＧＲＦに代えてＧＲＦ受容体との結合能を保有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチド（例えば、ＧＲＦ受容体との結合能を有するＧＲＦの変異体や誘導体）を用いることもできる。なお、本発明においてこれらを「ＧＲＦホモログ」と称する。例えばかかるＧＲＦの変異体としては、ＧＲＦの天然に存在するアレル変異体や天然に存在しない変異体、及び人為的にＧＲＦのアミノ酸配列の一部が欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。
【００９０】
また本発明のスクリーニング方法に使用されるＧＲＦは、必ずしもその全アミノ酸配列を保持する必要はなく、少なくともＧＲＦのＧＲＦ受容体に対する結合部位を有していれば良い。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、ＧＲＦに代えて、少なくともＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメイン（Science，Vol.218, 585 (1982); Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.123, 854 (1984)）を有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドを用いることもできる。本発明でいう「ＧＲＦホモログ」には、このような蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドも包含される。また、上記ＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメインは、ＧＲＦ受容体との結合能が維持されている限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失するか、他のアミノ酸によって置換、付加または挿入等されていてもよく、かかる改変されたＧＲＦのＧＲＦ受容体結合ドメインを有する蛋白質またはポリ（オリゴ）ペプチドも本発明でいう「ＧＲＦホモログ」に包含される。
【００９１】
ＧＲＦは、基本的に44アミノ酸からなる蛋白質である。よって、ヒトまたは各種生物に由来するＧＲＦのアミノ酸配列情報（GenBankアクセッション番号：NP 066567［配列番号２］, NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, M 31654）に基づいて、通常のペプチド合成法に準じて合成することができる。例えば、ペプチドの合成は文献〔ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991〕などに記載されている方法を参考にして実施することができる。また、ペプチド合成法によれば前述するＧＲＦホモログも容易に調製することができる。
【００９２】
また、ＧＲＦまたはＧＲＦホモログは、ＧＲＦの遺伝子情報（GenBankアクセッション番号：NM 021081［配列番号１］, NM 031577, NM 010285, AF 242855, U 10156, M 73486, M 31658, M 31654）に基づいて、前述するＧＲＦ受容体またはＧＲＦ受容体ホモログの調製方法に準じて、遺伝子工学的に作製することもできる。なおこの場合、ＧＲＦのｃＤＮＡのクローニングは、ヒト又はヒト以外の哺乳類のＧＲＦ産生腫瘍細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを対象として実施することができる。
【００９３】
さらにＧＲＦは商業的に入手できるものを利用してもよい。ＧＲＦは例えば住友製薬株式会社（日本）から入手することができる。
【００９４】
ＧＦＲまたはＧＲＦホモログは、そのままで用いてもよいし、任意の標識物質で標識されたものを用いることもできる。ここで標識物質としては、放射性同位体（例えば、125Ｉ等）、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、マーカータンパク質、またはペプチドタグなどを例示することができる。マーカータンパク質としては、例えばアルカリフォスファターゼ（Cell 63,185-194 (1990)）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、またはＨＲＰ(Horse radish peroxidase)などの従来公知のマーカータンパク質を挙げることができる。またペプチドタグとしては、例えばＭｙｃタグ（Glu-Gln-Lys-Lue-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Ile：配列番号５）、Ｈｉｓタグ（His-His-His-His-His-His：配列番号６）、ＦＬＡＧタグ（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp：配列番号７）などの従来公知のペプチドタグを挙げることができる。
【００９５】
上記本発明のスクリーニング方法(1)の工程（ｉ）において、被験物質の存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させる条件は、被験物質の非存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とが結合する条件であれば特に制限されない。また、単離されたＧＲＦ受容体等に代えて、ＧＲＦ受容体等を発現した細胞またはＧＲＦ受容体等を有する細胞膜を用いる場合も、当該細胞または細胞膜上に存在するＧＲＦ受容体等がＧＲＦ等と接触して両者が結合する条件であればよい。具体的には、細胞の場合は、通常の生存可能な培養条件下、または細胞膜の場合はトリス-塩酸緩衝生理食塩水などの生理的条件下を例示することができる。
【００９６】
抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質の選別は、例えば上記条件でＧＲＦ受容体等（ＧＲＦ受容体等を発現した細胞またはその細胞膜の上に存在するＧＲＦ受容体等を含む）とＧＲＦ等とを接触させて両者の結合を阻害する物質を探索することによって実施できる。具体的には、被験物質の存在下でＧＲＦ受容体等とＧＲＦ等とを接触させた場合のＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量が、被験物質の非存在下で上記と同様に接触させた場合に得られるＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量（対照結合量）よりも低下することを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。なお、ここでいう低下には、対照結合量と対比するまでもなく、ＧＲＦ等のＧＲＦ受容体等に対する結合が完全に阻害されて両者が結合しない場合、すなわちＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量が実質的にゼロの場合も包含される。
【００９７】
ＧＲＦ受容体等に対するＧＲＦ等の結合量は、例えばＧＲＦ等に対する抗体を用いたウエスタンブロット法などの公知の方法により定量することができる。また、ＧＲＦ等として前述の標識ＧＲＦ等を用いる場合は、使用した標識物質に応じた測定方法（例えば、放射線測定法、蛍光検出法など）により、ＧＲＦ受容体等に結合したＧＲＦ等の量を定量することもできる。
【００９８】
(2) ＧＲＦの細胞内シグナル伝達の阻害を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦの細胞内シグナル伝達の阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【００９９】
当該方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる：
(i) 被験物質の存在下で、ＧＲＦ受容体またはそのホモログ(ＧＲＦ受容体等)を発現した細胞とＧＲＦまたはそのホモログ（ＧＲＦ等と）を接触させる工程、
(ii) 上記細胞のＧＲＦに起因する細胞内シグナル伝達物質の発現量または活性を測定し、当該発現量または活性を、被験物質非存在下でＧＲＦ受容体等を発現した細胞とＧＲＦ等とを接触させることによって得られる上記に対応する発現量または活性（対照発現量または対照活性）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の結果に基づいて、対照発現量または対照活性に比して発現量または活性を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１００】
２）ＧＲＦ受容体の発現を阻害する作用を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦ受容体の発現に対する阻害を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【０１０１】
当該スクリーニング方法は、特に制限されず当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能であるが、一例として、ＧＲＦ受容体を発現可能な細胞に被験物質を接触させた場合と被験物質を接触させない場合とで、当該細胞のＧＲＦ受容体の発現量を比較し評価することを含むスクリーニング方法を挙げることができる。当該スクリーニング方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる。
(i) 被験物質をＧＲＦ受容体を発現可能な細胞と接触させる工程、
(ii) 被験物質を接触させた細胞のＧＲＦ受容体の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞のＧＲＦ受容体の発現量（対照発現量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量に比してＧＲＦ受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１０２】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組換え体の別を問わず、ＧＲＦ受容体を発現し得る細胞であればよい。またＧＲＦ受容体の由来も特に制限されず、ヒト由来のものであっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類や他の生物種に由来するものであってもよい。かかる細胞として、具体的にはＧＲＦ受容体をコードする遺伝子（DNA）を有する脳下垂体前葉細胞（ヒト及びその他の生物種由来のものを含む）、単離調製された初代脳下垂体前葉培養細胞を挙げることができる。また、前述する方法等によりＧＲＦ受容体のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入して調製される形質転換細胞を用いることもできる。また、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【０１０３】
上記本発明のスクリーニング方法２）の工程（ｉ）において、被験物質とＧＲＦ受容体発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つＧＲＦ受容体の遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐH、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【０１０４】
抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＧＲＦ受容体発現可能細胞とを接触させて、ＧＲＦ受容体の発現量を抑制する物質を探索することによって実施できる。具体的には、被験物質存在下でＧＲＦ受容体発現可能細胞を培養した場合のＧＲＦ受容体の発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するＧＲＦ受容体発現可能細胞を培養した場合に得られるＧＲＦ受容体の発現量（対照発現量）よりも低下することを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。なお、ここでいう低下には、対照発現量と対比するまでもなく、ＧＲＦ受容体が全く発現しない場合（ＧＲＦ受容体遺伝子（ｍＲＮＡ）が全く発現しない場合、ＧＲＦ受容体タンパクが全く生成しない場合）、すなわちＧＲＦ受容体の発現量が実質的にゼロの場合も包含される。
【０１０５】
上記のスクリーニング方法２）の工程(ii)において、ＧＲＦ受容体の発現量は、ＧＲＦ受容体遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定するか、またはＧＲＦ受容体タンパクの生成量を測定することによって評価することができる。また、ＧＲＦ受容体の発現量を測定する方法は、直接これらの遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量や蛋白質生成量を測定する方法でなくても、これらを反映する方法であればよい。すなわち、工程(ii)においてＧＲＦ受容体の発現量を測定するとは、直接的または間接的な方法の別を問わず、ＧＲＦ受容体遺伝子の発現量やＧＲＦ受容体蛋白質の生成量が評価できる方法の実施を広く包含するものである。
【０１０６】
具体的には、ＧＲＦ受容体の発現量の測定（検出および定量）は、ＧＲＦ受容体発現可能細胞のＧＲＦ受容体ｍＲＮＡの発現量を当該ＧＲＦ受容体ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド等を利用してノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法などの公知の方法やＤＮＡアレイを利用して測定したり、またＧＲＦ受容体発現可能細胞の細胞表面に発現したＧＲＦ受容体のタンパク量を抗ＧＲＦ受容体抗体を利用してウエスタンブロット法等の公知の方法を行うことによって実施することができる。また、ＧＲＦ受容体の発現量の測定（検出及び定量）は、ＧＲＦ受容体遺伝子制御領域〔例えば、ＧＲＦ受容体のプロモーター（Genbank Accession number:AF267729, AF121969, AF127135など）の下流領域〕に、例えばルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子等のマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、当該マーカー遺伝子由来の蛋白質の活性を測定することによっても実施することができる。本発明のＧＲＦ受容体の発現量を指標とした抗自己免疫疾患剤の有効成分（標的物質）のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。なお、融合遺伝子の作成及びマーカー遺伝子由来の活性測定は、公知の方法で行うことができる。
【０１０７】
３）ＧＲＦの発現又は分泌を阻害する作用を指標としたスクリーニング方法
当該スクリーニング方法は、被験物質の中からＧＲＦ阻害作用を有する物質を、ＧＲＦの発現または分泌に対する阻害作用を指標として探索し、抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得する方法である。
【０１０８】
当該スクリーニング方法は、特に制限されず当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能であるが、一例として、ＧＲＦを発現可能な細胞に被験物質を接触させた場合と被験物質を接触させない場合とで、当該細胞のＧＲＦの発現量または分泌量を比較し評価することを含むスクリーニング方法を挙げることができる。当該スクリーニング方法は、具体的には下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を行うことによって実施することができる。
(i) 被験物質をＧＲＦを発現可能な細胞を接触させる工程、
(ii) 被験物質を接触させたＧＲＦ発現可能細胞のＧＲＦの発現量または分泌量を測定し、該発現量または分泌量を被験物質を接触させない上記に対応するＧＲＦ発現可能細胞（対照細胞）のＧＲＦの発現量または分泌量（対照発現量または対照分泌量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量または対照分泌量に比してＧＲＦの発現量または分泌量を低下させる被験物質を選択する工程。
【０１０９】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組換え体の別を問わず、ＧＲＦを発現し得る細胞であればよい。またＧＲＦの由来も特に制限されず、ヒト由来のものであっても、マウスなどヒト以外の哺乳類や他の生物種に由来するものであってもよい。かかる細胞として、具体的にはＧＲＦをコードする遺伝子を有する腫瘍細胞（ヒト及びその他の生物種由来のものを含む）、単離調製された初代腫瘍培養細胞を挙げることができる。また、前述する方法等によりＧＲＦのｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入して調製される形質転換細胞を用いることもできる。また、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【０１１０】
上記本発明のスクリーニング方法３）の工程（ｉ）において、被験物質とＧＲＦ発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つＧＲＦ遺伝子（ｍＲＮＡ）が発現し得培養条件（温度、ｐH、培地組成など）、または生成したＧＲＦタンパクが分泌し得る培養条件（温度、ｐH、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【０１１１】
抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＧＲＦ発現可能細胞とを接触させて、ＧＲＦの発現量または分泌量を抑制する物質を探索することによって実施できる。具体的には、被験物質存在下でＧＲＦ発現可能細胞を培養した場合のＧＲＦの発現量または分泌量が、被験物質非存在下で上記に対応するＧＲＦ発現可能細胞を培養した場合に得られるＧＲＦの発現量または分泌量（対照発現量または対照分泌量）よりも低下することを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。なお、ここでいう低下には、対照発現量または対照分泌量と対比するまでもなく、ＧＲＦが全く発現しない場合（ＧＲＦ遺伝子（ｍＲＮＡ）が全く発現しない場合、ＧＲＦタンパクが全く生成しない場合）やＧＲＦタンパクが全く分泌されない場合、すなわちＧＲＦの発現量または分泌量が実質的にゼロの場合も包含される。
【０１１２】
上記のスクリーニング方法３）の工程(ii)において、ＧＲＦの発現量は、ＧＲＦ遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定するか、またはＧＲＦ蛋白質の生成量を測定することによって評価することができる。またＧＲＦの分泌量は、ＧＲＦ発現可能細胞を培養して得られる培養液（培養上清）中に含まれるＧＲＦ蛋白質量を測定することによって評価することができる。また、ＧＲＦの発現量またはＧＲＦの分泌量を測定する方法は、直接これらの遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量や蛋白質生成量を測定したり、また培養上清中のＧＲＦ蛋白質量を測定する方法でなくても、これらを反映する方法であればよい。すなわち、工程(ii)においてＧＲＦの発現量または分泌量を測定するとは、直接的または間接的な方法の別を問わず、ＧＲＦ遺伝子の発現量やＧＲＦ蛋白質の生成量または培養上清中に放出されるＧＲＦ蛋白質量が評価できる方法の実施を広く包含するものである。
【０１１３】
ＧＲＦの発現量の測定（検出および定量）は、ＧＲＦ発現可能細胞のＧＲＦｍＲＮＡの発現量を、当該ＧＲＦｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド等を利用してノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法などの公知の方法やＤＮＡアレイを利用して測定したり、またＧＲＦ発現可能細胞の細胞表面に発現したＧＲＦ生成量を抗ＧＲＦ抗体を利用してウエスタンブロット法等の公知の方法で測定することによって実施することができる。また、ＧＲＦの発現量の測定（検出及び定量）は、ＧＲＦ遺伝子制御領域〔例えば、ＧＲＦのプロモーター（Genbank Accession number:U10153など）の下流領域〕に、例えば前述する各種レポーター遺伝子等のマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来の蛋白質の活性を測定することによっても実施することができる。本発明のＧＲＦの発現量を指標とした抗自己免疫疾患剤の有効成分（標的物質）のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。なお、融合遺伝子の作成及びマーカー遺伝子由来の活性測定は、公知の方法で行うことができる。
【０１１４】
またＧＲＦの分泌量の測定（検出および定量）は、ＧＲＦ発現可能細胞を培養し、得られる培養上清中に含まれるＧＲＦ蛋白質量を、例えば抗ＧＲＦ抗体を利用してウエスタンブロット法等の公知の方法で測定することによって実施することができる。
【０１１５】
以上説明した、１)の（1）及び(2)、２）並びに３）のスクリーニング方法によって被験物質の中から選別された候補物質は、更に、例えばヒトの各種の自己免疫疾患を模倣した病態モデル動物を用いた薬効試験や安全性試験に供することにより、より一層実用的な抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得することができる。
【０１１６】
より具体的には、得られた候補物質について、多発性硬化症の病態モデル動物（例えばEAE発症誘導マウス）を用いた薬効試験を行うことにより、当該候補物質について多発性硬化症に対する抑制効果（予防効果、治療効果）を評価することができる。また、得られた候補物質について、慢性関節リウマチの病態モデル動物（例えばコラーゲン誘導性関節炎 [Trentham DE,Townes AS,Kang AH:Autoimunity to typeII collagens:An experimental model of arthritis J Exp Med 146:857-868,1977]、抗原誘導性関節炎、またはアジュバント誘導性関節炎[Pearson CM：Development of arthritis,periarthritis and periotitis in rats given adjuvant.Proc Soc Expe Biolo Med 91:95-101,1956]のいずれかのマウス）を用いた薬効試験を行うことにより、当該候補物質について慢性関節リウマチに対する抑制効果（予防効果、治療効果）を評価することができる。このようにして選別、取得された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１１７】
以上のような本発明のスクリーニング方法を用いて選択されるＧＲＦ阻害作用を有する物質は、前述の如き抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。ここで自己免疫疾患としては、具体的には本明細書の第Ｉ章に記載する各種の疾病を任意に挙げることができるが、特に本発明が対象とするＧＲＦ阻害作用物質は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデス、好ましくは多発性硬化症、及び慢性関節リウマチに対して有効に使用することができる。
【０１１８】
本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、各種の自己免疫疾患に対して、その発症を阻害若しくは抑制する作用、その発症を遅延させる作用、発症後その症状を軽減若しくは改善する作用、または疾患を治癒する作用のいずれか少なくとも１つの作用を有するものである。その意味で、上記の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患予防剤、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患改善剤、または自己免疫疾患治療剤と言うこともでき、よって本発明のスクリーニング方法は、これらの有効成分の探索方法でありえる。
【０１１９】
本発明は、上記のスクリーニング方法により得られるＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤を提供するものである。
【０１２０】
III ．抗自己免疫疾患剤の用法について
以下、本発明のＧＲＦ阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤の投与形態、投与方法及び投与量等につき説明する。
【０１２１】
1) ＧＲＦ阻害作用を有する物質が低分子化合物、ペプチド又は蛋白質の形態である場合
ＧＲＦ阻害作用を有する物質が低分子化合物、ペプチドまたは抗体などの蛋白質である場合は、これらの物質について通常用いられる一般的な医薬組成物（医薬製剤）の形態に調製することができ、その形態に応じて経口または非経口的に投与することができる。一般的には以下のような投与形態、及び投与方法が挙げられる。
【０１２２】
投与形態としては、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤及びカプセル剤等の固形製剤や、溶液、懸濁液、乳液、シロップ及びエリキシルなどの液剤などの形態を挙げることができる。これらの各種形態は、投与経路に応じて経口投与剤の他、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤（坐剤）、舌下剤、経膣剤、注射剤（経静脈、経動脈、経筋肉、皮下、皮内）や点滴剤等の非経口投与剤に分類することができる。例えば、経口投与剤としては、例えば錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、乳液、及びシロップ等が、又は直腸投与剤や経膣剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤などの形態を採ることができる。経皮剤としては、例えばローション等の液剤の他、クリームや軟膏等の半固形剤の形態を採ることもできる。
【０１２３】
注射剤としては、例えば溶液、懸濁液または乳剤等の形態を採ることができ、具体的には無菌処理した水、水−プロピレングリコール溶液、緩衝化液、０.４重量％濃度の生理食塩水等を例示することができる。さらに注射剤は、液剤に調製した後、凍結処理又は凍結乾燥処理されていてもよく、これにより保存することができる。後者の凍結乾燥処理で調製される凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【０１２４】
上記の医薬組成物（医薬製剤）の形態には、当該分野で行われている通常の手法により、ＧＲＦ阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を配合することによって調製される。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤及び分散剤などを例示することができる。また、さらに当該分野において通常用いられる添加剤を配合することもできる。かかる添加剤は、調製する医薬組成物の形態に応じて、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、香料、着色料、張度調節剤、キレート剤、界面活性剤などの中から適宜選択して用いることができる。
【０１２５】
このような形態を有する医薬組成物は、目的とする疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内または筋肉内に投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与してもよいし、また経口投与や直腸投与も可能である。
【０１２６】
これらの医薬組成物の投与量や投与回数は、投与形態、患者の疾患やその症状、患者の年齢や体重等によって異なり、一概に規定することができないが、通常は成人に対し１日あたり有効成分の量として約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。
【０１２７】
２ ) ＧＲＦ阻害作用を有する物質がポリヌクレオチドの形態である場合
ＧＲＦ阻害作用を有する物質が、ＧＲＦ遺伝子やＧＲＦ受容体遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド等のようにポリヌクレオチドの形態を有するものである場合は、遺伝子治療剤または予防剤の形態を採ることができる。近年、種々の遺伝子を用いた遺伝子治療の報告がなされており、遺伝子治療は技術的にも確立された技術となっている。
【０１２８】
遺伝子治療剤は、ベクターに目的のポリヌクレオチドを導入して調製したり、また当該ベクターで適当な細胞を形質転換することによっても調製できる。ここで、患者への投与形態は、上記目的のポリヌクレオチドを導入するベクターとして(1)非ウイルスベクターを用いた場合と、(2)ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別される。ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合と非ウイルスベクターを用いる場合について、遺伝子治療剤の調製法及び投与法は実験手引書に詳しく解説されている（例えば、「別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術」, 羊土社,1996、別冊実験医学：「遺伝子導入＆発現解析実験法」, 羊土社, 1997、「日本遺伝子治療学会編 遺伝子治療開発研究ハンドブック」、エヌ・ティー・エス、1999など）。以下、用いるベクター毎に遺伝子治療剤の調製法及び投与法を具体的に説明する。
【０１２９】
（1）ベクターとして非ウイルスベクターを用いる場合
非ウイルスベクターとしては、生体内、好ましくはヒト生体内で目的のポリペプチドや蛋白質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現させることのできる任意の発現ベクターを用いることができる。特に制限されないが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200(1991)）や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ（以上、インビトロゲン社、ストラタジーン社）などが挙げられる。
【０１３０】
患者へのポリヌクレオチドの導入は、これらの非ウイルスベクター（発現ベクター）に常法に従って目的とするポリヌクレオチドを導入し、得られた組換え発現ベクターを投与することによって行うことができる。これにより、目的とするポリヌクレオチドを被験者の細胞や組織に導入することができる。
【０１３１】
より具体的には、細胞へのポリヌクレオチド導入法としては、リン酸−カルシウム共沈法や、微小ガラス管を用いたＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の直接注入法などが挙げられる。
【０１３２】
また、組織へのポリヌクレオチド導入法としては、内包型リポソーム（internal type liposome）または静電気型リポソーム（electrostatic type liposome）によるポリヌクレオチド導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（HVJ-AVEリポソーム法）、レセプター介在性ポリヌクレオチド導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにポリヌクレオチドを細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等の方法を例示することができる。
【０１３３】
（2）ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルスやレトロウイルスに由来するベクター等が挙げられる。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスのベクターを挙げることができる。中でもアデノウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも感染効率がはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクターを用いることが好ましい。
【０１３４】
患者へのポリヌクレオチドの導入は、これらのウイルスベクターに常法に従って目的とするポリヌクレオチドを導入し、得られた組換えウイルスを所望の細胞に感染させることによって行うことができる。これにより、細胞内に目的とするポリヌクレオチドを導入することが可能である。
【０１３５】
このようにして調製される遺伝子治療剤の患者への投与方法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するin vivo法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞をヒト体内に戻すex vivo法がある（「日経サイエンス」,1994年4月号,20-45頁；「月刊薬事」,36(1)，23-48,1994；「実験医学増刊」,12(15),1994；「日本遺伝子治療学会編 遺伝子治療開発研究ハンドブック」,エヌ・ティー・エス,1999）。本発明が対象とする自己免疫疾患のうち、全身性自己免疫疾患の予防または治療のために用いる場合は、in vivo法により体内に導入することが好ましい。
【０１３６】
In vivo法による投与は、目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。
【０１３７】
遺伝子治療剤の形態としては、上記の各投与形態に応じて種々の製剤形態を採用することができる。例えば注射剤の形態を有する場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えばＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等の溶剤に有効成分となるポリヌクレオチドを溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤及び遠心分離濃縮凍結剤などの各種のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【０１３８】
また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。
【０１３９】
遺伝子治療剤中のポリヌクオチドの含量は、治療対象とする疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、各々のポリヌクレオチドとして約０．０００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．００１〜約１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【０１４０】
また、前述する本発明は抗自己免疫疾患剤を用いる自己免疫疾患の予防方法または治療方法である。当該方法は、自己免疫疾患に罹患した被験者（自己免疫疾患患者）に本発明の抗自己免疫疾患剤を有効量投与することによって実施することができる。ここで自己免疫疾患としては、第Ｉ章に記載する各種の自己免疫疾患を挙げることができる。好ましくは多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスであり、より好ましくは多発性硬化症、慢性関節リウマチである。
【０１４１】
また、自己免疫疾患に罹患した被験者には、自己免疫疾患の具体的な病態を発症している被験者だけでなく、発症していない場合であっても潜在的に自己免疫疾患の発症の可能性を有している被験者も含まれる。従って、本発明でいう自己免疫疾患の予防には、自己免疫疾患に罹患した被験者について自己免疫疾患の発症を予防すること、発症程度を抑制することが包含される。また、本発明でいう自己免疫疾患の治療には、自己免疫疾患に罹患した被験者について発症した自己免疫疾患の病態（症状）を緩和ないしは改善することが包含される。
【０１４２】
抗自己免疫疾患剤の投与形態、投与方法、及び投与量については、前述の通りである。
【０１４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【０１４４】
実施例１ 成長ホルモン放出因子受容体（GRFR）遺伝子の欠損が実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症に与える影響の検討
自己免疫疾患の発症に対する成長ホルモン放出因子（GRF）の関与を調べるため、ＧＲＦ受容体遺伝子を欠損したマウスについて、ヒトの多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症の有無を検討した。実験方法と結果を以下に示す。
【０１４５】
＜実験方法＞
実験には、ＧＲＦＲ遺伝子ホモ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/lit）、ＧＲＦＲ遺伝子ヘテロ欠損マウス（C57BL/6J-Ghrhrlit/+）および対照として野生型マウス（C57BL/6J）（全てメス、いずれもThe Jackson Laboratoryより購入）を用いた。マウスはいずれも５週齢のものを購入し、毎日午前８時から午後８時まで照明を点灯し、水および固形飼料（CE-2；日本クレア）を自由に摂取できるようにして飼育した。
【０１４６】
これらのマウス（各群５匹づつ、合計１５匹）に人為的に実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症を誘導させた。具体的には、これらの各マウスに、生理食塩水(大塚製薬（株）製)に溶解した２mg/mlのミエリンオリゴデンドロサイトグリコプロテイン（MOG）35-55合成ペプチド（アミノ酸配列：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys：配列番号８）（アコード社製）の溶液と完全フロイントアジュバント（CFA）(ディフコ社製)を１：１に混合したエマルジョンを、100μｌずつ大腿部皮下に感作し、感作直後および２日後に生理食塩水(大塚製薬（株）製)に溶解した200ngの百日咳毒素(リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ社製)を腹腔内投与して、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を惹起させた。なお、すべてのマウスは上記実験期間中も含めて全飼育期間を通じて飼料と水を自由に摂取出来るようにした。
【０１４７】
２７日間にわたり、毎日体重を測定し、ＥＡＥ症状を観察して、以下の基準に基づいてＥＡＥ症状のスコアを記録した。
【０１４８】
[ＥＡＥ症状のスコア]
０：無症状、１：尾の麻痺、２：弱い後ろ足の麻痺、３：中程度から強度の後ろ足の麻痺あるいは弱い前足の麻痺、またはその両方、４：完全な後ろ足の麻痺あるいは中程度から強度の前足の麻痺、またはその両方、５：四肢の麻痺あるいは死戦期にある、６：死亡。
【０１４９】
＜結果＞
得られたＥＡＥ症状のスコアの平均値の推移を図１(Ａ)示す。その結果、ＧＲＦＲホモ欠損マウスでは、全観察期間(27日間)を通じて実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症（スコア１）が認められなかった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスについても、野生型マウスに比較してＥＡＥスコアの有意な低下が認められた。
【０１５０】
またＥＡＥの発症率の推移を図１（Ｂ）に示す。その結果、ＧＲＦＲホモ欠損マウスの発症率は全観察期間（27日間）を通じて０であった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスも野生型マウスに比較して発症率が低く抑えられた。これらの結果から、ＧＲＦＲ遺伝子の欠損によりＥＡＥの発症が強く抑制されることが明らかとなった。
【０１５１】
実施例２ 成長ホルモン放出因子（GRF）アンタゴニストの投与が実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症に与える影響の検討
ＧＲＦアンタゴニストの投与が自己免疫疾患の発症に与える影響を調べるため、ヒトの多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を用いて検討を行った。実験方法と結果を以下に示す。
【０１５２】
＜実験方法＞
実験には野生型マウス（PLSJLF1/J）（雌、The Jackson Laboratoryより購入）を用いた。マウスは５週齢で購入し、毎日午前８時から午後８時まで照明を点灯し、水および固形飼料（CE-2；日本クレア）を自由に摂取できるようにして飼育した。まずこれらのマウス（合計１０匹）に、生理食塩水(大塚製薬（株）製)に溶解した2mg/mlのウサギミエリン塩基性タンパク質(MBP)(シグマ社製)と完全フロイントアジュバント（CFA）(ディフコ社)を１：１に混合したエマルジョンを、100μｌずつ大腿部皮下に感作し、感作の直後および2日後に生理食塩水に溶解した200ngの百日咳毒素(リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ社製)を腹腔内投与して、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を惹起させた。次いで、GRFアンタゴニストの投与は以下の手順に従って行った。ＭＢＰ感作と百日咳毒素の投与を行ったマウス（計１０匹）を２群に分け、１群（５匹）には、マウス１匹あたり30μgのＧＲＦアンタゴニスト（MZ-4-71：米国カルビオケムノバビオケム社製）をＭＢＰ感作後８日目から１５日目まで毎日１回、頚背部皮下部に投与した（ＧＲＦアンタゴニスト(MZ-4-71)投与群）。もう１群（５匹）には、対照として同量の生理食塩水を同様にＭＢＰ感作後８日目から１５日目まで毎日１回、頚背部皮下部に投与した（生理食塩水投与群）。なお、すべてのマウスは上記実験時間を含む全飼育期間を通じて飼料と水を自由に摂取出来るようにした。毎日体重を測定し、ＥＡＥ症状を観察して、下記の基準に基づいてＥＡＥ症状のスコアを記録した。
【０１５３】
＜ＥＡＥ症状のスコア＞
０：無症状、１：尾の麻痺、２：弱い後ろ足の麻痺、３：中程度から強度の後ろ足の麻痺あるいは弱い前足の麻痺、またはその両方、４：完全な後ろ足の麻痺あるいは中程度から強度の前足の麻痺、またはその両方、５：四肢の麻痺あるいは死戦期にある、６：死亡。
【０１５４】
＜結果＞
結果を図２に示す。図２(Ａ)にはＥＡＥスコアの平均値の推移を示す。ＧＲＦアンタゴニスト（MZ-4-71）投与群では、生理食塩水投与群と比較してＥＡＥスコアの低下が認められた。 図２（Ｂ）にはＥＡＥの発症率の推移を示した。ＧＲＦアンタゴニスト（MZ-4-71）投与群は、生理食塩水投与群に比較してＥＡＥ発症の開始に遅延が認められた。これらの結果から、ＧＲＦアンタゴニストの投与によりＥＡＥの発症が抑制されることが明らかとなった。
【０１５５】
実施例３ ＧＲＦ受容体（GRFR）発現細胞を用いた抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング
ＧＲＦ受容体のｃＤＮＡを含有する発現ベクターを用いて、常法によりＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞を形質転換し、ＧＲＦ受容体を細胞表面に安定に発現する形質転換細胞を取得する。または常法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, p12298-12302 (1994)を参照）によりラット脳下垂体前葉細胞を単離・調製する。他方、ＧＲＦ（住友製薬（株）製）を常法によりビオチンまたはラジオアイソトープ（125Ｉ）などで標識する。
【０１５６】
次に、前記ＧＲＦ受容体発現細胞（形質転換細胞、またはラット脳下垂体前葉細胞）に対して、(i)標識ＧＲＦ、又は(ii)標識ＧＲＦ及び被験物質を添加し、所定時間後、これら(i)の反応系及び(ii)の反応系における標識ＧＲＦのＧＲＦ受容体発現細胞への結合性を測定し、両者を比較する。(ii)の反応系において、結合性が認められないか、または(i)の反応系における結合性と比較して結合性が低くなる被験物質を、抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質として選択する。
【０１５７】
また得られた候補物質は、さらにＧＲＦ阻害作用を検出する別のスクリーニング系、およびＥＡＥモデル動物に対する投与実験などに供される。これにより、前記候補物質について抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得ることを確認することができる。
【０１５８】
実施例４ ＧＲＦ発現可能細胞を用いた抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング
ＧＲＦ産生腫瘍細胞に対し（i）被験物質を添加しない群と、（ii）被験物質を添加した群を準備する。各群について一定期間培養し、次いで細胞を回収して常法により溶解し、ノーザンブロット解析によりＧＲＦのｍＲＮＡの発現量を比較する。あるいは、細胞培養上清を回収し、ウエスタンブロット解析により、培養液中に分泌されたＧＲＦのタンパク量を比較する。これらのスクリーニングにより、(ii)の群についてＧＲＦ発現またはＧＲＦ分泌が認められない場合、または(ii)の群のＧＲＦ発現量またはＧＲＦ分泌量が、(i)の群で得られる結果よりも少ない場合、(ii)に用いた被験物質を抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質として選択する。
【０１５９】
また得られた候補物質は、さらにＧＲＦ阻害作用を検出する別のスクリーニング系、およびＥＡＥモデル動物に対する投与実験などに供される。これにより、前記候補物質について抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得ることを確認することができる。
【０１６０】
【発明の効果】
本発明により、ＧＲＦ阻害作用という新たな作用メカニズムに基づく新規な抗自己免疫疾患剤を提供することができる。さらに本発明により、ＧＲＦ阻害作用という新たな作用メカニズムに基づいて効果を発揮する抗自己免疫疾患剤の有効成分を取得するためのスクリーニング方法が提供される。本発明のＧＲＦ阻害作用を指標としたスクリーニング方法によれば、新たな作用メカニズムに基づいて自己免疫疾患の発症を予防したり治療することのできる有効成分を取得することが可能である。よって、本発明のスクリーニング方法は、自己免疫疾患の予防または治療に有効な新規薬剤の開発に好適に利用することができる。
【０１６１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１における実験結果を示す図である。具体的には、ＥＡＥ発症に対するＧＲＦの関与について検討するため、ＧＲＦＲ遺伝子ホモ欠損マウス（―□―）、ＧＲＦＲヘテロ欠損マウス（―△―）、および対照として用いた野生型マウス（―●―）のそれぞれについて、人為的に誘導したＥＡＥ発症の有無を示したグラフである。
図中(Ａ)にはＥＡＥスコアの平均値の推移を示す。野生型マウスでは感作後16日目からＥＡＥの発症（スコア１）が見られ始め、感作後25日目にはスコアが１.２に達した。一方ＧＲＦＲホモ欠損マウスにおいては全観察期間（27日間）を通じて全く発症が認められなかった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスではＥＡＥは発症したものの、その平均スコア値は野生型マウスの平均スコア値に比較して著しく低かった。図中（Ｂ）にはＥＡＥ発症率の推移を示す。ＧＲＦＲホモ欠損マウスは全観察期間を通じて発症率が０であった。またＧＲＦＲヘテロ欠損マウスは野生型マウスと比較してＥＡＥの発症率は著しく低かった。
【図２】 図２は、PLSJLF1マウスにMBPの感作と百日咳毒素の投与によりEAE発症を誘導し、GRFアンタゴニストであるMZ-4-71投与のEAE発症に対する影響を検討した結果を示したグラフである。
図中（Ａ）にはEAEスコアの平均の推移を示した。図中、黒い太線で示した期間はMZ-4-71または対照として生理食塩水を投与した期間を示す。生理食塩水投与群では感作後12日目から発症が見られ、感作後16日目にはスコアの平均値は4.2に達した。一方、MZ-4-71投与群では感作後11日目から発症が認められたが、感作後13日目に平均スコアが0.3に達した後に一旦寛解が導入され、感作後17日目にはすべてのマウスが寛解となり、平均スコアは0になった。感作後20日目から再発が見られたが、その後の観察期間中を通じて平均スコアの最大値は2.2（感作後23日目）にとどまった。これらの結果から、GRFアンタゴニストの投与によってEAE発症が抑制されることが示された。図中（Ｂ）には発症率の推移を示した。図中、黒い太線で示した期間はMZ-4-71または対照として生理食塩水を投与した期間を示す。生理食塩水投与群では、感作後12日目から13日目に急速な発症が見られ、感作後13日目には発症率が80%に達した。一方、MZ-4-71投与群では発症は緩慢に開始し、感作後26日目の時点でも発症率は60%にとどまった。これらの結果から、発症率の点からもGRFアンタゴニストの投与によってEAE発症が抑制されることが示された。
Claims (9)
- 被験物質の中から、成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、成長ホルモン放出因子受容体を介した成長ホルモン放出因子の作用の阻害を指標として探索することを特徴とする、抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする方法。
- 成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、成長ホルモン放出因子と成長ホルモン放出因子受容体との結合阻害を指標として探索することを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
- 下記の工程（i）、(ii)及び(iii)を含む請求項２に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする方法：
(i) 被験物質の存在下で、成長ホルモン放出因子受容体若しくはそのホモログと成長ホルモン放出因子若しくはそのホモログとを接触させる工程、
(ii) 上記成長ホルモン放出因子受容体若しくはそのホモログに対する成長ホルモン放出因子若しくはそのホモログの結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下で成長ホルモン放出因子受容体若しくはそのホモログと成長ホルモン放出因子若しくはそのホモログとを接触させることによって得られる成長ホルモン放出因子受容体若しくはそのホモログに対する成長ホルモン放出因子若しくはそのホモログの結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
(iii) 上記(ii)の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を低下させる被験物質を選択する工程。 - 請求項３に記載の工程(i)、(ii)及び(iii)に更に：(iv) 上記(iii)で選択された被験物質の中から、更に成長ホルモン放出因子と同じ作用を発揮しない被験物質を選択する工程を含む、請求項３に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする方法。
- 被験物質の中から、成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、成長ホルモン放出因子受容体の発現阻害を指標として探索することを特徴とする、抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法。
- 下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む請求項５に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする方法：
（ｉ）被験物質を成長ホルモン放出因子受容体を発現可能な細胞と接触させる工程、
（ii）被験物質を接触させた細胞の成長ホルモン放出因子受容体の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない上記に対応する成長ホルモン放出因子受容体を発現可能な細胞（対照細胞）の成長ホルモン放出因子受容体の発現量（対照発現量）と比較する工程、
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量に比して成長ホルモン放出因子受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程。 - 被験物質の中から、成長ホルモン放出因子阻害作用を有する物質を、成長ホルモン放出因子の発現又は分泌の阻害を指標として探索することを特徴とする、抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする方法。
- 下記の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む請求項７に記載の抗自己免疫疾患剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする方法：
（ｉ）被験物質を成長ホルモン放出因子を発現可能な細胞と接触させる工程、
（ii）被験物質を接触させた上記細胞の成長ホルモン放出因子の発現量または分泌量を測定し、該発現量または分泌量を、被験物質を接触させない上記に対応する対照細胞の成長ホルモン放出因子の発現量（対照発現量）又は分泌量（対照分泌量）と比較する工程、
(iii) 上記(ii)の比較結果に基づいて、対照発現量または対照分泌量に比して成長ホルモン放出因子の発現量または分泌量を低下させる被験物質を選択する工程。 - 抗自己免疫疾患剤が多発性硬化症、慢性関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスの予防または治療薬である、請求項１乃至８のいずれかに記載のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002143221A JP4273293B2 (ja) | 2001-05-18 | 2002-05-17 | Ｇｒｆ作用の阻害による新規抗自己免疫疾患剤、及びそのスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-148607 | 2001-05-18 | ||
| JP2001148607 | 2001-05-18 | ||
| JP2002143221A JP4273293B2 (ja) | 2001-05-18 | 2002-05-17 | Ｇｒｆ作用の阻害による新規抗自己免疫疾患剤、及びそのスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003048853A JP2003048853A (ja) | 2003-02-21 |
| JP4273293B2 true JP4273293B2 (ja) | 2009-06-03 |
Family
ID=26615305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002143221A Expired - Fee Related JP4273293B2 (ja) | 2001-05-18 | 2002-05-17 | Ｇｒｆ作用の阻害による新規抗自己免疫疾患剤、及びそのスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4273293B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150130284A (ko) * | 2013-03-15 | 2015-11-23 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 암 백신 및 이를 이용한 치료 방법 |
-
2002
- 2002-05-17 JP JP2002143221A patent/JP4273293B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003048853A (ja) | 2003-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2021185178A (ja) | 胆汁酸に関係した障害の治療方法 | |
| Yotsumoto et al. | Expression of adrenomedullin, a hypotensive peptide, in the trophoblast giant cells at the embryo implantation site in mouse | |
| JP2002517977A (ja) | Ｔｎｆリガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー | |
| JP2002521055A (ja) | ９８個のヒト分泌タンパク質 | |
| EP3735260B1 (en) | Therapeutic peptides and methods for treating autoimmune related disease | |
| JP2025116861A (ja) | ペプチドおよび疾患の治療方法 | |
| Catli et al. | Atypical STAT5B deficiency, severe short stature and mild immunodeficiency associated with a novel homozygous STAT5B Variant | |
| JP2002537796A (ja) | ヒトグリコシル化酵素 | |
| JP2000083689A (ja) | シアロアドヘシンファミリ―メンバ――２（ｓａｆ―２） | |
| JP2003024085A (ja) | 腫瘍壊死関連受容体ｔｒ７ | |
| US20190194290A1 (en) | Methods for preventing, modulating and/or reducing cardiovascular disease | |
| JP2001509372A (ja) | 血小板凝集に関与する細胞表面受容体であるヒトｆ１１抗原 | |
| ES3031007T3 (en) | Peptide for preventing, modulating and/or reducing cardiovascular disease | |
| JP4273293B2 (ja) | Ｇｒｆ作用の阻害による新規抗自己免疫疾患剤、及びそのスクリーニング方法 | |
| US20030013637A1 (en) | Novel anti-autoimmune composition by inhibition of GRF action | |
| JP2008509655A (ja) | Ｕｎｃ５ｈ２のスプライス変異体 | |
| JP2002300891A (ja) | 新規化合物 | |
| JP2000125888A (ja) | シアロアドヘシンファミリ―メンバ――３ | |
| JP2002527104A (ja) | Ｔｎｆｒ関連遺伝子１２ | |
| US7056662B2 (en) | Method of diagnosing a risk of developing insulin resistance | |
| JP5493234B2 (ja) | Ｐｓｇｌ−１阻害によるメタボリックシンドロームの予防及び治療法 | |
| AU2009270826A1 (en) | Compositions comprising MG29 nucleic acids, polypeptides and associated methods of use | |
| JP2004041175A (ja) | ヒトｌｉｇ−１相同体（ｈｌｉｇ−１） | |
| JP2004000193A (ja) | 免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバー、ｐｉｇｒ−２ | |
| JPH11103867A (ja) | Ｅｐｏ一次応答遺伝子１、ｅｐｒｇ１ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050419 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20051026 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080716 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080912 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080916 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081029 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081219 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090128 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090217 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120313 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |