JP4313049B2

JP4313049B2 - 血管新生関連疾患の予防又は治療用医薬組成物

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Publication number: JP4313049B2
Application number: JP2003015280A
Authority: JP
Inventors: 惠司蓮見; 偉民胡
Original assignee: TTC Co Ltd
Current assignee: TTC Co Ltd
Priority date: 2003-01-23
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2023-01-23
Also published as: JP2004224738A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規の血管新生関連疾患の予防及び治療用医薬組成物にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、血管新生が、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症又はリウマチ等の疾患の、病因又は病態の悪化に関与していることが知られている。血管新生を阻害することはこれら疾患の予防及び治療に重要である。
【０００３】
プラスミノゲン／プラスミン系は血栓溶解のみならず、炎症、組織リモデリング、腫瘍転移、及び血管形成など、局在化蛋白分解を必要とする様々な生理学的及び病理学的イベントにも非常に重要な役割を演じる。プラスミノゲンは、Ｎ−末端ペプチドと、５個のクリングルドメインと、セリンプロテアーゼドメインとからなる。２種のセリンプロテアーゼ、つまり組織型プラスミノゲン活性化因子とウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ウロキナーゼ）は、Ａｒｇ⁵⁶¹−Ｖａｌ⁵⁶²結合を切断することにより、プラスミノゲンの活性化を触媒する。生じたプラスミンは、Ｌｙｓ⁷⁷−Ｌｙｓ⁷⁸及び/又はＬｙｓ⁷⁸−Ｖａｌ⁷⁹を切断して、二硫化物架橋によって結合した２個のポリペプチド鎖からなる成熟したプラスミンを生成する。この重鎖（Ａ鎖；Ｌｙｓ⁷⁸−又はＶａｌ⁷⁹−Ａｓｐ⁵⁶¹）は、5個のクリングルドメインを含み、軽鎖（Ｂ鎖；Ｖａｌ⁵⁶²−Ａｓｎ⁷⁹¹）は、セリンプロテアーゼドメインを有する。循環するプラスミノゲンでは、Ｎ末端ペプチド内のＬｙｓ⁵⁰ 及び/又はＬｙｓ⁶²が５番目のクリングルドメイン（Ｋ５）のリシン結合部位（アミノヘキシル部位）に分子内結合することによって緊密ならせん形コンホメーションが維持されるため、活性化が困難である。フィブリン及び細胞リセプターは、プラスミノゲンに結合し、プラスミノゲンコンホメーションを緩めて高度に活性化することできるため、効率的な局在化蛋白分解が促進される。同様に、リシン類似体は、プラスミノゲンクリングルに結合して、そのコンホメーションを緩めて、プラスミンへの活性化を増強する。このように、プラスミノゲンのコンホメーション調整は、プラスミノゲンの活性化にとって重要である。
【０００４】
腫瘍の進行及び炎症など特定の状況下では、プラスミン（プラスミノゲン）は蛋白分解を受けて、様々なクリングル含有Ａ鎖フラグメント（集合的にアンジオスタチンと呼ばれる）を形成する。部分的な二硫化物還元の前又は後に行われる生理的プラスミン（プラスミノゲン）切断は、プラスミン自身、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、メタロエラスターゼ、及び／又は腫瘍細胞か炎症マクロファージが産生するカテプシンＤに介されると仮定されている。典型的アンジオスタチンは、プラスミンの最初の４個のクリングルドメイン（Ｋ１−４）からなる。アンジオスタチン及びその類縁物（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ５、Ｋ１−３、Ｋ１−４_1/2、及びＡ₆₁など）は、血管内皮細胞に影響を与えて、血管形成の基本的過程である内皮細胞の増殖、遊走、及び管形成を阻害する。アンジオスタチンは、血管形成の阻害により、動物モデルでの原発性腫瘍及び転移性腫瘍の両方の成長の両者を抑制する。
【０００５】
最近、プラスミノゲン活性化の新規な非リシン類似モジュレータ（non-lysine-analog modulators）が発見された。例えば、特許文献１では、スタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）は、トリプトファンおよびリジンを添加した培地で培養すると、それらのアミノ酸部分を構造成分として有するトリプレニルフェノール化合物（以下「ＳＭＴＰ」という）を選択的に産生することが開示されている。
このようなスタプラビンおよびＳＭＴＰ、さらにチオプラビン（thioplabins）などの非リシン類似モジュレータは、プラスミノゲン活性化及びプラスミノゲン−フィブリン結合の両者を増強し、フィブリン溶解を増加させる。
【０００６】
しかし、これらＳＭＴＰが、血管新生阻害作用を有していることは知られてはいなかった。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−６５２８８号公報
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規の血管新生関連疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することにある。
【０００９】
非リシン類似モジュレータの、プラスミノゲン活性化とプラスミノゲン−フィブリン結合の両者を増強し、フィブリン溶解を増加させる効果は、プラスミノゲンの活性は高めても、プラスミノゲン−フィブリン結合及びフィブリン溶解は阻害するリシン類似モジュレータの作用とは著しく異なり、そのため、そのような非リシン類似モジュレータが誘導するコンホメーション変化は、リシン類似体に誘導された変化と識別できる。本発明者は、非リシン類似モジュレータによるプラスミノゲンのコンホメーション調整は、プラスミノゲン活性化を増強するだけでなく、並はずれた蛋白分解感度をプラスミン（プラスミノゲン）に付与することを見出している。さらに、本発明者は、そのような化合物のうちの３種（ＳＭＴＰ−６、チオプラビンＢ、及びコンプレスタチン（complestatin））が、広範なフラグメント形成を受けた触媒ドメイン（Ｂ鎖）によって、プラスミン（プラスミノゲン）誘導体（ＰＭＤと呼ばれる）の自己触媒的生成を促進し、血管内皮細胞の増殖、遊走、及び管形成を阻害することも見出している。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
発明者は、鋭意研究を重ねた結果、トリプレニルフェノール化合物に血管新生阻害活性を有することを見出し、また、その化合物が腫瘍成長を阻害するのに有効であることも見出し、本願発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、式Ｉ：
【化２】

〔式中、
Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚであり、
Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ若しくは−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成し、
ｍは、１又は２であり、
ｍが１であるとき、点線（……）は結合を示さず、
Ｒ^１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基であり、
ｍが２であるとき、点線（……）は結合を示し、
Ｒ^２は、二価の結合基となり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ₂Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ₂）_ｎ−ＮＨ₂（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である〕
で示される、少なくとも一つの化合物又はその薬学的に許容され得る塩、エステル若しくは溶媒和物を含む、血管新生関連疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【００１２】
上記の式Ｉの化合物において、ｍが１であるとき、式Ｉの化合物は、式II：
【００１３】
【化３】

【００１４】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＲ¹は上記で定義されたのと同じ意味である）
で表すこともでき、また、ｍが２であるとき、式Ｉの化合物は、式III：
【００１５】
【化４】

【００１６】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＲ²は上記で定義されたのと同じ意味である）
で表すこともできる。
【００１７】
また、本発明は、式Ｉ、II又IIIで示される、少なくとも一つの化合物を含む、血管新生関連疾患の予防又は治療用医薬組成物にも関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
【００１９】
前記の式中の置換基Ｘは、好ましくは、Ｙ及びＺがそれぞれ−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成した、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚであり、特に好ましくは、Ｙ及びＺが一緒になって単結合を形成した、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚである。
【００２０】
上記の式において、ｍが１であるとき、置換基Ｒ^１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基である。
上記の、ｍが１であるときの（１）〜（３）の天然アミノ酸は、天然に存在し得るアミノ酸であれば、特に制限されず、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸及びδ−アミノ酸などがある。このようなアミノ酸は、天然物から得られるものであってもよく、又は人為的に有機合成などの手法により得られるものでもよい。
【００２１】
上記の、ｍが１であるときの（１）〜（３）のアミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、ホモシステイン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸及びジアミノプロピオン酸などが挙げられ、β−アミノ酸として、β−アラニンなどが挙げられ、γ−アミノ酸として、γ−アミノ酪酸及びカルニチンなどが挙げられ、δ−アミノ酸として、５−アミノレブリン酸及び５−アミノ吉草酸などが挙げられる。
【００２２】
上記のｍが１であるときの（３）の天然アミノ酸若しくは天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物として、例えばアミノアルコール及びアミンが挙げられる。このようなアミノアルコールとして、例えば２−アミノエタノール及びイソプロピルアルコールなどが挙げられる。
【００２３】
Ｒ^１は、疎水性であることが好ましく、ｍが１であるときの（１）〜（３）の天然アミノ酸として、例えば、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びロイシンなどが好ましい。
【００２４】
上記の式において、ｍが２であるとき、置換基Ｒ^２は、二価の結合基であり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ₂Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ₂）_ｎ−ＮＨ₂（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である。
上記の、ｍが２であるときの（１）〜（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸は、天然に存在し得るアミノ酸で、２個のアミノ基を有していれば、特に制限されず、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸及びδ−アミノ酸などがある。このようなアミノ酸は、天然物から得られるものであってもよく、又は人為的に有機合成などの手法により得られるものでもよい。
【００２５】
上記の、ｍが２であるときの（１）〜（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、シスチン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸及びジアミノプロピオン酸などが挙げられる。
【００２６】
上記の、ｍが２であるときの（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸若しくは２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物として、Ｈ₂Ｎ−（ＣＨ₂）_ｌ−ＮＨ₂（ｌは１〜１０、好ましくは２〜６、より好ましくは３又は４の整数である）が挙げられる。
【００２７】
上記のｎが２であるときの（４）の化合物は、ｎは０〜９、好ましくは１〜５、より好ましくは２又は３の整数である。
【００２８】
又、Ｒ²は上記のｎが２であるときの（４）の化合物において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物から２個のアミノ基を除いた残基であってもよい。
【００２９】
本発明の化合物には、式Ｉ〜IIIで示される化合物の鏡像異性体又はこれらの鏡像異性体が混在してなるラセミ混合物も含まれる。好ましい鏡像異性体として、式IV：
【００３０】
【化５】

で示される、本発明の化合物が挙げられる。
【００３１】
本発明の化合物として、好ましくは、図５〜７に示すように、ＳＭＴＰ−１、ＳＭＴＰ−２、ＳＭＴＰ−３、ＳＭＴＰ−４、ＳＭＴＰ−５、ＳＭＴＰ−６、ＳＭＴＰ−７、ＳＭＴＰ−８、ＳＭＴＰ−９、ＳＭＴＰ−１０及びＳＭＴＰ−１１が挙げられる。また、これら化合物の鏡像異性体及びこれらの鏡像異性体が混在してなるラセミ混合物も本発明の化合物として使用できる。
【００３２】
本明細書において、本発明の化合物の鏡像異性体は以下の表現を用いる。すなわち、上記の鏡像異性体として、上記のＳＭＴＰ−３〜ＳＭＴＰ−１１の、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＲ配置をとるものをそれぞれＳＭＴＰ−３Ｄ〜ＳＭＴＰ−１１Ｄと表現する。また、上記のＳＭＴＰ−３〜ＳＭＴＰ−１１の、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＳ配置をとるものをＳＭＴＰ−３Ｌ〜ＳＭＴＰ−１１Ｌと表現する。また、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＲ配置をとるＳＭＴＰをＳＭＴＰ−Ｄと、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＳ配置をとるＳＭＴＰをＳＭＴＰ−Ｌと表現する。
【００３３】
本発明の化合物は、有機化学的合成手法により得てもよいが、好ましくは特許文献１に記載されたように、真菌を培養し、その代謝物より得ることができる。詳細には、生産菌としては、スタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌はスタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。基本培地は、以下組成を示すＡ培地が好ましいが、本発明はこの組成の培地に限定されるものではない。Ａ培地：グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇを１リットルの精製水に溶解し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでpHを５．５に調整する。培地組成で最も重要な点は、目的とする本発明の化合物に応じて、適切なアミノ酸、アミノアルコールまたはアミンを培地に添加することである。
例えば、ＳＭＴＰ−１およびＳＭＴＰ−２は２−アミノエタノールを、ＳＭＴＰ−３はセリンを、ＳＭＴＰ−４はフェニルアラニンを、ＳＭＴＰ−５はロイシンを、ＳＭＴＰ−６はトリプトファンを、ＳＭＴＰ−７はオルニチンを、ＳＭＴＰ−８はリジンを、ＳＭＴＰ−９はシスチンを、ＳＭＴＰ−１０はイソロイシンを、ＳＭＴＰ−１１はバリンを、それぞれ培地に添加することにより選択的に生産することができる。
また、本発明の化合物の鏡像異性体を得るには、ＳＭＴＰ−３Ｄ〜１１Ｄは、上記アミノ酸としてＤ−アミノ酸を使用すれば得られ、ＳＭＴＰ−３Ｌ〜１１Ｌは、上記アミノ酸としてＬ−アミノ酸を使用すれば得られる。
アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加濃度は、０．５から２mg／mlが望ましいが、本発明はこの濃度に限定されるものではない。アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加時期は、培養直後から培養３日目までが望ましい。培養温度は２５℃が最適であるが、この温度に限定されるものではない。培養時間は、アミノ酸あるいはアミノアルコール添加後３から６日で充分な生産量が得られる。通気攪拌条件は、５００ml容の三角フラスコに１００mlのＡ培地を入れ、適当な通気栓をした場合、１８０rpmの旋回培養で得られる条件が適当である。ジャーファーメンターを用いる場合、これに相当する条件が望ましい。本発明の方法により、極めて多様なトリプレニルフェノール化合物の一群を生産できる。
【００３４】
本発明において、前記の式中の置換基Ｘが、−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、−ＣＨ₂−Ｃ（ＣＨ₃）₂ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ₃）₂又は−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ₃）₂ＯＨである本発明の化合物は、Ｘが−ＣＨ＝（ＣＨ₃）₂である本発明の化合物から、慣用の方法に従い、例えば、接触還元、酸触媒、オキシ水銀化−脱水銀法、ヒドロボレーション−酸化法、又は冷アルカリ性ＫＭｎＯ₄若しくは過ギ酸ＨＣＯ₂ＯＨによる処理法などから、当業者が適宜選択される方法で、得ることもできる。
【００３５】
本発明の化合物は、遊離形態、薬学的に許容され得る塩若しくはエステルの形態、又は溶媒和物の形態で用いることができる。塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、またはクエン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の無機酸または有機酸が、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩の形成に好適である。また、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属を含む化合物、塩基性アミン、または塩基性アミノ酸も、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩の形成に好適である。
【００３６】
また、炭素数１〜１０個のアルコールまたはカルボン酸など、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸、又はプロピオン酸などが、本発明の化合物の薬学的に許容され得るエステルの形成に好適である。
【００３７】
また、水などが、本発明の化合物の薬学的に許容され得る溶媒和の形成に好適である。
【００３８】
本発明の化合物は、強い血管新生阻害作用を有するので、血管新生阻害剤として使用できる。血管新生阻害剤として、血管新生関連疾患、例えば、血管新生が病因あるいは病態の悪化に関与している疾患の予防及び治療に有用である。このような疾患として、例えば、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチなどが挙げられる。
【００３９】
本発明の化合物を血管新生関連疾患の予防及び治療用医薬組成物として用いることができる。これら化合物を成分とする医薬組成物の投与形態は経口的あるいは非経口的に投与でき、経口投与に適する製剤の例としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤の例としては、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。これら化合物を成分とする薬剤の投与量は特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。例えば静脈内投与の場合には、成人１日当り有効成分量として１から２５mg/kgの投与、経口投与の場合には、成人１日当り有効成分量として２から２００mg/kgの投与が望ましい。投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【００４０】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
実験材料
ヒトウロキナーゼは日本ケミカルリサーチ（日本）から、Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（ＶＬＫ−ｐＮＡ）はバッケム（スイス）から得た。ヒトプラスミノゲンは、ヒト血漿からアフィニティー精製した。インビトロ実験で使用する場合は、本発明の化合物を緩衝液（ＴＢＳ／Ｔ；５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM ＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、pH７．４）に直接溶解した。動物実験では、希ＮａＯＨで約pH７に調整した、本発明の化合物を、生理食塩水に溶解した。日本チャールスリバー（横浜）からＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）を得て、１週間維持した後実験に使用した。
【００４２】
本発明の化合物の産生方法
S. microspora IFO 30018の斜面培養のループフル（loopful）を、３％グルコース、１％大豆粉、０．３％ペプトン、０．３％肉エキス、０．３％酵母エキス、０．０５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及び０．０１％ＣＢ４４２（消泡剤、日本油脂（日本））からなる培地１００mlを含む５００ml三角フラスコに播種した。そのフラスコを、１８０rpmのロータリーシェーカーで２５℃で３日間インキュベートした。種培養物のうちの１mlを、２％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、アミノ酸１００mg、及び０．０１％ＣＢ４４２（pH５．５）からなる培地１００mlを含む５００ml三角フラスコに播種し、そのフラスコを４〜６日間上記のようにインキュベートした。
【００４３】
プラスミノゲン活性化の測定方法
ＶＬＫ−ｐＮＡ加水分解及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を測定することにより、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノゲン活性化を測定した。プラスミノゲン（１００nM）をＴＢＳ／Ｔ〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM ＮａＣｌ、及び０．０１％（w/v）Ｔｗｅｅｎ８０、pH７．４〕中の５０Ｕ／mlウロキナーゼと３７℃で最長６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、その混合物にＴＢＳ／Ｔ中の１mM ＶＬＫ−ｐＮＡを１／９量添加して、更に３７℃でインキュベートし、４０５nmの吸光度を２分間隔で測定した。ｐＮＡ放出の初速度から、プラスミン濃度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用した分子種の決定のために、上述の反応混合物（０〜６０分間インキュベートしたもの）を１０％トリクロロ酢酸で処理し、得られた沈殿をアセトンで洗浄して、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料緩衝液〔２％（w/v）ＳＤＳ、６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH６．８、１０％（w/v）スクロース、及び０．０２％（w/v）ブロモフェノールブルー〕１１μlに溶解した。混合物の一部（１０μl）を１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、そのゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。
【００４４】
動物実験
最初の実験では、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で継代したルイス肺がん細胞を、使用前に２mM ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散させた。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳに１ｘ１０⁷個／mlになるよう懸濁させ、その懸濁液０．１mlをＣ５７ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。ＳＭＴＰ−７は、移植日以降、連日腹腔内投与した。その他の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス内でインビボで継代したルイス肺がん細胞を用いた。腫瘍を注入するために、マウスから切除し、０．２５％トリプシンを含むハンクス液に分散させた。細胞を図の凡例に示した密度になるようＰＢＳに懸濁させて、その懸濁液０．２mlをＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。マウスは、どの実験でも２２℃、湿度５０％、１２時間の明暗周期で維持し、標準食及び飲水を自由に摂取させた。腫瘍サイズは、以下の式：幅²ｘ長さｘ０．５２を用いて計算した容積（mm³）として表した。
【００４５】
実施例１ＳＭＴＰ−７Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−オルニチンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（０．９リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（１６５mg）を、ＭｅＯＨで約１００mg／mlに溶解して、LiChrolut（登録商標）ＲＰ−１８固相抽出カラムに通して、Inertsil PREP-ODSカラム（３０ｘ２５０mm；ＧＬサイエンス（日本、東京））での分取ＨＰＬＣに供試した。８０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを用いて、そのカラムを４０℃で２５ml／分の速度で展開した。保持時間３４〜３９分で溶出された分画を蒸発させてＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルで抽出して、精製ＳＭＴＰ−７Ｄを１７．９mg得た。
【００４６】
実施例２ＳＭＴＰ−７Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−オルニチンを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。
【００４７】
実施例３ＳＭＴＰ−８Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−リジンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（１．８リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（７５２mg）を、シリカゲルカラム（３０ｘ２４０mm）に負荷し、そのカラムをヘキサン２００ml、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０及び２０：８０）３００ml、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１００：０、９８：２、９５：５、９０：１０）３００mlで逐次展開した。酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９５：５及び９０：１０）分画を濃縮して残渣１６３mgを得た。その残渣をシリカゲルカラム（３０ｘ２４０mm）のクロマトグラフィーに再度供試し、ヘキサン１００ml、酢酸エチル２００ml、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９８：２及び９５：５）で逐次展開した。酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９５：５）分画を濃縮して、残渣１４３mgを得た。Inertsil PREP-ODSカラム（３０ｘ２５０mm）による分取ＨＰＬＣでは、８０％水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを用いて、４０℃で２５ml／分の速度で展開し、その残渣を更に精製した。ＳＭＴＰ−８Ｄを含む分画（保持時間４２〜５０分）を蒸発させてＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルで抽出して精製ＳＭＴＰ−８Ｄを３３．７mg得た。
【００４８】
実施例４ＳＭＴＰ−８Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−リジンを使用した以外は、実施例３と同様な方法で行なった。
【００４９】
実施例５ＳＭＴＰ−４Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−フェニルアラニンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．９リットルの培養液から得られた油状残渣（３７９mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４６．５〜５０分で溶出された分画からＳＭＴＰ−４Ｄを４２．４mg得た。
【００５０】
実施例６ＳＭＴＰ−５Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−ロイシンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（２３６mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間５９〜６２分で溶出された分画からＳＭＴＰ−５Ｄを１５．７mg得た。
【００５１】
実施例７ＳＭＴＰ−６Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−トリプトファンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（１．６リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（７８９mg）を、シリカゲルカラム（３０ｘ２４０mm）に負荷し、そのカラムをヘキサン２００ml、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０及び２０：８０）３００ml、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１００：０、９８：２、９５：５、９０：１０）３００mlで逐次展開した。ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２０：８０）分画を濃縮して精製ＳＭＴＰ−６Ｄを７９．５mg得た。
【００５２】
実施例８ＳＭＴＰ−９Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−シスチンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．９リットルの培養液から得られた油状残渣（３５８mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４９．５〜５１．３分で溶出された分画からＳＭＴＰ−９Ｌを２３．４mg得た。
【００５３】
実施例１０ＳＭＴＰ−１０Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−イソロイシンを使用し、６０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（１６０mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４１〜４５分で溶出された分画からＳＭＴＰ−１０Ｌを１９．０mg得た。
【００５４】
実施例１１ＳＭＴＰ−１１Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−バリンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（１９３mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間２８〜３２分で溶出された分画からＳＭＴＰ−１１Ｌを４．４mg得た。
【００５５】
プラスミノゲンフラグメント生成に対する影響
実施例１〜４の化合物（図１）の、プラスミン（プラスミノゲン）フラグメント生成の能力についてテストした。ＳＭＴＰ−７Ｌの存在下でウロキナーゼ触媒によりプラスミノゲンを活性化したところ、５分以内にプラスミンのＢ鎖に対応する２７kDaのバンドが出現し、その後そのバンド強度が急速に低下するのが、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された。その一方で、Ａ鎖に対応する６８／７０kDaの二重バンドの強度は、経時的に増大した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、６８〜７７kDaの広いバンドがインキュベーションの１０分後に現われ、その強度は最長で５０分間増大した。対照実験では、Ａ鎖及びＢ鎖の緩やかで着実な増加が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察され、６８〜７７kDaのバンドの出現は非還元ゲルでは検出されなかった。これらの結果から、ＳＭＴＰ−７Ｌが、プラスミンの急速な生成と、主にＢ鎖内のプラスミン分解の両者を誘導して、６８〜７７kDaのプラスミンフラグメント（ＰＭＤ）を生成することが示された。図２Ｃに示すように、Ｂ鎖の急速な分解は、プラスミン活性の低下を伴ったが、ウロキナーゼ触媒によるプラスミン形成は、直線的に増加した。
【００５６】
次に、ＰＭＤ生成を促進する複数のＳＭＴＰの活性を、奏効に必要な濃度に関して比較した。テスト化合物は、これまでに２５０μMの濃度でＰＭＤ生成の促進を示したＳＭＴＰ−６Ｌと比較すると、プラスミノゲン活性化を増強する活性が高かった。図３に示すように、テストした実施例の化合物は全て、ＳＭＴＰ−６Ｌの奏効に必要な濃度よりも低濃度でＰＭＤ生成の活性を有した。活性を発揮するのに必要な濃度は、プラスミノゲン活性化を増強する濃度と同一であった。このように、４種のテスト化合物のうちではＳＭＴＰ−７Ｌが最も強力で、９０μMという低濃度で効果が示された。ＳＭＴＰ−８ＬとＳＭＴＰ−７Ｌの活性は同じく９０μMで認められたが、ＰＭＤ生成の規模は、ＳＭＴＰ−７Ｌよりも小さかった。ＳＭＴＰ−８Ｄは、３種の化合物よりも活性が有意に低く、１２０μMで活性を示した。
【００５７】
これらの結果から、実施例の化合物がＰＭＤ生成を促進する活性を有することが実証される。プラスミノゲンを増強する活性が高い化合物ほど、ＰＭＤ生成が強力であり、ＰＭＤ生成に必要なＳＭＴＰ濃度は、プラスミノゲン活性化の増大に必要な各濃度に類似していた。そのため、おそらくプラスミノゲンコンホメーションの調整は、プラスミノゲン活性化を増強する根本的なメカニズムであり、ＳＭＴＰによるＰＭＤ生成の促進でも役割を演じていると思われた。
【００５８】
ＳＭＴＰ−７Ｌによる腫瘍成長の阻害
プラスミノゲンフラグメントであるアンジオスタチンの高用量を担腫瘍マウスに全身処理したところ（４０〜５０mg/kgを１日２回）、原発性腫瘍の成長阻害が示されたため、次にルイス肺がん細胞を移植されたマウスモデルを用いて、インビボで腫瘍成長を抑制するＳＭＴＰ−７Ｌの能力についてテストした。最初の実験では、インビトロ培養したルイス肺がん細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射して、ＳＭＴＰ−７Ｌを移植の翌日から連日腹腔内投与した。その結果から、ＳＭＴＰ−７Ｌの投与が移植腫瘍の有意な阻害を引き起こすことが実証された。阻害は、１３日後に明確になり、それぞれ５及び５０mg/kgの日用量で処理した２０日後に、腫瘍容積の６５％及び７５％減少が観察された（図４Ａ）。処理したマウスの体重変化を図４Ｂに示しているが、その図から、５０mg/kgのＳＭＴＰ−７Ｌ投与が体重減少を引き起こさず、腫瘍による体重増加分の減少さえも防止することが示された。
【００５９】
２番目に行った１組の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス内でインビボで保持したルイスラットの癌の分散細胞を、０日目にマウスに皮下注入し、移植した腫瘍が認識できるサイズに成長した７又は８日目に、体重及び腫瘍サイズが群間で均等に分配されるようにマウスを群分けした。群分けの日とその後３日毎に、ＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。図４Ｃに示すように、腫瘍成長の阻害は、１０日目より後（ＳＭＴＰ−７Ｌで処置した後３日間）に観察され、その阻害は、それぞれ１．５及び２０mg/kgの用量で５６％及び６２％であった。腫瘍の重量も、ＳＭＴＰ−７Ｌ処置により有意に減少した（図４Ｄ）。１．５mg/kg及び２０mg/kgの用量で有効性は同様であったことから、次に、その薬物をより低用量でテストした。その結果（図４Ｅ）から、０．０１５及び０．１５mg/kg用量の有効性は統計学的に有意でなかったが、１．５mg/kgの有効性は１０日目から１６日目まで有意であることが示された。しかし、対照と１．５mg/kg群の間の腫瘍容積の差は、１９日目には有意でなくなった。
【００６０】
３番目の実験では、移植後４日目に行ったＳＭＴＰ−７Ｌ単回投与の有効性をテストした。図４Ｄに示すように、１．５mg/kg群の腫瘍容積の減少は穏やかで、対照群と比較して統計学的に有意でなかった。
【００６１】
一連の動物実験から、ＳＭＴＰ−７Ｌが腫瘍成長を遅延させる活性があることが実証された。その効果は、１．５mg/kgの腹腔内投与で認められたが、その用量は、成長初期の腫瘍を抑制するために用いられる蛋白質様の薬剤アンジオスタチンの用量（４０〜５０mg/kgを１日２回）よりもはるかに低かった。こうして、アンジオスタチン様プラスミン（プラスミノゲン）フラグメントの内因的生成をＳＭＴＰにより薬理学的に促進することは、有利な腫瘍治療となる可能性がある。プラスミノゲン活性化因子の供給が多ければ、そのような低分子量化合物を用いた宿主媒介反応を活用することにより、ＰＭＤが腫瘍内で現場生成させることになり、それゆえ有効性及び選択性だけでなく、高レベルの蛋白質様薬剤の投与で問題となる耐容性に関しても有利になる。ＳＭＴＰ−７Ｌは、有効用量より３０倍高い日用量５０mg/kgの腹腔内投与では毒性を示さなかったため、その薬剤が抗腫瘍薬として有望である。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の化合物は、血管新生阻害作用を有し、血管新生関連疾患の治療と予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＭＴＰ−７Ｄ、−８Ｄ、−７Ｌ、及び−８Ｌの構造を表す図である。
ジヒドロピラン部分の立体配置は相対的なものである。
【図２】ＳＭＴＰ−７ＬによるＰＭＤ生成の促進を表す図である。
（Ａ〜Ｄ）プラスミノゲン（１００nM）を、１２０μMＳＭＴＰ−７Ｌの非存在下（Ａ及びＣ；対照）又は存在下（Ｂ及びＤ）でウロキナーゼ（５０Ｕ／ml）とインキュベートした。記載した時間インキュベートした後、インキュベーションの一部（２μg蛋白質）を非還元（Ａ及びＢ）又は還元（Ｃ及びＤ）条件下で１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試した。分子量マーカ（左）に加えプラスミン及びＰＭＤのＡ鎖及びＢ鎖（右）の位置を示している。（Ｅ）プラスミノゲンとウロキナーゼをＡ〜Ｄと同様にインキュベートし、記載した時間にＶＬＫ−ｐＮＡを添加して、プラスミン活性を測定した。各値は、三重測定の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図３】ＳＭＴＰ−７Ｄ、−８Ｄ、−７Ｌ、及び−８Ｌの活性の比較を表す図である。
記載した濃度のＳＭＴＰ−７Ｄ、−８Ｄ、−７Ｌ、及び−８Ｌの存在下で、プラスミノゲン（１００nM）をウロキナーゼ（５０Ｕ／ml）と３０分間インキュベートした。インキュベーションの一部（２μg蛋白質）を非還元条件下で１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試した。分子量マーカの位置を示している。
【図４】ＳＭＴＰ−７Ｌによるインビボでの腫瘍成長の阻害を表す図である。
（Ａ及びＢ）０日目に、インビトロ培養したルイスラットの肺癌の懸濁液（１００μl；１ｘ１０⁷細胞／ml）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。生理食塩水中のＳＳＭＴＰ−７Ｌ又は生理食塩水のみを、移植の翌日から連日腹腔内投与し、腫瘍容積及び体重を測定した（各群ｎ＝３〜４）。
（Ｃ及びＤ）インビボで保持したルイスラットの肺癌の分散細胞を、２ｘ１０⁶細胞／mlに懸濁させ、その懸濁液２００μlを０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。７日目に、体重と腫瘍サイズが群間で均等に分配されるように、マウスを群分けした（ｎ＝３〜４）。７日目及びその後３日毎に、生理食塩水又はＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。１５日目に腫瘍を切除して、重量（Ｄ）を測定した。
（Ｅ）インビボ培養したルイス肺がん細胞の懸濁液（２００μl；１．１４ｘ１０⁶細胞／ml）を、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。６日目に、体重と腫瘍サイズが群間で均等に分配されるように、マウスを群分けした（ｎ＝５〜６）。６日目及びその後３日毎に、生理食塩水又はＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。
（Ｆ）インビボ培養したルイス肺がん細胞の懸濁液（２００μl；２ｘ１０⁶細胞／ml）を、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。４日目にマウスを群分けして（ｎ＝４）、４日目だけ生理食塩水又はＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。記載したＰ値は、正規分布した変数を用いるスチューデントｔ検定の両側Ｐ値である。
【図５】ＳＭＴＰ−４Ｄ、−５Ｄ、−６Ｄ、−７Ｄ、及び−８Ｄ構造を表す図である。
【図６】ＳＭＴＰ−９、−１０、及び−１１の構造を表す図である。
【図７】ＳＭＴＰ−１、−２、及び−３の構造を表す図である。

Claims

式III：

〔式中、
Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚであり、
Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ若しくは−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成し、
Ｒ^２は、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ ₂ ） _ｎ −（ｎは０〜９の整数である）で示される残基である〕
で示される、少なくとも一つの化合物又はその薬学的に許容され得る塩、エステル若しくは溶媒和物を含む、腫瘍の予防又は治療用医薬組成物。
Ｘが−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ ₃ ） ₂ であり、ｎが３又は４である、請求項１記載の医薬組成物。