JP4320104B2 - Method for detecting partially complementary nucleic acid fragments - Google Patents

Description

【００１２】
ＰＮＡは、電気的には中性であり、塩の存在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有する機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡと核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのため、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬への応用が期待されている分子である（特表平６−５０９０６３号の明細書）。
【００１３】
特開平１１−３３２５９５号公報には、固相担体表面にＰＮＡ断片をその一端で固定してなるＰＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブを用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰＮＡプローブは、アビジン−ビオチン法によって、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップにＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡプローブを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴シグナルを測定することによって行なわれている。また、ＰＮＡプローブ、およびラジオアイソトープで標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトープ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上させることができる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、一本鎖の正常遺伝子断片と一本鎖の異常遺伝子断片とで形成される遺伝子多型を検出するために有用な部分相補性核酸断片を検出する方法を提供することにある。また、本発明は、ＰＮＡ特有の性質を利用して、上記部分相補性核酸断片を検出する方法を提供することにもある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）導電性基板の表面にＤＮＡ断片がその一端で固定されてなるＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、そして（２）上記の工程（１）で測定された電流値を、上記のＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にある。
【００１６】
本発明はまた、（１）導電性基板の表面にＤＮＡ断片がその一端で固定されてなるＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、（２）上記と同一の構成のＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片を含まない水性液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れるバックグラウンド電流値を測定する操作を含む工程、そして（３）上記の工程（１）で測定された電流値を、前記のＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合し、かつ工程（２）で測定された電流値と比較する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にもある。
【００１７】
本発明の、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）ＤＮＡ分析素子として、ＤＮＡ断片の固定部位以外の表面に電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基板の表面への接触を妨げるマスク処理が施されているＤＮＡ分析素子を用いる。
（ロ）マスク処理が、導電性基板の表面にＤＮＡ断片をその一端で固定させた後、２−メルカプトエタノールにて表面処理をする方法によって行われた。
（ハ）ＤＮＡ分析素子として、既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片がその一端で結合しているＤＮＡ分析素子を用いる。
（ニ）電気化学活性縫い込み型インターカレータとして、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いる。
（ホ）各工程における電流値の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【００１８】
本発明はさらに、（１）導電性基板の表面にＰＮＡ断片がその一端で固定されてなるＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、そして（２）上記の工程（１）で測定された電流値を、上記のＰＮＡ分析素子に固定されているＰＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にある。
【００１９】
本発明はさらにまた、（１）導電性基板の表面にＰＮＡ断片がその一端で固定されてなるＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れる二本鎖の形成量に依存しない電流値を測定する操作を含む工程、（２）上記と同一の構成のＰＮＡ分析素子に、試料核酸断片を含まない水性液を接触させ、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、３０℃以下の温度で該分析素子に電位を印加することにより、該インターカレータと該分析素子との間を流れるバックグラウンド電流値を測定する操作を含む工程、そして（３）上記の工程（１）で測定された電流値を、前記のＰＮＡ分析素子に固定されているＰＮＡ断片に相補性を有する核酸断片を用い、上記（１）の操作と同じ操作によって得られる相補性核酸断片の標準電流値と照合し、かつ工程（２）で測定された電流値と比較する工程を含むことを特徴とする、工程（１）で用いた試料核酸断片が、上記相補性核酸断片と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出する方法にもある。
【００２０】
本発明の、ＰＮＡ分析素子を用いる検出方法の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）ＰＮＡ分析素子として、ＰＮＡ断片の固定部位以外の表面に電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基板の表面への接触を妨げるマスク処理が施されているＰＮＡ分析素子を用いる。
（ロ）マスク処理が、導電性基板の表面にＰＮＡ断片をその一端で固定させた後、２−メルカプトエタノールにて表面処理をする方法によって行われた。
（ハ）ＰＮＡ分析素子として、既知の塩基配列を有するＰＮＡ断片がその一端で結合しているＰＮＡ分析素子を用いる。
（ニ）電気化学活性縫い込み型インターカレータとして、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いる。
（ホ）各工程における電流値の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の部分相補性核酸断片の検出方法では、一本鎖の正常遺伝子断片と一本鎖の異常遺伝子断片とのハイブリダイゼーションによって得られるハイブリッドＤＮＡの検出に、電極型センサ法（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回分析化学討論会予稿集、ｐ１３７−１３８（１９９６年））を利用する。
この電極型センサ法は、出力端子を備えかつＤＮＡ断片が固定された電極に、試料核酸断片を電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて接触させ、電流値を測定することによって、相補性を有する試料核酸断片を検出する方法である。
【００２２】
以下、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法を中心に説明するが、特に断らない限りＰＮＡ分析素子を用いる場合についても同様とする。本明細書において、次のように定義する。
「ＰＮＡ断片」には、合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片化したものを含まない。
「ＤＮＡ分析素子」とは、導電性基板の表面に多数のＤＮＡ断片がその一端部にて固定された分析素子をいう。
「マスク処理」とは、マスク処理用化合物を含む溶液を未処理のＤＮＡ分析素子表面の全体に滴下し、必要であれば乾燥させ、そして固定することをいう。
「ハイブリッドＤＮＡ」とは、ＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰＮＡ」とは、ＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「結合」とは、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子がハイブリッドＤＮＡ構造内に挿入された状態、あるいはハイブリッドＤＮＡ構造外でハイブリッドＤＮＡに静電的に相互作用している状態をいう。
「部分相補性核酸断片」とは、ＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片にの塩基配列に対して部分的に相補性を示す核酸断片であって、部分的に非相補性を示すものをいう。従って、完全に相補性を示す核酸断片および完全に相補性を示さない核酸断片は、部分相補性核酸断片の対象とはならない。
【００２３】
図２に、本発明の部分相補性核酸断片の検出方法の代表例を模式的に示す。以下、本発明の検出方法についてＤＮＡ分析素子を用いる場合を中心に詳述するが、特に断らない限り、ＰＮＡ分析素子を用いる場合も同様とする。
本発明の検出方法は、次の三工程よりなる。
工程Ａ；導電性基板（４１）の表面に一本鎖のＤＮＡ断片（一本鎖の正常遺伝子断片）（５１）を固定し、ＤＮＡ分析素子（６１）とする。ここに、試料核酸断片として、正常遺伝子断片（７１ａ）の特定の一塩基に対して非塩基対を形成する塩基を含む塩基配列を有する異常遺伝子断片（７１ｂ）、あるいは正常遺伝子断片（７１ａ）の特定の二つの塩基に対してそれぞれ非塩基対を形成する塩基を含む塩基配列を有する異常遺伝子断片（７１ｃあるいは７１ｄ）が溶解あるいは分散してなる試料液をそれぞれ接触させ、そして（６１）に（７１ｂ）、（７１ｃ）および（７１ｄ）（「×」印は、変異した塩基の位置を示す）をそれぞれ結合させると、ミスマッチ構造を有するハイブリッドＤＮＡ（９１ｂ）、バルジ構造を有するハイブリッドＤＮＡ（９１ｃあるいは９１ｄ）がそれぞれ得られる。（９１ｃ）および（９１ｄ）は、何れも二個の非塩基対形成部分を持つ。これらに、電気化学活性縫い込み型インターカレータ（１００）を接触させ、そして結合させると、（９１ｂ）、（９１ｃ）あるいは（９１ｄ）に、（１００）がそれぞれ結合した複合体（１０１ｂ）、（１０１ｃ）、（１０１ｄ）が得られる。次いで、これらに電位を印加し、該インターカレータと導電性基板との間に流れる電流量を測定する。
工程（Ｂ）；試料核酸断片として正常遺伝子断片（７１ａ）を用いて、工程（Ａ）と同様の操作を行うことにより、フルマッチ構造を有するハイブリッドＤＮＡ（９１ａ）が得られる。ここに、該インターカレータ（１００）を接触させ、そして結合させると、複合体（１０１ａ）が得られる。工程（Ａ）と同様にして、その電流値を測定する。
工程（Ｃ）；工程（Ａ）で測定された電流値と、工程（Ｂ）で測定された電流値を比較する。
従って、工程（Ａ）、（Ｂ）あるいは（Ｃ）によって、異常遺伝子断片（７１ｂ）（あるいは（７１ｃ）、（７１ｄ））が、正常遺伝子断片（７１ａ）と塩基配列に関して部分的に同一なものであるか否かを検出することができる。図２には、異常遺伝子断片が塩基置換を有する場合を示すが、塩基欠損、塩基挿入等の塩基変化の場合についても、同様の検出方法が利用できる。
【００２４】
また、本発明の検出方法は、上記の工程（Ａ）乃至（Ｃ）に加えて、工程（Ｄ）を含む検出方法にもある。工程（Ｄ）は、試料核酸断片は接触させずに、ＤＮＡ分析素子に該インターカレータのみを接触させることによって、バックグラウンド電流値が得る工程である。即ち、上記の工程（Ａ）および（Ｂ）で得られる電流値は、それぞれバックグラウンド電流値に対して変化した電流値である。
【００２５】
［導電性基板］
導電性基板は、疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてなる基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板および電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。
電気絶縁性の担体の材質としては、何れも、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
疎水性の導電性基板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく用いることができるが、電極を用いることが特に好ましい。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることがが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
【００２６】
導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてなる基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体の凹凸を軽減することができる。また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体も好ましく用いることができる。
【００２７】
電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置されたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載の、核酸が未固定のシリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線導電性基板のように、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであってもよい。
【００２８】
［ＤＮＡ断片］
本発明の検出方法は、ＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡ（遺伝子多型）を検出し、さらに試料核酸断片の変異の態様を解析することを本来の目的とする一次スクリーニング法である。従って、ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片および試料核酸断片としては、それらの内の何れか一方が正常遺伝子断片であって、他方が異常遺伝子断片であることが好ましい。ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片および試料核酸断片の何れが正常遺伝子断片であってもよいが、ＤＮＡ断片としては正常遺伝子断片を用いることが好ましい。
【００２９】
正常遺伝子断片としては、生物の試料から抽出した塩基変異の認められないＤＮＡ、遺伝子操作等によって作製した塩基変異の伴わないＤＮＡ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳動による分離操作等で精製したＤＮＡ断片を用いることが好ましい。これらのＤＮＡ断片は、熱処理、アルカリ処理等によって、上記分離操作の前もしくは後に一本鎖のＤＮＡ断片に解離させる。また、生物の試料から抽出した塩基変異の認められないＤＮＡから得られる一本鎖のＤＮＡ断片と同一の塩基配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを化学合成し、これを用いることもできる。
【００３０】
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。ＤＮＡ断片は、３乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。ＤＮＡ断片として、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれに、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定させるため、そのような複数の種類のＤＮＡ断片を用いることも好ましい。
【００３１】
ＤＮＡ断片の固定方法としては、公知の方法を用いることができる。ＤＮＡ断片の導電性基板への固定方法は、ＤＮＡ断片の種類および導電性基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素, Vol. 43, No.13, 2004-2011(1998)）。合成ヌクレオチドを固定する場合には、導電性基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための反応性基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した導電性基板に共有結合させる方法を用いることができる。例えば、導電性基板の表面が金で蒸着処理されている場合には、ＤＮＡ断片の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、ＤＮＡ断片を導電性基板に固定する。該ＤＮＡ断片にメルカプト基を導入する方法は、文献（M.Maeda et al., Chem.Lett., 1805-1808(1994)およびB.A.Connolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484(1985)）に記載されている。導電性基板の表面がグラシーカーボンで塗布処理されている場合には、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、導電性基板の表面にカルボン酸基を導入し、ＤＮＡ断片をアミド結合により導電性基板表面に固定することができる。実際の固定化方法については、文献（K.M.Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323(1993)）に詳細が記載されている。ＤＮＡ断片は、予め調製されたハイブリッドＤＮＡであってもよい。ハイブリッドＤＮＡを金で蒸着処理された導電性基板に固定する場合には、ハイブリッドＤＮＡの片方の鎖の５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）にメルカプト基を導入しておく。そして、ハイブリッドＤＮＡを固定後に二本鎖を解離させ、一本鎖を固定することもできる。
共有結合のための反応性基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。導電性基板としてガラスやシリコンを用いる場合には、その表面処理には、公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。
【００３２】
ＤＮＡ断片の固定は、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれの上に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散されてなる水性液を点着することによって実施することが好ましい。点着するＤＮＡ断片の濃度は、数ｐＭ乃至数ｍＭの範囲にあることが好ましく、数ｐＭ乃至数ｎＭの範囲にあることが特に好ましい。点着量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１０ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うことも好ましい。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片が複数の導電性基板上に固定される。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
点着によって固定されたＤＮＡ断片の量は、導電性基板表面１ｍｍ²当たり１０^-20乃至１０^-12モルの量の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の固定量は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）等の機器分析の手段により決定することができる。
【００３３】
［ＰＮＡ断片］
本発明で好ましく用いられるＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００３４】
【化２】

【００３５】
上記式中、Ｂ¹¹は、リガンドであって、天然の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩基類似体を表す。Ｂ¹¹は、天然に見出される位置、即ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリンについては、９位において、チミン、ウラシルもしくはシトシンを含むピリミジンについては、１位において結合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が導入された化合物）をいう。また、Ｂ¹¹は、核酸塩基を含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノイル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。
典型的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片への結合親和性を増加させることが知られている（特開平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５）。
さらに、Ｂ¹¹は、ＤＮＡインターカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あるいは放射性標識であってもよい。
Ｂ¹¹は、核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に好ましい。
【００３６】
Ｒ¹¹は、水素原子、もしくは天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基を示す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基、メルカプト基、および炭素原子数が１乃至６のアルキル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていてもよい。Ｒ¹³およびＲ¹⁴は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキルチオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしくは水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基は、Ｒ¹¹が結合している炭素原子の水素原子と一緒になって脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【００３７】
Ｌ¹¹は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＲ¹²−基であることが好ましく、−ＣＯ−基であることが特に好ましい。Ｒ¹²は、水素原子、炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のアルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい。
【００３８】
ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよびｃは、何れも１であることが好ましい。
【００３９】
本発明で用いるＰＮＡ断片は、下記一般式(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式中、Ｂ¹¹およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ¹¹、ｄを表す。
【００４０】
【化３】

【００４１】
ＰＮＡ断片は、ペプチドと同様に液相法や固相法によって合成することができ、合成されたものは市販もされている。ＰＮＡの合成法については、特表平６−５０９０６３号の明細書、米国特許２７５８９８８号の明細書、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1987(1992)、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 9677-9678(1992)などに詳細が記載されている。
【００４２】
ＤＮＡ分析素子に固定されているＤＮＡ断片の量は、導電性基板１ｍｍ²当たり１０^-15乃至１０^-10モルの量の範囲にあることが好ましい。導電性基板の表面にＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着させても、通常、その点着量と実際に固定される量とでは異なるためである。
【００４３】
ＤＮＡ断片が１０^-10モル以上の量で導電性基板に固定されている場合には、ＤＮＡ断片は、導電性基板上で密集状態にあり、１０^-12モルより少ない場合には、導電性基板の表面にＤＮＡ断片が結合していない部分、即ち、すき間部分が生じていると推定される。このすき間部分の発生によって、ＤＮＡ断片の多くは、導電性基板の表面上に倒れた状態で結合しているものと考えられる。ＤＮＡ断片と試料核酸断片との効率よいハイブリダイゼーションのためには、ＤＮＡ断片が導電性基板の表面に対して、可能な限り垂直方向に伸張した状態で固定されていることが望ましい。また、電気化学活性縫い込み型インターカレータは、このすき間部分に接触し、非特異的に吸着する結果、バックグラウンド電流値を上げるとものと推定される。従って、本発明で用いるＤＮＡ分析素子は、下記のマスク処理が施されていることが好ましい。
【００４４】
［マスク処理］
マスク処理は、マスク処理用化合物を含む溶液をＤＮＡ分析素子の表面に点着することによって実施することができる。マスク処理用化合物は、０．５乃至２ｍＭの範囲で用いることが好ましく、０．８乃至１．５ｍＭの範囲で用いることが特に好ましい。マスク処理用化合物を点着後、所定の温度（好ましくは、室温）で数時間放置することが好ましい。点着後、必要であればインキュベーションを行ってもよい。マスク処理がなされたＤＮＡ分析素子は、数日間保存することが可能で、また数回であれば繰り返し使用することもできる。
【００４５】
マスク処理用化合物は、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有していてもよい鎖状分子に、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部もしくはその近傍に、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が結合している化合物である。該鎖状分子は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基を介して、導電性基板の表面に固定される。
一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有するとは、親水性基が必ずしも鎖状分子の末端に位置していなくてもよいことを示すが、端部に親水性基を有することが好ましい。親水性基は、一個であっても、複数個であってもよい。導電性基板の表面に結合可能な反応性基は、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に結合していることが好ましい。途中に環状基を有していてもよい鎖状分子は、マスク処理用化合物から誘導された分子である。
マスク処理用化合物としては、先に導電性基板に固定されているＤＮＡ断片よりも直鎖の長さが短い化合物であって、直鎖の炭素原子数が１乃至６のアルキレン基の一方の末端に親水性基を有しかつ他方の末端に導電性基板と結合する反応性基を有する化合物であることが好ましい。
【００４６】
導電性基板の表面に結合可能な反応性基としては、メルカプト基、スルフィド基、ジスルフィド基、チオカルボニル基およびチオカルボン酸基からなる群より選ばれる基を挙げることができる。導電性基板の表面にアミノ基、アルデヒド基、カルボン酸基等の反応性基を導入する処理を予め施している場合には、該反応性基としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、アミド基、カルボン酸基、アルデヒド基、エポキシ基および過オキシ酸基からなる群より選ばれる基を挙げることもできる。上記の該反応性基としては、メルカプト基、チオカルボニル基もしくはスルフィド基であることがさらに好ましく、メルカプト基であることが特に好ましい。
【００４７】
親水性基は、水酸基、カルボン酸基、アミド基、リン酸基もしくはスルホン酸基であることが好ましく、水酸基であることが特に好ましい。但し、導電性基板の表面に結合可能な反応性基とは、互いに異なるものであることが好ましい。
環状基は、環構成炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、あるいはＮ、Ｓ、ＯおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１０の複素環基であることが好ましい。環状基は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が共同して環状基を形成している基であってもよい。後者の好ましい例として、イミダゾール−２−チオン基を挙げることができる。
【００４８】
よって、マスク処理用化合物としては、メルカプトメタノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノール、Ｎ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンもしくは文献に記載のイミダゾール−２−チオン誘導体（A.J.Arduengo et al., J.Am.Chem.Soc., 1990, 112, 6153-6154）であることが好ましく、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノールであることがさらに好ましく、２−メルカプトエタノールであることが特に好ましい。上記のマスク処理用化合物は、そのナトリウム、カリウム等の塩であってもよく、また、そのアルキレン鎖が特定の置換基によって置換されていてもよい。その特定の置換基としては、炭素原子数が１乃至６の炭化水素基（好ましくは、メチル基、エチル基、フェニル基等）であることが好ましい。
ＤＮＡ断片の固定方法に応じて、マスク処理用化合物を選択することが望ましい。二種類以上のマスク処理用化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００４９】
［ハイブリダイゼーション］
ハイブリダイゼーションは、電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下にて、ＤＮＡ分析素子に、試料核酸断片を接触させることによって実施する。ＤＮＡ分析素子への試料核酸断片の接触は、ＤＮＡ分析素子上に試料核酸断片を含む水性液を滴下する方法、あるいは試料核酸断片を含む水性液中にＤＮＡ分析素子を浸漬する方法の何れによっても実施できる。このとき、試料核酸断片を含む水性液中にインターカレータを含めてもよい。または、ハイブリダイゼーションの終了後に形成されたハイブリッドＤＮＡにインターカレータを接触させてもよい。この場合には、未反応の試料核酸断片を除去しておくことが好ましい。一本鎖の試料核酸断片あるいは試料中に含まれる二本鎖の試料核酸断片に、インターカレータが非特異的に結合するのを避けるため、ハイブリダイゼーション終了後に未反応の試料核酸断片を除去してから、インターカレータを接触させることが望ましい。洗浄は、界面活性剤（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩衝液）との混合溶液を用いて行うことが好ましい。インターカレータは、１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲にて用いることが好ましい。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、一塩基変異の検出を目的とする場合には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００５１】
ハイブリッドＤＮＡに結合する該インターカレータの量は、図２に示すように、特殊ＤＮＡ構造に依存して異なる。この結合量は、二本鎖形成において非塩基対形成部分が増加するに伴い減少する。
【００５２】
［試料核酸断片］
試料核酸断片は、ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片の少なくとも一個の塩基に対して非塩基対を形成する塩基配列を有する断片である。試料核酸断片としては、ＤＮＡ分析素子に固定する好ましいＤＮＡ断片が正常遺伝子断片であることに対応して、異常遺伝子断片を用いることが好ましい。異常遺伝子断片は、その対象となる正常遺伝子断片の少なくとも一個の塩基に対して非塩基対を形成する塩基配列を有する断片である。このような塩基配列を有するものであれば、如何なる種類の塩基変異（塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等）を伴うものであってもよい。異常遺伝子断片としては、遺伝子異常の生物の試料から抽出したＤＮＡ、遺伝子操作等によって作製した下記の異常遺伝子と同一の塩基配列を有するＤＮＡ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳動による分離操作等で精製したＤＮＡ断片を用いることが好ましい。これらのＤＮＡ断片は、熱処理、アルカリ処理等によって、上記分離操作の前もしくは後に一本鎖のＤＮＡ断片に解離させる。また、下記の異常遺伝子と同一の塩基配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを化学合成し、これを用いることもできる。
【００５３】
異常遺伝子としては、遺伝性疾患、外因性の遺伝子異常による疾患あるいは遺伝性素因に環境因子が作用した疾患に由来するものの何れであってもよい。例えば、遺伝性疾患よりも環境因子の作用する割合が多いと思われていた疾患（糖尿病、高血圧症等）、既知の遺伝病（小児高尿酸血症、鎌状赤血球貧血症、フェニルケトン尿症等）等を挙げることができる。
【００５４】
試料核酸断片の接触量については、導電性基板１ｍｍ²当たり１０^-18乃至１０^-10モルの量の範囲にあることが好ましく、１０^-18乃至１０^-12モルの量の範囲にあることが特に好ましい。対照として用いる試料核酸断片の接触量は、上記試料核酸断片と同一であることが好ましい。
【００５５】
［電気化学活性縫い込み型インターカレータ］
電気化学活性縫い込み型インターカレータは、ハイブリッドＤＮＡにインターカレートし、かつ電気化学活性を有する分子であれば何れのものも使用することができる。但し、ハイブリッドＤＮＡの塩基対形成部分を定量的に認識できることが要求されるため、ＤＮＡの溝結合性型のものは好ましくない。
【００５６】
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータは、酸化還元活性を有する物質であることが好ましい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体、ビオローゲン化合物等であることが好ましく、フェロセン化合物であることが特に好ましい。インターカレータ部分としては、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等であることが好ましく、ナフタレンジイミドであることが特に好ましい。よって、該インターカレータとしては、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（S.Takenaka et al., J.Chem.Soc.,Commun., 1111(1998)）であることが特に好ましい。
【００５７】
【化４】

【００５８】
また、下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００５９】
【化５】

【００６０】
但し、Ｘは下記式で表されるフェロセン誘導体である。
【００６１】
【化６】

【００６２】
【化７】

【００６３】
【化８】

【００６４】
【化９】

【００６５】
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータには、酸化還元活性部分とインターカレータ部分とを繋ぐリンカー部分がある。前記式で表される１，４−ジプロピルピペラジニル基がこのリンカー部分に相当する。このピペラジニル基の代わりに、四級化されたイミノ基を導入することもできる。四級化されたイミノ基を導入した下記式で表されるインターカレータは、反応系のｐＨに関わらすカチオン性となるために、ハイブリッドＤＮＡあるいはハイブリッドＰＮＡの結合がより強くなる。四級化されたイミノ基を導入したインターカレータは、ＰＮＡ分析素子を用いる場合に特に有効である。リンカー部分に相当する基としては上記記載のものに限定されない。例えば、ピペラジニル基の代わりに、Ｎ−アルキル基（アルキル基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることが好ましく、メチル基、エチル基もしくはｎ−プロピル基であることが特に好ましい）を導入することも好ましい。リンカー部分に相当する基の構造の違いより、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
【００６６】
【化１０】

【００６７】
縫い込み型インターカレータとして上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、そのナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、二塩基おきに配列してハイブリッドＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミド誘導体の二つのフェロセン分子が、それぞれハイブリッドＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡからの解離速度が極めて遅くなり、ハイブリッドＤＮＡとナフタレンジイミド誘導体との安定な複合体を形成することができる。また、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッドＤＮＡへの結合がインターカレーションモードであることは、一般的にハイブリッドＤＮＡにインターカレータを接触させたときに、粘度の変化が認められることにより確認される。例えば、ウイルスＳＶ４０に代表される閉環状プラスミドは、インターカレーションが起こると、超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知られている。一方、インターカレータは、一本鎖ＤＮＡ断片に対しては結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに解離して遊離のインターカレータとなる。
【００６８】
［応答電流の測定］
電流量の測定は、ハイブリッドＤＮＡが固定されている導電性基板と電気化学活性縫い込み型インターカレータの導電性基との間を流れる電流量が測定できる方法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリックボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグラフィ、ポテンショスタット等を用いること好ましく、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを用いることが特に好ましい。カウンタ電極とハイブリッドＤＮＡが固定された導電性基板とを電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成させて、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定することが好ましい。
【００６９】
本発明の検出方法は、前述したように、ＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡ（遺伝子多型）を検出し、試料核酸断片の変異の態様を解析することを本来の目的とする一次スクリーニング法である。そこで、ＤＮＡ断片として特定の正常遺伝子断片、試料核酸断片として異常遺伝子断片を使用すれば、本発明の検出方法によって異常遺伝子断片の塩基変異の定量も可能である。例えば、正常遺伝子断片について既知の数の塩基置換を伴う塩基配列を有する異常遺伝子断片であって、置換数が互いに異なる三点以上の異常遺伝子断片をスクリーニングすることによって、塩基置換度と電流値との関係が定められるので、未知の数の塩基置換を伴う異常遺伝子断片を試料とすれば、その電流値から塩基置換度を求めることができる。その塩基置換度から遺伝子多型の予測をすることも可能である。遺伝子多型の検出は、遺伝的リスク診断の可能性を示す。例えば、原発性ＩＶ型高脂血症（高グリセリド血症）の異常遺伝子を保有する患者の染色体ＤＮＡを試料核酸断片として用いれば、その多型から、発病の有無を診断することも可能である。
【００７０】
本発明の検出方法において、電流値の変化の割合がハイブリッドＤＮＡに結合した電気化学活性縫い込み型インターカレータの量のみに依存し、導電性基板上のハイブリッドＤＮＡの形成量に依存するものではないことは、後述する実施例５で確認することができる。
【００７１】
【実施例】
〈実施例系１〉
実施例２乃至４において使用する、正常リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子のセンス鎖であるｄ（ＧＴＣＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡ）をオリゴヌクレオチド「ＷＴ＋」、そのアンチセンス鎖であるｄ（ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴ）をオリゴヌクレオチド「ＷＴ−」、正常ＬＰＬ遺伝子の４４７番目のセリン（ＴＣＡ）が終止コドン（ＴＧＡ）に変化したために異常をきたした患者の遺伝子のセンス鎖であるｄ（ＧＴＣＧＧＡＧ^*ＴＧＡＡＧＡ）をオリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋」、およびそのアンチセンス鎖であるｄ（ＣＡＧＣＣＴＣ^*ＡＣＴＴＣＴ）をオリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ−」と略する。但し、右上に＊印を有する塩基は、変異遺伝子が有する、正常遺伝子とは異なる塩基を意味する。
【００７２】
［実施例１］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片としてモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
面積が２ｍｍ²の金電極を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１時間浸積し、超純水で洗浄後、濃硝酸に浸し、１５分間攪拌した。この金電極を超純水で洗浄後、金電極表面に、アデニンの２０量体である試料ＤＮＡ断片のその５’末端にメルカプトヘキシル基を結合させたオリゴヌクレオチド（ＨＳ−ｄＡ₂₀）（１０ピコモル／μＬ）の水溶液１．０μＬを点着し、２時間放置後、超純水で洗浄したｄＡ₂₀およびＨＳ−ｄＡ₂₀の合成については、特開平９−２８８０８０号公報およびB.A.Connolly,Nucleic Acids Res., 13, 4484(1985)の記載の方法に従って行った。点着前のＨＳ−ｄＡ₂₀の水溶液および点着後に回収されたＨＳ−ｄＡ₂₀の水溶液を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に付し、クロマトグラフィのピークの変化量から金電極への固定量を決定した。ＨＳ−ｄＡ₂₀は、ほぼ定量的に金電極に修飾された。
（２）電極のマスク処理
上記（１）で得たＤＮＡ分析素子表面に、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）の水溶液１μＬを滴下し、該電極にキャップをして２時間放置した。次いで、超純水で洗浄した。
（３）試料ＤＮＡ断片の調製
下記式（ＩＩＩ）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
で表される試料ＤＮＡ断片ｄＴ₉ｄＡｄＴ₁₀は、上記公報に記載の方法に従って合成した。
（４）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成
下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミドについても、上記公報に記載の方法に従って合成した。
【００７３】
【化１１】

【００７４】
（５）ＤＮＡ分析素子と試料ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション
上記（３）の試料ＤＮＡ断片ｄＴ₉ｄＡｄＴ₁₀（２０ピコモル／μＬ）の水溶液１μＬをＤＮＡ分析素子に滴下し、２０℃で３０分間放置した。
（６）電流量の測定
恒温セルを用いて、２０℃に保ち、前記（４）のフェロセン化ナフタレンジイミド（５０μＭ）を含む電解質溶液（０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合液）中に、上記（５）で得られたハイブリダイゼーション電極（作用極）、白金（対極）および銀／塩化銀参照電極を浸して三電極を形成させ、４２℃にてデファレンシャルパルスボルタモグラフィー（ＤＰＶ２）を測定した(図３の−□−）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶ１を測定した(図３の−○−)。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ２のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１のピーク電流値と比べて高い値を示し、その変化量は２２．２％であった。
【００７５】
［試料ＤＮＡ断片としてモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ｂ）］
試料ＤＮＡ断片を、下記式（ＩＶ）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
で表されるｄＴ₈ｄＡ₄ｄＴ₈に変えた以外は、実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子と当該ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、そのＤＰＶ４を測定した（図４の−□−）。ｄＴ₈ｄＡ₄ｄＴ₈は前記公報に記載の方法に従って合成した。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶ３を測定した（図４の−○−）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ４のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ３のピーク電流値と比べて、１５．１％変化した。
【００７６】
［試料ＤＮＡ断片としてモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ｃ）］
試料ＤＮＡ断片を、チミンの２０量体（ｄＴ₂₀）に変えた以外は、部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ａ）と同様にして、ＤＮＡ分析素子と当該ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、そのＤＰＶ６を測定した（図５の−□−）。但し、ｄＴ₂₀は前記公報に記載の方法に従って合成した。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶ５を測定した（図５の−○−）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ６のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ５のピーク電流値と比べて３７．３％変化した。
部分相補性ＤＮＡ断片の検出（１Ｃ）（フルマッチ構造の検出）の電流値の変化の割合は、前記記載の検出（１Ａ）（ミスマッチ構造の検出）および（１Ｂ）（バルジ構造の検出）の電流値の変化の割合に対するコントロール値となる。
【００７７】
本実施例より、試料ＤＮＡ断片として、上記式（ＩＩＩ、（ＩＶ）で表される化合物およびｄＴ₂₀を用いる限りにおいては、非塩基対形成部分の増加（塩基置換度の増加）に従い、電流値の変化の割合が減少することが分かる。
【００７８】
［実施例２］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（２Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
ＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオチド「ＷＴ−」の５’末端にメルカプトヘキシル基を有するＨＳ−ｄ（ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴ）（１０ピコモル）の水溶液を用いた外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製した。オリゴヌクレオチド「ＷＴ−」は、前記の公報に記載の方法に従って合成した。
（２）試料ＤＮＡ断片の調製
ＬＰＬ異常遺伝子を有する患者のモデル遺伝子として、「Ｓ４４７Ｘ＋」を前記の公報に記載の方法に従って合成した。
（３）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
上記（１）で得られたＤＮＡ分析素子、および上記（２）の試料ＤＮＡ断片を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行い、２０℃にてそのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ８）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ７）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ８のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ７のピーク電流値と比べて６．３％変化した。
【００７９】
［試料ＤＮＡ断片として、正常ＬＰＬ遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（２Ｃ）］
試料ＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオチド「ＷＴ＋」を用いる以外は、実施例４と同様にしてそのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１０）。オリゴヌクレオチド「ＷＴ＋」は、前記の公報に記載の方法に従って合成した。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ９）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１０のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ９のピーク電流値と比べて６５．４％変化した。この変化の割合が、上記記載の検出（２Ａ）のコントロール値に相当する。
【００８０】
実施例２より、二本鎖ＤＮＡ断片がミスマッチ構造を有する場合には、電流値の変化の割合がかなり減少することが分かる。
【００８１】
［実施例３］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（３Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ−」の５’末端にメルカプトヘキシル基を有するＨＳ−ｄ（ＣＡＧＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴ）（１０ピコモル／μＬ）を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製した。オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ−」は、前記の公報に記載の方法に従って合成した。
（２）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
ＤＮＡ分析素子として上記（１）のＤＮＡ分析素子、および試料ＤＮＡ断片として「ＷＴ＋」を用いる以外は実施例１と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１２）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１１）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１２のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１１のピーク電流値と比べて９．７％変化した。
【００８２】
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（３Ｃ）］
オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋」を用いた以外は上記検出（３Ａ）と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製し、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１４）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１３）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１４のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１３のピーク電流値と比べて２９．４％変化した。
この変化の割合が上記検出（３Ａ）のコントロール値である。実施例３においても、実施例１および２と同様な結果が認められた。
【００８３】
［実施例４］部分相補性ＤＮＡ断片の検出
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ遺伝子異常の患者のＤＮＡ断片を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（４Ａ）］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
オリゴヌクレオチド「ＷＴ−」（２ピコモル／μＬ）を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ分析素子を作製した。
（２）試料ＤＮＡ断片の調製
ＬＰＬ遺伝子異常の患者の白血球（１ｍＬ）より精製した染色体ＤＮＡを用い、ＰＬＰ遺伝子部をＰＣＲ増幅（４０サイクル）して、オリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋／Ｓ４４７Ｘ＋」を得た。この試料ＤＮＡ断片は、透析によって精製を行い、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
（３）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
上記（１）のＤＮＡ分析素子および上記（２）の試料ＤＮＡ断片（５ピコモル）を用いた以外は実施例１と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１６）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１５）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１６のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１５のピーク電流値と比べて１．４％減少したが、実際にはほとんど変化が認められなかった。
【００８４】
［試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ遺伝子異常の患者のＤＮＡ断片を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（４Ｂ）］
（１）試料ＤＮＡ断片の調製
正常ＬＰＬ遺伝子を有するヒト白血球（１ｍＬ）より精製した染色体ＤＮＡを用い、ＬＰＬ遺伝子部（「ＷＴ＋」に相当する部分）をＰＣＲ増幅（４０サイクル）して、オリゴヌクレオチド「ＷＴ＋／ＷＴ＋」を得た。試料ＤＮＡ断片として、このオリゴヌクレオチド「ＷＴ＋／ＷＴ＋」、および上記の実施例８で得られたオリゴヌクレオチド「Ｓ４４７Ｘ＋／Ｓ４４７Ｘ＋」を１対１の割合で混合したもの（「ＷＴ＋／Ｓ４４７Ｘ＋」）を調製した。この試料ＤＮＡ断片は、透析によって精製を行い、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
（２）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
上記（１）で得られた試料ＤＮＡ断片（５ピコモル）用いた以外は実施例８と同様の操作を行い、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１８）。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１７）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ１８のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１７のピーク電流値と比べて１６．４％変化した。
【００８５】
［試料ＤＮＡ断片として、正常ＬＰＬ遺伝子のＤＮＡ断片を用いる部分相補性ＤＮＡ断片の検出（４Ｃ）］
試料ＤＮＡ断片として、実施例９で得られたオリゴヌクレオチド「ＷＴ＋／ＷＴ＋」（５．０ピコモル）を用いた以外は実施例３と同様の操作を行い、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ２０）。この試料ＤＮＡ断片は、予め透析によって精製を行った。また、試料ＤＮＡ断片を存在させない以外は上記と同様にして、そのＤＰＶを測定した（ＤＰＶ１９）。
その結果、４６０ｍＶにおけるＤＰＶ２０のピーク電流値は、同電位におけるＤＰＶ１９のピーク電流値と比べて３８．４％変化した。
この変化の割合が、前記の検出（４Ａ）および上記の検出（４Ｂ）のコントロール値に相当する。
【００８６】
上記実施例１〜４の結果を下記第１表にまとめて示す。
【００８７】
【表１】

【００８８】
実施例１〜４の結果より、ミスマッチ構造もしくはバルジ構造のような特殊ＤＮＡ構造を有する二本鎖ＤＮＡ断片は、試料ＤＮＡ断片の一例として、ＬＰＬ異常遺伝子のモデル化合物を使用しても充分に検出できることが確認された。また、試料ＤＮＡ断片として、ＬＰＬ遺伝子異常の患者の実際のＤＮＡを用いても、上記の検出が可能であることが分かる。即ち、ＬＰＬ遺伝子正常体では、電流値が約３８％増加したのに対して、ＬＰＬ遺伝子異常体（ヘテロ接合体：染色体上に二つのＬＰＬ遺伝子が存在し、その一方に変異が生じているもの）では約１６％増加し、ＬＰＬ遺伝子異常体（ホモ接合体：染色体上に二つのＬＰＬ遺伝子が存在し、その両方に変異が生じているもの）では増加が認められなかった。このことは、ＬＰＬ遺伝子の多型を調べることによって、ＬＰＬ遺伝子に関わる遺伝病の遺伝子診断が可能であることを示している。
【００８９】
［実施例５］電流値の変化の割合が、二本鎖ＤＮＡ断片に結合したインターカレータの量に依存することの確認
ハイブリダイゼーションおよび電流値の測定は、同一の温度（２０℃）で実施したが、その温度を１５、２５、３５および４５℃のそれぞれに変えた以外は実施例１と同様にして、それらのＤＰＶを測定し、４５０ｍＶにおける各ピーク電流値を求めた（図６の−△−）。２０℃の場合のピーク電流値（実施例１）についても併せて示す。
【００９０】
試料ＤＮＡ断片をｄＴ₈ｄＡ₄ｄＴ₈に変えた以外は上記と同様にして、各ピーク電流値を求めた（図６の−○−）。但し、３０℃における電流値も測定した。
【００９１】
図６より、試料ＤＮＡ断片としてｄＴ₂₀を用いた場合には、温度が３０℃より高くなるとピーク電流値の減少が認められ、ｄＴ₈ｄＡ₄ｄＴ₈を用いた場合には、２０℃付近よりピーク電流値の減少が認められた。ｄＡ₂₀とｄＴ₂₀との二本鎖ＤＮＡ断片の溶液中での融解温度は４２℃であることが知られているが、前者の結果は、この事実と良い一致を示す。前者では、形成される二本鎖ＤＮＡ断片はフルマッチ構造となることから、二本鎖構造が安定であり、３０℃付近までは、この二本鎖ＤＮＡ断片にフェロセン化ナフタレンジイミドが安定に結合するのに対し、後者では、二本鎖ＤＮＡ断片がバルジ構造をとり、フルマッチ構造よりは安定性が低下することから、該ナフタレンジイミドが安定に結合できるのは二本鎖の解離が少ない２０℃付近までであると考えられる。従って、ピーク電流値は、二本鎖ＤＮＡ断片への該ナフタレンジイミドの結合量に対応し、電極上の二本鎖ＤＮＡ断片の形成量に対応するものではないことが分かる。また、上記と同様の関係は、温度の変化に対する吸光度の変化の様子を測定した実験においても認められた（データ非表示）。よって、低温（２０℃前後）下でハイブリダイゼーションおよび電気化学測定を行う限りにおいて、二本鎖の形成量に依存した電流値の変化は認められないため、正確に二本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。
【００９２】
〈実施例系２〉
［実施例６］
［試料ＤＮＡ断片としてＤＮＡ−（Ａ）₄ＧＴＡＧＡＧを用いる検出−１−］
（１）ＰＮＡ断片の合成
下記式で表されるＰＮＡ断片：ＰＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）₂（Ｔ）₄を、文献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society,114,1895-1897(1992)および114,9677-9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔはチミンを、Ｃはチトシンを表す。ＰＮＡ断片をＤＮＡ断片と区別するために、以下、ＰＮＡ−、ＤＮＡ−を付して示す。
【００９３】
【化１２】

【００９４】
（２）ＰＮＡ分析素子の作製
表面にメルカプト基を有する面積が２．２５ｍｍ²の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られる、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極に、１００ピコモル／１μＬのＰＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）₂（Ｔ）₄の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時間放置してＰＮＡ分析素子を作製した。
（３）試料ＤＮＡ断片の調製
試料ＤＮＡ断片として、ＤＮＡ−（Ａ）₄ＧＴＡＧＡＧを特開平１０−２８８０８０号公報に記載の方法に従って調製した。
（４）ハイブリダイゼーションおよび電流量の測定
４−１ バックグラウンド値の測定
実施例１で合成したフェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータ（５０μＭを含む０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液に、３８℃にて、前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子を浸漬し、１００乃至７００ｍＶの範囲で電圧を印加し、デファレンシャル・パルス・ボルタンメトリ（ＤＰＶ）を測定した。次いで、印加電圧４６０ｍＶでの応答電流値（バックグラウンド値）測定したところ、−１．３μＡであった。測定は、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳおよびスキャン速度１００ｍＶ／秒にて行った。
【００９５】
４−２ 相補性ＤＮＡ断片の検出
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子の上に、前記（３）で得たＤＮＡ−（Ａ）₄ＧＴＡＧＡＧ（７０ピコモル）を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液２μＬを滴下し、２５℃にて３０分間インキュベートした。次いで、インキュベート後のＰＮＡ修飾電極の表面を０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、未反応のＤＮＡ−（Ａ）₄ＧＴＡＧＡＧを除去した。そして、上記のバックグラウンド値の測定と同様の操作を行って、応答電流値（ＰＮＡと試料ＤＮＡ断片との複合体の電流値）を測定したところ、−１．７μＡであった。また、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、３１％であった。
【００９６】
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子を用いる代わりに、ＤＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）₂（Ｔ）₄を含む水溶液を滴下して作製したＤＮＡ分析素子を用いる以外は、上記と同様にして、バックグラウンド値および応答電流値を測定したところ、それぞれ、−２．５μＡ、−３．０μＡであった。また、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、２０％であった。
【００９７】
［試料ＤＮＡ断片としてＤＮＡ−（Ａ）₄（Ｇ）₂ＡＧＡＧを用いる検出−２−］
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子の上に、試料ＤＮＡ断片：ＤＮＡ−（Ａ）₄ＧＴＡＧＡＧの代わりに、特開平１０−２８８０８０号公報に記載の方法に従って調製した試料ＤＮＡ断片：ＤＮＡ−（Ａ）₄（Ｇ）₂ＡＧＡＧを用いる以外は上記（４）と同様にしてハイブリダイゼーションおよび電流量の測定を行ったところ、バックグラウンド値は、−１．３μＡ、応答電流値は、−２．７μＡ、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、１０８％であった。
【００９８】
前記（２）で作製したＰＮＡ分析素子を用いる代わりに、ＤＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）₂（Ｔ）₄を含む水溶液を滴下して作製したＤＮＡ分析素子を用いる以外は、上記と同様にして、バックグラウンド値および応答電流値を測定したところ、それぞれ、−２．５μＡ、−３．５μＡであった。また、バックグランド値に対する応答電流値の変化の割合は、４０％であった。
【００９９】
実施例６の検出−１−より、ＰＮＡ−ＣＴＣＴ（Ｃ）₂（Ｔ）₄とＤＮＡ−（Ａ）₄ＧＴＡＧＡＧとで形成されるミスマッチ構造を有する二本鎖断片の確認が可能であり、ＰＮＡ分析素子を用いてもＤＮＡ分析素子を用いる場合（検出−２−）と同様に、部分相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。また、検出の感度については、ＰＮＡ分析素子を用いる場合にはバックグラウンド値をより低下させることができるため、ＤＮＡ分析素子を用いる場合に比べてより高くなることが分かる。
【０１００】
【発明の効果】
本発明の検出方法では、ＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリダイゼーションによって形成されたハイブリッドＤＮＡの構造に依存して、ハイブリッドＤＮＡへの電気化学活性縫い込み型インターカレータの結合量が異なることより、試料核酸断片が、ＤＮＡ断片に部分相補性を有する核酸断片であることを検出できる。ＤＮＡ断片をＰＮＡ断片に代えても、ＰＮＡ断片に部分相補性を有する核酸断片を検出することが可能である。ＰＮＡ断片は、ＤＮＡ断片に比べると試料核酸断片に対する結合力がより強いため、試料核酸断片との相補性をより厳密に認識できる。
また、本発明の検出方法は、低温下で行われる迅速かつ簡便な方法であり、正常遺伝子断片を固定した導電性基板を使用すれば、対応する異常遺伝子断片の如何なる遺伝子変異の検出にも使用することができる。従来法であるＳＳＣＰ法では、特に非塩基対形成部分がハイブリッドＤＮＡの末端部に存在する場合にはその検出が困難であったが、本発明の方法では充分に可能である。従って、本発明は、医学、生物学等での遺伝子変異の解析に有力な手法を提供できるものであり、遺伝病のリスク診断にその利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来技術であるＳＳＣＰ法を模式的に示した図である。
【図２】本発明の部分相補性ＤＮＡ断片の検出方法の代表的な模式図である。
【図３】ＨＳ−ｄＡ₂₀とｄＴ₉ｄＡｄＴ₁₀とをハイブリダイゼーションした場合のデファレンシャルパルスボルタモグラフィおよびＨＳ−ｄＡ₂₀のデファレンシャルパルスボルタモグラフィである。
【図４】ＨＳ−ｄＡ₂₀とｄＴ₈ｄＡ₄ｄＴ₈とをハイブリダイゼーションした場合のデファレンシャルパルスボルタモグラフィおよびＨＳ−ｄＡ₂₀のデファレンシャルパルスボルタモグラフィである。
【図５】ＨＳ−ｄＡ₂₀ とｄＴ₂₀とをハイブリダイゼーションした場合のデファレンシャルパルスボルタモグラフィおよびＨＳ−ｄＡ₂₀のデファレンシャルパルスボルタモグラフィである。
【図６】ＨＳ−ｄＡ₂₀とｄＴ₂₀とのハイブリダイゼーションおよび電気量の測定における温度の変化に対するピーク電流値の変化の様子を示したグラフ、およびＨＳ−ｄＡ₂₀とｄＴ₈ｄＡ₄ｄＴ₈とのハイブリダイゼーションおよび電気量の測定における温度の変化に対するピーク電流値の変化の様子を示したグラフである。
【符号の説明】
１１ａ 正常遺伝子断片
１１ｂ 異常遺伝子断片
２１ａ 一本鎖の正常遺伝子断片
２１ｂ 一本鎖の異常遺伝子断片
３１ 変性処理
４１ 導電性基板
５１ ＤＮＡ断片
６１ ＤＮＡ分析素子
７１ａ ＤＮＡ断片に相補性を示す試料核酸断片
７１ｂ、７１ｃ、７１ｄ ＤＮＡ断片と一個以上の非塩基対形成部分を形成する試料核酸断片
８１ ハイブリダイゼーション
９１ａ フルマッチ構造のハイブリッドＤＮＡ
９１ｂ ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡ
９１ｃ、９１ｄ バルジ構造のハイブリッドＤＮＡ
１００ 電気化学活性縫い込み型インターカレータ
１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃ、１０１ｄ ハイブリッドＤＮＡと電気化学活性縫い込み型インターカレータとで形成される複合体[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a gene polymorphism and a method for analyzing a mutation of an abnormal gene fragment, which are important as one means for gene diagnosis.
[0002]
[Prior art]
In general, diseases are thought to develop as a result of environmental factors acting on hereditary predispositions, but it has been elucidated that many diseases are associated with genetic or exogenous genetic abnormalities as genetic technology advances. Yes. Genetic diagnosis refers to diagnosing abnormalities (base substitution, base deletion, base insertion, base point mutation, base transposition, etc.) that occur in these genes, and the target is abnormal germline genes. It includes not only hereditary diseases but also diseases caused by abnormalities in the somatic genes caused by external effects.
[0003]
One direction of research in the field of genetic diagnosis is the search and identification of unknown abnormal genes. Positional cloning (a method for determining the locus of a mutated gene on a chromosome by extracting the DNA of a patient's family and examining the degree of abnormality by linkage analysis) has now been established. Thus, genetic diagnosis of not only hereditary diseases with a clear family history but also diseases (diabetes, hypertension, etc.) that have been thought to have a higher proportion of environmental factors than before is possible.
The other is the development of rapid and accurate diagnostic methods for a large number of patients with known abnormal genes. Currently, over 2000 types of genetic diseases are known. Among them, pediatric hyperuricemia, sickle cell anemia, phenylketonuria and the like are typical diseases. For this type of disease, mass screening methods for newborns and fetuses have been established, and early detection has been achieved, but the development of effective diagnostic methods for future gene therapy is important. .
[0004]
Various genetic analysis methods such as SSCP (single-stranded conformation polymorphism) method for detecting mutations in gene fragments are known. FIG. 1 shows a conventional SSCP method. When the double-stranded normal gene fragment (11a) and the double-stranded abnormal gene fragment (11b) are denatured (31), any of the gene fragments is dissociated into single-stranded normal gene fragments (21a), It becomes a single-stranded abnormal gene fragment (21b) ((A) of FIG. 1). The “x” mark in the figure indicates the position of the mutated base. The abnormal gene fragment (11b) means a DNA fragment obtained from a patient having a specific genetic abnormality. When these gene fragments (21a and 21b) are subjected to electrophoresis in a polyacrylamide gel, each gene fragment has a unique higher order structure depending on its base sequence. Accordingly, different mobility is shown ((B) in FIG. 1). Therefore, subtle mutations in the gene can be confirmed by detecting this mobility.
[0005]
However, in the SSCP method, a change in the base of a single-stranded DNA fragment may not always be associated with a change in mobility. In particular, when the base change occurs near the end of the DNA fragment, there is little change in the higher order structure, so the DNA fragment mobility without any base change and any DNA fragment with any base change As a result, the difference between the two DNA fragments becomes extremely small, and as a result, it is difficult to distinguish these two DNA fragments.
[0006]
As a method other than the SSCP method, gene change is confirmed by detecting a double-stranded DNA fragment having a special DNA structure obtained by hybridization of a single-stranded normal gene fragment and a single-stranded abnormal gene fragment. There are several known ways to do this. Japanese National Publication No. 9-501561 discloses a method for detecting a double-stranded DNA fragment having a special DNA structure with an external fluorescence microscope. In addition, a method is also known in which the double-stranded DNA fragment is detected by temperature gradient gel electrophoresis using the difference in mobility due to the difference in double-stranded stability.
Here, the special DNA structure means that the normal DNA structure is a “full match structure” (structure forming a complete double strand), whereas the “mismatch structure” (normal gene fragment and abnormal gene fragment is Has a double-stranded structure, but the double-stranded structure has one non-base-pairing moiety), “bulge structure” (these gene fragments form a double-stranded structure) The double strand has a plurality of non-base-pairing portions). A structure that does not form a complete double strand can be broadly called a mismatch structure, but in this specification, it is divided as described above.
[0007]
However, the above-described method using an external fluorescence microscope has a problem that fading of a fluorescent substance such as fluorescein used as a label tends to occur. In the method using electrophoresis, conditions must be set for each measurement, and there is a problem that it is not rapid. Although the radioisotope method is also used, there remains a problem in terms of safety. Therefore, in order to detect all changes in genes easily and with high sensitivity, it is necessary to develop a method capable of detecting double-stranded DNA fragments having a special DNA structure quickly and with high sensitivity.
[0008]
Japanese Patent Laid-Open No. 9-288080 discloses a method for detecting a double-stranded DNA fragment having a “full match structure” using an electrochemical method. In this method, a sample DNA fragment having complete complementarity to a known DNA fragment is detected by using a DNA probe in which a known DNA fragment is immobilized on a solid phase carrier and an electrochemically active threaded intercalator. be able to. This method is very excellent in that it does not have the inferiority observed in the fluorescence method, can solve the safety problem in the radioisotope method, and does not require labeling of the sample DNA fragment.
[0009]
In Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-236396, DNA is a molecule having a negative charge, but instead of the DNA, PNA (peptide nucleic acid) is a molecule that has no negative charge and mimics DNA (or RNA). ) Is disclosed.
[0010]
PNA is known as one of so-called antisense molecules. When a gene is expressed, an antisense molecule binds with high selectivity to a transcription region of a DNA base sequence that becomes a single strand or a translation region of an RNA base sequence, and restricts the function of that region. It is a working molecule and is known as an antisense drug in the field of gene therapy. PNA has a nucleobase in its molecule like a nucleic acid, and specifically hybridizes to a nucleic acid having a complementary base sequence to form a double strand (PENielsen et al., Science, 254, 1497). -1500 (1991)). PNA is functionally almost the same as a nucleic acid, but its structure is completely different, and it is based on a polyamide based on N- (2-aminoethyl) glycine, and contains sugar and phosphate in the molecule. Absent. The nucleobase is usually bonded to the polyamide skeleton via a methylenecarbonyl group. Below, the typical structure of PNA is shown with the structure of DNA.
[0011]
[Chemical 1]

[0012]
PNA is electrically neutral and does not charge even in the absence of salt. Although the function of PNA is almost the same as that of nucleic acid, the double strand formed by PNA and nucleic acid is more stable than the double strand formed by DNA and nucleic acid. It has a feature that it can be recognized more precisely (Naoto Sugimoto, Abstracts of the 74th Spring Meeting of the Chemical Society of Japan, page 1287). Therefore, PNA is a molecule that is expected to be applied to various diagnostic agents in addition to antisense drugs (specification of JP-T-6-509063).
[0013]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-332595 discloses a PNA probe in which a PNA fragment is fixed at one end to the surface of a solid support, and a DNA fragment detection method using the PNA probe. This PNA probe is obtained by immobilizing a PNA fragment on a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor by an avidin-biotin method. Detection of a DNA fragment using a PNA probe is performed by measuring a surface plasmon resonance signal. In addition, a method for detecting a sample DNA fragment having complementarity using a PNA probe and a sample DNA fragment labeled with a radioisotope is known (PENielsen et al., Science, 254, 1497-1500 (1991)). ). In both the avidin-biotin method and the radioisotope method described above, the electric repulsion generated between the PNA fragment and the sample DNA fragment is reduced, so that the detection sensitivity can be improved.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for detecting a partially complementary nucleic acid fragment useful for detecting a gene polymorphism formed by a single-stranded normal gene fragment and a single-stranded abnormal gene fragment. Another object of the present invention is to provide a method for detecting the partially complementary nucleic acid fragment by utilizing the unique properties of PNA.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present invention includes (1) a sample analysis solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed is brought into contact with a DNA analysis element in which a DNA fragment is fixed at one end to the surface of a conductive substrate, and an electrochemically active stitching type In the presence of an intercalator, At temperatures below 30 ° C Flow between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element Independent of the amount of duplex formation A step including an operation of measuring a current value, and (2) using a nucleic acid fragment having a complementarity to the DNA fragment fixed to the DNA analysis element, the current value measured in the above step (1), The sample nucleic acid fragment used in step (1) includes a step of collating with a standard current value of a complementary nucleic acid fragment obtained by the same operation as the operation of (1) above, There is a method for detecting whether or not the nucleotide sequences are partially identical.
[0016]
The present invention also provides: (1) a sample analysis solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed is brought into contact with a DNA analysis element in which a DNA fragment is fixed at one end to the surface of a conductive substrate; In the presence of a type intercalator, At temperatures below 30 ° C Flow between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element Independent of the amount of duplex formation A step including an operation of measuring a current value, (2) an aqueous liquid not containing a sample nucleic acid fragment is brought into contact with a DNA analysis element having the same configuration as described above, and in the presence of an electrochemically active threaded intercalator, At temperatures below 30 ° C Including a step of measuring a background current value flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element, and (3) the current measured in the step (1) above. Using a nucleic acid fragment complementary to the DNA fragment immobilized on the DNA analysis element, comparing the value with the standard current value of the complementary nucleic acid fragment obtained by the same operation as in the above (1), and The sample nucleic acid fragment used in step (1) is characterized in that the sample nucleic acid fragment used in step (1) is partially identical to the complementary nucleic acid fragment with respect to the base sequence, which comprises a step of comparing with the current value measured in step (2). There is also a method for detecting whether or not there is.
[0017]
Preferred embodiments of the detection method using the DNA analysis element of the present invention are as follows.
(A) As a DNA analysis element, a DNA analysis element in which a mask treatment that prevents contact of the electrochemically active threaded intercalator with the surface of the conductive substrate is used on the surface other than the DNA fragment fixing site.
(B) The mask treatment was performed by a method in which the DNA fragment was fixed to the surface of the conductive substrate at one end, and then the surface treatment was performed with 2-mercaptoethanol.
(C) As a DNA analysis element, a DNA analysis element in which a DNA fragment having a known base sequence is bound at one end thereof is used.
(D) A ferrocene-modified electrochemically active threaded intercalator having redox activity is used as the electrochemically active threaded intercalator.
(E) The current value in each step is measured by differential pulse voltammography.
[0018]
The present invention further includes (1) contacting a sample solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed with a PNA analytical element in which a PNA fragment is fixed to the surface of a conductive substrate at one end thereof, and then sewing the electrochemical activity. In the presence of a type intercalator, At temperatures below 30 ° C Flow between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element Independent of the amount of duplex formation A step including an operation of measuring a current value, and (2) using a nucleic acid fragment complementary to the PNA fragment immobilized on the PNA analysis element, the current value measured in the above step (1), The sample nucleic acid fragment used in step (1) includes a step of collating with a standard current value of a complementary nucleic acid fragment obtained by the same operation as the operation of (1) above, There is a method for detecting whether or not the nucleotide sequences are partially identical.
[0019]
Furthermore, the present invention further comprises: (1) a sample solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed is brought into contact with a PNA analytical element in which a PNA fragment is fixed to the surface of a conductive substrate at one end thereof, and electrochemically active sewing is performed. In the presence of embedded intercalators, At temperatures below 30 ° C Flow between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element Independent of the amount of duplex formation A step including an operation of measuring a current value, (2) an aqueous liquid not containing a sample nucleic acid fragment is brought into contact with a PNA analysis element having the same configuration as above, and in the presence of an electrochemically active threaded intercalator, At temperatures below 30 ° C Including a step of measuring a background current value flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element, and (3) the current measured in the step (1) above. Using a nucleic acid fragment complementary to the PNA fragment immobilized on the PNA analytical element, and comparing the value with the standard current value of the complementary nucleic acid fragment obtained by the same operation as in the above operation (1); The sample nucleic acid fragment used in step (1) is characterized in that the sample nucleic acid fragment used in step (1) is partially identical to the complementary nucleic acid fragment with respect to the base sequence. There is also a method for detecting whether or not there is.
[0020]
Preferred embodiments of the detection method using the PNA analysis element of the present invention are as follows.
(A) As the PNA analysis element, a PNA analysis element in which a mask treatment that prevents contact of the electrochemically active stitched intercalator with the surface of the conductive substrate is used on the surface other than the fixed portion of the PNA fragment is used.
(B) The mask treatment was performed by a method in which the PNA fragment was fixed to the surface of the conductive substrate at one end, and then the surface treatment was performed with 2-mercaptoethanol.
(C) As a PNA analysis element, a PNA analysis element in which a PNA fragment having a known base sequence is bound at one end thereof is used.
(D) A ferrocene-modified electrochemically active threaded intercalator having redox activity is used as the electrochemically active threaded intercalator.
(E) The current value in each step is measured by differential pulse voltammography.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
According to the method for detecting a partially complementary nucleic acid fragment of the present invention, an electrode-type sensor method (Japanese Patent Laid-Open No. 9-92) is used to detect hybrid DNA obtained by hybridization of a single-stranded normal gene fragment and a single-stranded abnormal gene fragment. No. 288080 and the 57th Analytical Chemistry Conference Proceedings, p137-138 (1996)).
In this electrode type sensor method, a sample nucleic acid fragment is brought into contact with an electrode having an output terminal and a DNA fragment is fixed in the presence of an electrochemically active threaded intercalator, and the current value is measured. This is a method for detecting a sample nucleic acid fragment having sex.
[0022]
Hereinafter, the detection method using the DNA analysis element will be mainly described, but the same applies to the case where the PNA analysis element is used unless otherwise specified. In this specification, the definition is as follows.
The “PNA fragment” does not include a PNA obtained by synthesis that has been fragmented by an operation such as cleavage.
“DNA analysis element” refers to an analysis element in which a large number of DNA fragments are fixed to one surface of a conductive substrate.
“Mask treatment” means that a solution containing a compound for mask treatment is dropped on the whole surface of an untreated DNA analysis element, dried if necessary, and fixed.
“Hybrid DNA” refers to a double-stranded fragment formed by a DNA fragment immobilized on a DNA analysis element and a sample nucleic acid fragment. “Hybrid PNA” refers to a PNA fragment immobilized on a PNA analysis element. A double-stranded fragment formed from a sample nucleic acid fragment.
“Binding” refers to a state in which a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule is inserted into the hybrid DNA structure, or a state in which the hybrid DNA is electrostatically interacted with the hybrid DNA outside the hybrid DNA structure.
A “partially complementary nucleic acid fragment” is a nucleic acid fragment partially complementary to a base sequence of a DNA fragment immobilized on a DNA analysis element and partially non-complementary. Say. Therefore, nucleic acid fragments that are completely complementary and nucleic acids that are not completely complementary are not subject to partially complementary nucleic acid fragments.
[0023]
FIG. 2 schematically shows a representative example of the method for detecting a partially complementary nucleic acid fragment of the present invention. Hereinafter, the detection method of the present invention will be described in detail mainly using a DNA analysis element, but the same applies to the case where a PNA analysis element is used unless otherwise specified.
The detection method of the present invention comprises the following three steps.
Step A: A single-stranded DNA fragment (single-stranded normal gene fragment) (51) is fixed on the surface of the conductive substrate (41) to obtain a DNA analysis element (61). Here, as a sample nucleic acid fragment, an abnormal gene fragment (71b) having a base sequence containing a base that forms a non-base pair with a specific base of the normal gene fragment (71a), or a normal gene fragment (71a) Contact each with a sample solution in which an abnormal gene fragment (71c or 71d) having a base sequence containing a base that forms a non-base pair with respect to two specific bases is dissolved or dispersed, and (61) ( 71b), (71c) and (71d) ("x" indicates the position of the mutated base), respectively, are combined, hybrid DNA (91b) having a mismatch structure, hybrid DNA (91c or bulge structure) 91d) are obtained respectively. (91c) and (91d) both have two non-base-pairing moieties. When the electrochemically active threaded intercalator (100) is brought into contact with and bonded to these, the composite (101b), (101b), (91c) or (91d) is combined with (100b), 101c) and (101d) are obtained. Next, a potential is applied to them, and the amount of current flowing between the intercalator and the conductive substrate is measured.
Step (B): Using the normal gene fragment (71a) as a sample nucleic acid fragment, the same operation as in step (A) is performed to obtain a hybrid DNA (91a) having a full-match structure. When the intercalator (100) is brought into contact with and bonded thereto, the composite (101a) is obtained. The current value is measured in the same manner as in step (A).
Step (C): The current value measured in the step (A) is compared with the current value measured in the step (B).
Therefore, in step (A), (B) or (C), the abnormal gene fragment (71b) (or (71c), (71d)) is partially identical to the normal gene fragment (71a) with respect to the base sequence. It is possible to detect whether or not. Although FIG. 2 shows the case where the abnormal gene fragment has a base substitution, the same detection method can be used also in the case of a base change such as base deletion or base insertion.
[0024]
The detection method of the present invention is also a detection method including a step (D) in addition to the steps (A) to (C). Step (D) is a step of obtaining a background current value by bringing only the intercalator into contact with the DNA analysis element without contacting the sample nucleic acid fragment. That is, the current values obtained in the above steps (A) and (B) are current values that have changed with respect to the background current value.
[0025]
[Conductive substrate]
The conductive substrate may be a hydrophobic (or low hydrophilic) conductive substrate, or a plurality of hydrophobic (or low hydrophilic) conductive substrates on a hydrophobic (or low hydrophilic) electrically insulating carrier. It is preferable that the substrate is provided. Any of the conductive hydrophobic substrate and the electrically insulating hydrophobic carrier can be preferably used even if the surface has irregularities and low planarity.
As materials for the electrically insulating carrier, any of ceramics such as glass, cement, ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymethyl methacrylate, polymers, silicon, activated carbon, porous Porous materials such as porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven or knitted fabric, nonwoven fabric, filter paper, short fiber, membrane filter, etc., but may be various polymers, glass or silicon Particularly preferred. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis by electrochemical methods. The thickness of the electrically insulating carrier is not particularly limited, but when it is plate-like, it is preferably in the range of 100 to 10,000 μm.
As the hydrophobic conductive substrate, an electrode, an optical fiber, a photodiode, a thermistor, a piezo element, a surface acoustic wave element, or the like can be preferably used, but an electrode is particularly preferable. The electrode materials include carbon electrodes such as graphite and glassy carbon, noble metal electrodes such as platinum, gold, palladium and rhodium, oxide electrodes such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide and lead oxide, Si, Ge, ZnO Examples thereof include semiconductor electrodes such as CdS and electron conductors such as titanium, but it is particularly preferable to use gold or glassy carbon. These electronic conductors may be coated with a conductive polymer or a monomolecular film.
[0026]
As the conductive substrate, it is particularly preferable to use a substrate in which a plurality of hydrophobic conductive substrates are provided on a hydrophobic electrically insulating carrier. At this time, it is preferable that the conductive substrates are regularly arranged on an electrically insulating carrier so as not to contact each other. Before the conductive substrate is provided on the electrically insulating carrier, a layer made of a hydrophilic polymer substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent may be provided on the electrically insulating carrier. By providing such a layer, the unevenness of the carrier can be reduced. Further, depending on the type of the carrier, it is possible to include a hydrophilic polymer substance having a charge in the carrier, and a carrier subjected to such treatment can also be preferably used.
[0027]
Examples of a plurality of electrodes arranged on an electrically insulating carrier are described in the literature (Sosnowski, RG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123 (1997)) A silicon chip to which nucleic acids are not immobilized can also be preferably used. Moreover, the electrode may be printed on a conductive substrate like a printed wiring conductive substrate.
[0028]
[DNA fragment]
The detection method of the present invention is a primary screening method originally intended to detect a hybrid DNA (gene polymorphism) formed by a DNA fragment and a sample nucleic acid fragment, and to analyze the variation of the sample nucleic acid fragment. It is. Accordingly, it is preferable that any one of the DNA fragment and the sample nucleic acid fragment fixed to the DNA analysis element is a normal gene fragment and the other is an abnormal gene fragment. Either the DNA fragment immobilized on the DNA analysis element or the sample nucleic acid fragment may be a normal gene fragment, but a normal gene fragment is preferably used as the DNA fragment.
[0029]
As normal gene fragments, DNA extracted from biological samples without base mutation, DNA without base mutation prepared by genetic manipulation, etc. were cleaved with restriction enzymes, and then purified by electrophoresis separation operation, etc. It is preferable to use a DNA fragment. These DNA fragments are dissociated into single-stranded DNA fragments before or after the separation operation by heat treatment, alkali treatment or the like. In addition, a single-stranded oligonucleotide having the same base sequence as a single-stranded DNA fragment obtained from a DNA extracted from a biological sample and in which no base mutation is observed can be chemically synthesized and used.
[0030]
The base sequence of the DNA fragment is preferably determined in advance by a general base sequence determination method, and the base type is preferably known. The DNA fragment is preferably a 3 to 50 mer, particularly preferably a 10 to 25 mer. In order to immobilize DNA fragments having different base sequences on each of a plurality of conductive substrates arranged at regular intervals on an electrically insulating carrier as a DNA fragment, It is also preferable to use it.
[0031]
As a method for fixing the DNA fragment, a known method can be used. As a method for fixing the DNA fragment to the conductive substrate, an appropriate method can be selected according to the type of the DNA fragment and the type of the conductive substrate (Protein / Nucleic Acid / Enzyme, Vol. 43, No. 13, 2004). -2011 (1998). When immobilizing synthetic nucleotides, a method of directly synthesizing on a conductive substrate, or a method of synthesizing an oligomer in which a reactive group for covalent bonding has been introduced at the terminal in advance and covalently bonding it to a surface-treated conductive substrate Can be used. For example, when the surface of the conductive substrate is vapor-deposited with gold, a mercapto group is introduced at the 5 ′ or 3 ′ end of the DNA fragment, and the DNA fragment is removed via coordinate bond between gold and sulfur. Secure to conductive substrate. Methods for introducing mercapto groups into the DNA fragments are described in the literature (M. Maeda et al., Chem. Lett., 1805-1808 (1994) and BAConnolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484 (1985)). ing. When the surface of the conductive substrate is coated with glassy carbon, the glassy carbon is oxidized with potassium permanganate to introduce carboxylic acid groups on the surface of the conductive substrate, thereby It can be fixed to the surface of the conductive substrate by an amide bond. Details of the actual immobilization method are described in the literature (KMMillan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323 (1993)). The DNA fragment may be a hybrid DNA prepared in advance. When hybrid DNA is immobilized on a conductive substrate that has been vapor-deposited with gold, a mercapto group is introduced into the 5 ′ or 3 ′ end (preferably the 5 ′ end) of one strand of the hybrid DNA. Then, after fixing the hybrid DNA, the double strand can be dissociated to fix the single strand.
Examples of reactive groups for covalent bonding include amino groups, aldehyde groups, mercapto groups, and biotin. When glass or silicon is used as the conductive substrate, a known silane coupling agent is preferably used for the surface treatment.
[0032]
The DNA fragments are fixed by spotting an aqueous solution in which the DNA fragments are dissolved or dispersed on each of a plurality of conductive substrates arranged at regular intervals on an electrically insulating carrier. It is preferable. The concentration of the DNA fragment to be spotted is preferably in the range of several pM to several mM, and particularly preferably in the range of several pM to several nM. The amount of spotting is preferably in the range of 1 to 100 nL, and particularly preferably in the range of 1 to 10 nL. The aqueous liquid containing the DNA fragment may contain an additive that increases the viscosity of the aqueous liquid. Examples of such additives include sucrose, polyethylene glycol, glycerol and the like. Although spotting can be performed by manual operation, it is also preferable to perform spotting using a spotter equipped in a widely used DNA chip manufacturing apparatus. After spotting, the DNA fragments are fixed on a plurality of conductive substrates when left for several hours at a predetermined temperature. It is also preferable to perform incubation after spotting. After incubation, it is preferable to remove unattached DNA fragments by washing.
The amount of DNA fragments fixed by spotting is 1 mm on the surface of the conductive substrate. ² 10 per hit ^-20 Thru 10 ^-12 It is preferably in the range of molar amounts. The amount of DNA fragment immobilized can be determined by means of instrumental analysis such as HPLC (high performance liquid chromatography).
[0033]
[PNA fragment]
The PNA fragment preferably used in the present invention is a compound represented by the following general formula (I).
[0034]
[Chemical formula 2]

[0035]
In the above formula, B ¹¹ Is a ligand and represents a natural nucleobase (A, T, C, G, I or U) or a base analog. B ¹¹ Are attached at the position found in nature, ie at position 9 for purines containing adenine, guanine or inosine and at position 1 for pyrimidines containing thymine, uracil or cytosine. A base analog is an organic base similar to a non-naturally occurring nucleobase, a compound in which a part of the purine ring or pyrimidine ring is substituted from C to N, or N to C, or a purine ring or pyrimidine ring. A compound (a compound into which a sulfhydryl group or a halogen atom has been introduced) is newly modified in part. B ¹¹ May be an aromatic part not containing a nucleobase, an alkanoyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxyl group or a hydrogen atom. Base analogs can include 7-deazaadenine, 6-azauracil and 5-azacytosine.
Exemplary nucleobase ligands and exemplary synthetic ligands are illustrated in WO 92/20702, where 5-propylthymine and 3-deazauracil are known to increase binding affinity to DNA fragments ( JP-A-11-236396). Other useful non-natural nucleobases are 6-thioguanine and pyrazolo [4,3d] -pyrimidine (international application PCT / US92 / 04795).
In addition, B ¹¹ May be a DNA intercalator, a reporter ligand (eg, fluorophore), a hapten or biotin protein label, a spin label, or a radioactive label.
B ¹¹ Is particularly preferably a nucleobase (A, T, C, G or U).
[0036]
R ¹¹ Represents a hydrogen atom or a group representing a side chain of a natural α-amino acid. The group representing the side chain of a natural α-amino acid includes a carbon atom containing an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. An aralkyl group having 7 to 26 carbon atoms, a heteroaryl group having 6 to 20 carbon atoms, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, -NR ¹³ R ¹⁴ A group selected from the group consisting of a group, a mercapto group, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be further substituted with a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms. R ¹³ And R ¹⁴ Are independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 3 carbon atoms, and a hydroxyl group. Or represents a hydroxyl group. The group representing the side chain of a natural α-amino acid is R ¹¹ An alicyclic or heterocyclic ring may be formed together with a hydrogen atom of a carbon atom to which is bonded.
[0037]
L ¹¹ Represents a linking group, -CO- group or -CO-NR ¹² -Group is preferable, and -CO- group is particularly preferable. R ¹² Represents an atom or group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, and an amino group. The alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, the alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms and the amino group are all alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 4 carbon atoms, or It may be substituted with a hydroxyl group.
[0038]
d represents an integer of 1 to 60. d is preferably an integer of 1 to 40. a, b and c each independently represents an integer of 0 to 5; It is preferable that all of a, b and c are 1.
[0039]
The PNA fragment used in the present invention is particularly preferably a compound represented by the following general formula (II). Where B ¹¹ And d are each B in the general formula (I). ¹¹ , D.
[0040]
[Chemical 3]

[0041]
The PNA fragment can be synthesized by a liquid phase method or a solid phase method in the same manner as a peptide, and the synthesized one is also commercially available. Regarding the synthesis method of PNA, the specification of JP-A-6-509063, the specification of US Pat. No. 2,758,888, PENielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1987 (1992), PENielsen et al. , Journal of American Chemical Society, 114, 9677-9678 (1992).
[0042]
The amount of DNA fragments fixed on the DNA analysis element is 1 mm on the conductive substrate. ² 10 per hit ^-15 Thru 10 ^-Ten It is preferably in the range of molar amounts. This is because even when an aqueous liquid in which DNA fragments are dissolved or dispersed is spotted on the surface of the conductive substrate, the spotted amount is usually different from the actually fixed amount.
[0043]
10 DNA fragments ^-Ten When immobilized on the conductive substrate in an amount greater than or equal to a mole, the DNA fragments are in a dense state on the conductive substrate. ^-12 When the number is less than the mole, it is presumed that a portion where the DNA fragment is not bonded to the surface of the conductive substrate, that is, a gap portion is generated. It is considered that most of the DNA fragments are bound on the surface of the conductive substrate in a collapsed state due to the generation of the gap portion. For efficient hybridization between the DNA fragment and the sample nucleic acid fragment, it is desirable that the DNA fragment is fixed in a state where it extends in the vertical direction as much as possible with respect to the surface of the conductive substrate. In addition, it is estimated that the electrochemically active stitched intercalator increases the background current value as a result of contact with the gap and non-specific adsorption. Therefore, the DNA analysis element used in the present invention is preferably subjected to the following mask treatment.
[0044]
[Mask processing]
Mask processing can be performed by spotting a solution containing a compound for mask processing on the surface of the DNA analysis element. The compound for mask treatment is preferably used in the range of 0.5 to 2 mM, particularly preferably in the range of 0.8 to 1.5 mM. After spotting the mask processing compound, it is preferably left at a predetermined temperature (preferably room temperature) for several hours. After the spotting, if necessary, incubation may be performed. The DNA analysis element subjected to the mask treatment can be stored for several days, and can be used repeatedly as long as it is several times.
[0045]
The compound for mask treatment has a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof, and a chain molecule which may have a cyclic group in the middle is opposite to the hydrophilic group side end of the chain molecule. It is a compound in which a reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate is bonded to the side edge or the vicinity thereof. The chain molecule is fixed to the surface of the conductive substrate through a reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate.
Having a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof indicates that the hydrophilic group does not necessarily have to be located at the end of the chain molecule, but preferably has a hydrophilic group at the end. . One or more hydrophilic groups may be used. The reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate is preferably bonded to the end of the chain molecule opposite to the end of the hydrophilic group. The chain molecule which may have a cyclic group in the middle is a molecule derived from a mask processing compound.
The compound for mask treatment is a compound having a shorter straight chain length than the DNA fragment previously fixed to the conductive substrate, and one end of the straight chain alkylene group having 1 to 6 carbon atoms. It is preferable that the compound has a hydrophilic group and a reactive group bonded to the conductive substrate at the other end.
[0046]
Examples of the reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate include a group selected from the group consisting of a mercapto group, a sulfide group, a disulfide group, a thiocarbonyl group, and a thiocarboxylic acid group. In the case where a treatment for introducing a reactive group such as an amino group, an aldehyde group, or a carboxylic acid group has been performed on the surface of the conductive substrate in advance, the reactive group includes an amino group, an imino group, a hydrazine group, a hydrazide Mention may also be made of groups selected from the group consisting of groups, amide groups, carboxylic acid groups, aldehyde groups, epoxy groups and peroxy acid groups. The reactive group is more preferably a mercapto group, a thiocarbonyl group, or a sulfide group, and particularly preferably a mercapto group.
[0047]
The hydrophilic group is preferably a hydroxyl group, a carboxylic acid group, an amide group, a phosphoric acid group or a sulfonic acid group, and particularly preferably a hydroxyl group. However, the reactive groups that can be bonded to the surface of the conductive substrate are preferably different from each other.
The cyclic group is an aryl group having 6 to 12 ring carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, or 1 to 4 heteroatoms selected from the group consisting of N, S, O, and P. It is preferably a heterocyclic group having 2 to 10 carbon atoms. The cyclic group may be a group in which reactive groups capable of binding to the surface of the conductive substrate jointly form a cyclic group. A preferred example of the latter is imidazol-2-thione group.
[0048]
Therefore, as the compound for mask treatment, mercaptomethanol, 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 4-mercaptobutanol, 5-mercaptopentanol, 6-mercaptohexanol, N, N′-di (3-hydroxy-n -Propyl) -imidazole-2-thione or an imidazole-2-thione derivative described in the literature (AJArduengo et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 6153-6154) is preferable. -Mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 4-mercaptobutanol, 5-mercaptopentanol, and 6-mercaptohexanol are more preferable, and 2-mercaptoethanol is particularly preferable. The mask treatment compound may be a salt such as sodium or potassium, and the alkylene chain may be substituted with a specific substituent. The specific substituent is preferably a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms (preferably a methyl group, an ethyl group, a phenyl group, or the like).
It is desirable to select a compound for mask treatment depending on the DNA fragment immobilization method. Two or more kinds of mask processing compounds may be used in combination.
[0049]
[Hybridization]
Hybridization is performed by bringing a sample nucleic acid fragment into contact with a DNA analysis element in the presence of an electrochemically active threaded intercalator. The sample nucleic acid fragment can be contacted with the DNA analysis element by either dropping the aqueous solution containing the sample nucleic acid fragment on the DNA analysis element or immersing the DNA analysis element in the aqueous solution containing the sample nucleic acid fragment. Can be implemented. At this time, an intercalator may be included in the aqueous liquid containing the sample nucleic acid fragment. Or you may make an intercalator contact the hybrid DNA formed after completion | finish of hybridization. In this case, it is preferable to remove unreacted sample nucleic acid fragments. To avoid nonspecific binding of the intercalator to single-stranded sample nucleic acid fragments or double-stranded sample nucleic acid fragments contained in the sample, unreacted sample nucleic acid fragments should be removed after hybridization. Therefore, it is desirable to contact the intercalator. Washing is preferably performed using a mixed solution of a surfactant (preferably sodium dodecyl sulfate) and a buffer (preferably citrate buffer). The intercalator is preferably used in a concentration range of 10 nM to 10 mM.
[0050]
Hybridization is preferably performed in the temperature range of room temperature to 70 ° C. and in the range of 0.5 to 20 hours. However, depending on the length of the DNA fragment immobilized on the conductive substrate, the type of the sample nucleic acid fragment, etc. Therefore, it is desirable to set optimum conditions for hybridization. For example, when analyzing gene expression, it is preferable to perform hybridization for a long time so that low-expressing genes can be sufficiently detected, and when detecting single-base mutations, It is preferable to perform hybridization for a short time.
[0051]
The amount of the intercalator that binds to the hybrid DNA varies depending on the special DNA structure, as shown in FIG. This amount of binding decreases as the number of non-base-pairing moieties increases in duplex formation.
[0052]
[Sample nucleic acid fragment]
A sample nucleic acid fragment is a fragment having a base sequence that forms a non-base pair with at least one base of a DNA fragment immobilized on a DNA analysis element. As the sample nucleic acid fragment, it is preferable to use an abnormal gene fragment corresponding to the fact that the preferred DNA fragment immobilized on the DNA analysis element is a normal gene fragment. An abnormal gene fragment is a fragment having a base sequence that forms a non-base pair with at least one base of a normal gene fragment of interest. Any type of base mutation (base substitution, base deletion, base insertion, etc.) may be used as long as it has such a base sequence. Abnormal gene fragments include DNA extracted from a sample of a genetically abnormal organism, DNA having the same base sequence as that of the following abnormal gene prepared by genetic manipulation, etc., cut with a restriction enzyme, and then separated by electrophoresis, etc. It is preferable to use the DNA fragment purified in (1). These DNA fragments are dissociated into single-stranded DNA fragments before or after the separation operation by heat treatment, alkali treatment or the like. Alternatively, a single-stranded oligonucleotide having the same base sequence as that of the following abnormal gene can be chemically synthesized and used.
[0053]
The abnormal gene may be any of a hereditary disease, a disease caused by an exogenous gene abnormality, or a disease derived from an environmental factor acting on a hereditary predisposition. For example, diseases that seemed to have a higher proportion of environmental factors than diabetic diseases (diabetes, hypertension, etc.), known genetic diseases (pediatric hyperuricemia, sickle cell anemia, phenylketonuria) Etc.).
[0054]
For contact amount of sample nucleic acid fragment, conductive substrate 1mm ² 10 per hit ^-18 Thru 10 ^-Ten Preferably in the range of molar amounts 10 ^-18 Thru 10 ^-12 It is particularly preferred to be in the range of molar amounts. The contact amount of the sample nucleic acid fragment used as a control is preferably the same as that of the sample nucleic acid fragment.
[0055]
[Electrochemically active stitching intercalator]
Any electrochemically active threaded intercalator can be used as long as it intercalates into hybrid DNA and has an electrochemical activity. However, since it is required that the base-paired portion of the hybrid DNA can be quantitatively recognized, the DNA groove-binding type is not preferable.
[0056]
The sewn intercalator labeled with a conductive group is preferably a substance having redox activity. The redox active moiety is preferably a ferrocene compound, a catecholamine compound, a metal bipyridine complex, a metal phenanthroline complex, a viologen compound, or the like, and particularly preferably a ferrocene compound. The intercalator part is preferably naphthalene diimide, anthracene, anthraquinone or the like, and particularly preferably naphthalene diimide. Therefore, as the intercalator, a ferrocene naphthalenediimide derivative represented by the following formula (S. Takenaka et al., J. Chem.) Synthesized by reaction of ferrocenecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester with a corresponding amine form is used. Soc., Commun., 1111 (1998)).
[0057]
[Formula 4]

[0058]
Moreover, the ferrocene naphthalene diimide derivative represented by a following formula is also used preferably.
[0059]
[Chemical formula 5]

[0060]
However, X is a ferrocene derivative represented by the following formula.
[0061]
[Chemical 6]

[0062]
[Chemical 7]

[0063]
[Chemical 8]

[0064]
[Chemical 9]

[0065]
A sewn intercalator labeled with a conductive group has a linker portion that connects the redox active portion and the intercalator portion. The 1,4-dipropylpiperazinyl group represented by the above formula corresponds to this linker moiety. Instead of this piperazinyl group, a quaternized imino group can also be introduced. Since the intercalator represented by the following formula into which the quaternized imino group is introduced is cationic with respect to the pH of the reaction system, the binding of hybrid DNA or hybrid PNA becomes stronger. An intercalator into which a quaternized imino group has been introduced is particularly effective when a PNA analytical element is used. The group corresponding to the linker moiety is not limited to those described above. For example, instead of a piperazinyl group, an N-alkyl group (the alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably a methyl group, an ethyl group or an n-propyl group). ) Is also preferred. The redox potential of the ferrocene molecule varies depending on the structure of the group corresponding to the linker moiety.
[0066]
Embedded image

[0067]
When the above naphthalene diimide derivative is used as a stitched intercalator, the naphthalene diimide derivative binds to the hybrid DNA with high specificity, and is arranged every two bases and is saturated with the hybrid DNA. This means that the two ferrocene molecules of the naphthalenediimide derivative are closely arranged in the main groove and the minor groove of the hybrid DNA, respectively. For this reason, the naphthalene diimide derivative has a very slow dissociation rate from the hybrid DNA, and a stable complex of the hybrid DNA and the naphthalene diimide derivative can be formed. In addition, the binding of the naphthalene diimide derivative to the hybrid DNA is confirmed by the change in viscosity generally observed when the intercalator is brought into contact with the hybrid DNA. For example, it is known that when an intercalation occurs in a closed circular plasmid typified by the virus SV40, the viscosity changes with a change in the super helix. On the other hand, an intercalator does not bind to a single-stranded DNA fragment, or once it is bound, it dissociates immediately and becomes a free intercalator.
[0068]
[Measurement of response current]
The current amount may be measured by any method as long as it can measure the amount of current flowing between the conductive substrate on which the hybrid DNA is fixed and the conductive group of the electrochemically active threaded intercalator. . Cyclic voltammography (CV), differential pulse voltammography (DPV), linear sweep voltammography, potentiostat, etc. are preferably used, and differential pulse voltammography is particularly preferably used. It is preferable to measure differential pulse voltammography by immersing a counter electrode and a conductive substrate on which hybrid DNA is fixed in an electrolyte solution to form a pair of electrolytic systems.
[0069]
As described above, the detection method of the present invention is intended to detect a hybrid DNA (gene polymorphism) formed by a DNA fragment and a sample nucleic acid fragment, and analyze the variation of the sample nucleic acid fragment. Primary screening method. Therefore, if a specific normal gene fragment is used as the DNA fragment and an abnormal gene fragment is used as the sample nucleic acid fragment, the base mutation of the abnormal gene fragment can be quantified by the detection method of the present invention. For example, abnormal gene fragments having a base sequence with a known number of base substitutions with respect to normal gene fragments and having three or more abnormal gene fragments with different numbers of substitutions can be used to determine the degree of base substitution and the current value. Therefore, if an abnormal gene fragment with an unknown number of base substitutions is used as a sample, the base substitution degree can be obtained from the current value. It is also possible to predict gene polymorphism from the degree of base substitution. Detection of genetic polymorphism indicates the possibility of genetic risk diagnosis. For example, if chromosomal DNA of a patient having an abnormal gene for primary type IV hyperlipidemia (hyperglyceridemia) is used as a sample nucleic acid fragment, the presence or absence of disease can be diagnosed from the polymorphism. .
[0070]
In the detection method of the present invention, the rate of change in the current value depends only on the amount of electrochemically active threaded intercalator bound to the hybrid DNA, not on the amount of hybrid DNA formed on the conductive substrate. This can be confirmed in Example 5 described later.
[0071]
【Example】
<Example system 1>
As used in Examples 2 to 4, d (GTCGGAACTGAAGA), which is the sense strand of the normal lipoprotein lipase (LPL) gene, is oligonucleotide “WT +”, and its antisense strand d (CAGCCTGAACTTTCT) is the oligonucleotide “WT−”. , D (GTCGGGAG), which is a sense strand of a gene of a patient having an abnormality due to the change of serine (TCA) at position 447 of the normal LPL gene to a stop codon (TGA) ^* TGAAGA) as oligonucleotide “S447X +” and its antisense strand d (CAGCTCTC) ^* ACTTCT) is abbreviated as oligonucleotide “S447X-”. However, a base having an asterisk (*) in the upper right means a base different from the normal gene that the mutant gene has.
[0072]
[Example 1] Detection of partially complementary DNA fragments
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound as sample DNA fragment (1A)]
(1) Preparation of DNA analysis element
Area is 2mm ² The gold electrode was immersed in a 2N aqueous sodium hydroxide solution for 1 hour, washed with ultrapure water, immersed in concentrated nitric acid, and stirred for 15 minutes. After washing the gold electrode with ultrapure water, an oligonucleotide (HS-dA) in which a mercaptohexyl group was bound to the 5 ′ end of a sample DNA fragment which is a 20-mer of adenine on the surface of the gold electrode. ₂₀ ) DA washed with ultrapure water after spotting 1.0 μL of an aqueous solution of (10 pmol / μL), leaving it for 2 hours ₂₀ And HS-dA ₂₀ Was synthesized according to the methods described in JP-A-9-288080 and BAConnolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484 (1985). HS-dA before spotting ₂₀ Aqueous solution and HS-dA recovered after spotting ₂₀ The aqueous solution was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC), and the amount immobilized on the gold electrode was determined from the amount of change in the chromatographic peak. HS-dA ₂₀ Was modified to a gold electrode almost quantitatively.
(2) Electrode mask processing
1 μL of an aqueous solution of 2-mercaptoethanol (1 mM) was dropped onto the surface of the DNA analysis element obtained in (1) above, and the electrode was capped and left for 2 hours. Subsequently, it was washed with ultrapure water.
(3) Preparation of sample DNA fragment
Formula (III) below:
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 '
The sample DNA fragment dT represented by ₉ dAdT _Ten Was synthesized according to the method described in the above publication.
(4) Synthesis of ferrocene stitched intercalator
Ferrocene naphthalene diimide represented by the following formula was also synthesized according to the method described in the above publication.
[0073]
Embedded image

[0074]
(5) Hybridization of DNA analysis element and sample DNA fragment
Sample DNA fragment dT of (3) above ₉ dAdT _Ten 1 μL of an aqueous solution (20 pmol / μL) was added dropwise to the DNA analysis element and left at 20 ° C. for 30 minutes.
(6) Measurement of current
Using an isothermal cell, keep the temperature at 20 ° C., and mix the electrolyte solution (0.1M acetic acid / potassium acetate aqueous solution (pH 5.6) -0.1M potassium chloride aqueous solution) containing the ferrocene naphthalenediimide (50 μM) of (4) above. In the solution, the hybridization electrode (working electrode) obtained in (5) above, platinum (counter electrode), and a silver / silver chloride reference electrode are immersed to form three electrodes, and differential pulse voltammography at 42 ° C. (DPV2) was measured (-□-in FIG. 3). Further, the DPV1 was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (-o in FIG. 3).
As a result, the peak current value of DPV2 at 460 mV was higher than the peak current value of DPV1 at the same potential, and the amount of change was 22.2%.
[0075]
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound as sample DNA fragment (1B)]
A sample DNA fragment is represented by the following formula (IV):
5'-TTTTTTTTAAAAATTTTTTTT-3 '
DT represented by ₈ dA _Four dT ₈ The DNA analysis element and the DNA fragment were hybridized in the same manner as in Example 1 except that the DPV4 was measured (-□-in FIG. 4). dT ₈ dA _Four dT ₈ Was synthesized according to the method described in the publication. Further, the DPV3 was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (-◯ in FIG. 4).
As a result, the peak current value of DPV4 at 460 mV changed by 15.1% compared to the peak current value of DPV3 at the same potential.
[0076]
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound as sample DNA fragment (1C)]
The sample DNA fragment was converted into a thymine 20-mer (dT ₂₀ The DNA analysis element and the DNA fragment were hybridized in the same manner as in detection of partially complementary DNA fragment (1A) except that the DPV6 was measured (-□-in FIG. 5). However, dT ₂₀ Was synthesized according to the method described in the publication. Further, the DPV5 was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (-◯ in FIG. 5).
As a result, the peak current value of DPV6 at 460 mV changed by 37.3% compared to the peak current value of DPV5 at the same potential.
The rate of change in the current value in the detection of partially complementary DNA fragments (1C) (detection of full match structure) is the current of detection (1A) (detection of mismatch structure) and (1B) (detection of bulge structure) described above. This is the control value for the rate of change of the value.
[0077]
From this example, as a sample DNA fragment, the compounds represented by the above formulas (III, (IV) and dT ₂₀ As long as is used, it can be seen that the rate of change in the current value decreases as the non-base-pairing portion increases (increase in the degree of base substitution).
[0078]
[Example 2] Detection of partially complementary DNA fragments
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound of LPL abnormal gene as sample DNA fragment (2A)]
(1) Preparation of DNA analysis element
A DNA analysis element was produced in the same manner as in Example 1 except that an aqueous solution of HS-d (CAGCCTGAACTTTCT) (10 pmol) having a mercaptohexyl group at the 5 ′ end of the oligonucleotide “WT-” was used as the DNA fragment. did. Oligonucleotide “WT-” was synthesized according to the method described in the above publication.
(2) Preparation of sample DNA fragment
As a model gene for a patient having an LPL abnormal gene, “S447X +” was synthesized according to the method described in the above publication.
(3) Hybridization and current measurement
The DPV was measured at 20 ° C. in the same manner as in Example 1 except that the DNA analysis element obtained in (1) above and the sample DNA fragment in (2) were used (DPV8). Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV7).
As a result, the peak current value of DPV8 at 460 mV changed by 6.3% compared to the peak current value of DPV7 at the same potential.
[0079]
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound of normal LPL gene as sample DNA fragment (2C)]
The DPV was measured in the same manner as in Example 4 except that the oligonucleotide “WT +” was used as the sample DNA fragment (DPV10). Oligonucleotide “WT +” was synthesized according to the method described in the above publication. Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV9).
As a result, the peak current value of DPV 10 at 460 mV changed by 65.4% compared to the peak current value of DPV 9 at the same potential. This rate of change corresponds to the control value for detection (2A) described above.
[0080]
From Example 2, it can be seen that when the double-stranded DNA fragment has a mismatch structure, the rate of change in the current value is considerably reduced.
[0081]
[Example 3] Detection of partially complementary DNA fragments
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound of LPL abnormal gene as sample DNA fragment (3A)]
(1) Preparation of DNA analysis element
A DNA analysis element was prepared in the same manner as in Example 1 except that HS-d (CAGCTCCACTTTCT) (10 pmol / μL) having a mercaptohexyl group at the 5 ′ end of the oligonucleotide “S447X-” was used. Oligonucleotide “S447X-” was synthesized according to the method described in the above publication.
(2) Hybridization and current measurement
The DPV was measured in the same manner as in Example 1 except that the DNA analysis element of (1) above was used as the DNA analysis element and “WT +” was used as the sample DNA fragment (DPV12). Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV11).
As a result, the peak current value of DPV12 at 460 mV changed by 9.7% compared to the peak current value of DPV11 at the same potential.
[0082]
[Detection of partially complementary DNA fragment using model compound of LPL abnormal gene as sample DNA fragment (3C)]
A DNA analysis element was prepared in the same manner as in the detection (3A) except that the oligonucleotide “S447X +” was used, and the DPV was measured (DPV14). Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV13).
As a result, the peak current value of DPV14 at 460 mV changed by 29.4% compared to the peak current value of DPV13 at the same potential.
The rate of change is the control value for the detection (3A). In Example 3, the same results as in Examples 1 and 2 were observed.
[0083]
[Example 4] Detection of partially complementary DNA fragments
[Detection of partially complementary DNA fragment using DNA fragment of patient with abnormal LPL gene as sample DNA fragment (4A)]
(1) Preparation of DNA analysis element
A DNA analysis element was produced in the same manner as in Example 1 except that the oligonucleotide “WT-” (2 pmol / μL) was used.
(2) Preparation of sample DNA fragment
Using chromosomal DNA purified from leukocytes (1 mL) of a patient with abnormal LPL gene, the PLP gene part was PCR amplified (40 cycles) to obtain an oligonucleotide “S447X + / S447X +”. This sample DNA fragment was purified by dialysis and used for the following hybridization.
(3) Hybridization and current measurement
The DPV was measured in the same manner as in Example 1 except that the DNA analysis element of (1) and the sample DNA fragment (5 pmol) of (2) were used (DPV16). Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV15).
As a result, the peak current value of DPV 16 at 460 mV decreased by 1.4% compared to the peak current value of DPV 15 at the same potential, but practically no change was observed.
[0084]
[Detection of partially complementary DNA fragment using DNA fragment of patient with abnormal LPL gene as sample DNA fragment (4B)]
(1) Preparation of sample DNA fragment
Using chromosomal DNA purified from human leukocytes (1 mL) having a normal LPL gene, the LPL gene part (part corresponding to “WT +”) was PCR amplified (40 cycles) to obtain oligonucleotide “WT + / WT +” . As a sample DNA fragment, a mixture (“WT + / S447X +”) of this oligonucleotide “WT + / WT +” and the oligonucleotide “S447X + / S447X +” obtained in Example 8 above in a ratio of 1: 1 was prepared. did. This sample DNA fragment was purified by dialysis and used for the following hybridization.
(2) Hybridization and current measurement
The same operation as in Example 8 was performed except that the sample DNA fragment (5 pmol) obtained in (1) above was used, and the DPV was measured (DPV18). Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV17).
As a result, the peak current value of DPV 18 at 460 mV changed by 16.4% compared to the peak current value of DPV 17 at the same potential.
[0085]
[Detection of partially complementary DNA fragment using DNA fragment of normal LPL gene as sample DNA fragment (4C)]
The DPV was measured in the same manner as in Example 3 except that the oligonucleotide “WT + / WT +” (5.0 pmol) obtained in Example 9 was used as a sample DNA fragment (DPV20). This sample DNA fragment was previously purified by dialysis. Further, the DPV was measured in the same manner as described above except that the sample DNA fragment was not present (DPV19).
As a result, the peak current value of DPV 20 at 460 mV changed by 38.4% compared to the peak current value of DPV 19 at the same potential.
The rate of this change corresponds to the control value of the detection (4A) and the detection (4B).
[0086]
The results of Examples 1 to 4 are summarized in Table 1 below.
[0087]
[Table 1]

[0088]
From the results of Examples 1 to 4, a double-stranded DNA fragment having a special DNA structure such as a mismatch structure or a bulge structure is sufficiently detected even when a model compound of an LPL abnormal gene is used as an example of a sample DNA fragment. It was confirmed that it was possible. It can also be seen that the above detection is possible even when the actual DNA of a patient with an abnormal LPL gene is used as the sample DNA fragment. That is, in the normal LPL gene, the current value increased by about 38%, whereas the abnormal LPL gene (heterozygote: two LPL genes on the chromosome, one of which has a mutation) ) Increased by about 16%, and no increase was observed in the abnormal LPL gene (homozygote: two LPL genes on the chromosome, both of which have mutations). This indicates that genetic diagnosis of genetic diseases related to the LPL gene is possible by examining the polymorphism of the LPL gene.
[0089]
[Example 5] Confirmation that the rate of change in current value depends on the amount of intercalator bound to the double-stranded DNA fragment
Hybridization and measurement of current values were carried out at the same temperature (20 ° C.), but their DPV was measured in the same manner as in Example 1 except that the temperatures were changed to 15, 25, 35 and 45 ° C., respectively. Was measured, and each peak current value at 450 mV was determined (-Δ- in FIG. 6). The peak current value at 20 ° C. (Example 1) is also shown.
[0090]
Sample DNA fragment is dT ₈ dA _Four dT ₈ Each peak current value was determined in the same manner as described above except that it was changed to (-o- in FIG. 6). However, the current value at 30 ° C. was also measured.
[0091]
From FIG. 6, as a sample DNA fragment, dT ₂₀ When the temperature is higher than 30 ° C., a decrease in peak current value is observed, and dT ₈ dA _Four dT ₈ In the case of using, a decrease in peak current value was observed from around 20 ° C. dA ₂₀ And dT ₂₀ It is known that the melting temperature of the double-stranded DNA fragment in solution is 42 ° C., but the former result is in good agreement with this fact. In the former, since the double-stranded DNA fragment formed has a full-match structure, the double-stranded structure is stable, and ferrocene naphthalenediimide is stably bound to this double-stranded DNA fragment up to about 30 ° C. On the other hand, in the latter case, the double-stranded DNA fragment has a bulge structure and is less stable than the full-match structure. It is thought that. Therefore, it can be seen that the peak current value corresponds to the amount of the naphthalenediimide bound to the double-stranded DNA fragment, and does not correspond to the amount of double-stranded DNA fragment formed on the electrode. The same relationship as above was also observed in an experiment in which the change in absorbance with respect to a change in temperature was measured (data not shown). Therefore, as long as hybridization and electrochemical measurement are performed at a low temperature (around 20 ° C.), no change in current value depending on the amount of double-stranded formation is observed, so double-stranded DNA fragments are accurately detected. be able to.
[0092]
<Example system 2>
[Example 6]
[DNA- (A) as sample DNA fragment _Four Detection using GTAGAG 1-]
(1) Synthesis of PNA fragment
PNA fragment represented by the following formula: PNA-CTCT (C) ₂ (T) _Four Was synthesized according to the method described in the literature (PENielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1897 (1992) and 114,9677-9678 (1992)). T represents thymine and C represents cytosine. In order to distinguish the PNA fragment from the DNA fragment, PNA- and DNA- are shown below.
[0093]
Embedded image

[0094]
(2) Production of PNA analysis element
The area having a mercapto group on the surface is 2.25 mm. ² 1, 2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane phosphate buffer solution was added dropwise to the gold electrode, and 100 μmol / 1 μL of PNA- CTCT (C) ₂ (T) _Four An aqueous solution (2 μL) was added dropwise and allowed to stand at room temperature for 1 hour to prepare a PNA analytical element.
(3) Preparation of sample DNA fragment
As a sample DNA fragment, DNA- (A) _Four GTAGAG was prepared according to the method described in JP-A-10-288080.
(4) Hybridization and current measurement
4-1 Measurement of background value
The ferrocene-modified electrochemically active threaded intercalator synthesized in Example 1 (in a 0.1 M potassium chloride-0.1 M acetic acid buffer (pH 5.6) solution containing 50 μM at 38 ° C. in the above (2) The fabricated PNA analytical element was immersed, a voltage was applied in the range of 100 to 700 mV, and differential pulse voltammetry (DPV) was measured, and then a response current value (background value) was measured at an applied voltage of 460 mV. The measurement was performed at a pulse amplitude of 50 mV, a pulse width of 50 mS, and a scan speed of 100 mV / sec.
[0095]
4-2 Detection of complementary DNA fragments
On the PNA analytical element prepared in (2) above, the DNA- (A) obtained in (3) above _Four 2 μL of 10 mM Tris buffer (pH 7.5) solution containing GTAGAG (70 pmol) was added dropwise and incubated at 25 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the surface of the PNA-modified electrode after the incubation was washed with 0.1 M sodium dihydrogen phosphate-disodium hydrogen phosphate aqueous solution (pH 7.0), and unreacted DNA- (A) _Four GTAGAG was removed. Then, the same operation as the measurement of the background value was performed, and the response current value (current value of the complex of PNA and sample DNA fragment) was measured to be -1.7 μA. Further, the rate of change of the response current value with respect to the background value was 31%.
[0096]
Instead of using the PNA analytical element prepared in (2) above, DNA-CTCT (C) ₂ (T) _Four A background value and a response current value were measured in the same manner as described above except that a DNA analysis element prepared by dropping an aqueous solution containing a solution was used. The values were −2.5 μA and −3.0 μA, respectively. Further, the rate of change of the response current value with respect to the background value was 20%.
[0097]
[DNA- (A) as sample DNA fragment _Four (G) ₂ Detection using AGAG-2-]
On the PNA analytical element prepared in (2) above, a sample DNA fragment: DNA- (A) _Four Sample DNA fragment prepared in accordance with the method described in JP-A-10-288080 instead of GTAGAG: DNA- (A) _Four (G) ₂ When hybridization and current measurement were performed in the same manner as in (4) above except that AGAG was used, the background value was −1.3 μA, the response current value was −2.7 μA, and the response to the background value. The rate of change in current value was 108%.
[0098]
Instead of using the PNA analytical element prepared in (2) above, DNA-CTCT (C) ₂ (T) _Four The background value and the response current value were measured in the same manner as described above except that a DNA analysis element prepared by dropping an aqueous solution containing was used, and the values were −2.5 μA and −3.5 μA, respectively. Further, the rate of change of the response current value with respect to the background value was 40%.
[0099]
From detection 1- of Example 6, PNA-CTCT (C) ₂ (T) _Four And DNA- (A) _Four A double-stranded fragment having a mismatch structure formed with GTAGAG can be confirmed, and a sample having partial complementarity is used even when a PNA analysis element is used and a DNA analysis element is used (detection-2-) It can be seen that DNA fragments can be detected. Further, it can be seen that the detection sensitivity is higher when the PNA analysis element is used, because the background value can be further lowered, compared with the case where the DNA analysis element is used.
[0100]
【The invention's effect】
In the detection method of the present invention, depending on the structure of the hybrid DNA formed by hybridization of the DNA fragment and the sample nucleic acid fragment, the amount of binding of the electrochemically active threaded intercalator to the hybrid DNA differs. It can be detected that the sample nucleic acid fragment is a nucleic acid fragment having partial complementarity to the DNA fragment. Even if the DNA fragment is replaced with a PNA fragment, a nucleic acid fragment having partial complementarity to the PNA fragment can be detected. Since the PNA fragment has a stronger binding force to the sample nucleic acid fragment than the DNA fragment, the complementarity with the sample nucleic acid fragment can be recognized more strictly.
In addition, the detection method of the present invention is a quick and simple method performed at a low temperature, and can be used to detect any gene mutation in a corresponding abnormal gene fragment if a conductive substrate on which a normal gene fragment is fixed is used. can do. In the SSCP method, which is a conventional method, the detection is difficult particularly when a non-base pairing portion is present at the end of the hybrid DNA, but the method of the present invention is sufficiently possible. Therefore, the present invention can provide a powerful method for analysis of gene mutations in medicine, biology, etc., and is expected to be used for risk diagnosis of genetic diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing a conventional SSCP method.
FIG. 2 is a typical schematic diagram of the method for detecting a partially complementary DNA fragment of the present invention.
FIG. 3 HS-dA ₂₀ And dT ₉ dAdT _Ten Differential pulse voltammography and HS-dA ₂₀ Is a differential pulse voltammography.
FIG. 4 HS-dA ₂₀ And dT ₈ dA _Four dT ₈ Differential pulse voltammography and HS-dA ₂₀ Is a differential pulse voltammography.
FIG. 5 HS-dA ₂₀ And dT ₂₀ Differential pulse voltammography and HS-dA ₂₀ Is a differential pulse voltammography.
FIG. 6 HS-dA ₂₀ And dT ₂₀ Showing a change in peak current value with respect to a change in temperature in hybridization and measurement of electric quantity, and HS-dA ₂₀ And dT ₈ dA _Four dT ₈ 5 is a graph showing a change in peak current value with respect to a change in temperature in the measurement of hybridization and electric quantity.
[Explanation of symbols]
11a Normal gene fragment
11b Abnormal gene fragment
21a Single-stranded normal gene fragment
21b Single-stranded abnormal gene fragment
31 Modification
41 Conductive substrate
51 DNA fragment
61 DNA analysis element
71a Sample nucleic acid fragment showing complementarity to DNA fragment
71b, 71c, 71d Sample nucleic acid fragments that form one or more non-base-pairing portions with DNA fragments
81 Hybridization
91a Hybrid DNA with full match structure
91b Hybrid DNA with mismatch structure
91c, 91d Hybrid DNA with bulge structure
100 Electrochemically active stitched intercalator
101a, 101b, 101c, 101d Complex formed by hybrid DNA and electrochemically active stitched intercalator

Claims (14)

(1) Presence of an electrochemically active threaded intercalator by bringing a sample solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed into contact with a DNA analysis element in which a DNA fragment is fixed at one end of the surface of a conductive substrate. And an operation of measuring a current value independent of the amount of double strands flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element at a temperature of 30 ° C. or lower. Step (2) The current value measured in Step (1) above is the same as the operation in (1) above, using a nucleic acid fragment complementary to the DNA fragment immobilized on the DNA analysis element. The sample nucleic acid fragment used in the step (1) is partially identical with the complementary nucleic acid fragment with respect to the base sequence, characterized in that the sample nucleic acid fragment used in step (1) comprises a step of collating with the standard current value of the complementary nucleic acid fragment obtained by the operation. thing How to detect whether or not. (1) Presence of an electrochemically active threaded intercalator by bringing a sample solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed into contact with a DNA analysis element in which a DNA fragment is fixed at one end of the surface of a conductive substrate. And an operation of measuring a current value independent of the amount of double strands flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element at a temperature of 30 ° C. or lower. Step (2) An aqueous liquid not containing a sample nucleic acid fragment is brought into contact with a DNA analysis element having the same constitution as described above , and the analysis is performed at a temperature of 30 ° C. or less in the presence of an electrochemically active threaded intercalator. Including a step of measuring a background current value flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the element; and (3) measured in the above step (1). Using the nucleic acid fragment complementary to the DNA fragment immobilized on the DNA analysis element, the current value is compared with the standard current value of the complementary nucleic acid fragment obtained by the same operation as in the above (1), The sample nucleic acid fragment used in step (1) is partially identical with the complementary nucleic acid fragment in terms of base sequence, characterized in that the sample nucleic acid fragment used in step (1) comprises a step of comparing with the current value measured in step (2) How to detect whether or not.   As the DNA analysis element, a DNA analysis element in which a mask treatment that prevents contact with the surface of the conductive substrate of the electrochemically active stitched intercalator is used on the surface other than the DNA fragment fixing site is used. The detection method according to claim 1 or 2.   The detection method according to claim 3, wherein the mask treatment is performed by a method in which a DNA fragment is fixed to the surface of a conductive substrate at one end and then surface treatment is performed with 2-mercaptoethanol.   The detection method according to any one of claims 1 to 3, wherein a DNA analysis element in which a DNA fragment having a known base sequence is bound at one end thereof is used as the DNA analysis element.   The detection method according to any one of claims 1 to 3, wherein a ferrocene-modified electrochemically active threaded intercalator having redox activity is used as the electrochemically active threaded intercalator.   The detection method according to claim 1 or 2, wherein the current value in each step is measured by differential pulse voltamography. (1) Presence of an electrochemically active threaded intercalator by bringing a sample solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed into contact with a PNA analytical element in which a PNA fragment is fixed at one end to the surface of a conductive substrate. And an operation of measuring a current value independent of the amount of double strands flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element at a temperature of 30 ° C. or lower. Step (2) The current value measured in the above step (1) is the same as the operation in (1) above, using a nucleic acid fragment complementary to the PNA fragment immobilized on the PNA analytical element. The sample nucleic acid fragment used in the step (1) is partially identical with the complementary nucleic acid fragment with respect to the base sequence, characterized in that the sample nucleic acid fragment used in step (1) comprises a step of collating with the standard current value of the complementary nucleic acid fragment obtained by the operation. thing How to detect whether or not. (1) Presence of an electrochemically active threaded intercalator by bringing a sample solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed into contact with a PNA analytical element in which a PNA fragment is fixed at one end to the surface of a conductive substrate. And an operation of measuring a current value independent of the amount of double strands flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the analytical element at a temperature of 30 ° C. or lower. Step (2) An aqueous liquid not containing a sample nucleic acid fragment is brought into contact with a PNA analytical element having the same structure as described above , and the analysis is performed at a temperature of 30 ° C. or lower in the presence of an electrochemically active threaded intercalator. Including a step of measuring a background current value flowing between the intercalator and the analytical element by applying a potential to the element; and (3) measured in the above step (1). Using a nucleic acid fragment complementary to the PNA fragment immobilized on the PNA analytical element, the current value is collated with the standard current value of the complementary nucleic acid fragment obtained by the same operation as in the above (1), The sample nucleic acid fragment used in step (1) is partially identical with the complementary nucleic acid fragment in terms of base sequence, characterized in that the sample nucleic acid fragment used in step (1) comprises a step of comparing with the current value measured in step (2) How to detect whether or not.   As the PNA analysis element, a PNA analysis element in which a mask treatment that prevents the electrochemically active threaded intercalator from contacting the surface of the conductive substrate is used on the surface other than the fixed part of the PNA fragment is used. The detection method according to claim 8 or 9.   The detection method according to claim 10, wherein the mask treatment is performed by a method of fixing the PNA fragment on the surface of the conductive substrate at one end thereof and then performing a surface treatment with 2-mercaptoethanol.   The detection method according to any one of claims 8 to 10, wherein a PNA analysis element in which a PNA fragment having a known base sequence is bound at one end thereof is used as the PNA analysis element.   The detection method according to any one of claims 8 to 10, wherein a ferrocene-modified electrochemically active threaded intercalator having redox activity is used as the electrochemically active threaded intercalator.   10. The detection method according to claim 8, wherein the current value in each step is measured by differential pulse voltammography.

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