JP4323369B2 - 走査型蛍光顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料にパルス励起光を照射して励起された試料から放出される蛍光光子をカウントし、カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置に関するものである。

従来、励起光を試料に照射して試料を励起状態にして、試料が基底状態に遷移する過程で発する蛍光を測定して蛍光寿命を算出し、試料の励起状態を調べる方法が知られている。蛍光寿命を算出する方法として、試料にパルス励起光を照射し、試料から放出される蛍光光子数を複数の時間帯において測定し、測定された蛍光光子数から蛍光寿命を算出する時間ゲート法が知られている（非特許文献１参照）。

"Multiple Time-Gate Module for Fluorescence Lifetime Imaging"C.J.DE GRAUW and H.C.GERRITSEN,APPLIED SPECTROSCOPY, Volume 55, Number 6, 2001.

ところで、蛍光寿命の誤差を小さくするには、蛍光光子を数多く測定する必要があるが、励起光の光強度を増加させて蛍光光子の放出確率を増大させると、蛍光光子が連続して測定器に入射し、測定器の測定分解能を超えるため、蛍光光子数の測定誤差が増大し、蛍光寿命の誤差も大きいものとなる。そのため、蛍光寿命の誤差を小さくするため、励起光の１回の照射あたりの光子蛍光光子の発生確率を０．０１以下に抑える必要があった。つまり、誤差の小さい蛍光寿命を算出するためには、多大な時間が必要であった。しかしながら、蛍光寿命が経時的に変化する生体等の蛍光寿命を算出する場合、経時変化に蛍光寿命の算出速度が追随できず、生体等の蛍光寿命の分布が観察できないという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で短時間に誤差の小さい蛍光寿命が測定できる走査型蛍光顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、請求項１にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の比率で分離する分離手段と、前記分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、前記補正手段によって補正された各蛍光光子数を加算する加算手段と、前記加算手段によって加算された前記蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する演算手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の偏光成分ごとに偏向させて分離する偏光分離手段と、前記偏光分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、前記補正手段によって補正された各蛍光光子数をもとに前記試料の配向を演算する偏光演算手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項３にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の偏光成分ごとに偏向させて分離する偏光分離手段と、前記偏光分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、前記補正手段によって補正された各蛍光光子数をもとに前記試料の配向を演算する偏光演算手段と、前記補正手段によって補正された各蛍光光子数を加算する加算手段と、前記加算手段によって加算された前記蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する演算手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項４にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の比率で分離する分離手段と、前記分離手段によって分離された前記蛍光光子を所定の偏光成分ごとに偏向させて分離する偏光分離手段と、前記偏光分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、前記補正手段によって補正された各蛍光光子数をもとに前記試料の配向を演算する偏光演算手段と、前記補正手段によって補正された各蛍光光子数を加算する加算手段と、前記加算手段によって加算された前記蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する演算手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項５にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、前記補正手段は、前記カウント手段によってカウントされた前記蛍光光子数が時間に対してポアソン分布に従う補正を行うことを特徴とする。

また、請求項６にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、前記分離手段は、前記蛍光光子を等分比で反射し、前記蛍光光子を等分比で透過させるハーフミラーであることを特徴とする。

また、請求項７にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、前記分離手段は、前記ハーフミラーを複数接続し、前記蛍光光子を少なくとも３以上に等分するものであることを特徴とする。

また、請求項８にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、前記偏光分離手段は、前記蛍光光子のＳ偏光成分を反射し、前記蛍光光子のＰ偏光成分を透過させる偏光ビームスプリッタであることを特徴とする。

また、請求項９にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、入射した光を所定の偏光角の直線偏光光に偏光するポラライザを前記励起光が通る光路に配置することを特徴とする。

また、請求項１０にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、上記の発明において、前記試料と前記偏光分離手段との間に前記蛍光光子の偏光角を回転させる偏光方向回転手段を配置し、前記分離手段に入射する前記蛍光の各偏光成分が略等分に分離される偏光角になるように制御することを特徴とする。

本発明にかかる走査型蛍光顕微鏡装置は、蛍光光子の光路を分離するハーフミラーを配置し、連続した蛍光光子を分離し、短時間に誤差の小さい蛍光寿命が算出できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる走査型蛍光顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１である走査型蛍光顕微鏡装置１００の概要構成を示すブロック図である。図１において、この走査型蛍光顕微鏡装置１００は、レーザ光源１と、コリメーターレンズ２と、ダイクロイックミラー３と、ガルバノ４と、瞳投影レンズ５と、ミラー６と、観察鏡筒７と、結像レンズ８と、観察照明ユニット９と、ハーフミラー１０と、対物レンズ１１と、試料１２と、測定ユニット１３と、制御部２０と、表示部２５とを有している。

測定ユニット１３は、集光レンズ１４と、ピンホール１５と、ハーフミラー１６と、吸収フィルタ１７ａ，１７ｂと、光検出器１９ａ，１９ｂとを有している。制御部２０は、信号処理部２１ａ，２１ｂと、補正部２２ａ，２２ｂと、加算部２３と、演算部２４とを有している。

まず、制御部２０の制御のもと、レーザ光源１からパルス励起光が出射される。パルス励起光は、ダイクロイックミラー３で反射され、ガルバノ４、瞳投影レンズ５、ミラー６、観察鏡筒７、結像レンズ８、ハーフミラー１０、対物レンズ１１を順次介して、試料１２に集光する。試料１２に集光したパルス励起光は、試料１２を励起し、試料１２から蛍光光子が放出される。試料１２から放出された蛍光光子は、対物レンズ１１からダイクロイックミラー３までパルス励起光と同じ光路を逆行し、ダイクロイックミラー３を透過して測定ユニット１３に入射する。測定ユニット１３に入射した蛍光光子は、集光レンズ１４、ピンホール１５を順次介してハーフミラー１６に入射する。ハーフミラー１６は、入射した蛍光光子を５０％の確率で反射し、５０％の確率で透過する。したがって、例えば１０００個の蛍光光子がハーフミラー１６に入射した場合、確率的に５００個の蛍光光子は、ハーフミラー１６で反射され、吸収フィルタ１７ａを介して光検出器１９ａに入射する。光検出器１９ａは、蛍光光子が飛来するごとに電気信号Ｓａを制御部２０に出力する。一方、残りの５００個の蛍光光子は、ハーフミラー１６を透過し、吸収フィルタ１７ｂを介して光検出器１９ｂに入射する。光検出器１９ｂは、蛍光光子が飛来するごとに電気信号Ｓｂを制御部２０に出力する。

従って、本発明にかかるカウントされた各蛍光光子数に対して補正処理を行わずに従来の時間相関単一光子計数法（ＴＣＳＰＣ）を用いて蛍光寿命を算出する場合、前述した様に個々の光検出器１９ａ，１９ｂの能力は、１回の照射あたりの蛍光光子数の発生確率が０．０１以下に制限されているが、ハーフミラー１６を用いて２系列の光検出器１９ａ，１９ｂによって、蛍光光子の検出を行えば、発生確率を０．０２まで向上させることができる。

制御部２０内の信号処理部２１ａ，２１ｂは、入力した電気信号Ｓａ，Ｓｂをそれぞれ異なる時間帯に設定された複数の時間ゲートでカウントし、カウントした蛍光光子数を補正部２２ａ，２２ｂに出力する。補正部２２ａ，２２ｂは、入力した蛍光光子数に所定の補正を行い加算部２３に出力する。加算部２３は、補正された蛍光光子数を加算して、加算された蛍光光子数を演算部２４に出力する。演算部２４は、入力した加算された蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算し、蛍光寿命を表示部２５に出力する。表示部２５は、入力した蛍光寿命を表示信号に変換し、表示出力する。

つぎに、図２を参照して、補正部２２ａ，２２ｂが行う補正の内容について説明する。図２は、制御部２０の概要構成を示すブロック図である。制御部２０は、信号処理部２１ａ，２１ｂと、補正部２２ａ，２２ｂと、加算部２３と、演算部２４とを有している。さらに、信号処理部２１ａは、スイッチＳＷ１ａ，ＳＷ２ａと、波高分別器２１１ａ，２１２ａと、カウンタ２１３ａ，２１４ａとを有し、信号処理部２１ｂは、スイッチＳＷ１ｂ，ＳＷ２ｂと、波高分別器２１１ｂ，２１２ｂと、カウンタ２１３ｂ，２１４ｂとを有している。

光検出器１９ａから出力された電気信号Ｓａは、信号処理部２１ａに入力され、光検出器１９ｂから出力された電気信号Ｓｂは、信号処理部２１ｂに入力される。スイッチＳＷ１ａ，ＳＷ１ｂは、制御部２０からのゲート制御信号によって「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングが制御され、「ＯＮ」動作の間だけ電気信号Ｓａ，Ｓｂを波高分別器２１１ａ，２１１ｂを介してカウンタ２１３ａ，２１３ｂに出力し、カウンタ２１３ａ，２１３ｂは、蛍光光子数ｋ１ａ，ｋ１ｂをカウントし、カウントされた蛍光光子数ｋ１ａ，ｋ１ｂは、補正部２２ａに出力される。スイッチＳＷ２ａ，ＳＷ２ｂは、制御部２０からのゲート制御信号によって「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングが制御され、「ＯＮ」動作の間だけ電気信号Ｓａ，Ｓｂを波高分別器２１２ａ，２１２ｂを介してカウンタ２１４ａ，２１４ｂに出力し、カウンタ２１４ａ，２１４ｂは、蛍光光子数ｋ２ａ，ｋ２ｂをカウントし、カウントされた蛍光光子数ｋ２ａ，ｋ２ｂは、補正部２２ｂに出力される。

補正部２２ａは、入力した蛍光光子数ｋ１ａ，ｋ２ａを補正して蛍光光子数ｍ１ａ，ｍ２ａに変更し、蛍光光子数ｍ１ａ，ｍ２ａを加算部２３に出力し、補正部２２ｂは、入力した蛍光光子数ｋ１ｂ，ｋ２ｂを補正して蛍光光子数ｍ１ｂ，ｍ２ｂに変更し、蛍光光子数ｍ１ｂ，ｍ２ｂを加算部２３に出力する。加算部２３は、加算器２３ａ，２３ｂを有し、加算器２３ａは、蛍光光子数ｍ１ａと蛍光光子数ｍ１ｂとを加算して蛍光光子数ｍ１（＝ｍ１ａ＋ｍ１ｂ）を演算部２４に出力し、加算器２３ｂは、入力した蛍光光子数ｍ２ａと蛍光光子数ｍ２ｂとを加算して蛍光光子数ｍ２（＝ｍ２ａ＋ｍ２ｂ）を演算部２４に出力する。演算部２４は、蛍光光子数ｍ１，ｍ２をもとに蛍光寿命を演算する。

つぎに、補正部２２ａ，２２ｂが行う補正について説明する。一般的に、試料１２が励起状態から基底状態に遷移する過程で放出される蛍光光子の放出確率は、ポアソン分布にしたがい、励起光のエネルギーを増大させると蛍光光子の放出確率は高くなり、蛍光光子が連続して放出されるため、蛍光光子数の測定誤差が生じ易い。しかし、蛍光光子の放出確率が高い状態で測定した蛍光光子数をポアソン分布にしたがうように補正すれば、誤差の小さい蛍光寿命が測定できる。つまり、補正部２２ａ，２２ｂは、測定された蛍光光子がポアソン分布にしたがうように補正を行う。

試料１２から放出される蛍光光子が、１回の励起光の照射において、所定の時間ゲートΔＴに入射する平均蛍光光子数をμ個とすると、時間ゲートΔＴに入射する蛍光光子数がｒ個である確立ｐ（ｒ，μ）は、以下の式（１）で表せる。

・・・・・・・・・・（１）
また、ｒが１以上とすると、式（１）から式（２）が導き出される。

・・・・・・・・・・・（２）
励起光の照射をＮ回行い、時間ゲートΔＴにおいて測定された蛍光光子数をｋ個とすると、時間ゲートΔＴにおいて測定された平均の蛍光光子数（カウントレート）ｘは、ｘ＝ｋ／Ｎとなる。一方、時間ゲートΔＴにおいて蛍光光子が入射しない確率ｐ（０，μ）は、カウントレートｘを用いて以下の式（３）で表せる。

・・・・・・・・・・・（３）
また、同様に時間ゲートΔＴにおいて蛍光光子が入射しない確率ｐ（０，μ）は、式（１）から以下の式（４）によって表せる。

・・・・・・・・・・・（４）
したがって、式（３），（４）から時間ゲートΔＴにおいて入射する平均蛍光光子数μは、以下の式（５）によって表せる。

・・・・・・・・・・・（５）
ここで、時間ゲートΔＴにおいて入射する蛍光光子数をｍ個とすると、ｍは以下の式（６）のように、励起光の照射回数Ｎと時間ゲートΔＴにおいて入射した平均蛍光光子数μとの乗算値になる。

・・・・・・・・・・・・（６）
つまり補正部２２ａ，２２ｂは、レーザ光源１が照射する照射回数Ｎと信号処理部２１ａ，２１ｂから入力する測定された蛍光光子数ｋとによって式（６）を演算し、測定された蛍光光子数ｋ個を実際に入射した蛍光光子数ｍ個に補正する。

つぎに、演算部２４が行う演算について説明する。複数の時間ゲートとして第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２とが設定され、第１の時間ゲートΔＴ１において測定された蛍光光子数がｋ１個であり、第２の時間ゲートΔＴ２において測定された蛍光光子数がｋ２個である場合、また、第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２との測定開始時間の時間差がｔであり、第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２との時間幅が等しい場合、蛍光寿命τは、以下の式（７）によって表される。

・・・・・・・・・・（７）

図３は、レーザ光源１の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作と、スイッチＳＷ１ａ，ＳＷ１ｂ．ＳＷ２ａ，ＳＷ２ｂの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイミングチャートである。制御部２０は、レーザ光源１のレーザ光の出射タイミングとスイッチＳＷ１ａ，ＳＷ１ｂ，ＳＷ２ａ，ＳＷ２ｂを制御することによって、第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２との時間差ｔとを設定している。

補正部２２ａは、式（６）を演算して測定した蛍光光子数ｋ１ａ，ｋ２ａをそれぞれｍ１ａ，ｍ２ａに補正して加算部２３に出力し、補正部２２ｂは、式（６）を演算して測定した蛍光光子数ｋ１ｂ，ｋ２ｂをそれぞれｍ１ｂ，ｍ２ｂに補正して加算部２３に出力する。加算部２３の加算器２３ａは、蛍光光子数ｍ１ａとｍ１ｂとを加算し、第１の時間ゲートΔＴ１に入射した蛍光光子数ｍ１（＝ｍ１ａ＋ｍ１ｂ）を演算部２４に出力し、加算部２３の加算器２３ｂは、蛍光光子数ｍ２ａとｍ２ｂとを加算し、第２の時間ゲートΔＴ２に入射した蛍光光子数ｍ２（＝ｍ２ａ＋ｍ２ｂ）を演算部２４に出力する。

演算部２４は、入力したｍ１，ｍ２をもとに以下の式（８）を演算して蛍光寿命τを算出する。

・・・・・・・・・・（８）

この実施の形態１では、ハーフミラー１６を用いて、蛍光光子を分離することによって連続した蛍光光子数を正確に測定することができるようにしている。このようにすると、個々の光検出器１９ａ，１９ｂによって計数された光子数を蛍光光子の放出確率であるポアソン分布にしたがう補正を行うことで、カウントレートを従来の０．０１から１近くまで引き上げても誤差を増大させることなく蛍光寿命の算出が行える。つまり、パルス励起光の光強度を高めることができる。したがって、ハーフミラー１６を用いることと、蛍光光子数を補正することとを組合わせることによって、さらにカウントレートを２に近づけることができる。すなわち、蛍光寿命の算出を従来に比して約２００倍近く速く行うことができる。

なお、この実施の形態１では、第１の時間ゲートΔＴ１の時間幅と第２の時間ゲートΔＴ２の時間幅とを等しいものとしたが、等しいものとしなくてもよい。また、測定開始時間の時間差ｔを第１の時間ゲートΔＴ１よりも小さいものとしたが、時間差ｔが一定であれば、小さいものとしなくてもよい。

つぎに、この実施の形態１の変形例を説明する。実施の形態１では、ハーフミラーを１個配置して蛍光光子を分離して、蛍光光子数の測定時間を１／２にするようにしていたが、この変形例では、ハーフミラーを３個配置し、蛍光光子数の測定時間を１/４にするようにしている。

図４は、この発明の実施の形態１変形例である走査型蛍光顕微鏡装置２００の概要構成を示すブロック図である。図４において、測定ユニット１３Ａは、ハーフミラー１６の後段にハーフミラー１６ａ，１６ｂを配置し、ハーフミラー１６ａ，１６ｂの後段には、それぞれ吸収フィルタ１７ａ１，１７ａ２，１７ｂ１，１７ｂ２と、光検出器１９ａ１，１９ａ２，１９ｂ１，１９ｂ２を配置している。また、制御部２０Ａは、信号処理部２１ｅ，２１ｆ，２１ｇ，２１ｈと、補正部２２ｅ，２２ｆ，２２ｇ，２２ｈと、加算部２３ｂと、演算部２４ｂとを有している。なお、図１と同一の構成部分には同一符号を付している。

ハーフミラー１６に入射した蛍光光子は、分離され、さらにハーフミラー１６ａ，１６ｂによって分離される。したがって、光検出器１９ａ１，１９ａ２，１９ｂ１，１９ｂ２からは、４つに分離された蛍光光子の電気信号Ｓａ１，Ｓａ２，Ｓｂ１，Ｓｂ２が出力される。信号処理部２１ｅ，２１ｆ，２１ｇ，２１ｈは、それぞれ電気信号Ｓａ１，Ｓａ２，Ｓｂ１，Ｓｂ２を入力して蛍光光子数を測定し、測定した蛍光光子数をそれぞれ補正部２２ｅ，２２ｆ，２２ｇ，２２ｈに出力する。補正部２２ｅ，２２ｆ，２２ｇ，２２ｈは、入力した蛍光光子数に対してポアソン分布にしたがう補正を行い、補正後の蛍光光子数を加算部２３に出力する。加算部２３は、入力した蛍光光子数を加算し、演算部２４に出力する。演算部２４は、入力した蛍光光子数をもとに蛍光寿命を算出する。

この実施の形態１の変形例では、ハーフミラー１６，１６ａ，１６ｂを３個配置し、蛍光光子を４つに分離するようにしていた。つまり、蛍光光子の測定時間を従来の１／４にできるようにしている。

なお、この実施の形態１の変形例では、ハーフミラー１６，１６ａ，１６ｂを配置して蛍光光子を４つに分離し、蛍光光子数の測定時間を１／４にしていたが、ハーフミラーを３個以上連結させて蛍光光子数の測定時間をより短くするようにしてもよい。

（実施の形態２）
つぎに、この実施の形態２について説明する。実施の形態１では、ハーフミラー１６を配置して蛍光光子数の測定時間を短くするようにしていたが、この実施の形態２では、偏光ビームスプリッタを配置し、蛍光光子の測定時間を短くするとともに、試料中の蛍光分子の配向も測定できるようにしている。

図５は、この発明の実施の形態２である走査型蛍光顕微鏡装置３００の概要構成を示すブロック図である。図５において、この走査型蛍光顕微鏡装置３００は、コリメーターレンズ２とダイクロイックミラー３との間に励起光の直線性をより向上させる為にポラライザ２７を配置し、ハーフミラー１６に代えて偏光ビームスプリッタ３０を配置している。さらに、偏光ビームスプリッタ３０の偏光特性の限界を補助する為にアナライザ１８ａ，１８ｂを追加している。また、制御部２０Ｂは、偏光演算部２７を有している。なお、図１と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

図５に示すようにレーザ光源１から出射されたパルス励起光は、ポラライザ２６によって所定の偏光角に偏光されて試料１２に照射される。試料１２中の蛍光分子に遷移モーメントが存在する場合、試料１２は、この遷移モーメントと平行な偏光光によってのみ励起状態になり、この励起状態から失活遷移に伴う蛍光も遷移モーメントと平行な偏光光となる。したがって、ポラライザ２６によって偏光された偏光角が試料１２中の蛍光分子に遷移モーメントに平行になると、試料１２から偏光を伴う蛍光が発光する。

試料１２から発光した偏光を伴う蛍光は、対物レンズ１１からダイクロイックミラー３までパルス励起光と同じ光路を逆行し、測定ユニット１３Ｂに入射する。測定ユニット１３Ｂに入射した蛍光は、集光レンズ１４、ピンホール１５を順次介して偏光ビームスプリッタ３０に入射する。偏光ビームスプリッタ３０は、入射した光を９０°に偏差（Ｐ偏光）させて透過光とし、０°に偏差（Ｓ偏光）させて反射光とする特性を有する。したがって、偏光ビームスプリッタ３０に入射する蛍光の偏光角が４５°である場合、Ｐ偏光される確率は５０％であり、Ｓ偏光される確率は５０％である。つまり、４５°の偏光角をもったＮ個の蛍光光子は、Ｐ偏光側とＳ偏光側とにＮ／２個ずつ分離される。

Ｓ偏光された蛍光光子は、吸収フィルタ１７ａ、アナライザ１８ａを介して光検出器１９ｃに入射し、Ｐ偏光された蛍光光子は、吸収フィルタ１７ｂ、アナライザ１８ｂを介して光検出器１９ｄに入射する。光検出器１９ｃは、蛍光光子が飛来するごとに電気信号Ｓｓを信号処理部２１ａに出力し、光検出器１９ｄは、蛍光光子が飛来するごとに電気信号Ｓｐを信号処理部２１ｂに出力する。

信号処理部２１ａ，２１ｂに入力された電気信号Ｓｓ，Ｓｐは、補正部２２ａ，２２ｂでカウントされた蛍光光子数を補正され、加算部２３、演算部２４を順次介して蛍光寿命が演算されるとともに、偏光演算部２７に入力され、Ｓ偏光にかかる蛍光光子数とＰ偏光にかかる蛍光光子数とが演算されてそれぞれ表示部２８に表示される。表示部２５は、制御部２０Ｂの制御のもと、蛍光寿命にかかる画像とＳ偏光、Ｐ偏光にかかる画像とを選択表示する。

この実施の形態２では、ポラライザ２６と偏光ビームスプリッタ３０とを配置することによって、蛍光光子を２つに分離して蛍光光子数の測定時間を１／２にして、かつ偏光された蛍光光子を表示することによって、試料１２中の蛍光分子の配向も知ることができる。

なお、この実施の形態２では、表示部２５を一つにして蛍光寿命の分布画像と偏光にかかる画像とを選択出力するようにしていたが、表示部を２つにしてそれぞれを常に出力表示できるようにしてもよい。

つぎに、この実施の形態２の変形例について説明する。実施の形態２では、偏光ビ−ムスプリッタ３０を配置して、蛍光光子数の測定時間を１／２にして、かつ蛍光分子の配向を観察できるようにしていたが、この変形例では、変化する蛍光の偏光角に対応できるように波長板を集光レンズ１４とピンホール１５との間に配置し、偏光ビームスプリッタ３０に入射する蛍光の偏光角を調整するようにしている。

図６は、この発明の実施の形態２変形例である走査型蛍光顕微鏡装置４００の概要構成を示すブロック図である。図６において、測定ユニット１３Ｃは、集光レンズ１４とピンホール１５との間に偏光方向回転手段として１／２波長板２９を配置し、制御部２０Ｃは、波長板制御部２８を有している。１／２波長板２９は、波長板制御部２８によって、回転が制御されている。なお、図５と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

１／２波長板２９は、水平偏光と垂直偏光との屈折率の違いの原理にもとづいて、垂直偏光の軸を位相シフトすることによって、入射光の偏光角を変えて出射させる特性を有している。試料１２から発光する蛍光の偏光角は、ポラライザ２６によって決まるものの、試料１２が生体であるような場合、蛍光の偏光角が変化することがある。このように蛍光の偏光角が４５°から変化すると、偏光ビームスプリッタ３０によってＳ偏光される確率とＰ偏光される確率とが異なることになり、蛍光光子は、均等に分離されなくなる、そこで、蛍光の偏光角を波長板２９によって回転させて調整して、偏光ビームスプリッタ３０に入射する蛍光の偏光角が常に４５°を保つようにする。波長板制御部２８は、光検出器１９ｃ，１９ｄのそれぞれの出力が等しくなるように信号処理部２２ａ，２２ｂからの信号を入力して１／２波長板２９の回転角を制御する。

この変形例では、１／２波長板２９を用いて偏光ビームスプリッタ３０に入射する蛍光の偏光角を調整し、試料１２中の蛍光分子の遷移モーメントが変化しても、この変化に対応するようにしている。そのため、偏光ビームスプリッタ３０に入射する蛍光光子を均等に分離して、蛍光寿命測定をより正確に、かつ高速に行える。

（実施の形態３）
つぎに、この実施の形態３について説明する。実施の形態１では、ハーフミラー１６を配置し、実施の形態２では、偏光ビームスプリッタ３０を配置し、蛍光光子を分割して蛍光光子数の測定時間を短くするようにしていたが、この実施の形態３では、ハーフミラーと偏光ビームスプリッタとを組み合わせて配置し、蛍光光子数の測定時間を短くするとともに、蛍光分子の配向も観察できるようにしている。

図７は、この発明の実施の形態３である走査型蛍光顕微鏡装置５００の概要構成を示すブロック図である。図７において、この走査型蛍光顕微鏡装置５００は、コリメーターレンズ２とダイクロイックミラー３との間にポラライザ２６を配置し、ハーフミラー１６の後段に偏光ビームスプリッタ３０ａ，３０ｂを配置している。また、制御部２０Ｄは、偏光演算部２７ｄを有している。なお、図４と同一の構成部分には同一の符号を付している。

図７に示すようにレーザ光源１から出射されたパルス励起光は、ポラライザ２６によって所定の偏光角に偏光されて試料１２に照射される。試料１２からは、偏光をともなった蛍光が発光され、蛍光は、測定ユニット１３Ｄに入射し、集光レンズ１４、ピンホール１５を順次介してハーフミラー１６に入射する。ハーフミラー１６は、入射した蛍光光子を偏光角に関係なく偏光角をともなって分離し、偏光角をともなって分離された蛍光光子は、後段の偏光ビームスプリッタ３０ａ，３０ｂにそれぞれ入射する。偏光ビームスプリッタ３０ａ，３０ｂは、入射した蛍光光子の偏光角によって２つに分離する。したがって、測定ユニット１３Ｄに入射した蛍光光子は、最終的に４つに分離される。

４分割された蛍光光子は、吸収フィルタ１７ｅ，１７ｆ，１７ｇ，１７ｈ、アナライザ１８ｅ，１８ｆ，１８ｇ，１８ｈ、光検出器１９ｅ，１９ｆ，１９ｇ，１９ｈを順次介して、電気信号に変換され、信号処理部２１ｅ，２１ｆ，２１ｇ，２１ｈ、補正部２２ｅ，２２ｆ，２２ｇ，２２ｈ、加算部２３ｃ、演算部２４を順次介して蛍光寿命が演算されるとともに、補正部２２ｅ，２２ｆ，２２ｇ，２２ｈで補正された各蛍光光子数は、偏光演算部２７ｄに入力されてＳ偏光、Ｐ偏光にかかる蛍光光子数が演算される。

この実施の形態３では、ハーフミラー１６を配置し、ハーフミラー１６の後段に偏光ビームスプリッタ３０ａ，３０ｂを配置することによって、蛍光光子数の測定時間を１／４にして、かつ試料１２中の蛍光分子の配向も測定できるようにしている。

なお、この実施の形態３では、ハーフミラー１６を１個配置し、ハーミラー１６の後段に２個の偏光ビームスプリッタ３０ａ，３０ｂを配置するようにしていたが、ハーフミラーを複数配置し、最後段に偏光ビームスプリッタをそれぞれ配置するようにしてもよい。

また、集光レンズ１４とピンホール１５との間に波長板を配置し、蛍光の偏光角の変化に対応し、偏光ビームスプリッタ３０ａ，３０ｂに入射する蛍光の偏光角が一定になるように調整してもよい。

また、この実施の形態２，３では、ポラライザ２６を用いてパルス励起光の直線偏光性をさらに高めているようにしていたが、励起光源が直線偏光性の高いレーザ光である場合、ポラライザ２６を用いなくてもよい。

この発明の実施の形態１にかかる走査型蛍光顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。 この発明の実施の形態１にかかる制御部の詳細を示す機能ブロック図である。 この発明の実施の形態１にかかるレーザ光源とスイッチの「ＯＮ」「ＯＦＦ」のタイミングを示すタイミングチャートである。 この発明の実施の形態１の変形例にかかる走査型蛍光顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。 この発明の実施の形態２にかかる走査型蛍光顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。 この発明の実施の形態２の変形例にかかる走査型蛍光顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。 この発明の実施の形態３にかかる走査型蛍光顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。

符号の説明

１ レーザ光源
２ コリメーターレンズ
３ ダイクロイックミラー
４ ガルバノ
５ 瞳投影レンズ
６ ミラー
７ 観察鏡筒
８ 結像レンズ
９ 観察照明ユニット
１０，１６，１６ａ，１６ｂ ハーフミラー
１１ 対物レンズ
１２ 試料
１３，１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ，１３Ｄ 測定ユニット
１４ 集光レンズ
１５ ピンホール
１７ａ，１７ｂ，１７ｃ，１７ｄ，１７ｅ，１７ｆ，１７ｇ，１７ｈ 吸収フィルタ
１８ｃ，１８ｄ，１８ｅ，１８ｆ，１８ｇ，１８ｈ アナライザ
１９ａ，１９ａ１，１９ａ２，１９ｂ，１９ｂ１，１９ｂ２，１９ｃ，１９ｄ，１９ｅ，１９ｆ，１９ｇ，１９ｈ 光検出器
２０，２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃ，２０Ｄ 制御部
２１ａ，２１ｂ，２１ｅ，２１ｆ，２１ｇ，２１ｈ 信号処理部
２２ａ，２２ｂ，２２ｅ，２２ｆ，２２ｇ，２２ｈ 補正部
２３，２３ｃ 加算部
２３ａ，２３ｂ 加算器
２４ 演算部
２５ 表示部
２６ ポラライザ
２７，２７ａ，２７ｂ 偏光演算部
２８ 波長板制御部
２９ １／２波長板
３０，３０ａ，３０ｂ 偏光ビームスプリッタ
２１１ａ，２１１ｂ，２１２ａ，２１２ｂ 波高分別器
２１３ａ，２１３ｂ，２１４ａ，２１４ｂ カウンタ
１００，２００，３００，４００，５００ 走査型蛍光顕微鏡装置

Claims (10)

1. 試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、
   前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の比率で分離する分離手段と、
   前記分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、
   前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、
   前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、
   前記補正手段によって補正された各蛍光光子数を加算する加算手段と、
   前記加算手段によって加算された前記蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する演算手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型蛍光顕微鏡装置。
2. 試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、
   前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の偏光成分ごとに偏向させて分離する偏光分離手段と、
   前記偏光分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、
   前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、
   前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、
   前記補正手段によって補正された各蛍光光子数をもとに前記試料の配向を演算する偏光演算手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型蛍光顕微鏡装置。
3. 試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、
   前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の偏光成分ごとに偏向させて分離する偏光分離手段と、
   前記偏光分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、
   前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、
   前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、
   前記補正手段によって補正された各蛍光光子数をもとに前記試料の配向を演算する偏光演算手段と、
   前記補正手段によって補正された各蛍光光子数を加算する加算手段と、
   前記加算手段によって加算された前記蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する演算手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型蛍光顕微鏡装置。
4. 試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに少なくとも蛍光寿命を測定する走査型蛍光顕微鏡装置において、
   前記蛍光光子が通る光路に配置され、前記蛍光光子を所定の比率で分離する分離手段と、
   前記分離手段によって分離された前記蛍光光子を所定の偏光成分ごとに偏向させて分離する偏光分離手段と、
   前記偏光分離手段によって分離された各蛍光光子を検出する検出手段と、
   前記検出手段によって検出された各蛍光光子数をカウントするカウント手段と、
   前記カウント手段によってカウントされた各蛍光光子数に対して所定の補正を行う補正手段と、
   前記補正手段によって補正された各蛍光光子数をもとに前記試料の配向を演算する偏光演算手段と、
   前記補正手段によって補正された各蛍光光子数を加算する加算手段と、
   前記加算手段によって加算された前記蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する演算手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型蛍光顕微鏡装置。
5. 前記補正手段は、前記カウント手段によってカウントされた前記蛍光光子数が時間に対してポアソン分布に従う補正を行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の走査型蛍光顕微鏡装置。
6. 前記分離手段は、前記蛍光光子を等分比で反射し、前記蛍光光子を等分比で透過させるハーフミラーであることを特徴とする請求項１，４または５に記載の走査型蛍光顕微鏡装置。
7. 前記分離手段は、前記ハーフミラーを複数接続し、前記蛍光光子を少なくとも３以上に等分するものであることを特徴とする請求項１または４〜６のいずれか一つに記載の走査型蛍光顕微鏡装置。
8. 前記偏光分離手段は、前記蛍光光子のＳ偏光成分を反射し、前記蛍光光子のＰ偏光成分を透過させる偏光ビームスプリッタであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一つに記載の走査型蛍光顕微鏡装置。
9. 入射した光を所定の偏光角の直線偏光光に偏光するポラライザを前記励起光が通る光路に配置することを特徴とする請求項２〜５または８のいずれか一つに記載の走査型蛍光顕微鏡装置。
10. 前記試料と前記偏光分離手段との間に前記蛍光光子の偏光角を回転させる偏光方向回転手段を配置し、前記分離手段に入射する前記蛍光の各偏光成分が略等分に分離される偏光角になるように制御することを特徴とする請求項２〜４，８または９のいずれか一つに記載の走査型蛍光顕微鏡装置。

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