JP4332698B2 - Menthol derivative, process for producing the same, and antibacterial or bactericidal agent containing menthol derivative as an active ingredient - Google Patents

Description

【００１０】
（式中、Ｒ¹及びＲ²は、同一又は異なってそれぞれ水素原子又はアルカノイル基を表す）
で示される化合物、その製法及び該化合物を有効成分とする抗菌剤又は殺菌剤を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
＜６，８−ジヒドロキシメントール誘導体（化合物［Ｉ］）＞
本発明の化合物［Ｉ］のＲ¹又はＲ²がアルカノイル基の場合、該アルカノイルとしては、例えば、炭素数１〜１２の直鎖状又は分岐状のアルカノイルが挙げられる。好ましくは、炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状の低級アルカノイルが挙げられ、より好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ピバロイル等が挙げられる。中でも、アセチルが特に好ましい。
【００１２】
本発明の化合物［Ｉ］のうち好ましい化合物としては、例えば、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）体である化合物が挙げられる。
【００１３】
本発明の化合物［Ｉ］のうちより好ましい化合物としては、例えば、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメントール、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメンチル ３，６−ジアセテートが挙げられる。
【００１４】
＜６−ジヒドロキシメントール誘導体（化合物［ＩＩ］）＞
一般式［ＩＩ］：
【００１５】
【化８】

【００１６】
（式中、Ｒ³及びＲ⁴は、同一又は異なってそれぞれ水素原子又はアルカノイル基を表す）
で示される化合物のＲ³又はＲ⁴がアルカノイル基の場合、該アルカノイルとしては、例えば、炭素数１〜１２の直鎖状又は分岐状のアルカノイルが挙げられる。好ましくは、炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状の低級アルカノイルが挙げられる。より好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ピバロイル等が挙げられる。中でも、アセチルが特に好ましい。
【００１７】
本発明の化合物［ＩＩ］のうち好ましい化合物としては、例えば、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）体である化合物が挙げられる。
【００１８】
本発明の化合物［ＩＩ］のうちより好ましい化合物としては、例えば、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメントール、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメンチル ジアセテートが挙げられる。
【００１９】
＜化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］の製法＞
化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］は、メントールを糸状菌R. solaniにより微生物変換し、所望により生成物の水酸基をアルカノイル化することにより製造することができる。
（ｉ）メントールのR. solaniによる微生物変換は、例えば、次のようにして行うことができる。
【００２０】
まず、前培養として、培地を調製し滅菌を行い、その後培地を冷やして菌株を摂取した後、震とう培養する。
【００２１】
培地としては、公知の培地を用いればよく、例えば、リチャーズ培地（Richard's medium）（蒸留水中、5%(w/v)スクロース、0.25%(w/v)硫酸マグネシウム、1%(w/v)硝酸カリウム、0.5%(w/v)リン酸二水素カリウム、0.002%(w/v)塩化鉄(III)）、ツァペックドックス培地（Czapak-Dox medium）（蒸留水中、0.2%(w/v)硝酸ナトリウム、0.05%(w/v)硫酸マグネシウム、0.1%(w/v)リン酸第二カリウム、0.05%(w/v)塩化カリウム、0.001%(w/v)硫酸第一鉄、4%(w/v)グルコース）等が挙げられる。そのうち、リチャーズ培地が好ましい。
【００２２】
培地での滅菌方法は公知の方法を用いればよく、例えば、０．０１Ｍ〜１ＭPa程度の圧力下、１００〜１５０℃の温度で、１分〜１時間程度で行えばよい。
【００２３】
用いる菌株としては、例えば、R. solani AG-1等が挙げられ、より具体的には、R. solani AG-1-IA、R. solani AG-1-IB、R. solani AG-1-IC、R. solani AG-1-ID等があげられる。特に、メントールに対する反応性の観点より、R. solani AG-1-ICが好ましく、そのうちR. solani AG-1-IC F-1、R. solani AG-1-IC F-4、R. solani AG-1-IC P-1等が好ましい。
【００２４】
菌株の摂取量は、例えば、培地100mlに対し、１〜５０mg程度であればよい。
【００２５】
前培養の条件は、公知の条件を用いればよく、例えば、０．０１Ｍ〜１ＭPa程度の圧力下、１００〜１５０℃の温度で、１分〜１時間程度行えばよい。
【００２６】
次に、別途調製した培地を加圧滅菌し、これに前培養した菌液を投入後培養する。培養条件は、例えば、０．０１Ｍ〜１ＭPa程度の圧力下、１００〜１５０℃の温度で、１分〜１時間程度行えばよい。また、回転培養を用いることが好ましい。
【００２７】
これに原料のメントールを添加し変換反応を行う。原料のメントールとしては、具体的にｌ−メントールを用いることが好ましい。メントールの添加量としては、メントールの変換効率の観点より、培地の体積100mlに対し、１〜５０mg程度が好ましい。変換反応の条件は、例えば、常圧下、２５〜２７℃の温度で、５〜１０日程度行えばよい。反応の経時変化は、菌液を少量採取し、NaCl等で塩析させ、有機溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム）で抽出してTLC、GC、GC-MS分析を行うことにより確認する。
【００２８】
上記変換反応により得られる抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、溶出液：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル）で精製することにより、化合物［Ｉ−ａ］：
【００２９】
【化９】

【００３０】
及び化合物［ＩＩ−ａ］：
【００３１】
【化１０】

【００３２】
を得る。具体的には、ｌ−メントールを原料として用いた場合、化合物［Ｉ−ａ］としては、例えば、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメントールが、化合物［ＩＩ−ａ］としては、例えば、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメントールが得られる。
（ｉｉ）生成物の水酸基のアルカノイル化
化合物［Ｉ］のうちＲ¹及び／又はＲ²がアルカノイル基である化合物、又は化合物［ＩＩ］のうちＲ³及び／又はＲ⁴がアルカノイル基である化合物は、溶媒中、塩基の存在下又は非存在下、上記（ｉ）で得られる化合物［Ｉ−ａ］又は［ＩＩ−ａ］とアルカノイルハライド又はアルカン酸無水物とを反応させることにより製造することができる。
【００３３】
溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。また、塩基は溶媒として用いることもできる。塩基の使用量は、酸無水物との反応の場合は触媒量でよく、アルカノイルハライドとの反応の場合は、例えば、化合物［Ｉ−ａ］又は［ＩＩ−ａ］に対して、２〜３等量程度であればよい。反応温度は、例えば、５０〜１２０℃程度であればよく、反応時間は、例えば、５分〜１時間程度であればよい。
【００３４】
該アルカノイルハライドのアルカノイルとしては、例えば、炭素数１〜１２の直鎖状又は分岐状のアルカノイルが挙げられる。好ましくは、炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状の低級アルカノイルが挙げられる。より好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ピバロイル等が挙げられる。中でも、アセチルが特に好ましい。該アルカノイルハライドのハライドとしては、クロライド、ブロマイド等が挙げられる。
【００３５】
該アルカン酸無水物としては、例えば、無水酢酸、プロパン酸無水物、ｎ−ブタン酸無水物等が挙げられる。
【００３６】
化合物［Ｉ−ａ］のアルカノイル化反応では、立体障害の影響により３つの水酸基のうち、８位の３級水酸基はアルカノイル化されにくく、３位及び６位の２級水酸基の双方あるいは一方が選択的にアルカノイル化される。
【００３７】
本発明の化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］は、シクロヘキサン環上に不斉炭素を有する場合その不斉炭素に基づく複数の立体異性体（ジアステレオマー異性体、光学異性体）として存在しうるが、本発明はこれらのうちいずれか１個の立体異性体又はそれらの混合物のいずれをも含むものである。
【００３８】
本発明の化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］は、遊離の形でも溶媒和物（エタノール、水等）をいずれも含むものである。
【００３９】
＜化合物［Ｉ］及び化合物［ＩＩ］の用途＞
本発明の化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］は、病原菌（雪腐病菌：Micronectriella nivalis 305031）に対し、公知の抗菌作用を有する８−ハイドロキシキノリン銅と同等又はそれ以上の溶菌活性を示すことから、化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］は、抗菌剤又は殺菌剤として用いることができる。
【００４０】
具体的には、化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］は、人体、動物、及び魚類用の抗菌剤又は殺菌剤として用いることができる。
【００４１】
本発明の人体、動物、及び魚類用の抗菌剤又は殺菌剤は、注射、経直腸、点眼等の非経口投与、固形もしくは液体形態での経口投与等のための製薬上許容しうる担体とともに組成物として処方することができる。
【００４２】
注射剤としての本発明の組成物の形態としては、例えば、製薬上許容しうる無菌水もしくは非水溶液、懸濁液もしくは乳濁液が挙げられる。適当な非水担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルとしては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油等）等が挙げられる。このような組成物は、補助剤を含んでいてもよく、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤等を挙げることができる。これらの組成物は、例えば、細菌保持フィルターによるろ過により、又は使用直前に滅菌水を混入することにより滅菌することができる。点眼投与のための製剤としては、例えば、溶解補助剤、保存剤、等張化剤、増粘剤等を加えてもよい。
【００４３】
経口投与のための固形製剤としては、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。この固形製剤は、例えば、化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］に少なくとも１種の不活性希釈剤（例えば、スクロース、乳糖、でんぷん等）を混和して調製することができる。この製剤はまた、通常の製剤化において、不活性希釈剤以外に滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）等を含んでいても良い。カプセル剤、錠剤、又は丸剤の場合には、緩衝剤を含んでいても良い。これらの固形製剤には、さらに腸溶解性被膜を施すこともできる。
【００４４】
経口投与のための液体製剤には、当業者間で普通に使用される不活性希釈剤（例えば、水を含む製薬上許容しうる乳剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等）が含まれていても良い。かかる不活性希釈剤に加えて、補助剤（例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、調味剤、香味剤等）等を配合することができる。経直腸投与のための製剤は、好ましくは化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］に加えて、賦形剤（例えば、カカオ脂、坐剤ワックス等）等を含んでいても良い。
【００４５】
本発明の化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］の投与量は、投与される化合物の性状、投与経路、所望の処置時間、その他の要因によって左右されるが、一般に、一日あたり約０．１から１０００ｍｇ／ｋｇ、特に約０．１から１００ｍｇ／ｋｇが好ましい。また、所望によりこの一日量を２〜４回に分割して投与することもできる。
【００４６】
また、化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］は、農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤として用いることもできる。
【００４７】
本発明の農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤は、例えば、イネのいもち病、ごま葉枯病、苗立枯病；ムギ類の赤かび病、赤さび病、黄さび病、黒さび病、うどんこ病；甘薯の黒斑病等の植物病害に防除効果を有する。また、例えば、ソラマメ（さび病等）、エンドウ（うどんこ病等）、ホウレンソウ（立枯病等）、セロリ（葉枯病等）、キュウリ（うどんこ病等）、イチゴ（うどんこ病等）、ホップ（灰色かび病等）、リンゴ（赤星病等）、ナシ（黒星病等）、モモ（黒星病等）、カキ（うどんこ病等）、バラ（うどんこ病等）等の農業用植物の各種病原菌を防除対象とすることもできる。防除対象となる植物病原菌は、上記例示したものに限定されることはない。
【００４８】
本発明の化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］は、それ自体で農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤として用いることができるが、公知の農薬補助剤を含んだ組成物の形態で農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤として用いることが好ましい。その形態は、例えば、乳剤、水和剤、水溶剤、懸濁剤（フロアブル剤）、油剤等の液剤；粉剤、微粒剤、粒剤、錠剤、マイクロカプセル剤等の固形剤；くん煙剤；くん蒸剤等の形態の組成物が好適である。農薬用補助剤は、例えば、効果の向上、安定化、分散性の向上等の目的で使用することができ、具体的には、担体（希釈剤）、展着剤、乳化剤、湿展剤、分散剤、崩壊剤等を挙げることができる。
【００４９】
液体担体としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ブタノール、グリコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、メチルナフタレン、シクロヘキサン、動植物油、脂肪酸等を挙げることができる。
【００５０】
固体担体としては、例えば、クレー、カオリン、タルク、珪藻土、シリカ、炭酸カルシウム、モンモリナイト、ベントナイト、長石、石英、アルミナ、鋸屑、ニトロセルロース、でんぷん、アラビアゴム等を用いることができる。
【００５１】
乳化剤、分散剤としては、通常の界面活性剤を使用することができ、例えば、高級アルコール硫酸ナトリウム、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等の展着剤；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ジアルキルスルホサクシネート等の湿展剤；カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等の固着剤；リグニンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等の崩壊剤を用いることができる。
【００５２】
農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤に配合される化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］の含有量は、特に限定されず、農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤の形態、使用の目的及び使用方法等の条件に応じて適宜選択することが可能である。例えば、粉剤、水和剤及び乳化剤等では、農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤の全重量に対して、０．００１〜２０重量％の範囲から選択することができる。
【００５３】
農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤の形態、製造方法、並びに使用方法は、公知の方法に基づき当業者が適宜選択可能である。
【００５４】
本発明の農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤は、有効成分である化合物［Ｉ］及び／又は［ＩＩ］以外に、他の殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、昆虫生育調製剤、肥料、土壌改良剤等の有効成分を任意に配合してもよい。
【００５５】
本発明の農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤の施用対象及び施用形態は、特に限定されないが、例えば、茎葉処理（液剤散布、粉剤散布、煙霧等）、種子処理（浸漬、粉衣、塗抹等）、土壌処理（粉剤散布、灌注、混和、くん蒸等）、水面施用（粒剤散布等）等のいずれでもよい。例えば、茎葉散布の場合、１〜１０００ｐｐｍ程度の溶液を１アールあたり１０〜１００Ｌ程度の施用量で用いればよく、水面施用の場合は、通常、有効成分が１〜２０％程度の粒剤では、１アールあたり０．１〜１ｋｇ程度であればよい。
【００５６】
更に、本発明の化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］は、人体、動物、及び魚類用の抗菌剤又は殺菌剤として使用しうる濃度範囲、或いは農業用抗菌剤又は農業用殺菌剤として使用しうる濃度の範囲では、人体への悪影響を及ぼすことがなく低毒性であり、安全性が高いという特長をも有する。また、本発明の化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］はともに無色であり、メントールより臭気は小さい。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明の具体例（実施例及び実験例）を示すが、これにより本発明が限定されるものではない。
【００５８】
実施例
（１）前培養
500mlの坂口フラスコに200mlのリチャーズ培地（Richard's medium）（蒸留水中、5%(w/v：(質量g／培地の体積ml))スクロース、0.25%(w/v)硫酸マグネシウム、1%(w/v)硝酸カリウム、0.5%(w/v)リン酸二水素カリウム、0.002%(w/v)塩化鉄(III)）を調整し、121℃で15分加圧滅菌を行った。その後、培地を冷やしスラントから菌株を約30mg摂取した後、25℃で7日間震盪培養を行った。菌株は、岐阜大学の百町満朗博士より入手した、R. solani AG-1-IC F-1（MAFF305909）又はR. solani AG-1-IC F-4を用いた。
（２）経時変化
200mlフラスコにリチャーズ培地100mlを調整した後、加圧滅菌を行い、先の前培養した菌液を5ml投入後、27℃で7日間回転培養を行った。7日後、基質であるl-メントール（和光純薬工業製）を30mg添加し、その後5日間変換反応を行った。毎日菌液を10ml回収し、NaClで塩析させ、ジクロロメタンにより変換生成物の抽出を行った。抽出物をGC、GC-MSで分析することにより変換生成物の経時的変化を追跡した。培養液中の各成分の経時変化を、図１（菌株R. solani AG-1-IC F-1の場合）、及び図２（菌株R. solani AG-1-IC F-4の場合）に示す。
【００５９】
変換反応で得られた生成物の全量（％）を表１に示す。
【００６０】
【表１】

【００６１】
（３）大量変換
1Lの大量培養槽に800mlのリチャーズ培地を調整し加圧滅菌する。その後、前培養した菌液を投入し、27℃で7日間回転培養を行った。7日後、基質であるl-メントールを240mg添加し、その後5日間変換反応を行った。5日後、菌液を全量回収し、NaClで塩析させジクロロメタンにより変換生成物の抽出を行った。
（４）変換生成物の単離
大量培養により得られた抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル）により分画をくり返し行うことにより、下記の変換生成物を得た。
【００６２】
（−）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメントール：
結晶； [α]_D ²⁵:-42.0°(CHCl₃;c0.4); HR-MS m/z:172.1465; EI-MS m/z(相対強度):154(15), 139(48), 121(13), 111(15), 97(40), 95(17), 83(33), 69(37), 67(10), 55(67), 43(100); IRν_max cm^-1:3264, 1450, 1343, 1029; ¹³C-NMR:δ15.9(C-9), δ18.1(C-10), δ20.9(C-8), δ25.7(C-7), δ32.4(C-5), δ38.3(C-1), δ42.5(C-2), δ48.5(C-4), δ70.6(C-3), δ75.9(C-6); ¹H-NMR (500.00MHz, CDCl₃, TMS内部標準) δppm:0.82(3H, d, J=7.0Hz), 0.99(3H, d, J=7.1Hz), 1.03(3H, d, J=7.2Hz), 1.09(1H, ddd, J=12.9, 11.3, 11.2Hz), 1.12(1H, ddd, J=13.0, 11.1, 10.6Hz), 1.26 (1H, brs), 1.50(1H, dddd, J=11.3, 10.5, 4.2, 3.0Hz), 1.61(1H, dddd, J=11.1, 11.0, 7.0, 4.0Hz), 1.76(1H, ddd, J=12.9, 4.2, 3.9Hz), 1.96(1H, ddd, J=13.0, 4.0, 3.9Hz), 2.04 (1H, brs), 2.15(1H, ddd, J=7.2, 7.1, 3.0Hz), 3.19(1H, ddd, J=11.2, 11.0, 3.9Hz), 3.45(1H, ddd, J=10.6, 10.5, 3.8Hz)。
【００６３】
（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメントール：
オイル；[α]_D ²⁵:+5.2°(CHCl₃;c1.0); HR-MS m/z；188.1413; EI-MS m/z(相対強度):173(1), 155(1), 137(3), 116(22), 94(80), 83(10), 79(30), 70(11), 58(100), 53(4), 43(47); IRν_max cm^-1:3332, 1369, 1159, 1022; ¹³C-NMR:δ17.9(C-7), δ23.7(C-9), δ30.1(C-10), δ36.1(C-5), δ38.1(C-1), δ42.2(C-2), δ51.8(C-4), δ72.0(C-3), δ74.8(C-8), δ75.6(C-6); ¹H-NMR (500.00MHz, CDCl₃, TMS内部標準) δppm:0.94(1H, ddd, J=13.1, 10.5, 10.4Hz), 1.01 (1H, brs), 1.02(3H, d, J=7.0Hz), 1.08(1H, brs), 1.16(1H, ddd, J=13.0, 4.1, 4.0Hz), 1.22(3H, s), 1.24(3H, s), 1.41(1H, dddd, J=10.2, 10.0, 7.0, 4.0Hz), 1.56(1H, ddd, J=10.4, 10.3, 4.2Hz), 1.88(1H, ddd, J=13.1, 4.3, 4.2Hz), 1.94(1H, ddd, J=13.0, 10.1, 10.0Hz), 2.03(1H, brs), 3.21(1H, ddd, J=10.5, 10.2, 4.3Hz), 3.77(1H, ddd, J=10.3, 10.1, 4.1Hz)。
（５）アセチル化反応
上記（４）で得られた（−）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメントール30mgの酢酸エチル溶液30mlに、室温下ピリジン28ml及び塩化アセチル27mgを加え、室温で1時間攪拌した。反応液に水を加え、5%塩酸、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することにより、（−）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメンチル ジアセテート44.5mgを得た。
オイル；[α]_D ²⁵:-82.2°(CHCl₃;c1.0); EI-MS m/z(相対強度):154(3), 136(30), 121(21), 107(5), 93(40), 81(8), 69(8), 55(10), 43(100); IRν_max cm^-1:2359, 2340, 1736, 1457, 1370, 1242, 1026; ¹³C-NMR:δ16.2(C-9), δ17.8(C-10), δ20.5(C-7), δ21.1及びδ21.2(CH₃CO), δ26.2(C-8), δ29.0(C-5), δ35.4(C-1), δ38.1(C-2), δ45.2(C-4), δ77.1(C-6), δ170.6及びδ170.8(CH₃CO); ¹H-NMR (500.00MHz, CDCl₃, TMS内部標準) δppm:0.75(3H, d, J=7.1Hz), 0.85(3H, d, J=7.0Hz), 0.91(3H, d, J=7.2Hz), 1.11(1H, ddd, J=12.9, 11.3, 11.2Hz), 1.16(1H, ddd, J=13.0, 11.1, 10.6Hz), 1.61(1H, dddd, J=11.3, 10.5, 4.2, 3.0Hz), 1.67(1H, dddd, J=11.1, 11.0, 7.0, 4.0Hz), 1.86(1H, ddd, J=7.2, 7.1, 3.0Hz), 1.92(1H, ddd, J=12.9, 4.2, 3.9Hz), 2.02(1H, ddd, J=13.0, 4.0, 3.9Hz), 2.04(3H, s), 2.06(3H, s), 4.45(1H, ddd, J=11.2, 11.0, 3.9Hz), 4.67(1H, ddd, J=10.6, 10.5, 3.8Hz)。
【００６４】
上記（４）で得られた（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメントール30mgを、上記と同様に処理することにより、（−）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメンチル ３，６−ジアセテート43.4mgを得た。
【００６５】
オイル；[α]_D ²⁵:-35.8°(CHCl₃;c1.0); EI-MS m/z(相対強度):197(1), 152(2), 138(1), 134(6), 109(3), 100(2), 94(77), 79(29), 69(3), 59(21), 55(7), 43(100); IRν_max cm^-1:3472, 1737, 1457, 1371, 1242, 1114, 1026, 757; ¹³C-NMR:δ17.7(C-7), δ21.1及びδ21.5(CH₃CO), δ22.7(C-9), δ28.3(C-10), δ35.3(C-1), δ36.1(C-5), δ38.1(C-2), δ49.6(C-4), δ72.5(C-3), δ74.1(C-8), 76.5(C-6), δ170.0及びδ170.7(CH₃CO); ¹H-NMR (500.00MHz, CDCl₃, TMS内部標準) δppm:0.91(3H, d, J=7.0Hz), 1.12(1H, ddd, J=13.1, 10.5, 10.4Hz), 1.15(3H, s), 1.16(3H, s), 2.06(3H, s), 2.07(1H, s), 2.11(1H, ddd, J=13.1, 4.3, 4.2Hz), 2.16(1H, ddd, J=13.0, 10.1, 10.0Hz), 2.52(1H, brs), 4.46(1H, ddd, J=10.5, 10.2, 4.3Hz), 4.84(1H, dddd, J=10.3, 10.1, 4.1Hz)。
【００６６】
実験例（溶菌活性試験）
試験対象である病原菌（雪腐病菌：Micronectriella nivalis 305031）を、あらかじめ２５℃で７日間ＰＤＡ（potato dextrose agar）培地上で伸長させる。伸長させた病原菌の菌そう先端部を直径３ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、２％グルコース素寒天培地上に７ｍｍ四方のセロファンを敷き、含菌寒天の半分がセロファンにかかるように置床する（図３参照）。その後、２５℃で１〜２日セロファン上に菌糸を伸長させる（セロファンから菌糸先端がでない程度）。
【００６７】
マルチディッシュ中にサンプル濃度を調製した滅菌水３００μＬを入れ、菌糸を伸長させたセロファンを滅菌水中に浮かべ３℃で４８時間静置する。その後、セロファンをスライドグラス上に取り出し、０．０５％コットン ブルー（Cotton Blue）で菌糸の細胞質を染色し光学顕微鏡で観察する（図４参照）。
【００６８】
溶菌活性の評価の値は、図４に示した３種類の菌糸状態（溶菌なし、不完全溶菌、完全溶菌）の割合を下記式にあてはめ、溶菌率として求めた。
【００６９】
【式１】

【００７０】
溶菌活性試験の結果を下記の表２に示す。
【００７１】
【表２】

【００７２】
本発明の具体例である上記実施例で得られた化合物（(-)-(1S,3R,4S,6S)-6-ヒドロキシメントール、(-)-(1S,3R,4S,6S)-6-ヒドロキシメントール ジアセテート、(+)-(1S,3R,4R,6S)-6,8-ジヒドロキシメントール、(-)-(1S,3R,4R,6S)-6,8-ジヒドロキシメントール 3,6-ジアセテート）は、病原菌（雪腐病菌：Micronectriella nivalis 305031）に対し、８−ハイドロキシキノリン銅と同等又はそれ以上の溶菌活性を示すことが分かった。
【００７３】
【発明の効果】
ｌ−メントールをR. solaniを用いて変換することにより、（−）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメントール及び（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−６，８−ジヒドロキシメントールを効率的に製造する方法を見い出した。
【００７４】
ｌ−メントールから上記生物変換反応により得られ、所望により該生成物の水酸基をアルカノイル化して得られる化合物［Ｉ］及び［ＩＩ］は、高い溶菌作用を有し、かつ低毒性であることから抗菌剤又は殺菌剤として用いうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 R. solani AG-1-IC F-1によるｌ−メントールの微生物変換で生じた化合物の相対濃度の経時変化を示す図である。
【図２】 R. solani AG-1-IC F-4によるｌ−メントールの微生物変換で生じた化合物の相対濃度の経時変化を示す図である。
【図３】 溶菌活性試験における２％グルコース素寒天培地の模式図である。
【図４】 ０．０５％コットン ブルーで菌糸の細胞質を染色したときの光学顕微鏡での観察図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a menthol derivative obtained by microbial conversion of menthol with the filamentous fungus Rhizoctonia solani.
[0002]
[Prior art]
Many attempts have been made to produce high value-added compounds by microbial conversion of inexpensive natural organic compounds that are available in large quantities.
[0003]
For example, it is known that (−)-6-hydroxymenthol is obtained as a minor component by microbial conversion of natural organic compound 1-menthol with Aspergillus Species. Phytochemistry. Vol.30, No.12, pp3981-3987, 1991 Has been reported.
[0004]
l-Menthol is a main component of various mint oils and has a refreshing scent and taste, so it is widely used as an additive for foods, cosmetics, pharmaceutical preparations and the like. Further, l-menthol is known to have various physiological activities such as antibacterial action and bactericidal action.
[0005]
R. solani (Rhizoctonia solani) is known as a filamentous fungus that causes seedling blight, strain rot, stem rot, spider web disease, etc. in various plants, and 188 in 32 families (family) It has a wide host of species (Manibhushanrao K et al., Phytotoxic metabolite of Rhizoctonia solani. Scientific and Industrial Research 40: 602 (1981)). R. solani is a complex species consisting of at least 13 anastomosis groups (AG), that is, AG-1 to AG-12 and AG-BI.
[0006]
Regarding the microbial conversion reaction of organic compounds using R. solani, for example, hydroxylation of aromatic organic acids at the meta position (Keisuke Koumoto, Masatsugu Nishimura, Isamu Hiroe: Nikkatsu Disease Report, 35, p94 (1969) ), Hydroxylation of phenylacetic acid (Keisuke Koumoto, Masatsugu Nishimura: Nikkatsu disease report, 4, p102 (1975)), etc. have been reported, but the conversion reaction of l-menthol using R. solani is reported. There is no report example until.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a menthol derivative obtained by microbial conversion of menthol with a filamentous fungus R. solani, a method for producing the same, and an antibacterial agent or fungicide containing the menthol derivative as an active ingredient.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides a compound represented by the general formula [I]:
[0009]
[Chemical 7]

[0010]
(Wherein R ¹ and R ² are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
The antibacterial agent or bactericidal agent which uses this compound and its manufacturing method and this compound as an active ingredient is provided.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<6,8-dihydroxymenthol derivative (compound [I])>
When R ¹ or R ² of the compound [I] of the present invention is an alkanoyl group, examples of the alkanoyl include linear or branched alkanoyl having 1 to 12 carbon atoms. Preferably, a C1-C6 linear or branched lower alkanoyl is mentioned, More preferably, formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, pivaloyl, etc. are mentioned. Of these, acetyl is particularly preferable.
[0012]
Preferred compounds among the compounds [I] of the present invention include, for example, compounds that are (1S, 3R, 4R, 6S) isomers.
[0013]
Among the compounds [I] of the present invention, more preferred compounds include, for example, (1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthol, (1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthyl. 3,6-diacetate is mentioned.
[0014]
<6-Dihydroxymenthol Derivative (Compound [II])>
General formula [II]:
[0015]
[Chemical 8]

[0016]
(Wherein R ³ and R ⁴ are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
In the case where R ³ or R ⁴ of the compound represented by formula (1) is an alkanoyl group, examples of the alkanoyl include linear or branched alkanoyl having 1 to 12 carbon atoms. Preferably, C1-C6 linear or branched lower alkanoyl is mentioned. More preferred are formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, pivaloyl and the like. Of these, acetyl is particularly preferable.
[0017]
Preferred compounds among the compounds [II] of the present invention include, for example, compounds that are (1S, 3R, 4S, 6S) isomers.
[0018]
Among the compounds [II] of the present invention, more preferred compounds include, for example, (1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthol, (1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthyl diacetate. It is done.
[0019]
<Production Method of Compounds [I] and [II]>
Compounds [I] and / or [II] can be produced by microbial conversion of menthol with the filamentous fungus R. solani and, if desired, alkanoylation of the hydroxyl group of the product.
(I) Microbial conversion of menthol with R. solani can be performed, for example, as follows.
[0020]
First, as a pre-culture, a medium is prepared and sterilized, and then the medium is cooled and the strain is ingested, followed by shaking culture.
[0021]
As the medium, a known medium may be used. For example, Richard's medium (distilled water, 5% (w / v) sucrose, 0.25% (w / v) magnesium sulfate, 1% (w / v) Potassium nitrate, 0.5% (w / v) potassium dihydrogen phosphate, 0.002% (w / v) iron (III) chloride), Czapak-Dox medium (0.2% (w / v) in distilled water) Sodium nitrate, 0.05% (w / v) magnesium sulfate, 0.1% (w / v) dibasic potassium phosphate, 0.05% (w / v) potassium chloride, 0.001% (w / v) ferrous sulfate, 4% (w / v) glucose) and the like. Of these, the Richards medium is preferred.
[0022]
A known method may be used as the sterilization method in the medium, for example, it may be performed at a temperature of 100 to 150 ° C. under a pressure of about 0.01 M to 1 MPa for about 1 minute to 1 hour.
[0023]
Examples of the strain to be used include R. solani AG-1 and the like. More specifically, R. solani AG-1-IA, R. solani AG-1-IB, R. solani AG-1-IC R. solani AG-1-ID and the like. In particular, R. solani AG-1-IC is preferred from the viewpoint of reactivity to menthol, of which R. solani AG-1-IC F-1, R. solani AG-1-IC F-4, R. solani AG -1-IC P-1 and the like are preferable.
[0024]
The intake amount of the strain may be about 1 to 50 mg per 100 ml of the medium, for example.
[0025]
Known conditions may be used for the preculture, for example, it may be performed at a temperature of 100 to 150 ° C. under a pressure of about 0.01 M to 1 MPa for about 1 minute to 1 hour.
[0026]
Next, the separately prepared medium is autoclaved, and after the pre-cultured bacterial solution is added thereto, it is cultured. The culture conditions may be, for example, about 1 minute to 1 hour at a temperature of 100 to 150 ° C. under a pressure of about 0.01 M to 1 MPa. Moreover, it is preferable to use rotation culture.
[0027]
The raw material menthol is added to perform a conversion reaction. Specifically, it is preferable to use l-menthol as a raw material menthol. The addition amount of menthol is preferably about 1 to 50 mg per 100 ml of the medium volume from the viewpoint of menthol conversion efficiency. The conditions for the conversion reaction may be, for example, about 25 to 27 days at a temperature of 25 to 27 ° C. under normal pressure. The time course of the reaction is confirmed by collecting a small amount of the bacterial solution, salting out with NaCl or the like, extracting with an organic solvent (for example, dichloromethane, chloroform) and conducting TLC, GC, GC-MS analysis.
[0028]
The extract obtained by the above conversion reaction is purified by silica gel column chromatography (for example, eluent: n-hexane-ethyl acetate) to obtain compound [Ia]:
[0029]
[Chemical 9]

[0030]
And compound [II-a]:
[0031]
Embedded image

[0032]
Get. Specifically, when l-menthol is used as a raw material, as the compound [Ia], for example, (1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthol is compound [II-a]. For example, (1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthol is obtained.
(Ii) Compound in which R ¹ and / or R ² is an alkanoyl group in the alkanoylated compound [I] of the product hydroxyl group, or a compound in which R ³ and / or R ⁴ is an alkanoyl group in compound [II] Is produced by reacting the compound [Ia] or [II-a] obtained in (i) above with an alkanoyl halide or alkanoic anhydride in a solvent in the presence or absence of a base. Can do.
[0033]
Examples of the solvent include diethyl ether, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform and the like. Examples of the base include triethylamine, pyridine, diisopropylethylamine and the like. A base can also be used as a solvent. The amount of the base used may be a catalytic amount in the case of reaction with an acid anhydride, and in the case of reaction with an alkanoyl halide, for example, 2 to 3 with respect to the compound [Ia] or [II-a]. Any equivalent amount may be used. The reaction temperature may be, for example, about 50 to 120 ° C., and the reaction time may be, for example, about 5 minutes to 1 hour.
[0034]
Examples of the alkanoyl of the alkanoyl halide include linear or branched alkanoyl having 1 to 12 carbon atoms. Preferably, C1-C6 linear or branched lower alkanoyl is mentioned. More preferred are formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, pivaloyl and the like. Of these, acetyl is particularly preferable. Examples of the alkanoyl halide include chloride and bromide.
[0035]
Examples of the alkanoic anhydride include acetic anhydride, propanoic anhydride, n-butanoic anhydride and the like.
[0036]
In the alkanoylation reaction of compound [Ia], among the three hydroxyl groups, the tertiary hydroxyl group at the 8-position is hardly alkanoylated due to the steric hindrance, and either or both of the tertiary hydroxyl groups at the 3-position and the 6-position are selected. Is alkanoylated.
[0037]
When the compounds [I] and [II] of the present invention have an asymmetric carbon on the cyclohexane ring, they may exist as a plurality of stereoisomers (diastereoisomers, optical isomers) based on the asymmetric carbon. The present invention includes any one of these stereoisomers or a mixture thereof.
[0038]
The compounds [I] and [II] of the present invention include both solvates (ethanol, water, etc.) even in a free form.
[0039]
<Uses of Compound [I] and Compound [II]>
Since the compounds [I] and [II] of the present invention exhibit a lytic activity equivalent to or higher than that of 8-hydroxyquinoline copper having a known antibacterial action against pathogenic bacteria (Snow rot fungus: Micronectriella nivalis 305031), Compound [I] and / or [II] can be used as an antibacterial or bactericidal agent.
[0040]
Specifically, the compounds [I] and / or [II] can be used as antibacterial agents or fungicides for human bodies, animals, and fish.
[0041]
The antibacterial or bactericidal agent for the human body, animals and fish of the present invention is composed with a pharmaceutically acceptable carrier for parenteral administration such as injection, rectal and eye drops, or oral administration in solid or liquid form. Can be formulated as a product.
[0042]
Examples of the form of the composition of the present invention as an injection include pharmaceutically acceptable sterile water or non-aqueous solution, suspension or emulsion. Suitable non-aqueous carriers, diluents, solvents or vehicles include, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils (eg olive oil, etc.) and the like. Such a composition may contain an adjuvant, and examples thereof include a preservative, a wetting agent, an emulsifier, and a dispersant. These compositions can be sterilized, for example, by filtration through a bacteria retaining filter, or by mixing sterile water immediately prior to use. As a preparation for ophthalmic administration, for example, a solubilizer, a preservative, an isotonic agent, a thickener and the like may be added.
[0043]
Examples of solid preparations for oral administration include capsules, tablets, pills, powders, granules and the like. This solid preparation can be prepared, for example, by mixing compound [I] and / or [II] with at least one inert diluent (eg, sucrose, lactose, starch, etc.). This preparation may also contain a lubricant (for example, magnesium stearate) and the like in addition to the inert diluent in a normal preparation. In the case of capsules, tablets, or pills, a buffer may be included. These solid preparations can be further provided with an enteric coating.
[0044]
Liquid formulations for oral administration include inert diluents commonly used by those skilled in the art (eg, pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., including water). It may be included. In addition to such inert diluents, auxiliary agents (for example, wetting agents, emulsifying agents, suspending agents, sweetening agents, seasonings, flavoring agents, etc.) can be blended. The preparation for rectal administration may preferably contain an excipient (for example, cacao butter, suppository wax, etc.) and the like in addition to the compounds [I] and / or [II].
[0045]
The dose of the compound [I] and / or [II] of the present invention depends on the properties of the compound to be administered, the route of administration, the desired treatment time, and other factors. 1 to 1000 mg / kg, especially about 0.1 to 100 mg / kg is preferred. If desired, this daily dose can be divided into 2 to 4 doses.
[0046]
Moreover, compound [I] and / or [II] can also be used as an agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide.
[0047]
The agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide of the present invention is, for example, rice blast, sesame leaf blight, seedling blight; wheat red rot, red rust, yellow rust, black rust, udon This disease has a controlling effect on plant diseases such as black spot of sweet potato. In addition, for example, broad bean (such as rust), pea (such as powdery mildew), spinach (such as leaf blight), celery (such as leaf blight), cucumber (such as powdery mildew), strawberry (such as powdery mildew) , Agricultural plants such as hops (gray mold disease, etc.), apples (red star disease, etc.), pears (black star disease, etc.), peaches (black star disease, etc.), oysters (powdery mildew, etc.), roses (powdery mildew, etc.) It is also possible to control various pathogens. The plant pathogens to be controlled are not limited to those exemplified above.
[0048]
Although the compound [I] and / or [II] of the present invention can be used as an agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide by itself, the agricultural antibacterial agent in the form of a composition containing known agricultural chemical adjuvants. It is preferably used as an agent or agricultural fungicide. The form is, for example, emulsions, wettable powders, aqueous solvents, suspensions (flowables), liquids such as oils; solids such as powders, fine granules, granules, tablets, microcapsules; smokes; A composition in the form of a fumigant or the like is preferred. Agrochemical adjuvants can be used, for example, for the purpose of improving effects, stabilizing, improving dispersibility, and the like. Specifically, carriers (diluents), spreading agents, emulsifiers, wetting agents, A dispersing agent, a disintegrating agent, etc. can be mentioned.
[0049]
Examples of the liquid carrier include water, alcohols such as methanol, ethanol, butanol and glycol, ketones such as acetone, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, methylnaphthalene, cyclohexane, animal and vegetable oils, fatty acids and the like.
[0050]
As the solid carrier, for example, clay, kaolin, talc, diatomaceous earth, silica, calcium carbonate, montmorillonite, bentonite, feldspar, quartz, alumina, sawdust, nitrocellulose, starch, gum arabic and the like can be used.
[0051]
As the emulsifier and the dispersant, usual surfactants can be used. For example, spreading agents such as higher alcohol sodium sulfate, stearyltrimethylammonium chloride, polyoxyethylene lauryl ether; polyoxyethylene nonylphenyl ether, dialkyl Wetting agents such as sulfosuccinate; fixing agents such as carboxymethyl cellulose and polyvinyl alcohol; disintegrating agents such as sodium lignin sulfonate and sodium lauryl sulfate can be used.
[0052]
Content of compound [I] and / or [II] mix | blended with an agricultural antibacterial agent or an agricultural fungicide is not specifically limited, The form of an agricultural antibacterial agent or an agricultural fungicide, the objective of use, and use It is possible to select appropriately according to conditions such as the method. For example, powders, wettable powders and emulsifiers can be selected from the range of 0.001 to 20% by weight based on the total weight of the agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide.
[0053]
A person skilled in the art can appropriately select the form, production method, and usage of the agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide based on known methods.
[0054]
The agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide of the present invention is not limited to compounds [I] and / or [II], which are active ingredients, but other fungicides, insecticides, acaricides, herbicides, insect growth preparations. Active ingredients such as fertilizers and soil improvers may be optionally blended.
[0055]
The application target and application form of the agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide of the present invention are not particularly limited. For example, foliage treatment (liquid spraying, powder spraying, haze, etc.), seed treatment (immersion, powder coating, smearing, etc.) ), Soil treatment (powder spraying, irrigation, mixing, fumigation, etc.), water surface application (granule spraying, etc.) and the like. For example, in the case of foliage spraying, a solution of about 1 to 1000 ppm may be used at an application rate of about 10 to 100 L per are, and in the case of water surface application, usually in a granule having an active ingredient of about 1 to 20%, What is necessary is just about 0.1-1 kg per are.
[0056]
Further, the compounds [I] and [II] of the present invention may be used in a concentration range that can be used as antibacterial agents or fungicides for humans, animals, and fish, or concentrations that can be used as agricultural antibacterial agents or agricultural fungicides. In this range, it has the characteristics that it has no adverse effects on the human body, has low toxicity and is highly safe. The compounds [I] and [II] of the present invention are both colorless and have a lower odor than menthol.
[0057]
【Example】
Specific examples (Examples and Experimental Examples) of the present invention are shown below, but the present invention is not limited thereby.
[0058]
Example (1) Pre-culture
In a 500 ml Sakaguchi flask, 200 ml Richard's medium (5% (w / v: (mass g / ml of medium volume)) sucrose in distilled water), 0.25% (w / v) magnesium sulfate, 1% (w / v) Potassium nitrate, 0.5% (w / v) potassium dihydrogen phosphate, 0.002% (w / v) iron (III) chloride) were prepared, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the medium was cooled and about 30 mg of the strain was ingested from the slant, followed by shaking culture at 25 ° C. for 7 days. The strain used was R. solani AG-1-IC F-1 (MAFF305909) or R. solani AG-1-IC F-4 obtained from Dr. Mitsuro Hyakumachi of Gifu University.
(2) Change with time
After adjusting 100 ml of Richards medium in a 200 ml flask, autoclaving was performed, 5 ml of the previously cultured bacterial solution was added, and then rotating culture was performed at 27 ° C. for 7 days. Seven days later, 30 mg of the substrate l-menthol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, followed by a conversion reaction for 5 days. 10 ml of the bacterial solution was collected every day, salted out with NaCl, and the conversion product was extracted with dichloromethane. The extract was analyzed by GC and GC-MS, and the change over time of the conversion product was followed. Fig. 1 (in the case of strain R. solani AG-1-IC F-1) and Fig. 2 (in the case of strain R. solani AG-1-IC F-4) show the time course of each component in the culture solution. Show.
[0059]
Table 1 shows the total amount (%) of the product obtained in the conversion reaction.
[0060]
[Table 1]

[0061]
(3) Mass conversion
Prepare 800ml of Richards medium in a 1L mass culture tank and autoclave. Thereafter, the pre-cultured bacterial solution was added and rotational culture was performed at 27 ° C. for 7 days. Seven days later, 240 mg of the substrate l-menthol was added, and then the conversion reaction was carried out for 5 days. After 5 days, the whole amount of the bacterial solution was collected, salted out with NaCl, and the conversion product was extracted with dichloromethane.
(4) Isolation of conversion product The extract obtained by mass culture was subjected to repeated fractionation by silica gel column chromatography (eluent: n-hexane-ethyl acetate) to obtain the following conversion product. .
[0062]
(−)-(1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthol:
Crystal; [α] _D ²⁵ : -42.0 ° (CHCl ₃ ; c0.4); HR-MS m / z: 172.1465; EI-MS m / z (relative intensity): 154 (15), 139 (48), 121 (13), 111 (15), 97 (40), 95 (17), 83 (33), 69 (37), 67 (10), 55 (67), 43 (100); IRν _max cm ^-1 : 3264, 1450, 1343, 1029; ¹³ C-NMR: δ15.9 (C-9), δ18.1 (C-10), δ20.9 (C-8), δ25.7 (C-7), δ32.4 (C-5), δ38.3 (C-1), δ42.5 (C-2), δ48.5 (C-4), δ70.6 (C-3), δ75.9 (C -6); ¹ H-NMR (500.00MHz, CDCl ₃ , TMS internal standard) δppm: 0.82 (3H, d, J = 7.0Hz), 0.99 (3H, d, J = 7.1Hz), 1.03 (3H, d , J = 7.2Hz), 1.09 (1H, ddd, J = 12.9, 11.3, 11.2Hz), 1.12 (1H, ddd, J = 13.0, 11.1, 10.6Hz), 1.26 (1H, brs), 1.50 (1H, dddd, J = 11.3, 10.5, 4.2, 3.0Hz), 1.61 (1H, dddd, J = 11.1, 11.0, 7.0, 4.0Hz), 1.76 (1H, ddd, J = 12.9, 4.2, 3.9Hz), 1.96 ( 1H, ddd, J = 13.0, 4.0, 3.9Hz), 2.04 (1H, brs), 2.15 (1H, ddd, J = 7.2, 7.1, 3.0Hz), 3.19 (1H, ddd, J = 11.2, 11.0, 3.9 Hz), 3.45 (1H, ddd, J = 10.6, 10.5, 3.8 Hz).
[0063]
(+)-(1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthol:
Oil; [α] _D ²⁵ : + 5.2 ° (CHCl ₃ ; c1.0); HR-MS m / z; 188.1413; EI-MS m / z (relative intensity): 173 (1), 155 (1), 137 (3), 116 (22), 94 (80), 83 (10), 79 (30), 70 (11), 58 (100), 53 (4), 43 (47); IRν _max cm ^-1 : 3332, 1369, 1159, 1022; ¹³ C-NMR: δ17.9 (C-7), δ23.7 (C-9), δ30.1 (C-10), δ36.1 (C-5), δ38.1 (C-1), δ42.2 (C-2), δ51.8 (C-4), δ72.0 (C-3), δ74.8 (C-8), δ75.6 (C -6); ¹ H-NMR (500.00MHz, CDCl ₃ , TMS internal standard) δppm: 0.94 (1H, ddd, J = 13.1, 10.5, 10.4Hz), 1.01 (1H, brs), 1.02 (3H, d, J = 7.0Hz), 1.08 (1H, brs), 1.16 (1H, ddd, J = 13.0, 4.1, 4.0Hz), 1.22 (3H, s), 1.24 (3H, s), 1.41 (1H, dddd, J = 10.2, 10.0, 7.0, 4.0Hz), 1.56 (1H, ddd, J = 10.4, 10.3, 4.2Hz), 1.88 (1H, ddd, J = 13.1, 4.3, 4.2Hz), 1.94 (1H, ddd, J = 13.0, 10.1, 10.0Hz), 2.03 (1H, brs), 3.21 (1H, ddd, J = 10.5, 10.2, 4.3Hz), 3.77 (1H, ddd, J = 10.3, 10.1, 4.1Hz).
(5) Acetylation reaction 28 ml of pyridine and 27 mg of acetyl chloride were added to 30 ml of ethyl acetate solution of 30 mg of (-)-(1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthol obtained in (4) above at room temperature. And stirred at room temperature for 1 hour. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was washed with 5% hydrochloric acid, 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and brine, dried over magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (eluent: n-hexane: ethyl acetate = 1: 1) to give 44.5 mg of (−)-(1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthyl diacetate. Obtained.
Oil; [α] _D ²⁵ : -82.2 ° (CHCl ₃ ; c1.0); EI-MS m / z (relative strength): 154 (3), 136 (30), 121 (21), 107 (5) , 93 (40), 81 (8), 69 (8), 55 (10), 43 (100); IRν _max cm ^-1 : 2359, 2340, 1736, 1457, 1370, 1242, 1026; ¹³ C-NMR : δ16.2 (C-9), δ17.8 (C-10), δ20.5 (C-7), δ21.1 and δ21.2 (CH ₃ CO), δ26.2 (C-8), δ29.0 (C-5), δ35.4 (C-1), δ38.1 (C-2), δ45.2 (C-4), δ77.1 (C-6), δ170.6 and δ170 .8 (CH ₃ CO); ¹ H-NMR (500.00MHz, CDCl ₃ , TMS internal standard) δppm: 0.75 (3H, d, J = 7.1Hz), 0.85 (3H, d, J = 7.0Hz), 0.91 (3H, d, J = 7.2Hz), 1.11 (1H, ddd, J = 12.9, 11.3, 11.2Hz), 1.16 (1H, ddd, J = 13.0, 11.1, 10.6Hz), 1.61 (1H, dddd, J = 11.3, 10.5, 4.2, 3.0Hz), 1.67 (1H, dddd, J = 11.1, 11.0, 7.0, 4.0Hz), 1.86 (1H, ddd, J = 7.2, 7.1, 3.0Hz), 1.92 (1H, ddd , J = 12.9, 4.2, 3.9Hz), 2.02 (1H, ddd, J = 13.0, 4.0, 3.9Hz), 2.04 (3H, s), 2.06 (3H, s), 4.45 (1H, ddd, J = 11.2 , 11.0, 3.9Hz), 4.67 (1H, ddd, J = 10.6, 10.5, 3.8Hz).
[0064]
By treating 30 mg of (+)-(1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthol obtained in (4) in the same manner as above, (−)-(1S, 3R, 4R , 6S) -6,8-dihydroxymenthyl 3,6-diacetate 43.4 mg.
[0065]
Oil; [α] _D ²⁵ : -35.8 ° (CHCl ₃ ; c1.0); EI-MS m / z (relative strength): 197 (1), 152 (2), 138 (1), 134 (6) , 109 (3), 100 (2), 94 (77), 79 (29), 69 (3), 59 (21), 55 (7), 43 (100); IRν _max cm ^-1 : 3472, 1737 , 1457, 1371, 1242, 1114, 1026, 757; ¹³ C-NMR: δ17.7 (C-7), δ21.1 and δ21.5 (CH ₃ CO), δ22.7 (C-9), δ28 .3 (C-10), δ35.3 (C-1), δ36.1 (C-5), δ38.1 (C-2), δ49.6 (C-4), δ72.5 (C- 3), δ74.1 (C-8), 76.5 (C-6), δ170.0 and δ170.7 (CH ₃ CO); ¹ H-NMR (500.00MHz, CDCl ₃ , TMS internal standard) δppm: 0.91 (3H, d, J = 7.0Hz), 1.12 (1H, ddd, J = 13.1, 10.5, 10.4Hz), 1.15 (3H, s), 1.16 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.07 ( 1H, s), 2.11 (1H, ddd, J = 13.1, 4.3, 4.2Hz), 2.16 (1H, ddd, J = 13.0, 10.1, 10.0Hz), 2.52 (1H, brs), 4.46 (1H, ddd, J = 10.5, 10.2, 4.3Hz), 4.84 (1H, dddd, J = 10.3, 10.1, 4.1Hz).
[0066]
Experimental example (lysis activity test)
The pathogen (Snow rot: Micronectriella nivalis 305031) to be tested is preliminarily grown on a PDA (potato dextrose agar) medium at 25 ° C. for 7 days. The tip of the expanded pathogen fungus is punched out with a 3 mm diameter cork borer, and 7 mm square cellophane is laid on a 2% glucose elemental agar medium and placed so that half of the bacterial agar is covered with cellophane (see FIG. 3). ). Thereafter, the mycelium is elongated on cellophane at 25 ° C. for 1 to 2 days (to the extent that there is no hyphal tip from the cellophane).
[0067]
300 μL of sterilized water whose sample concentration has been prepared is put into a multi-dish, and cellophane with elongated mycelia is floated in sterile water and allowed to stand at 3 ° C. for 48 hours. Thereafter, the cellophane is taken out on a slide glass, the cytoplasm of the mycelium is stained with 0.05% Cotton Blue and observed with an optical microscope (see FIG. 4).
[0068]
The evaluation value of the lytic activity was obtained as a lysis rate by fitting the ratio of the three types of mycelial states (no lysis, incomplete lysis, and complete lysis) shown in FIG.
[0069]
[Formula 1]

[0070]
The results of the lytic activity test are shown in Table 2 below.
[0071]
[Table 2]

[0072]
The compounds ((-)-(1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthol, (-)-(1S, 3R, 4S, 6S) -6 obtained in the above-mentioned Examples, which are specific examples of the present invention -Hydroxymenthol diacetate, (+)-(1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthol, (-)-(1S, 3R, 4R, 6S) -6,8-dihydroxymenthol 3,6 -Diacetate) was found to exhibit lytic activity equivalent to or higher than that of 8-hydroxyquinoline copper against pathogenic bacteria (Snow rot: Micronectriella nivalis 305031).
[0073]
【The invention's effect】
By converting 1-menthol using R. solani, (−)-(1S, 3R, 4S, 6S) -6-hydroxymenthol and (+)-(1S, 3R, 4R, 6S) -6, We have found a method for efficiently producing 8-dihydroxymenthol.
[0074]
Compounds [I] and [II] obtained from the above-mentioned bioconversion reaction from l-menthol and optionally obtained by alkanoylation of the hydroxyl group of the product have a high lytic action and are low in toxicity. It can be used as an agent or disinfectant.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the change over time in the relative concentration of a compound produced by microbial conversion of 1-menthol by R. solani AG-1-IC F-1.
FIG. 2 is a graph showing the change over time in the relative concentration of a compound produced by microbial conversion of l-menthol by R. solani AG-1-IC F-4.
FIG. 3 is a schematic view of a 2% glucose elementary agar medium in a lysis activity test.
FIG. 4 is an observation view with an optical microscope when the cytoplasm of the mycelium is stained with 0.05% cotton blue.

Claims (8)

Formula [I]:

(Wherein R ¹ and R ² are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
A compound represented by   The compound according to claim 1, which is a (1S, 3R, 4R, 6S) isomer.   The method for producing a compound according to claim 1, wherein menthol is microbiologically converted with Rhizoctonia solani, and if desired, the hydroxyl group of the product is alkanoylated.   The process according to claim 3, wherein the menthol is l-menthol and the Rhizoctonia solani is Rhizoctonia solani AG-1-IC. Formula [I]:

(Wherein R ¹ and R ² are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
The antibacterial agent or disinfectant which uses the compound shown by this as an active ingredient. Formula [I]:

(Wherein R ¹ and R ² are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
An agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide containing the compound represented by General formula [II]:

(Wherein R ³ and R ⁴ are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
The antibacterial agent or disinfectant which uses the compound shown by this as an active ingredient. General formula [II]:

(Wherein R ³ and R ⁴ are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkanoyl group)
An agricultural antibacterial agent or agricultural fungicide containing the compound represented by

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