JP4339564B2

JP4339564B2 - Antibodies and their uses

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Publication number: JP4339564B2
Application number: JP2002279091A
Authority: JP
Inventors: 寛和松本; 康子堀越; 千恵子北田; 徹也大瀧
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2022-09-25
Also published as: JP2003189854A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに結合特異性を有する抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づく配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法の開発、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体が関与する疾患の診断および予防・治療剤の開発などに有用な抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプターを通じて生体機能を調節している。これらのレセプターの多くは共役しているグアニンヌクレオチド結合性タンパク質（guanine nucleotide-binding protein、以下Ｇタンパク質と略称する）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。Ｇタンパク質共役型レセプターであるガラニン・レセプター・サブタイプ２（ＧＡＬＲ２）に対するペプチド性リガンドとして、ブタ型のリガンド、ヒト型のリガンドおよびラット型のリガンドが取得されており（特許文献１特開２０００−１５７２７３号公報，ＷＯ９９／４８９２０号公報）、これらリガンドを、Galanin-like Peptide（ＧＡＬＰ）と略称することもある（非特許文献１ J. Biol. Chem. 274巻, 37041頁, 1999年）。ＧＡＬＰは、ガラニン・レセプターに結合するガラニンに比べてＧＡＬＲ２に強い親和性を示し、そのレセプターの分布から幅広い生理作用を有することが推測される。ＧＡＬＰの生理的意義についてさらに詳細な研究が必要である。
【特許文献１】
特開２０００−１５７２７３号公報
【非特許文献１】
Journal of Biological Chemistry 274巻, 37041頁, 1999年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＡＬＰを簡便かつ高感度に検出・定量する測定系が切望されていた。
本発明は、ＧＡＬＰまたはその誘導体を感度よく特異的に定量することができる抗体（好ましくはモノクローナル抗体）、該抗体を用いるＧＡＬＰまたはその誘導体の検出・定量法、およびこれを用いた診断薬などを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）を免疫原として、モノクローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせることにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体を高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。即ち、keyhole limpet hemocyanin（キーホール・リンペット・ヘモシアニン、以下ＫＬＨと記載する。）と［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）との複合体を免疫原としてＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端部の部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（例、ＧＲ−１Ｃａ）を得た。これらの抗体は、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化した［Ｃｙｓ⁴³］ラット型（４３−６０）を用いる競合法免疫測定法では、ＧＡＬＰに対して極めて高い親和性を示した。さらに、この抗体と、すでに開発したＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体ＧＲ２−１Ｎａ（特開２０００−１５７２７３号公報）とを組み合わせることにより、ＧＡＬＰに対して極めて高感度なサンドイッチ−免疫測定法を与えることが明らかとなった。本発明により、ＧＡＬＰを簡便にかつ高感度に測定することが可能となり、血液、脳脊髄液および尿などの生体成分中のＧＡＬＰの変動を測定することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体の生理機能の解明に大いに役立つ。
【０００５】
本発明は、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドーマ細胞の製造法、すでに開発したＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（ＧＲ２−１Ｎa）と組み合わせたサンドイッチ法等によるＧＡＬＰおよびその誘導体の免疫測定法等を提供する。
【０００６】
即ち、本発明は、
(１）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
(２）Ｃ端側の部分ペプチドが、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第４４番目〜第５３番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）記載の抗体、
(３）Ｃ端側の部分ペプチドが、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第４０番目〜第６０番目、第４１番目〜第６０番目、第４２番目〜第６０番目、第４３番目〜第６０番目、第４４番目〜第６０番目、第４５番目〜第６０番目、第４６番目〜第６０番目、第４７番目〜第６０番目、第４８番目〜第６０番目、第４９番目〜第６０番目、第５０番目〜第６０番目、第４４番目〜第５４番目、第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番目、第４７番目〜第５４番目、第４８番目〜第５４番目、第４９番目〜第５４番目または第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１）記載の抗体、
(４）標識化された上記（１）記載の抗体、
(５）モノクローナル抗体である上記（１）記載の抗体、
(６）ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭＢＰ−７６８２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ−１Ｃａで標示される上記（５）記載のモノクローナル抗体、
(７）上記（５）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
(８）ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭＢＰ−７６８２）で標示される上記（７）記載のハイブリドーマ細胞、
(９）上記（７）記載のハイブリドーマ細胞を生体内または生体外で培養し、その体液または培養物から上記（５）記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記（５）記載のモノクローナル抗体の製造法、
(１０）上記（１）記載の抗体を含有してなる医薬、
(１１）上記（１）記載の抗体を含有してなる診断薬、
(１２）上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
(１３）上記（１）記載の抗体と配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体とを用いることを特徴とする被検液中の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
(１４）（１）（i）担体上に不溶化した上記（１）記載の抗体、（ii）標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、および（iii）被検液を反応させた後、または（２）（i）担体上に不溶化した配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、（ii）標識化された上記（１）記載の抗体、および（iii）被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する、被検液中の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチまたはその誘導体の定量法、
(１５）（１）（i）担体上に不溶化した上記（６）記載のモノクローナル抗体、（ii）標識化されたＧＲ２−１Ｎ（ＦＥＲＭＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体および（iii）被検液を反応させた後、または（２）（i）担体上に不溶化したＧＲ２−１Ｎ（ＦＥＲＭＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体、（ii）標識化された上記（６）記載のモノクローナル抗体、および（iii）被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する上記（１４）記載の定量法、
(１６）上記（１）記載の抗体、被検液および標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、
(１７）上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体が関与する疾患の診断法、
(１８)上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする肥満症、不妊症、膠原病またはリウマチ性疾患の診断法などに関する。
【０００７】
本明細書におけるタンパク質（ポリペプチド）は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ＧＡＬＰと称することもある。）としては、アミノ酸６０残基からなるラット型、ヒト型、ブタ型のポリペプチドなどが挙げられる（以下、本発明のペプチドと称することもある）。
【０００８】
本発明で用いられるＧＡＬＰの誘導体としては、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が、置換可能な基によって置換されたもの、アミノ酸残基の一部が欠失したもの、アミノ酸残基などが付加・挿入されたものなどが挙げられる。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体の例としては、▲１▼上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個）、より好ましくは、１、２または３個）のアミノ酸が欠失したもの、▲２▼上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、１、２または３個）のアミノ酸が付加したもの、▲３▼上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、１、２または３個）のアミノ酸が挿入されたもの、または▲４▼上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、１、２または３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。
【０００９】
本発明で用いられるＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドまたはＣ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、その一部のアミノ酸残基が欠失したもの、一部のアミノ酸残基が置換可能な基（例、Ｃｙｓ、水酸基など）によって置換されたもの、その一部のアミノ酸残基が欠失し、かつ一部のアミノ酸残基が置換可能な基（例、Ｃｙｓ、水酸基など）によって置換されたものなども挙げられる。
【００１０】
ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドの例としては、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の約４２〜５４残基が欠失したものが挙げられる。
より具体的には、該Ｃ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
（i）第４０番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第４１番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第４２番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第４３番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第４４番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第４５番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第４６番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（viii）第４７番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ix）第４８番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第４９番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xi）第５０番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xii）第４４番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiii）第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiv）第４６番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xv）第４７番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvi）第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvii）第４９番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xviii）第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（xix）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものなどが挙げられる。
【００１１】
ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドの例としては、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の約４０〜５０残基が欠失したものが挙げられる。
Ｎ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
（i）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第１番目〜第５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第１番目〜第６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第１番目〜第７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第１番目〜第９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（vii）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものなどが挙げられる。
【００１２】
本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチド（好ましくは、配列番号：２で表されるペプチドのＣ端側の部分ペプチド）に特異的に反応するものであればよい。このような抗体としては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第４０番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）第４１番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iii）第４２番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第４３番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（v）第４４番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（vi）第４５番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（vii）第４６番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（viii）第４７番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ix）第４８番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（x）第４９番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xi）第５０番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xii）第４４番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xiii）第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xiv）第４６番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xv）第４７番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xvi）第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xvii）第４９番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xviii）第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（xix）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものなどに特異的に反応する抗体が挙げられる。
【００１３】
本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、モノクローナル抗体がより好ましい。より具体的な本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）に特異的に反応する抗体などが挙げられる。なお、［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第４３番目〜第６０番目までのアミノ酸配列であり、かつこのアミノ酸配列の第４３番目をＣｙｓに置き換えたアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このような抗体としては、さらにＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するが、Ｎ端側の部分ペプチドには反応しない抗体がより好ましい。
本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体の例としては、ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭＢＰ−７６８２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体が挙げられる。
このように、本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、上記したＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の特定のアミノ酸配列を認識することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体と反応することができる。
【００１４】
ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよい。このような抗体としては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）第１番目〜第５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iii）第１番目〜第６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第１番目〜第７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（v）第１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（vi）第１番目〜第９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（vii）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものなどに特異的に反応する抗体が挙げられる。本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、モノクローナル抗体がより好ましい。
より具体的な抗体としては、ラット型ＧＡＬＰ（１−９）（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目〜第９番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチド）に特異的に反応する抗体が挙げられる。このような抗体としては、さらにＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するが、Ｃ端側の部分ペプチドには反応しない抗体がより好ましい。ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体の例としては、ＧＲ２−１Ｎ（ＦＥＲＭＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体が挙げられる（特開２０００−１５７２７３）。
このように、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、上記したＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の特定のアミノ酸配列を認識することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体と反応することができる。
【００１５】
以下に、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（以下、本発明の抗体と称することもある）の抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
【００１６】
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えばＧＡＬＰまたはその誘導体、ＧＡＬＰと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する合成ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単にＧＡＬＰ抗原と称することもある）。
ＧＡＬＰまたはその誘導体は、（ａ）ヒト、サル、ラット、マウス、ブタなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、あるいは（ｃ）ＧＡＬＰまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
【００１７】
（ａ）該哺乳動物の組織または細胞からＧＡＬＰ抗原を調製する場合は、その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、得られた抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離し、ＧＡＬＰ抗原を調製できる。
（ｂ）ＧＡＬＰ抗原を化学的に合成する場合に用いられる、合成ペプチドとしては、例えば天然より精製したＧＡＬＰ抗原と同一の構造を有するものや、ＧＡＬＰなどのアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが挙げられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて該ＧＡＬＰまたはその誘導体を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法（例えば、Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など）に従って作成することができる。該クローニング方法とは、（１）ＧＡＬＰまたはその誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該ＧＡＬＰまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または（２）該ＧＡＬＰまたはその誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により該ＧＡＬＰまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
【００１８】
ＧＡＬＰ抗原としてのペプチドは、（１）公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番号１：、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって調製することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチド、またはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の（i）または（ii）に記載された方法等が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１９】
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いて得ることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げるられる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
【００２０】
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、カルボジイミド類が好ましく用いられる。このようなカルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。各種活性化試薬による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。そのような溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒として用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００２１】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ_1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００２２】
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒またはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
【００２３】
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化し、その後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後に、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２４】
ＧＡＬＰ抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、ＧＡＬＰ抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）とＧＡＬＰ抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させたＧＡＬＰ抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で使用することができる。このような高分子担体としては、天然の高分子担体や合成の高分子担体が挙げられる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、ＫＨＬヘモシアニンなどが用いられる。
合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。縮合剤としては、例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ,Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【００２５】
（２）モノクローナル抗体の作製
ＧＡＬＰ抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられる。
【００２６】
モノクローナル抗体の作製に際しては、ＧＡＬＰ抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗ＧＡＬＰ抗体価の測定は、例えば後記の標識化ＧＡＬＰと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられ、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられ、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００２７】
抗ＧＡＬＰ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばＧＡＬＰまたはその誘導体またはそれらの部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＧＡＬＰを加え、固相に結合したＧＡＬＰモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体のスクリーニング、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ＧＡＬＰ抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００２８】
抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法（例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など）に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内または生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、上記の製造法に準じて製造でき、あるいは、公知の方法、例えば特開２０００−１５７２７３号公報に記載の方法に従っても製造できる。
【００２９】
本発明の抗体は、ヒト型ＧＡＬＰ、ラット型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬＰまたはそれらの誘導体を感度良く定量することができる。
以下に、ＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法（免疫測定法）など、本発明の抗体の用途について、詳細に説明する。
（１）ＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法
本発明の抗体を用いることにより、ＧＡＬＰの測定あるいは組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＧＡＬＰ量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製し算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。
このような測定法としては、例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法がより好ましく、特にサンドイッチ法が好ましい。
【００３０】
（１）サンドイッチ法
サンドイッチ法は、担体上に不溶化した本発明の抗体、標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体を定量する定量法である。
サンドイッチ法として、好ましくは、
（i）担体上に不溶化したＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法、
（ii）担体上に不溶化したＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法などが挙げられる。
さらに好ましいサンドイッチ法として、（iii）ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、ＧＲ２−１Ｎａで標示されるモノクローナル抗体であり、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、ＧＲ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体である上記（i）または（ii）の定量法が挙げられる。
【００３１】
サンドイッチ法においては、不溶化したＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体またはＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体に被検液を反応（１次反応）させ、さらに標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体またはＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体を反応（２次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより、被検液中のＧＡＬＰ量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は、前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法によるＧＡＬＰの測定法においては、例えば、１次反応で用いられる抗体がＧＡＬＰまたたその誘導体のＣ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体はＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｎ端側）を認識する抗体が好ましく、１次反応で用いられる抗体がＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体は、Ｎ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｃ端側）を認識する抗体が好ましく用いられる。
このような抗体の具体例としては、［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）を免疫原として作製したモノクローナル抗体と、ＧＡＬＰ（１−９）を免疫原として作製したモノクローナル抗体とが用いられる。これらの抗体は、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識化されて用いられることが好ましい。
【００３２】
（２）競合法
競合法は、本発明の抗体、被検液および標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体の割合を測定することにより、被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体を定量する定量法である。
競合法による被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体を定量は、例えば、固相化法を用いて行うことが好ましい。
固相化法の具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレートに、（i）本発明の抗体（例、ＧＲ−１Ｃａ）、（ii）ＨＲＰで標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるペプチド、および（iii）被検液を添加し、反応後、固相に吸着したＨＲＰ活性を測定し、ＧＡＬＰまたはその誘導体を定量する方法が挙げられる。
【００３３】
（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
【００３４】
（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００３５】
上記（１）〜（４）の定量法において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［¹²⁵Ｉ］、［¹³¹Ｉ］、［³Ｈ］、［¹⁴Ｃ］などが好ましい。上記酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。上記蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが挙げられる。上記発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結合には、ビオチン−アビジン系の化合物を用いることもできる。
【００３６】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
【００３７】
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧＡＬＰまたはその誘導体の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる（例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参照）。以上のように、本発明の抗体は、ＧＡＬＰまたはその誘導体を感度良く定量することができ、ＧＡＬＰの生理機能の解明およびＧＡＬＰが関与する疾患・症状の予防・治療や診断に有用である。
【００３８】
ＧＡＬＰは、血中ＬＨ濃度の特異的な上昇作用（ＬＨ分泌促進作用）を有し、その反応性はレプチンレセプターに異常が見られるZucker fattyラットにおいて亢進する。
本発明の抗体を用いて体液中（血液、血漿、血清、尿など）に含まれるＧＡＬＰまたはその誘導体の量を測定することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関与する疾患〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕などを診断することができる。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＧＡＬＰまたはその誘導体を検出するためにも使用することができる。また、ＧＡＬＰまたはその誘導体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＧＡＬＰまたはその誘導体の検出、被検細胞内におけるＧＡＬＰまたはその誘導体の挙動の分析などのために使用することもできる。
【００３９】
（２）本発明の抗体を含有してなる医薬
上述のとおり、本発明の抗体は、例えば、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関与する疾患〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕などの予防・治療剤または診断剤などの医薬として使用することができる。
【００４０】
本発明の抗体を含有してなる予防・治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して非経口的または経口的に投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil））等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
【００４１】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００４２】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００４３】
本発明の抗体を含有する予防・治療剤または診断剤（医薬）の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人の肥満症の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与（例、皮下投与）および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００４４】
本発明の明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
ＰＡＭ：フェニルアセタミドメチル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
Ｂг−Ｚ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｃｌ−Ｂｚｌ：２−クロロ−ベンジル
ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル
ＯＢｚｌ：ベンジルエステル
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルホニル
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル
Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル
Ｂｕｍ：ｔ−ブトキシメチル
Ｔｒｔ：トリチル
ＤＮＰ：ジニトロフェニル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＭＦ：Ｎ,Ｎ−ジメチルフォルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＣＣ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
ＣＨＯ：ホルミル
Ｇｌｙ：グリシン
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｃｙｓ：システイン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ：リジン
Ａｒｇ：アルギニン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｐｒｏ：プロリン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ｇｌｎ：グルタミン
【００４５】
本明細書において用いられる配列番号は、以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１〕ラット型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：２〕ヒト型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：３〕ブタ型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：４〕免疫原ペプチドのアミノ酸配列（ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）の４３番目のアミノ酸残基をシステインに変えたもの。［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）とも記載する。）を表す。
【００４６】
後述の実施例で得られたハイブリドーマ細胞のうち、ＧＲ−１Ｃは、平成１３（２００１）年７月３１日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６８２として寄託されている。
抗ＧＡＬＰ抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、ＧＲ２−１Ｎは、平成１１（１９９９）年３月１７日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６６８２として寄託されている。
なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に「ａ」を付けた形で表す。
【００４７】
【実施例】
以下に、実験例および実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実験例および実施例で、使用したペプチドである［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）は、アメリカンペプチド社において定法により合成されたものを購入した。
ラット型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬＰは、既報に基づき、リコンビナントＧＡＬＰを作製した（Journal of The Chemical Society-Perkin Transactions、2000年、1号、〜1335頁）。
ヒト型ＧＡＬＰは、PHOENIX PHARMACEUTICALS,INC社より購入した。
【００４８】
実験例１
配列番号：４で表されるラット型ＧＡＬＰ（４４−６０）を含む免疫原［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）の作製
[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)とKLHとの複合体を作製し、免疫原とした。
すなわち、KLH 20 mgを、0.1M リン酸緩衝液（pH6.5）1.4 mlに溶解させ、N-(γ-マレイミドブチリロキシ)サクシニミド（GMBS）2.2 mg（8μmol）を含むDMF溶液100μlと混合し、室温で40分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたKLH 15 mgと[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60) 3.9 mgとを混合し、4℃で1日間反応させた。反応後、生理食塩水に対し、4℃で2日間透析した。
【００４９】
実験例２
免疫
6〜8週令のBALB/C雌マウスに、実験例１で得られた[Cys⁴³]ラット型GALP（43-60）-KLH複合体を、約60μg/匹となるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに2〜3回追加免疫した。
【００５０】
実験例３
西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）の作製
[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)とHRP（酵素免疫測定法用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定法（EIA）の標識体とした。すなわち、HRP 6.7 mg（168nmol）を0.95 mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に溶解させ、GMBS 0.47 mg（1.65μmol）を含むＤＭＦ溶液50μlと混合し、室温で30分間反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マレイミド基の導入されたHRP 5.0 mg（117nmol）と[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60) 0.74 mg（352nmol）とを混合し、4℃で1日反応させた。反応後ウルトロゲルAcA44（LKB-ファルマシア社製）カラムで分画し、HRP標識化ラット型GALP(43-60)を得た。
【００５１】
実験例４
［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を3週間間隔で2回免疫を行い、その1週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を、4℃で12,000rpmで15分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず、抗マウスイムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社製）を100μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むPBSを300μlずつ分注し、4℃で少なくとも24時間処理した。
このようにして得られた抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウェルにバッファーＣ（1％BSA、0.4M NaCl、0.05％ 2mM EDTA・Na（エチレンジアミン四酢酸塩二水和物：Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate, DOJINDO社）を含む0.02Mリン酸緩衝液、pH7.0）50μl、およびバッファーＣで希釈した複合体に対する抗血清100μlを加え、4℃で16時間反応させた。次に、該プレートをPBSで洗浄したのち、実験例３で作製したHRP標識化[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)（バッファーＣで300倍希釈）100μlを加え、室温で1日反応させた。次に、該プレートをPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性をTMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）100μlを加え室温で10分間反応させた。反応を1Mリン酸100μlを加え停止させたのち、450nmの吸収をプレートリーダー（BICHROMATIC、大日本製薬社製）で測定した。
得られた吸収スペクトルを図１に示す。図１中、（−◇−）は、マウスＮｏ．１（１ａ）、（−□−）は、マウスＮｏ．２（２ａ）、（−△−）は、マウスＮｏ．３（３ａ）、（−○−）は、マウスＮｏ．４（４ａ）、（−◆−）は、マウスＮｏ．５（５ａ）、（−■−）は、マウスＮｏ．６（６ａ）、（−▲−）は、マウスＮｏ．７（７ａ）、（−●−）は、マウスＮｏ．８（８ａ）を表す。１ａ〜８ａは、８匹のマウス由来の抗体を表す。図１によれば、免疫した８匹のマウスの全ての複合体に対する抗血清中に［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）に対する抗体価の上昇が認められたことがわかる。
【００５２】
実施例１
抗［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）モノクローナル抗体の作製
図１を参照し、[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマの抗体産生細胞株の選択の例として、抗体6aと抗体7aを与えるマウスNo.6とNo.7を選択した。
抗体6aと抗体7aを与えるマウスに対して100〜150μgの免疫原を生理食塩水0.1 mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫3〜4日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメディウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3-X63.Ag8.U1（P3U1）を用いた（Current Topics in Microbiology and Imnology、81巻、１頁、1978年）。
細胞融合は、原法（Nature、256巻、495頁、1975年）に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ、血清を含有しないMEMで3度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5：1になるよう混合して、800回転で15分間遠心分離を行ない、細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）6000（コッホライト社製）を0.3 ml加え、37℃温水槽中で7分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分2 mlの割合でMEMを添加し、合計15 mlのMEMを加えた後600回転15分間遠心分離して上清を除去した。この細胞沈殿物を10％牛胎児血清を含有するGITメディウム（和光純薬）(GIT-10％ FCS）に、P3U1が1ml当り2×10⁵個になるように浮遊し、24穴マルチディッシュ（リンブロ社製）に1ウェルあたり1 mlずつ192ウェルに播種した。播種後、細胞を37℃、5％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。24時間後、HAT（ヒポキサンチン 1×10^-4M、アミノプテリン 4×10^-7M、チミジン 1.6×10^-3M）を含んだGIT-10％ FCS培地（HAT培地）を1ウェル当り1 mlずつ添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択培養は、培養開始3、6および9日後に旧液を1 ml捨てた後、1 mlのHAT培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後9〜14日で認められ、培養液が黄変したとき（約1×10⁶セル/ml）、上清を採取し、実験例４に記載の方法に従って抗体価を測定した。
抗体6aと抗体7aを与える[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマが、抗体を産生している状態を図２に示した。得られた抗体産生ハイブリドーマの中から下記の計５種類のハイブリドーマを選択した（表１）。これらのうちでも、特に大きな抗体価を与えた（吸光度が大きかった）ハイブリードーマNo.1およびNo.2を、それぞれGR-1CおよびGR-2Cと命名した。
【００５３】
【表１】

【００５４】
次に、これらのハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。クローニングに際しては、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウェル当り5×10⁵個になるように加えた。クローニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル0.5 mlを腹腔内投与されたマウス（BALB/C）に1〜3×10⁶セル/匹を腹腔内投与したのち、6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。
モノクローナル抗体は、得られた腹水よりプロテイン−Ａカラムにより精製した。即ち、腹水6〜20 mlを等量の結合緩衝液〔3.5M NaCl、0.05％ NaN₃を含む1.5Mグリシン（pH9.0）〕で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したプロテイン−Ａ−アガロース（生化学工業社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液〔（0.05％ NaN₃を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）〕で溶出した。溶出液をPBSに対して4℃、2日間透析したのち、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し、4℃あるいは-80℃で保存した。
モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定に際しては、精製モノクローナル抗体結合固相を用いる酵素標識免疫測定法（エンザイム−リンクトイムノソーベントアッセイ：ELISA）を行った。すなわち、抗体2μg/mlを含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。実験例４に記載の方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mouse-Typer^TM Sub-Isotyping Kit、バイオラッド社製）を用いるELISAによって固相化抗体のクラス、サブクラスを調べた。
【００５５】
実施例２
競合法酵素免疫測定法（競合法−ＥＩＡ）
[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を免疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法により調べた。
まず、モノクローナル抗体GR-1CaおよびGR-2Ca溶液の抗体価を実験例４記載の方法により調べ、競合法-EIAに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約50％となる抗体濃度を決定した。次に、実験例４記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、（i）80 ng/mlにバッファーＣで希釈された抗[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)抗体GR-1Ca溶液またはGR-2Ca溶液50 μl、および（ii）実験例３記載HRP標識[Cys⁴³]ラット型GALP(43-60)をバッファーＣで400倍希釈した溶液50μlを加えたウェルに、バッファーＣで希釈した濃度が10^-6M〜10^-10Mのラット型GALP、ヒト型GALPまたはブタ型GALP溶液50μlを加え、4℃で16時間反応させた。反応後、PBSで洗浄したのち抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート上の酵素活性を、実験例４記載の方法により測定した。
【００５６】
GR-1CaおよびGR-2Caの競合法の結果をそれぞれ図３および図４に示す。
図３、図４中、（−●−）は、ヒト型ＧＡＬＰに対する反応を表し、（−○−）は、ラット型ＧＡＬＰに対する反応を表し、（−●−）はブタ型ＧＡＬＰに対する反応を表す。これより、両抗体とも、ラット型ＧＡＬＰ、ヒト型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬＰに対して反応性を有することがわかる。
GR-1Caの標準曲線から、（B/B₀）=0.5を与えるGALP濃度は、ラット型GALP：3nM、ヒト型GALP：7nM、ブタ型GALP：8nMであることが分かった（図３）。これらの結果から、GR-1Caは、ラット型、ヒト型およびブタ型のいずれのGALPに対しても、ほぼ同定度の高い反応性を示しているものと考えられる。
また、GR-2Caの標準曲線から、（B/B₀）=0.5を与えるGALP濃度は、ラット型GALP：10nM、ヒト型GALP：20nM、ブタ型GALP：500nMであることが分かった（図４）。これらの結果から、GR-2Caは、ラット型GALPとヒト型GALPに対しての反応性は、ほぼ同程度であるが、ブタ型GALPに対しての反応性は弱いものと考えられる。
【００５７】
実験例５
ＨＲＰ標識化抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体（ＧＲ２−１Ｎａ−ＨＲＰ）の作製
特開2000-157273号公報記載のGALPのN端部（1-9）を認識するモノクローナル抗体GR2-1N精製画分9.25 mg（61.7nmol）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に、GMBS 0.74μmolを含むDMF 50μlを加え、室温で40分反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液、0.1Mリン酸緩衝液、pH6.7）で分離し、マレイミド基の導入された抗体画分7.17 mgを得た。次に、HRP 17.8 mg（445nmol）を含む0.02Mリン酸緩衝液（0.15M NaClも含む）（pH6.8）1.4 mlに、N-スクシニミジル-3-(2-ピリミジルジチオ)プロピオネート(SPDP)6.67μmolを含むDMF60μlを加え、室温で40分反応させた。次に、66μmolのジチオスレイトールを含む0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）0.4 mlを加え、室温で20分反応させた後、セファデックスＧ−２５カラム（溶離液、2 mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0）で分離し、SH基の導入されたHRP 9.8 mgを得た。次に、SH基の導入されたHRP 8 mgとマレイミド基の導入された抗体画分3 mgとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリウス社製）で約0.5 mlにまで濃縮したのち、4℃で16時間放置した。反応液を溶離液に0.1Mリン酸緩衝液、pH6.5を用いるSephacrylS-300HRカラム（Pharmacia社製）に供し、GR2-1Na-HRP複合体画分を精製した。
【００５８】
実施例３
サンドイッチ法−ＥＩＡ（サンドイッチ法−ＥＩＡの特異性と感度）
実施例１で得られた精製したモノクローナル抗体GR-1Caを15μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6溶液）を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。ウェルの余剰の結合部位をPBSで4倍希釈したブロックエース400μlを加え不活化した。
上記調製済みプレートに、バッファーＣで希釈したラット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ型GALPをそれぞれ100μlずつ加え、4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、実験例５で作製したGR2-1Na-HRP（バッファーＣで2,000倍希釈）100μlを加え、4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、実験例４記載の方法によりTMBを用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応20分）。
結果を図５に示す。
図５中、（−●−）は、ラット型ＧＡＬＰの吸収を表し、（−■−）は、ヒト型ＧＡＬＰの吸収を表し、（−▲−）は、ブタ型ＧＡＬＰの吸収を表す。図５から、本サンドイッチ法−ＥＩＡにより、極めて高感度にラット型ＧＡＬＰ、ヒト型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬＰを検出できることがわかった。
すなわち、このサンドイッチ法-EIAは、ラット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ型GALPを0.3fmol/ウェルで検出することが可能である。
したがって、例として、固相抗体としてGR-1Caを用い、標識体としてGR-1Na-HRPを用いるサンドイッチ法-EIAは、ラット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ型GALPを極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが可能であることがわかった。
【００５９】
実施例４
血漿中のラット型ＧＡＬＰの定量
ラット血漿を、同量のバッファーＥＣ（0.2％ BSA、0.4M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0）で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EIAによりラット型GALPを定量した。
結果を表２に示す。
【００６０】
【表２】

【００６１】
実施例５
ラット血漿中のＧＡＬＰの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分画
実施例４に記載の、ラット血漿中に含まれるＧＡＬＰ免疫活性を同定するため、ラット血漿12 mlにアセトニトリルを24 ml添加して混和後、遠心分離（2,500rpm，15分）を行い、タンパク質の除去を行った。上清を凍結乾燥後、この画分を濃縮後ODS-80TMを用いる逆相HPLCによって分画した。
カラム条件：
カラム：ODS-80TM（4.6 x 250 mm）
溶離液：Ａ液（0.05％トリフルオロ酢酸含有 5％アセトニトリル）
Ｂ液（0.05％トリフルオロ酢酸含有 60％アセトニトリル）
溶出方法：アセトニトリル濃度を最初の5分間に5％から30％まで上昇させ、次に30分間かけて30-50％に直線的に上昇させた。
流速：1.0 ml/分
分画：0.5 ml/tube
溶出画分を凍結乾燥したのち、250μlのバッファーＣに溶解させ、実施例３記載のサンドイッチ法-EIAに供した。
結果を図６に示す。
血漿中のラット型GALP免疫活性は、ほとんどラット型GALPの溶出位置に検出されたことから、該サンドイッチ法-EIAが、ラット型GALPを検出していることが確認された。
【００６２】
実施例６
血漿中のヒトＧＡＬＰの定量
ヒト血漿を、同量のバッファーＥＣ〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0〕で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EIAによりヒト血漿中のGALPを定量した。ヒト血漿は、武田薬品工業（株）の健常人ボランティアより提供されたものを使用し、インフォームドコンセントの確認を得たものである。
結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】

【００６４】
これより、この測定系は、血漿中のGALPの変動を研究する際の重要な手段となることがわかる。
【００６５】
実施例７
慢性炎症モデルであるアジュバンド関節炎ラットでのＧＡＬＰの定量
雄性Lewis ラット（7週齢、日本チャールズリバー）の左後肢に0.05 mlの流動パラフィンに懸濁した結核死菌（Mycobacterium tuberculosis (H37 RA, Difco)）250μgを皮内投与し感作した(A.A.群)。Vehicle群は、流動パラフィンを0.05 ml投与した。実験数はいずれも7例で行った。投与前および投与15日目にアジュバント感作ラットのアジュバンド非注射側後肢（右後肢）の足容積および非感作ラットの右後肢の足容積を測定した。投与24時間後および投与14日目にラットを断頭した。得られた血液より血漿を調製し、ラット血漿を、同量のバッファーＥＣ〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0〕で２倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法−ＥＩＡによりラット型ＧＡＬＰを定量した。
血中ＧＡＬＰ濃度を以下に示す。
アジュバンド感作24時間後は、vehicle群；10.1 ± 3.1 fmol/ml、A.A.群；4.5 ± 0.6 fmol/ml、アジュバンド感作14日後は、vehicle群；15.1 ± 3.5 fmol/ml、A.A.群；3.4 ± 0.4 fmol/mlであった。アジュバンド感作24時間および14日後のいずれも血中ＧＡＬＰ濃度は、vehicle群に比較して有意（p<0.05）に低下した。
これより、GALPがアジュバンド関節炎のマーカーとなり得ることがわかる。さらに、関節炎の発症により血中GALPが消費されていることもわかる。
また、下垂体を採取し5mlの蒸留水中にて10分間煮沸後氷中で冷却し、酢酸およびペプスタチン（ペプチド研究所）を添加して最終濃度をそれぞれ１Mおよび10μg/mlとした。ホモジナイザーにて下垂体を破砕後、溶液中のタンパク濃度をProtein assay kit(Bio Rad社)にて測定した。下垂体破砕溶液は、12,000 rpmで30分間遠心し、その上清をSep-Pak Plus C18カートリッジ265mg（Waters社製）で濃縮・前処理した後、ラット型GALPを上記実施例３記載サンドイッチ−EIAにより定量した。下垂体抽出液の前処理方法は、メタノール5 mlおよび0.1％ TFA含有蒸留水5mlを順次ながして活性化したSep-Pak Plus C18カートリッジに2mlの4％酢酸を添加した下垂体抽出液を負荷した。添加後、5 mlの0.1％ TFA含有蒸留水で洗浄後、0.1％ TFA含有60％アセトニトリル 3 mlで溶出し、凍結乾燥した。濃縮画分を0.25 mlのバッファーＥＣ中で再構成し、上記実施例３のサンドイッチ法-EIAにより定量した。
下垂体中のGALP含量を以下に示す。
アジュバンド感作24時間後は、vehicle群；3.1 ± 0.3 fmol/mg protein、A.A.群；4.9 ± 0.7 fmol/mg protein、アジュバンド感作14日後は、vehicle群；1.6 ± 0.2 fmol/mg protein、A.A.群；2.8 ± 0.3 fmol/mg proteinであった。アジュバンド感作24時間および14日後のいずれにおいても下垂体GALP含量は、vehicle群に比較して有意（p<0.01）に増加した。
これより、ＧＡＬＰが関節炎の発症を抑制する目的で、下垂体での産生が促進されていることがわかる。
【００６６】
実施例８
リポポリサッカリド投与ラットでのＧＡＬＰの定量
雄性Wistatラット（8週齢、日本チャールズリバー）の腹腔内に生理食塩水に溶解したリポポリサッカライド(LPS)（和光純薬）を1、3および10 mg/kg投与した（LPS群, n=5-7）。Vehicle群（n=8）は、生理食塩水を1 ml/kgで投与した。投与12時間後に断頭採血し得られた血液より血漿を調製した。血漿を、同量のバッファーＥＣ〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0〕で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EIAによりラット型GALPを定量した。
血中ＧＡＬＰ濃度の結果を図７に示す。
Vehicle群(12.0 ± 2.0 fmol/ml)に比較してLPS 3 mg/kg投与群で最も高値（251 ± 181 fmol/ml）を示し、有意な差ではないが高値を示した。
また、下垂体を採取し、上記実施例７と同様の方法で下垂体中のGALP濃度を測定した。
結果を図８に示す。
血中GALP濃度と同様に、LPS 3 mg/kg投与群で最も高値（8.39 ± 1.37 fmol/mg protein）を示し、vehicle群（2.82 ± 0.48 fmol/ mg protein）に比較して有意に高値（p<0.01）を示した。
これより、GALPがエンドトキシン刺激によりサイトカイン類と同様にその産生が亢進される因子であることがわかる。GALPはサイトカイン類の産生調節に関する因子であると考えられる。
【００６７】
実施例９
絶水負荷時の下垂体ＧＡＬＰ濃度の定量
雄性Wistatラット（8週齢、日本チャールズリバー）を絶水条件下で2、4および7日間飼育し、断頭後下垂体後葉を摘出し、下垂体を採取し、上記実施例７と同様の方法で下垂体中のGALP濃度を測定した。
結果を図９に示す。
絶水４日目（28.7 ± 2.29 fmol/mg protein）および７日目（43.8 ± 10.7 fmol/mg protein）で自由摂水群（3.93 ± 0.75 fmol/mg protein）に比較して有意に増加した。
これより、臓器中のＧＡＬＰの濃度変動も、本発明の抗体を用いて高感度に測定できることがわかる。さらに、GALPは、生体内の水分および浸透圧調節に関与する因子であることもわかる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の抗体は、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関与する疾患等の治療剤、予防剤、診断剤の開発に有用である。本発明の抗体を含むハイブリドーマ細胞を用いることにより、本発明の抗体は工業的に生産することが可能である。また、本発明の抗体を含有してなる医薬（特に診断薬）は、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関与する疾患・症状〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕の診断等に有用である。また、本発明の抗体を用いることにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体の量を高い感度で測定することができる。このため、本発明の定量法は、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関与する疾患・症状〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕の診断、予防または治療に有用である。
【００６９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定結果を表す。
【図２】［Ｃｙｓ⁴³］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。
【図３】ＧＲ−１Ｃaの競合法−ＥＩＡの結果を表す。
【図４】ＧＲ−２Ｃaの競合法−ＥＩＡの結果を表す。
【図５】ＧＲ−１Ｃａのサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結果を表す。
【図６】ラット血漿のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結果を表す。
【図７】実施例８のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。
【図８】実施例８のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。＊＊；ｐ＜＝０．０１
【図９】実施例９のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。＊＊；ｐ＜＝０．０１[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antibody having binding specificity for a C-terminal partial peptide of a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or a derivative thereof. More specifically, development of a method for quantifying a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 based on an antigen-antibody reaction or a derivative thereof, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: The present invention relates to an antibody useful for diagnosis of a disease associated with a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof and development of a preventive / therapeutic agent.
[0002]
[Prior art]
Many hormones and neurotransmitters regulate biological functions through specific receptors present on cell membranes. Many of these receptors perform intracellular signal transduction through activation of a conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter abbreviated as G protein). As a peptide ligand for galanin receptor subtype 2 (GALR2), which is a G protein-coupled receptor, a pig type ligand, a human type ligand and a rat type ligand have been obtained (Patent Document 1) 157273, WO 99/48920) and these ligands may be abbreviated as Galanin-like Peptide (GALP) (Non-patent Document 1 J. Biol. Chem. 274, 37041, 1999). GALP has a stronger affinity for GALR2 than galanin that binds to the galanin receptor, and is presumed to have a wide range of physiological effects from the distribution of the receptor. More detailed research is needed on the physiological significance of GALP.
[Patent Document 1]
JP 2000-157273 A
[Non-Patent Document 1]
Journal of Biological Chemistry 274, 37041, 1999
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
A measurement system for detecting and quantifying GALP simply and with high sensitivity has been desired.
The present invention relates to an antibody (preferably a monoclonal antibody) capable of quantifying GALP or a derivative thereof with high sensitivity, a method for detecting and quantifying GALP or a derivative thereof using the antibody, a diagnostic agent using the same, and the like. The purpose is to provide.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and as a result, [Cys ⁴³ An immunoassay that can detect GALP or its derivatives with high sensitivity and specificity by developing a plurality of monoclonal antibodies using rat GALP (43-60) as an immunogen and combining them was developed. That is, keyhole limpet hemocyanin (hereinafter referred to as KLH) and [Cys ⁴³ Using a complex with rat GALP (43-60) as an immunogen, a monoclonal antibody (eg, GR-1Ca) that recognizes a partial peptide at the C-terminus of GALP or a derivative thereof was obtained. These antibodies were peroxidase (HRP) labeled [Cys. ⁴³ The competitive immunoassay using the rat type (43-60) showed very high affinity for GALP. Furthermore, by combining this antibody with an antibody GR2-1Na (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-157273) that specifically reacts with the already developed GALP or its partial peptide on the N-terminal side of its derivative, It has been shown to provide a highly sensitive sandwich-immunoassay. The present invention makes it possible to measure GALP easily and with high sensitivity, and elucidation of the physiological function of GALP or its derivatives by measuring changes in GALP in biological components such as blood, cerebrospinal fluid and urine. Greatly help.
[0005]
The present invention relates to an antibody (preferably a monoclonal antibody) that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof, a hybridoma cell that produces the monoclonal antibody, a method for producing the antibody and the hybridoma cell, An immunoassay method for GALP and its derivatives by a sandwich method combined with an antibody (GR2-1Na) specifically reacting with a partial peptide on the N-terminal side of the GALP or its derivative is provided.
[0006]
That is, the present invention
(1) an antibody that specifically reacts with a C-terminal partial peptide of a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a derivative thereof,
(2) The above-mentioned (1), wherein the C-terminal partial peptide is a peptide having the 44th to 53rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. ) The antibody described,
(3) The partial peptide on the C-terminal side is 40th to 60th, 41st to 60th, 42nd of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. Th to 60th, 43rd to 60th, 44th to 60th, 45th to 60th, 46th to 60th, 47th to 60th, 48th to 48th 60th, 49th to 60th, 50th to 60th, 44th to 54th, 45th to 54th, 46th to 54th, 47th to 54th The antibody according to (1) above, which is a polypeptide having the amino acid sequence of the 48th, 48th to 54th, 49th to 54th, or 50th to 54th amino acid sequence,
(4) the labeled antibody according to (1),
(5) The antibody according to (1), which is a monoclonal antibody,
(6) The monoclonal antibody according to (5) above, which is indicated by GR-1Ca that can be produced from a hybridoma cell indicated by GR-1C (FERM BP-7682),
(7) a hybridoma cell that produces the monoclonal antibody according to (5) above,
(8) The hybridoma cell according to (7), which is indicated by GR-1C (FERM BP-7682),
(9) The monoclonal antibody according to (5), wherein the hybridoma cell according to (7) is cultured in vivo or in vitro, and the monoclonal antibody according to (5) is collected from the body fluid or culture. Antibody production methods,
(10) A medicament comprising the antibody according to (1) above,
(11) a diagnostic agent comprising the antibody according to (1) above,
(12) A method for quantifying a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a derivative thereof, characterized by using the antibody according to (1) above,
(13) Reacts specifically with the antibody described in (1) above and the N-terminal partial peptide of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof A method for quantifying a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof in a test solution,
(14) (1) (i) the antibody according to (1) above insolubilized on a carrier, (ii) the labeled amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. An antibody that reacts specifically with the N-terminal partial peptide of the polypeptide or derivative thereof, and (iii) after reacting the test solution or (2) (i) insolubilized on the carrier SEQ ID NO: 1 , An antibody that specifically reacts with the N-terminal partial peptide of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof, and (ii) the labeled (1) description And (iii) after reacting the test solution, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured, represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 in the test solution. Of polypeptides having a specific amino acid sequence or derivatives thereof Law,
(15) (1) (i) the monoclonal antibody described in (6) above insolubilized on a carrier, (ii) GR2 that can be produced from a hybridoma cell labeled with labeled GR2-1N (FERM BP-6682) Produced after reacting a monoclonal antibody labeled with -1Na and (iii) a test solution, or (2) (i) a hybridoma cell labeled with GR2-1N (FERM BP-6682) insolubilized on a carrier After reacting the monoclonal antibody labeled with GR2-1Na, (ii) the labeled monoclonal antibody described in (6), and (iii) the test solution, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. The quantitative method described in (14) above,
(16) Competitively compete with the antibody according to (1), the test solution, and the labeled polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof And the ratio of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof bound to the antibody is measured. A method for quantifying a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof in a test solution,
(17) Diagnosis of a disease involving a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a derivative thereof, characterized by using the antibody described in (1) above Law,
(18) The present invention relates to a diagnostic method for obesity, infertility, collagen disease or rheumatic disease, characterized by using the antibody described in (1) above.
[0007]
In the present specification, the protein (polypeptide) has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation.
The protein used in the present invention, including the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, is any of carboxyl group, carboxylate, amide or ester at the C-terminus. It may be.
Examples of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 (hereinafter sometimes referred to as GALP) include rat type, human type consisting of 60 amino acids, Examples include porcine polypeptides (hereinafter sometimes referred to as peptides of the present invention).
[0008]
As a derivative of GALP used in the present invention, for example, some amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 are substituted with a substitutable group. And those in which a part of the amino acid residue is deleted or those in which an amino acid residue is added or inserted.
Examples of the derivative of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 are: (1) one or more of the above amino acid sequences (preferably 1 to About 10 amino acids, more preferably several (1-5), more preferably 1, 2 or 3 amino acids deleted; (2) one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5), more preferably 1, 2 or 3 amino acids added, (3) above 1 or 2 or more amino acid sequences (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5), still more preferably 1, 2 or 3) With inserted amino acid Or (4) one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5), still more preferably 1, 2 or 3) amino acids in the above amino acid sequence Those substituted with other amino acids are mentioned.
[0009]
As the partial peptide on the N-terminal side or the partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof used in the present invention, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 In which a part of the amino acid residues is deleted, part of the amino acid residues is replaced by a substitutable group (eg, Cys, hydroxyl group, etc.), part of the amino acid residues is deleted And those in which some of the amino acid residues are substituted with groups that can be substituted (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
[0010]
Examples of the partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof include those in which about 42 to 54 residues on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof are deleted.
More specifically, the partial peptide on the C-terminal side is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
(I) a polypeptide having the 40th to 60th amino acid sequence,
(Ii) a polypeptide having the 41st to 60th amino acid sequence,
(Iii) a polypeptide having the 42nd to 60th amino acid sequence,
(Iv) a polypeptide having the 43rd to 60th amino acid sequence,
(V) a polypeptide having the 44th to 60th amino acid sequence,
(Vi) a polypeptide having the 45th to 60th amino acid sequence,
(Vii) a polypeptide having the 46th to 60th amino acid sequence,
(Viii) a polypeptide having the 47th to 60th amino acid sequence,
(Ix) a polypeptide having the 48th to 60th amino acid sequence,
(X) a polypeptide having the 49th to 60th amino acid sequence,
(Xi) a polypeptide having the 50th to 60th amino acid sequence,
(Xii) a polypeptide having the 44th to 54th amino acid sequence,
(Xiii) a polypeptide having the 45th to 54th amino acid sequence,
(Xiv) a polypeptide having the 46th to 54th amino acid sequence,
(Xv) a polypeptide having the 47th to 54th amino acid sequence,
(Xvi) a polypeptide having the 48th to 54th amino acid sequence,
(Xvii) a polypeptide having the 49th to 54th amino acid sequence,
(Xviii) a polypeptide having the 50th to 54th amino acid sequence, and
(Xix) Those in which some amino acid residues (for example, one) of these polypeptides are substituted with substitutable groups.
[0011]
Examples of the partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof include those obtained by deleting approximately 40 to 50 residues on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof.
The N-terminal partial peptide is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
(I) a polypeptide having the first to fourth amino acid sequences,
(Ii) a polypeptide having the first to fifth amino acid sequences,
(Iii) a polypeptide having the first to sixth amino acid sequences,
(Iv) a polypeptide having the first to seventh amino acid sequences,
(V) a polypeptide having the first to eighth amino acid sequences,
(Vi) a polypeptide having the first to ninth amino acid sequences, and
(Vii) Those in which some of the amino acid residues (eg, one) of these polypeptides are substituted with a substitutable group.
[0012]
The antibody specifically reacting with the partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof of the present invention is a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof (preferably, the C-terminal of the peptide represented by SEQ ID NO: 2). Any peptide that specifically reacts with the partial peptide on the side may be used. Examples of such antibodies include (i) a polypeptide having the 40th to 60th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, (ii) A polypeptide having the 41st to 60th amino acid sequence, (iii) a polypeptide having the 42nd to 60th amino acid sequence, (iv) a polypeptide having the 43rd to 60th amino acid sequence, (V) a polypeptide having the 44th to 60th amino acid sequence, (vi) a polypeptide having the 45th to 60th amino acid sequence, and (vii) a 46th to 60th amino acid sequence. (Viii) a polypeptide having the 47th to 60th amino acid sequence, (ix) a polypeptide having the 48th to 60th amino acid sequence, (x A polypeptide having the 49th to 60th amino acid sequence, (xi) a polypeptide having the 50th to 60th amino acid sequence, and (xii) a polypeptide having the 44th to 54th amino acid sequence (Xiii) a polypeptide having the 45th to 54th amino acid sequence, (xiv) a polypeptide having the 46th to 54th amino acid sequence, (xv) the 47th to 54th amino acid sequence (Xvi) a polypeptide having the 48th to 54th amino acid sequence, (xvii) a polypeptide having the 49th to 54th amino acid sequence, (xviii) the 50th to 54th amino acid A polypeptide having the second amino acid sequence, and (xix) some amino acid residues (eg, one) of these polypeptides are replaced by substitutable groups An antibody that specifically reacts with the above.
[0013]
As the antibody that specifically reacts with the partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof of the present invention, a monoclonal antibody is more preferable. As an antibody specifically reacting with the partial peptide on the C-terminal side of GALP of the present invention or a derivative thereof, [Cys ⁴³ And the like which specifically react with rat-type GALP (43-60). In addition, [Cys ⁴³ Rat type GALP (43-60) is the amino acid sequence from the 43rd to the 60th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence in which the 43rd amino acid sequence is replaced with Cys. It means a polypeptide having a sequence. As such an antibody, an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof but does not react with a partial peptide on the N-terminal side is more preferable.
As an example of an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of GALP of the present invention or a derivative thereof, labeled with GR-1Ca that can be produced from a hybridoma cell labeled with GR-1C (FERM BP-7682) And monoclonal antibodies.
Thus, an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof of the present invention recognizes a specific amino acid sequence on the C-terminal side of the above-mentioned GALP or a derivative thereof, thereby allowing GALP or Can react with its derivatives.
[0014]
The antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof may be any antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof. Examples of such antibodies include (i) a polypeptide having the first to fourth amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, (ii) A polypeptide having the first to fifth amino acid sequences, (iii) a polypeptide having the first to sixth amino acid sequences, (iv) a polypeptide having the first to seventh amino acid sequences, (V) a polypeptide having the first to eighth amino acid sequences, (vi) a polypeptide having the first to ninth amino acid sequences, and (vii) a partial amino acid residue of these polypeptides. An antibody that specifically reacts with a group (eg, one) substituted with a substitutable group. As the antibody specifically reacting with the partial peptide on the N-terminal side of the GALP of the present invention or a derivative thereof, a monoclonal antibody is more preferable.
As a more specific antibody, it specifically reacts with rat GALP (1-9) (polypeptide having the first to ninth amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). An antibody is mentioned. As such an antibody, an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof but does not react with a partial peptide on the C-terminal side is more preferable. As an example of an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof, a monoclonal antibody labeled with GR2-1Na that can be produced from a hybridoma cell labeled with GR2-1N (FERM BP-6682) An antibody is mentioned (Unexamined-Japanese-Patent No. 2000-157273).
Thus, an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof recognizes a specific amino acid sequence on the N-terminal side of the above-described GALP or a derivative thereof, thereby Can react.
[0015]
Hereinafter, a method for preparing an antigen of an antibody (hereinafter also referred to as the antibody of the present invention) that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof, and a method for producing the antibody will be described.
[0016]
(1) Preparation of antigen
As the antigen used for preparing the antibody of the present invention, any of, for example, GALP or a derivative thereof, a synthetic peptide having one or more antigen determinants identical to GALP can be used ( Hereinafter, these may be simply referred to as GALP antigen).
GALP or a derivative thereof is (a) prepared from a tissue or cell of a mammal such as a human, monkey, rat, mouse, or pig using a known method or a method equivalent thereto, and (b) a known using a peptide synthesizer, etc. (C) It can be produced by culturing a transformant containing DNA encoding GALP or a derivative thereof.
[0017]
(A) When preparing a GALP antigen from a tissue or cell of the mammal, the tissue or cell is homogenized and then extracted with an acid or alcohol, and the resulting extract is subjected to salting out, dialysis, The GALP antigen can be prepared by purification and isolation by combining chromatography such as gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography.
(B) The synthetic peptide used when chemically synthesizing the GALP antigen is, for example, one having the same structure as the GALP antigen purified from nature, or 3 or more, preferably 6 in the amino acid sequence such as GALP. Examples thereof include peptides containing one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at any location consisting of one or more amino acids.
(C) When the GALP or a derivative thereof is produced using a transformant containing DNA, the DNA can be obtained by a known cloning method (for example, Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring The method described in Harbor Lab. Press, 1989) can be used. The cloning method includes (1) transformation containing a DNA probe or DNA primer designed based on the amino acid sequence of GALP or a derivative thereof and DNA encoding the GALP or a derivative thereof from a cDNA library by a hybridization method. Or (2) a method for obtaining a transformant containing DNA encoding the GALP or derivative thereof by PCR using a DNA primer designed based on the amino acid sequence of the GALP or derivative thereof. It is done.
[0018]
A peptide as a GALP antigen is (1) according to a known peptide synthesis method, or (2) a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 with an appropriate peptidase. It can be prepared by cutting.
As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the peptide of interest can be produced by condensing a partial peptide that can constitute the peptide, or an amino acid and the remaining part, and removing the protective group when the product has a protective group. Examples of known condensation methods and removal of protecting groups include the methods described in (i) or (ii) below.
(I) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(Ii) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
Further, after the reaction, the peptide can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method. .
[0019]
Peptide amides can be obtained using a commercially available peptide synthesis resin suitable for amide formation. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target peptide. At the end of the reaction, the peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide. Alternatively, a partially protected peptide can be taken out using chlorotrityl resin, oxime resin, 4-hydroxybenzoic acid resin, and the like, and the protective group can be removed by conventional means to obtain the target peptide.
[0020]
For the above-described condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are preferably used. Examples of such carbodiimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like. For activation with various activating reagents, a protected amino acid together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt, etc.) can be added directly to the resin, or it can be pre-protected as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOBt ester. The amino acid can be added to the resin after activation. The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable for the peptide condensation reaction. Examples of such solvents include acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, and alcohols such as trifluoroethanol. , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate mixtures thereof Are used as solvents used for the activation of protected amino acids and condensation with resins. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually selected from the range of about -20 ° C to about 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of about 1.5 to about 4 times. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
[0021]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material amino acid include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoro. Acetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like can be mentioned. Examples of the protecting group for the carboxyl group include C _1-6 Alkyl group, C _3-8 A cycloalkyl group, C _7-14 In addition to the aralkyl group, 2-adamantyl, 4-nitrobenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like can be mentioned.
The hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for this esterification include lower (C _1-6 ) Aroyl groups such as alkanoyl group and benzoyl group, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group. Examples of groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tertiary butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyano Methyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt)] and the like. Examples of the activated amino group of the raw material include the corresponding phosphoric acid amide.
[0022]
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethane. Examples include acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1 It is effective to add a cation scavenger such as 1,2-ethanedithiol. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia and the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
[0023]
As another method for obtaining the amide form of the peptide, first, the α-carboxyl group of the carboxyl terminal amino acid is amidated, and then the peptide chain is extended to the desired chain length on the amino group side, and then the N-terminal of the peptide chain. Of the peptide except for the protecting group of α-amino group and the peptide (or amino acid) except for the protecting group of the C-terminal carboxyl group, and condensing both peptides in a mixed solvent as described above. A method is mentioned. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above method to obtain the desired crude peptide. This crude peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain an amide of the desired peptide.
To obtain an ester of a peptide, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then an ester of the desired peptide can be obtained in the same manner as the peptide amide.
[0024]
GALP antigen can also be directly immunized with insolubilized one. Alternatively, a complex in which a GALP antigen is bound or adsorbed to an appropriate carrier may be immunized. The mixing ratio between the carrier (carrier) and the GALP antigen (hapten) is such that any antibody can be bound or adsorbed at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the GALP antigen bound or adsorbed to the carrier. It is also possible to use a polymer carrier that is usually used in the production of antibodies against haptens at a weight ratio of 0.1 to 100 with respect to hapten 1. Examples of such polymer carriers include natural polymer carriers and synthetic polymer carriers. Examples of natural polymer carriers include serum albumin of mammals such as cows, rabbits and humans, mammalian thyroglobulin such as cows and rabbits, hemoglobins of mammals such as cows, rabbits, humans and sheep, and KHL. Hemocyanin is used.
Examples of synthetic polymer carriers that can be used include various latexes such as polymers or copolymers of polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, polypropylenes, and the like.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. Examples of the condensing agent include diazonium compounds such as bisdiazotized benzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tryptophan, dialdehyde compounds such as glutaraldehyde which crosslinks amino groups, diisocyanate compounds such as toluene-2,4-diisocyanate, and the like. Conveniently used are dimaleimide compounds such as N, N'-o-phenylenedimaleimide that crosslinks thiol groups, maleimide active ester compounds that crosslink amino groups and thiol groups, and carbodiimide compounds that crosslink amino groups and carboxyl groups. It is done. In addition, when amino groups are cross-linked, an active ester reagent having a dithiopyridyl group (for example, SPDP) is reacted with one amino group and then reduced to introduce a thiol group, and the other amino group It is also possible to react both after introducing a maleimide group with a maleimide active ester reagent.
[0025]
(2) Production of monoclonal antibodies
The GALP antigen is administered to a warm-blooded animal by itself, for example, by a method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection, alone or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice are preferably used for the production of monoclonal antibodies.
[0026]
When producing monoclonal antibodies, select warm-blooded animals immunized with GALP antigen, for example, individuals with antibody titers from mice and collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. An anti-GALP monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing antibody-producing cells with myeloma cells. The anti-GALP antibody titer in serum is measured, for example, by reacting labeled GALP described below with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and preferably PEG is used. Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, etc., and P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to be used and the number of bone marrow cells is usually about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. In general, cell fusion can be carried out efficiently by incubating usually at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for usually 1 to 10 minutes.
[0027]
Various methods can be used for screening anti-GALP antibody-producing hybridomas. For example, hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which GALP or a derivative thereof or a partial peptide thereof is adsorbed directly or with a carrier. Then, add anti-immunoglobulin antibodies labeled with radioactive substances or enzymes (if the cells used for cell fusion are mice, anti-mouse immunoglobulin antibodies are used) or protein A, and anti-GALP bound to a solid phase Method for detecting monoclonal antibody, adding hybridoma culture supernatant to solid phase adsorbed with anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding GALP labeled with radioactive substance or enzyme etc., and adding GALP monoclonal antibody bound to solid phase The method of detection etc. are mentioned. Screening and breeding of anti-GALP monoclonal antibodies are usually carried out in an animal cell culture medium (eg, RPMI 1640) containing 10-20% fetal calf serum with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) added. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-described measurement of the anti-GALP antibody titer in the antiserum.
[0028]
Separation and purification of the anti-GALP monoclonal antibody can be carried out in the same manner as in the separation and purification of an ordinary polyclonal antibody (eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger ( Example: DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification using an active adsorbent such as protein A or protein G to dissociate the binding and obtain the antibody Law).
As described above, the antibody of the present invention can be produced by culturing a hybridoma cell in vivo or ex vivo of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof can be produced according to the above production method, or can be produced by a known method, for example, the method described in JP-A No. 2000-157273. Can be manufactured.
[0029]
The antibody of the present invention can quantify human GALP, rat GALP and porcine GALP or their derivatives with high sensitivity.
Hereinafter, uses of the antibody of the present invention, such as a quantitative method (immunoassay method) of GALP or a derivative thereof, will be described in detail.
(1) Quantitative method for GALP or its derivatives
By using the antibody of the present invention, detection by GALP measurement or tissue staining can be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2, Fab ′ or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, GALP amount) in the solution to be measured is chemically or physically determined. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method which is detected by a specific means and is prepared and calculated using a standard solution containing a known amount of antigen.
As such a measuring method, for example, a sandwich method, a competitive method, an immunometric method, a nephrometry, and the like are used, but the sandwich method and the competitive method described later are more preferable in terms of sensitivity and specificity, and the sandwich method is particularly preferable. preferable.
[0030]
(1) Sandwich method
The sandwich method comprises reacting the antibody of the present invention insolubilized on a carrier, the labeled antibody of the present invention and a test solution, and then measuring the activity of the labeling agent to measure GALP or a derivative thereof in the test solution. It is a quantification method for quantifying.
As a sandwich method, preferably
(I) an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof insolubilized on a carrier, an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of a labeled GALP or a derivative thereof, and A method for quantifying GALP or a derivative thereof in a test liquid, characterized by measuring the activity of a labeling agent after reacting the test liquid;
(Ii) an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof insolubilized on a carrier, an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of a labeled GALP or a derivative thereof, and An example is a method for quantifying GALP or a derivative thereof in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent after reacting the test solution.
As a more preferable sandwich method, (iii) the antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof is a monoclonal antibody labeled with GR2-1Na, and the antibody on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof. Examples of the quantitative method of (i) or (ii) above include an antibody that specifically reacts with a partial peptide being a monoclonal antibody labeled with GR-1Ca.
[0031]
In the sandwich method, the test solution is reacted with an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of insolubilized GALP or a derivative thereof, or an antibody that reacts specifically with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof. An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of labeled GALP or a derivative thereof, or an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof After the reaction (secondary reaction), the amount of GALP in the test solution can be quantified by measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier. The primary reaction and the secondary reaction may be performed at the same time or may be performed at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be based on those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be. In the GALP measurement method by the sandwich method, for example, when the antibody used in the primary reaction recognizes a partial peptide on the C-terminal side of GALP or a derivative thereof, the antibody used in the secondary reaction is on the C-terminal side. An antibody that recognizes other than a partial peptide (that is, the N-terminal side) is preferable, and when the antibody used in the primary reaction recognizes a partial peptide on the N-terminal side of GALP or a derivative thereof, the antibody used in the secondary reaction is An antibody that recognizes other than the partial peptide on the N-terminal side (that is, the C-terminal side) is preferably used.
Specific examples of such antibodies include [Cys. ⁴³ A monoclonal antibody prepared using rat-type GALP (43-60) as an immunogen and a monoclonal antibody prepared using GALP (1-9) as an immunogen are used. These antibodies are preferably used after being labeled with horseradish peroxidase (HRP).
[0032]
(2) Competition method
In the competition method, the antibody of the present invention, the test solution, and labeled GALP or a derivative thereof are reacted competitively, and the ratio of the labeled GALP or the derivative bound to the antibody is measured. This is a quantitative method for quantifying GALP or its derivative in a test solution.
The quantification of GALP or its derivative in the test solution by the competitive method is preferably performed using, for example, a solid phase method.
As a specific example of the solid phase immobilization method, an anti-mouse IgG antibody (ICN / CAPPEL) was used as a solid phase antibody, and (i) the antibody of the present invention (eg, GR-1Ca), (ii) HRP-labeled SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and (iii) a test solution, and after the reaction, A method of measuring the adsorbed HRP activity and quantifying GALP or a derivative thereof can be mentioned.
[0033]
(3) Immunometric method
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody of the present invention, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the test is performed. The antigen in the solution is reacted with an excess amount of the labeled antibody of the present invention, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody of the present invention to the solid phase. Separate the phase from the liquid phase. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
[0034]
(4) Nephrometry
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
[0035]
In the quantitative methods (1) to (4) above, the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance is not particularly limited, but radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, etc. are used. It is done. The radioisotope is not particularly limited. For example, [ ¹²⁵ I], [ ¹³¹ I], [ ^Three H], [ ¹⁴ C] and the like are preferable. Although it does not specifically limit as said enzyme, A stable and large specific activity is preferable, for example, (beta) -galactosidase, (beta) -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase etc. are mentioned. Although it does not specifically limit as said fluorescent substance, For example, a fluorescamine, a fluorescein isothiocyanate, etc. are mentioned. Although it does not specifically limit as said luminescent substance, For example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin etc. are mentioned. Furthermore, a biotin-avidin compound can also be used for the binding between the antibody and the labeling agent.
[0036]
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
[0037]
In applying these individual immunological measurement methods to the method of the present invention, special conditions, operations, and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of GALP or its derivative (s), adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For the details of these general technical means, review articles, books, etc. can be referred to (for example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, issued in 1974), Hiroshi Irie “Continuing Radioimmunoassay”. (Kodansha, published in 1979), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Medical School, published in 1978), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Second Edition) (Medical School, 1982) Issued), Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical School, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibid Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal) Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid. Vol. 121 (see Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (published by Academic Press). As described above, the antibody of the present invention can quantify GALP or a derivative thereof with high sensitivity, and is useful for elucidating the physiological function of GALP and preventing / treating or diagnosing a disease / symptom associated with GALP.
[0038]
GALP has a specific effect of increasing blood LH concentration (LH secretion promoting effect), and its reactivity is enhanced in Zucker fatty rats in which an abnormality is observed in the leptin receptor.
By measuring the amount of GALP or a derivative thereof contained in a body fluid (blood, plasma, serum, urine, etc.) using the antibody of the present invention, a disease involving GALP or a derivative thereof (eg, related to LH secretion failure) Diseases (eg, obesity, infertility, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, premenstrual syndrome, menopause, pituitary dysfunction), diseases related to LH hypersecretion (eg, prostate cancer, prostate Hypertrophy, endometriosis, precocious puberty, ovarian cancer, LH-producing pituitary tumor, dementia, diabetes, immune disease [eg, collagen disease (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma (systemic sclerosis) ), Dermatomyositis, rheumatoid arthritis, rheumatic fever, polyarteritis nodosa), rheumatic diseases (eg, osteoarthritis, traumatic arthritis, gout, pseudogout, ulcerative colitis, hemophilia), Inflammation, myasthenia gravis, glomerulus Inflammation, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, etc.), water / electrolyte metabolism abnormalities (eg, frequent urination, hyponatremia, hypernatremia, hypokalemia, hyperkalemia, metabolic) Etc.) can be diagnosed. The antibody of the present invention can also be used to detect GALP or a derivative thereof present in a subject such as a body fluid or tissue. For the production of antibody columns used to purify GALP or its derivatives, detection of GALP or its derivatives in each fraction during purification, analysis of the behavior of GALP or its derivatives in the test cells, etc. It can also be used.
[0039]
(2) A medicament comprising the antibody of the present invention
As described above, the antibody of the present invention can be used, for example, for diseases involving GALP or its derivatives [eg, diseases related to LH secretion failure (eg, obesity, infertility, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, Premenstrual syndrome, menopause, pituitary dysfunction, etc., diseases related to LH hypersecretion (eg, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, endometriosis, precocious puberty, ovarian cancer, LH-producing pituitary tumor, etc. ), Dementia, diabetes, immune disease (eg, collagen disease (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma (systemic sclerosis), dermatomyositis, rheumatoid arthritis, rheumatic fever, polyarteritis nodosa), rheumatic Disease (eg, osteoarthritis, traumatic arthritis, gout, pseudogout, ulcerative colitis, hemophilia), inflammation, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistance Diabetes, etc.), water and electricity Used as a preventive / therapeutic or diagnostic agent for quality metabolism abnormalities (eg, frequent urination, hyponatremia, hypernatremia, hypokalemia, hyperkalemia, metabolic alkalosis, etc.) can do.
[0040]
The prophylactic / therapeutic agent comprising the antibody of the present invention has low toxicity and can be used as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, bovine). , Cats, dogs, monkeys, etc.) parenterally or orally.
The antibody of the present invention may be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention and a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such pharmaceutical compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included. Such an injection can be prepared according to a known method. As a method for preparing an injection, it can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid that is usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base.
[0041]
Compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field. As the carrier and excipient for tablets, for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
[0042]
The above parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories. The content of the antibody is preferably about 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, particularly about 5 to 100 mg for injections, and about 10 to 250 mg for other dosage forms.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
[0043]
The dose of the prophylactic / therapeutic agent or diagnostic agent (medicine) containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., but is used, for example, for the treatment of obesity in adults In this case, the dose of the antibody of the present invention is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight. Is conveniently administered by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration (eg, subcutaneous administration) and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
[0044]
In the specification of the present invention, when amino acids and the like are represented by abbreviations, they are based on abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. When there are optical isomers with respect to amino acids, the L-form is indicated unless otherwise specified.
PAM: Phenylacetamidomethyl
Boc: t-butyloxycarbonyl
Fmoc: 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chloro-benzyloxycarbonyl
Bг-Z: 2-bromo-benzyloxycarbonyl
Bzl: benzyl
Cl-Bzl: 2-chloro-benzyl
OcHex: cyclohexyl ester
OBzl: benzyl ester
Tos: p-toluenesulfonyl
HONB: N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
HOBt: 1-hydroxybenzotriazole
HOOBt: 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine
MeBzl: 4-methylbenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Bum: t-butoxymethyl
Trt: Trityl
DNP: Dinitrophenyl
TFA: trifluoroacetic acid
DMF: N, N-dimethylformamide
DCM: dichloromethane
DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
BHA: Benzhydrylamine
pMBHA: p-methylbenzhydrylamine
CHO: Formyl
Gly: Glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: Cysteine
Met: Methionine
Glu: Glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: Lysine
Arg: Arginine
His: Histidine
Phe: Phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
[0045]
The SEQ ID NOs used in the present specification represent the amino acid sequences of the following peptides.
[SEQ ID NO: 1] This represents the amino acid sequence of rat GALP.
[SEQ ID NO: 2] This shows the amino acid sequence of human GALP.
[SEQ ID NO: 3] This shows the amino acid sequence of porcine GALP.
[SEQ ID NO: 4] Amino acid sequence of immunogenic peptide (rat-type GALP (43-60) with the 43rd amino acid residue changed to cysteine [Cys. ⁴³ It is also described as rat type GALP (43-60). ).
[0046]
Among the hybridoma cells obtained in the examples described later, GR-1C has been used since July 31, 2001, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki, Japan. ), Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-7682.
Among the hybridoma cells that produce anti-GALP antibodies, GR2-1N is available from 1st March, 1st, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, from March 17, 1999 (zip code 305-8666), Deposited at the Patent Organism Depositary (former NIBH), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, under the accession number FERM BP-6682.
In addition, about the antibody obtained from each hybridoma cell, it represents with the form which attached "a" after the cell name.
[0047]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to experimental examples and examples, but these do not limit the scope of the present invention.
In the following experimental examples and examples, the peptides used were [Cys ⁴³ The rat type GALP (43-60) was purchased by American Peptide Co., Ltd. by a conventional method.
As for rat type GALP and porcine type GALP, recombinant GALP was produced based on the previous report (Journal of The Chemical Society-Perkin Transactions, 2000, No. 1, pp. 1335).
Human GALP was purchased from PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC.
[0048]
Experimental example 1
An immunogen comprising the rat GALP (44-60) represented by SEQ ID NO: 4 [Cys ⁴³ Production of rat-type GALP (43-60)
[Cys ⁴³ ] A complex of rat-type GALP (43-60) and KLH was prepared and used as an immunogen.
That is, 20 mg of KLH is dissolved in 1.4 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) and mixed with 100 μl of DMF solution containing 2.2 mg (8 μmol) of N- (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide (GMBS). And allowed to react at room temperature for 40 minutes. After the reaction, fractionation was performed with a Sephadex G-25 column, and then 15 mg of KLH having a maleimide group introduced therein and [Cys ⁴³ ] Rat type GALP (43-60) 3.9 mg was mixed and reacted at 4 ° C for 1 day. After the reaction, it was dialyzed against physiological saline at 4 ° C. for 2 days.
[0049]
Experimental example 2
Immunity
In 6 to 8 week old BALB / C female mice, [Cys ⁴³ ] Rat-type GALP (43-60) -KLH conjugate was immunized subcutaneously with complete Freund's adjuvant to approximately 60 μg / mouse. Thereafter, the same amount of immunogen was boosted 2-3 times with incomplete Freund's adjuvant every 3 weeks.
[0050]
Experimental example 3
Horseradish peroxidase (HRP) labeling [Cys ⁴³ Production of rat-type GALP (43-60)
[Cys ⁴³ ] Rat-type GALP (43-60) and HRP (for enzyme immunoassay, manufactured by Boehringer Mannheim) were cross-linked to form a label for enzyme immunoassay (EIA). That is, 6.7 mg (168 nmol) of HRP was dissolved in 0.95 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), mixed with 50 μl of DMF solution containing 0.47 mg (1.65 μmol) of GMBS, and reacted at room temperature for 30 minutes. Thereafter, fractionation was performed using a Sephadex G-25 column. Thus prepared 5.0 mg (117 nmol) of HRP having a maleimide group introduced and [Cys ⁴³ ] Rat type GALP (43-60) 0.74 mg (352 nmol) was mixed and reacted at 4 ° C. for 1 day. After the reaction, fractionation was performed using an Ultrogel AcA44 (LKB-Pharmacia) column to obtain HRP-labeled rat GALP (43-60).
[0051]
Experimental Example 4
[Cys ⁴³ Measurement of antibody titer in antiserum of mice immunized with rat-type GALP (43-60) -KLH complex
[Cys ⁴³ ] Rat-type GALP (43-60) -KLH complex was immunized twice at 3-week intervals, and one week later, blood was collected by collecting blood from the fundus. Further, the blood was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered to obtain antiserum. The antibody titer in the antiserum was measured by the following method. To prepare an anti-mouse immunoglobulin antibody-binding microplate, first, add a 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) solution containing 100 μg / ml of anti-mouse immunoglobulin antibody (IgG fraction, manufactured by Kappel) to a 96-well microplate. 100 μl each was dispensed and left at 4 ° C. for 24 hours. Next, after washing the plate with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), 300 μl of PBS containing 25% Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) was dispensed in order to block excess binding sites in the wells. And treated at 4 ° C. for at least 24 hours.
Buffer C (1% BSA, 0.4 M NaCl, 0.05% 2 mM EDTA · Na (ethylenediaminetetraacetate dihydrate: Ethylenediamine-N,) was added to each well of the anti-mouse immunoglobulin antibody-binding microplate thus obtained. N, N ′, N′-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate, DOJINDO) 0.02M phosphate buffer, pH 7.0) 50 μl, and 100 μl of antiserum against the complex diluted with buffer C, 4 The reaction was carried out at 16 ° C. for 16 hours. Next, after the plate was washed with PBS, the HRP labeled [Cys ⁴³ ] Rat-type GALP (43-60) (diluted 300-fold with buffer C) (100 μl) was added and reacted at room temperature for 1 day. Next, after washing the plate with PBS, 100 μl of TMB microwell peroxidase substrate system (KIRKEGAARD & PERRY LAB, INC, handled by Funakoshi Chemical) was added to react the enzyme activity on the solid phase at room temperature for 10 minutes. After stopping the reaction by adding 100 μl of 1M phosphoric acid, absorption at 450 nm was measured with a plate reader (BICHROMATIC, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
The obtained absorption spectrum is shown in FIG. In FIG. 1 (1a) and (-□-) are mouse numbers. 2 (2a) and (−Δ−) are mouse numbers. 3 (3a) and (-o-) are mouse numbers. 4 (4a) and (-◆-) are mouse numbers. 5 (5a) and (-■-) are mouse numbers. 6 (6a) and (-▲-) are mouse numbers. 7 (7a) and (-●-) are mouse numbers. 8 (8a) is represented. 1a to 8a represent antibodies derived from 8 mice. According to FIG. 1, in the antiserum against all complexes of 8 immunized mice [Cys ⁴³ It can be seen that an increase in the antibody titer against rat GALP (43-60) was observed.
[0052]
Example 1
Anti [Cys ⁴³ Preparation of rat GALP (43-60) monoclonal antibody
Referring to Figure 1, [Cys ⁴³ As examples of selection of antibody-producing cell lines of hybridomas derived from mice immunized with rat-type GALP (43-60) -KLH complex, mice No. 6 and No. 7 that gave antibody 6a and antibody 7a were selected.
The mice immunized with antibody 6a and antibody 7a were subjected to final immunization by intravenously inoculating 100-150 μg of immunogen dissolved in 0.1 ml of physiological saline. The spleen was removed from the mice 3 to 4 days after the final immunization, pressed with a stainless mesh, filtered, and suspended in Eagles Minimum Essential Medium (MEM) to obtain a spleen cell suspension. As cells used for cell fusion, BALB / C mouse-derived myeloma cells P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) were used (Current Topics in Microbiology and Imnology, vol. 81, page 1, 1978).
Cell fusion was performed according to the original method (Nature, 256, 495, 1975). That is, each spleen cell and P3U1 were washed three times with MEM without serum, mixed to a ratio of 5: 1 spleen cells and P3U1 and centrifuged at 800 rpm for 15 minutes, Precipitated. After sufficiently removing the supernatant, the precipitate was lightly loosened, 0.3 ml of 45% polyethylene glycol (PEG) 6000 (manufactured by Kochlite) was added, and the mixture was allowed to stand in a 37 ° C. hot water bath for 7 minutes for fusion. After the fusion, MEM was added to the cells at a rate of 2 ml / min, and a total of 15 ml of MEM was added, followed by centrifugation at 600 rpm for 15 minutes to remove the supernatant. This cell precipitate was added to GIT medium (Wako Pure Chemicals) (GIT-10% FCS) containing 10% fetal bovine serum, and P3U1 at 2 x 10 per ml. ^Five 1 ml per well was seeded in 192 wells in a 24-well multi-dish (Limbro). After seeding, the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator. 24 hours later, HAT (hypoxanthine 1 × 10 ^-Four M, aminopterin 4 × 10 ^-7 M, thymidine 1.6 × 10 ^-3 MIT-containing GIT-10% FCS medium (HAT medium) was added at 1 ml per well to initiate HAT selective culture. The HAT selective culture was continued by discarding 1 ml of the

old solution

3, 6 and 9 days after the start of the culture, and then adding 1 ml of HAT medium. Hybridoma growth was observed 9-14 days after cell fusion, and when the culture broth turned yellow (about 1 × 10 ⁶ Cell / ml), the supernatant was collected, and the antibody titer was measured according to the method described in Experimental Example 4.
Give antibody 6a and antibody 7a [Cys ⁴³ FIG. 2 shows a state in which a hybridoma derived from a mouse immunized with a rat-type GALP (43-60) -KLH complex produces an antibody. The following 5 types of hybridomas were selected from the antibody-producing hybridomas obtained (Table 1). Among these, the hybridomas No. 1 and No. 2 that gave particularly large antibody titers (the absorbance was large) were named GR-1C and GR-2C, respectively.
[0053]
[Table 1]

[0054]
Next, these hybridomas were subjected to cloning by limiting dilution. When cloning, BALB / C mouse thymocytes were used as feeder cells at 5 × 10 5 per well. ^Five It was added to become pieces. After cloning, the hybridoma was administered to mice (BALB / C) that had been intraperitoneally administered with 0.5 ml of mineral oil. ⁶ After the cells / animal were intraperitoneally administered, antibody-containing ascites was collected 6 to 20 days later.
The monoclonal antibody was purified from the obtained ascites using a protein-A column. That is, 6-20 ml of ascites was added to an equal volume of binding buffer [3.5 M NaCl, 0.05% NaN _Three After being diluted with 1.5 M glycine (pH 9.0) containing], it is applied to a protein-A-agarose (Seikagaku Corporation) column equilibrated in advance with a binding buffer, and the specific antibody is eluted with an elution buffer [(0.05% NaN _Three And 0.1 M citrate buffer solution (pH 3.0)]. The eluate was dialyzed against PBS at 4 ° C. for 2 days, sterilized by filtration through a 0.22 μm filter (Millipore), and stored at 4 ° C. or -80 ° C.
In determining the class / subclass of the monoclonal antibody, an enzyme-labeled immunoassay (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) using a purified monoclonal antibody-bound solid phase was performed. That is, 100 μl of 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) solution containing 2 μg / ml of antibody was dispensed into a 96-well microplate and left at 4 ° C. for 24 hours. In accordance with the method described in Experimental Example 4, after blocking excess binding sites in the well with Block Ace, an isotype typing kit (Mouse-Typer ^TM The class and subclass of the immobilized antibody were examined by ELISA using Sub-Isotyping Kit (manufactured by Bio-Rad).
[0055]
Example 2
Competitive method enzyme immunoassay (competitive method-EIA)
[Cys ⁴³ The reaction specificity of a monoclonal antibody prepared using the rat GALP (43-60) -KLH complex as an immunogen was examined by the following method.
First, the antibody titers of the monoclonal antibody GR-1Ca and GR-2Ca solutions are examined by the method described in Experimental Example 4, and the binding amount of the labeled product is about 50% of the saturation binding amount as the antibody concentration used in the competition method-EIA. Antibody concentration was determined. Next, (i) anti- [Cys diluted with buffer C to 80 ng / ml was added to the anti-mouse immunoglobulin antibody-binding microplate described in Experimental Example 4. ⁴³ ] Rat-type GALP (43-60) antibody GR-1Ca solution or 50 μl of GR-2Ca solution, and (ii) HRP labeling described in Experimental Example 3 [Cys ⁴³ The concentration of the diluted GALP (43-60) diluted with buffer C is 10 ^-6 M ~ 10 ^-Ten M rat-type GALP, human-type GALP or porcine-type GALP solution (50 μl) was added, and reacted at 4 ° C. for 16 hours. After the reaction, the plate was washed with PBS, and then the enzyme activity on the anti-mouse immunoglobulin antibody-conjugated microplate was measured by the method described in Experimental Example 4.
[0056]
The results of the competitive method of GR-1Ca and GR-2Ca are shown in FIGS. 3 and 4, respectively.
3 and 4, (-●-) represents a response to human GALP, (-o-) represents a response to rat GALP, and (-●-) represents a response to porcine GALP. . This shows that both antibodies have reactivity with rat GALP, human GALP and porcine GALP.
From the standard curve of GR-1Ca, (B / B ₀ ) = 0.5, the GALP concentrations giving 0.5 were found to be rat GALP: 3 nM, human GALP: 7 nM, porcine GALP: 8 nM (FIG. 3). From these results, it is considered that GR-1Ca shows almost high reactivity with rat, human and porcine GALP.
From the standard curve of GR-2Ca, (B / B ₀ The GALP concentration giving 0.5) was found to be rat GALP: 10 nM, human GALP: 20 nM, porcine GALP: 500 nM (FIG. 4). From these results, it is considered that GR-2Ca has approximately the same reactivity with rat GALP and human GALP, but weak reactivity with porcine GALP.
[0057]
Experimental Example 5
Preparation of HRP-labeled anti-GALP monoclonal antibody (GR2-1Na-HRP)
In a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 9.25 mg (61.7 nmol) of a purified fraction of monoclonal antibody GR2-1N that recognizes the N-terminal part (1-9) of GALP described in JP-A-2000-157273 Then, 50 μl of DMF containing 0.74 μmol of GMBS was added and reacted at room temperature for 40 minutes. The reaction solution was separated with a Sephadex G-25 column (eluent, 0.1 M phosphate buffer, pH 6.7) to obtain 7.17 mg of an antibody fraction into which a maleimide group was introduced. Next, 0.07M phosphate buffer solution (containing 0.15M NaCl) (pH6.8) containing 17.8 mg (445 nmol) of HRP, 1.4 ml of N-succinimidyl-3- (2-pyrimidyldithio) propionate (SPDP) 6.67 μmol DMF containing 60 μl was added and reacted at room temperature for 40 minutes. Next, 0.4 ml of 0.1 M acetic acid buffer (pH 4.5) containing 66 μmol of dithiothreitol was added and reacted at room temperature for 20 minutes. Then, a Sephadex G-25 column (eluent, 0.1 mM containing 2 mM EDTA) was used. Separation with M phosphate buffer (pH 6.0) gave 9.8 mg of HRP into which SH groups had been introduced. Next, 8 mg of SH group-introduced HRP and maleimide group-introduced antibody fraction 3 mg were mixed and concentrated to about 0.5 ml with a collodion bag (manufactured by Sartorius). Left for hours. The reaction solution was applied to a Sephacryl S-300HR column (manufactured by Pharmacia) using 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5 as an eluent, and the GR2-1Na-HRP complex fraction was purified.
[0058]
Example 3
Sandwich method-EIA (Specificity and sensitivity of sandwich method-EIA)
100 μl each of 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6 solution) containing 15 μg / ml of the purified monoclonal antibody GR-1Ca obtained in Example 1 was dispensed into a 96-well microplate and left at 4 ° C. for 24 hours. Excess binding sites in the wells were inactivated by adding 400 μl of Block Ace diluted 4-fold with PBS.
100 μl each of rat GALP, human GALP and porcine GALP diluted with buffer C was added to the prepared plate and reacted at 4 ° C. for 24 hours. After washing with PBS, 100 μl of GR2-1Na-HRP (2,000-fold diluted with buffer C) prepared in Experimental Example 5 was added and reacted at 4 ° C. for 24 hours. After washing with PBS, the enzyme activity on the solid phase was measured using TMB by the method described in Experimental Example 4 (enzyme reaction 20 minutes).
The results are shown in FIG.
In FIG. 5, (-●-) represents the absorption of rat GALP, (-■-) represents the absorption of human GALP, and (-▲-) represents the absorption of pig GALP. From FIG. 5, it was found that rat-type GALP, human-type GALP and porcine-type GALP can be detected with extremely high sensitivity by this sandwich method-EIA.
That is, this sandwich method-EIA can detect rat GALP, human GALP and porcine GALP at 0.3 fmol / well.
Therefore, as an example, the sandwich method using GR-1Ca as a solid phase antibody and GR-1Na-HRP as a label-EIA selects rat GALP, human GALP and porcine GALP with extremely high sensitivity and extremely high sensitivity. It was found that it can be detected automatically.
[0059]
Example 4
Determination of rat GALP in plasma
Rat plasma was mixed with the same amount of buffer EC (0.1% phosphate buffer, 0.2% BSA, 0.4M NaCl, 2 mM EDTA · Na, 10% Block Ace, 0.05% CHAPS, 0.05% sodium azide, pH 7.0). The rat GALP was quantified by the sandwich method-EIA of Example 3 above.
The results are shown in Table 2.
[0060]
[Table 2]

[0061]
Example 5
Fractionation of GALP in rat plasma by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)
In order to identify the GALP immunoreactivity contained in rat plasma described in Example 4, 24 ml of acetonitrile was added to 12 ml of rat plasma and mixed, followed by centrifugation (2,500 rpm, 15 minutes), Removal was performed. The supernatant was lyophilized, and the fraction was concentrated and fractionated by reverse phase HPLC using ODS-80TM.
Column conditions:
Column: ODS-80TM (4.6 x 250 mm)
Eluent: Liquid A (0.05% trifluoroacetic acid containing 5% acetonitrile)
Liquid B (0.05% trifluoroacetic acid-containing 60% acetonitrile)
Elution method: Acetonitrile concentration was increased from 5% to 30% in the first 5 minutes and then increased linearly from 30-50% over 30 minutes.
Flow rate: 1.0 ml / min
Fractionation: 0.5 ml / tube
The elution fraction was freeze-dried, dissolved in 250 μl of buffer C, and subjected to the sandwich method-EIA described in Example 3.
The results are shown in FIG.
Since rat-type GALP immunoreactivity in plasma was detected almost at the elution position of rat-type GALP, it was confirmed that the sandwich method-EIA detected rat-type GALP.
[0062]
Example 6
Quantification of human GALP in plasma
Human plasma was mixed with the same amount of buffer EC [0.2 M BSA, 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA · Na, 10% Block Ace, 0.05% CHAPS, 0.05 M sodium azide, 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0. ] Was diluted 2-fold, and GALP in human plasma was quantified by the sandwich method-EIA of Example 3 above. Human plasma was obtained from a healthy volunteer of Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., and informed consent was confirmed.
The results are shown in Table 3.
[0063]
[Table 3]

[0064]
This shows that this measurement system is an important means for studying fluctuations in plasma GALP.
[0065]
Example 7
Quantification of GALP in rats with adjuvant arthritis, a chronic inflammation model
Male Lewis rats (7-week-old, Charles River, Japan) were sensitized by intradermal administration of 250 μg of Mycobacterium tuberculosis (H37 RA, Difco) suspended in 0.05 ml liquid paraffin on the left hind limb (Group AA) ). In the Vehicle group, 0.05 ml of liquid paraffin was administered. The number of experiments was 7 in all cases. The foot volume of the adjuvant non-injected hind limb (right hind limb) and the right hind paw volume of non-sensitized rats were measured before and 15 days after administration. Rats were decapitated 24 hours after administration and 14 days after administration. Plasma is prepared from the obtained blood, and the rat plasma contains the same amount of buffer EC [0.2% BSA, 0.4M NaCl, 2 mM EDTA · Na, 10% Block Ace, 0.05% CHAPS, 0.05% sodium azide. 0.1-M phosphate buffer, pH 7.0], and the rat GALP was quantified by the sandwich method-EIA of Example 3 above.
The blood GALP concentration is shown below.
24 hours after adjuvant sensitization, vehicle group; 10.1 ± 3.1 fmol / ml, AA group; 4.5 ± 0.6 fmol / ml, 14 days after adjuvant sensitization, vehicle group; 15.1 ± 3.5 fmol / ml, AA group; 3.4 ± 0.4 fmol / ml. Blood GALP levels were significantly higher than those in the vehicle group at 24 hours and 14 days after adjuvant sensitization (p. <0.05).
This shows that GALP can be a marker for adjuvant arthritis. It can also be seen that blood GALP is consumed due to the onset of arthritis.
The pituitary gland was collected and boiled in 5 ml of distilled water for 10 minutes and then cooled in ice. Acetic acid and pepstatin (Peptide Institute) were added to final concentrations of 1 M and 10 μg / ml, respectively. The pituitary gland was crushed with a homogenizer, and the protein concentration in the solution was measured with a Protein assay kit (Bio Rad). The pituitary disruption solution was centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was concentrated and pretreated with 265 mg of a Sep-Pak Plus C18 cartridge (Waters), and then rat-type GALP was sandwiched with EIA described in Example 3 above. Was quantified. The pretreatment method of pituitary extract was loaded with pituitary extract added with 2 ml of 4% acetic acid on Sep-Pak Plus C18 cartridge activated by sequentially purging 5 ml of methanol and 5 ml of distilled water containing 0.1% TFA. . After the addition, it was washed with 5 ml of 0.1% TFA-containing distilled water, eluted with 3 ml of 60% acetonitrile containing 0.1% TFA, and lyophilized. The concentrated fraction was reconstituted in 0.25 ml buffer EC and quantified by the sandwich method-EIA of Example 3 above.
The GALP content in the pituitary is shown below.
24 hours after adjuvant sensitization, vehicle group; 3.1 ± 0.3 fmol / mg protein, AA group; 4.9 ± 0.7 fmol / mg protein, 14 days after adjuvant sensitization, vehicle group; 1.6 ± 0.2 fmol / mg protein, AA group: 2.8 ± 0.3 fmol / mg protein. Pituitary GALP content was significant compared to the vehicle group at both 24 hours and 14 days after adjuvant sensitization (p. <0.01).
This shows that GALP promotes production in the pituitary gland for the purpose of suppressing the onset of arthritis.
[0066]
Example 8
Determination of GALP in rats treated with lipopolysaccharide
Male Wistat rats (8-week-old, Charles River, Japan) were administered 1, 3, and 10 mg / kg of lipopolysaccharide (LPS) (Wako Pure Chemical Industries) dissolved in physiological saline (LPS group, n = 5-7). The vehicle group (n = 8) was administered physiological saline at 1 ml / kg. Plasma was prepared from blood obtained by decapitation blood collection 12 hours after administration. Plasma with the same amount of buffer EC [0.1 M phosphate buffer, pH 7.0 containing 0.2% BSA, 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA · Na, 10% Block Ace, 0.05% CHAPS, 0.05% sodium azide] The rat GALP was quantified by 2-fold dilution and the sandwich method-EIA of Example 3 above.
The result of blood GALP concentration is shown in FIG.
Compared to the vehicle group (12.0 ± 2.0 fmol / ml), the LPS 3 mg / kg administration group showed the highest value (251 ± 181 fmol / ml), showing a high value although not a significant difference.
Further, the pituitary gland was collected, and the GALP concentration in the pituitary gland was measured in the same manner as in Example 7.
The results are shown in FIG.
Similar to blood GALP concentration, the LPS 3 mg / kg group showed the highest value (8.39 ± 1.37 fmol / mg protein), which was significantly higher than the vehicle group (2.82 ± 0.48 fmol / mg protein) (p <0.01).
This shows that GALP is a factor whose production is enhanced by endotoxin stimulation like cytokines. GALP is thought to be a factor related to the regulation of cytokine production.
[0067]
Example 9
Quantitative determination of pituitary GALP concentration under water load
Male Wistat rats (8 weeks old, Charles River, Japan) were raised for 2, 4 and 7 days under water-absorptive conditions. After decapitation, the pituitary gland was removed and the pituitary gland was collected. The same method as in Example 7 above. Was used to measure the GALP concentration in the pituitary gland.
The results are shown in FIG.
On day 4 (28.7 ± 2.29 fmol / mg protein) and 7 days (43.8 ± 10.7 fmol / mg protein), water increased significantly compared to the free water group (3.93 ± 0.75 fmol / mg protein).
From this, it can be seen that GALP concentration fluctuations in organs can be measured with high sensitivity using the antibody of the present invention. Furthermore, it can be seen that GALP is a factor involved in the regulation of water and osmotic pressure in vivo.
[0068]
【The invention's effect】
The antibody of the present invention is useful for the development of therapeutic agents, prophylactic agents, and diagnostic agents for diseases involving GALP or its derivatives. By using a hybridoma cell containing the antibody of the present invention, the antibody of the present invention can be produced industrially. In addition, a medicament (particularly a diagnostic agent) containing the antibody of the present invention is a disease / symptom associated with GALP or a derivative thereof [eg, a disease related to LH secretion failure (eg, obesity, infertility, irregular menstruation). Dysmenorrhea, amenorrhea, premenstrual syndrome, menopause, pituitary dysfunction, etc., diseases related to LH hypersecretion (eg, prostate cancer, prostatic hypertrophy, endometriosis, precocious puberty, Ovarian cancer, LH-producing pituitary tumors, etc., dementia, diabetes, immune disease [eg, collagen disease (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma (systemic sclerosis), dermatomyositis, rheumatoid arthritis, rheumatic fever, nodule Polyarteritis etc.), rheumatic diseases (eg, osteoarthritis, traumatic arthritis, gout, pseudogout, ulcerative colitis, hemophilia), inflammation, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple Sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistance Diabetes, etc.], water-electrolyte metabolism is useful for diagnosis and the like (eg, pollakiuria, hyponatremia, hypernatremia, hypokalemia, hyperkalemia, such as metabolic alkalosis), etc.]. In addition, by using the antibody of the present invention, the amount of GALP or a derivative thereof can be measured with high sensitivity. Therefore, the quantification method of the present invention is applicable to diseases / symptoms related to GALP or its derivatives [eg, diseases related to LH secretion failure (eg, obesity, infertility, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, Premenstrual syndrome, menopause, pituitary dysfunction, etc., diseases related to LH hypersecretion (eg, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, endometriosis, precocious puberty, ovarian cancer, LH-producing pituitary tumor, etc. ), Dementia, diabetes, immune disease (eg, collagen disease (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma (systemic sclerosis), dermatomyositis, rheumatoid arthritis, rheumatic fever, polyarteritis nodosa), rheumatic Disease (eg, osteoarthritis, traumatic arthritis, gout, pseudogout, ulcerative colitis, hemophilia), inflammation, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistance Diabetes, etc.), water / electrolytes Xie abnormality diagnosis (e.g., pollakiuria, hyponatremia, hypernatremia, hypokalemia, hyperkalemia, such as metabolic alkalosis), etc.], which is useful for the prevention or treatment.
[0069]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 [Cys] ⁴³ The measurement result of the antibody titer in the antiserum of the mouse | mouth which immunized the rat type | mold GALP (43-60) -KLH complex is represented.
FIG. 2 [Cys ⁴³ This shows a state where the hybridoma derived from the mouse immunized with the rat-type GALP (43-60) -KLH complex is producing an antibody (result of absorption analysis).
FIG. 3 shows the results of GR-1Ca competition method-EIA.
FIG. 4 shows the results of GR-2Ca competition method-EIA.
FIG. 5 shows the measurement result of GR-1Ca sandwich method-EIA.
FIG. 6 shows the rat plasma sandwich method-EIA measurement results.
7 shows the measurement result of sandwich method-EIA of Example 8. FIG. The value on the vertical axis represents the average value ± standard error.
FIG. 8 shows the sandwich method-EIA measurement result of Example 8. The value on the vertical axis represents the average value ± standard error. **; p <= 0.01
9 shows the sandwich method-EIA measurement results of Example 9. FIG. The value on the vertical axis represents the average value ± standard error. **; p <= 0.01

Claims

GR-1C (FERM BP-7682 ) was labeled with GR-1Ca that can be produced from a hybridoma cell that is marked by makes the chromophore at the distal end monoclonal antibodies.

GR-1C are labeled with (FERM BP-7682) Ruha hybridoma cells.

Hybridoma cells of claim 2, wherein culturing in vivo or in vitro method for producing a monoclonal antibody of claim 1, wherein the collecting the monoclonal antibody of claim 1, wherein from the body fluids or culture.

A diagnostic agent comprising the antibody according to claim 1.

A method for quantifying a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a derivative thereof, characterized by using the antibody according to claim 1.

An antibody which specifically reacts with the N-terminal partial peptide of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof, and the antibody according to claim 1 A method for quantifying a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof in a test solution, which is characterized by being used.

(1) (i) the antibody of claim 1 insolubilized on a carrier, (ii) a polypeptide having the amino acid sequence represented by labeled SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of the derivative, and (iii) after reacting the test solution or (2) (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: insolubilized on the carrier 2. An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of a polypeptide having the amino acid sequence represented by 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof, (ii) a labeled antibody according to claim 1, and iii) After reacting the test solution, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured, and the test solution has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. A method for quantifying a polypeptide or a derivative thereof.

(1) (i) the monoclonal antibody according to claim 1 insolubilized on a carrier, (ii) labeled with GR2-1Na that can be produced from a hybridoma cell labeled with labeled GR2-1N (FERM BP-6682) (2) (i) GR2- that can be produced from a hybridoma cell labeled with GR2-1N (FERM BP-6682) insolubilized on a carrier. monoclonal antibodies labeled with 1na, claim 7 for measuring the (ii) labeled monoclonal antibody according to claim 1, and (iii) after reacting with a test fluid, the activity of the labeling agent on the insoluble carrier The quantitative method described.

The antibody according to claim 1, the test solution, and the labeled polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof, are reacted competitively. A test solution characterized by measuring the ratio of a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof bound to the antibody A method for quantifying a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof.

A method for testing a disease involving a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof, wherein the antibody according to claim 1 is used.

A method for testing a chronic inflammatory disease, comprising using the antibody according to claim 1.

A method for examining arthritis, wherein the antibody according to claim 1 is used.