JP4346819B2

JP4346819B2 - 大腸菌における外来遺伝子の調節された高効率発現

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Publication number: JP4346819B2
Application number: JP2000529443A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，ウイリアム・シー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1998-01-28
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2019-01-27
Also published as: WO1999038985A3; WO1999038985A2; EP1051502B1; ATE345391T1; ES2275335T3; JP2002501752A; US6180391B1; HK1030965A1; DE69933990T2; CA2318813A1; AU2564299A; DK1051502T3; DE69933990D1; EP1051502A2; PT1051502E; CA2318813C; AU731049B2

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）や他の宿主細胞において、毒性遺伝子を含む外来遺伝子を発現することができる新しい改良された発現ベクターシステムに関する。さらに具体的には、本発明は、宿主細胞において、クローニングされた遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を調節するために、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質（ＭＳ２ＣＰ）とＭＳ２認識部位とを利用する効率がよく厳密に調節された発現ベクターシステムに関する。さらに、本発明は、転写を制御する転写調節タンパク質、例えばバクテリオファージＴ４のｍｏｔＡおよびａｓｉＡを利用する発現ベクターシステムに関し、以前に記載された非計画性システムよりも複雑ではなく、かつ用途の広い計画された誘導性プロモーターシステムを提供する。
【０００２】
発明の背景
前核細胞は真核生物および前核生物のポリペプチドをコードするクローニングされた遺伝子の発現のための最良のシステムとなってきており、多くの発現システムが細菌における遺伝子産物の発現のために存在する。大腸菌における遺伝子の発現は分子プロセスの理解に手がかりとなる主要技術として確立されてきており、大腸菌発現システムは外因性タンパク質の生産と大規模な精製の標準的で一般的な方法となってきている。重要なことに、この技術は、以前では天然源からの単離によっては困難または不可能であった量および品質でタンパク質源を提供するようになった。
【０００３】
微生物宿主に用いられる多くの特許化された発現システムが記述されている。一部の例では、記載された発現システムは一般の発現システムに関する一方で、他の例では、特許化された発現システムは比較的厳密な調節を可能とするように設計されるか、または特定のタンパク質の発現に個々に仕立てられている。そのような特許の例としては米国特許第４，７６７，７０８号（正に調節された外来プロモーターの調節下にあるクローニングされた細菌ＤＮＡポリメラーゼＩを有する組換えベクターの構築）；米国特許第４，５０３，１４２号（大腸菌のｌａｃプロモーター／オペレーターの使用に基づくクローニングベクターと発現ベクターなどの種類のベクターの構築）；および米国特許第４，５７８，３５５（高レベルの発現ベクターを構築するためにバクテリオファージラムダのＰ_Ｌプロモーターの利用）が挙げられる。
【０００４】
ｐＥＴベクター発現システムと称されるもう一つの広く用いられている発現システムは、目的の遺伝子を転写するための強力なＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用している（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９：１１３−１３０（１９８６））。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはそれ自体のプロモーターに対して高い選択性があり、Ｔ７プロモーターは大腸菌のＤＮＡには存在しないことが知られている。Ｔ７はその高度に選択的なポリメラーゼを用いて、転写を、感染中の宿主ＤＮＡではなくそれ自体のＤＮＡに向けさせ、Ｔ７遺伝子１のクローニングされたコピーから提供される比較的少量のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、多コピープラスミド中のＴ７プロモーターからの高レベルの転写を指示するのに十分である。さらに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは大腸菌ポリメラーゼよりも少なくとも５倍以上活性がある（同上）。多くの異種タンパク質が、ｐＥＴシステムを用いて高収率でうまく発現された（例えば、Ｄｉｅｔｒｉｃｈｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１：３９９−４０７（１９９１）；Ｌａｔｈｒｏｐｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，３：５１２−５１７（１９９２）；Ａｕｋｈｉｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２５４２−２５５３（１９９３）を参照されたい）。
【０００５】
残念なことに、これらの報告や他の報告された発現系は、１）プロモーターのリークから生じる非誘導発現；２）（さらに典型的には細菌での真核生物の遺伝子の発現に伴って）遺伝子産物が発現されたときに宿主細胞を殺すか、または激しく損傷させるとき、必要な程度まで発現を調節することができないこと；３）発現の誘導のために、宿主の生化学的応答、またはコストが高くつくか、さもなければ不十分な誘導機構に依存しなければならないこと；４）十分なレベルで目的の遺伝子を発現を発現できないこと；および５）プラスミドの不安定性などの問題に多かれ少なかれ悩まされている。そのような問題に十分に取り組んでうまく克服されるまでは、そのような発現システムの十分な潜在能力は完全には評価されず、利用されないだろう。
【０００６】
すべての知られた誘導プロモーターシステムは、そのプロモーターの調節下にクローニングされている遺伝子の不適切な転写および発現を導く残留レベルの活性、すなわち「リーク」を有する。ほとんどの場合において、細胞は作られつつある遺伝子産物に対する耐性があり、すなわち、遺伝子産物は毒性がないために、これは問題とならない。しかし、作られつつある遺伝子産物に毒性があるか、または細胞に対して致死的である場合、これらの少量の発現でさえ有害となりうる。実際、どのクローニングベクターにおいても不安定であるために、「クローニングできない」ものとして特長付けられてきたある種の毒性遺伝子が存在する。
【０００７】
ＳｔｕｄｉｅｒＦ．Ｗ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９：３７−４４（１９９１））は、Ｌｙｓシリーズのベクターを開発することによりｐＥＴベクターのリーク発現の問題に取り組んだ。これらのベクターは、非誘導細胞に存在するＴ７ＲＮＡポリメラーゼに結合し、標的遺伝子を転写するのを妨ぐＴ７リゾチームの遺伝子を有する。ＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆとＳｔｕｄｉｅｒ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９：４５−５９（１９９１））は、ｐＥＴプラスミド中においてｌａｃオペロン調節要素の追加のコピーを供与することによりこの問題に取り組んだ。Ｂｒｏｗｎら（Ｇｅｎｅ，１２７：９９−１０３（１９９３））は変異Ｔ７ファージによる感染による誘導を用いて毒性ＰＯＬ３遺伝子をクローニングすることができた。残念なことに、これらのシステムや他の報告されたシステムはリークの問題を完全に軽減できず、またプラスミドの不安定性や高レベルのリゾチームおよび／またはファージ感染に伴う細胞溶解に問題がある。
【０００８】
本発明はバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質の翻訳抑制能力を利用することによりプロモーターのリークの問題に取り組み、この問題を解決するものである。バクテリオファージＭＳ２はかなり単純なライフサイクルを有するＲＮＡ含有ファージである（ＶａｎＤｕｉｎ，Ｊ．、「バクテリオファージにおける一本鎖ＲＮＡバクテリオファージ」（“Ｓｉｎｇｌｅ−ＳｔｒａｎｄｅｄＲＮＡＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓｉｎＴｈｅＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ”）、第４章、１１７〜１６７ページ、プレナムプレス、ニューヨーク（１９８８））。そのＲＮＡは４つの遺伝子をコードし、そのうちの一つはゲノムをコピーするリプリカーゼ遺伝子であり、そのうちの別のものは多機能コートタンパク質遺伝子である。コートタンパク質の濃度が細胞内で増加するにしたがって、該タンパク質は二量体を形成して、リプリカーゼ遺伝子のリボソーム結合部位とＡＴＧとからなるヘアピン構造に結合する。次に、この結合はリプリカーゼ遺伝子からのその後の翻訳を抑制し、そのライフサイクルをゲノムのパッケージングに効果的にシフトさせる。
【０００９】
ＭＳ２コートタンパク質の配列は発表されており（Ｆｉｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６０：５００−５０７（１９７６））、コートタンパク質の変異体が単離され、特性付けられており（Ｐｅａｂｏｄｙ＆Ｅｌｙ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０（７）：１６４９−１６５５（１９９２））、そしてコートタンパク質の翻訳リプレッサー活性の遺伝子的分析のために２プラスミドシステムの構築が記載されている（Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｄ．，Ｊｏｕｒｎ．ｏｆＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１０）：５６８４−５６８９（１９９０））。
【００１０】
バクテリオファージＭＳ２は、メッセンジャーＲＮＡに結合して翻訳を抑制するタンパク質を有することが知られている唯一のファージではない。例えば、バクテリオファージＴ４のＲｅｇＡタンパク質およびＭ１３の遺伝子Ｖタンパク質はそのような２種類の他のタンパク質である。しかし、ＲｅｇＡタンパク質、遺伝子Ｖタンパク質、およびＭＳ２コートタンパク質間の主要な違いは遺伝子の開始部位に対するそれらの認識部位の置換に関する。例えば、ＲｅｇＡタンパク質の認識部位は該遺伝子のコード領域にある配列からなるので、それによって調節されうる遺伝子を制限する。遺伝子Ｖタンパク質はリボソーム結合配列の上流にある配列を認識するので、低いレベルの翻訳開始が依然あり得る。ＭＳ２に関しては、結合部位は遺伝子のコード領域をカバーしてはいないが、リボソーム結合配列と開始コドンを有する。よって、ＭＳ２システムは最も厳密な抑制を可能としながらも、該部位をなおも普遍的に用いられることを可能とする。
【００１１】
ＭＳ２ＣＰとＭＳ２認識部位の具体的な使用を、ここで提供される実施例でさらに詳細に説明する。これらの実施例に示されるように、ＭＳ２システムのこの特有の使用によって、当業者は細菌における異種遺伝子の発現に通常伴うプロモーターリークの問題を効果的に解決することができる。誘導点以前の産物のリークは通常望ましくないから、商業的な生産の視点からこれが特に有用である。加えて、毒性遺伝子を効果的に発現する能力に関連しているので、これは当分野の研究者らにとっては非常に大きな価値を有する。なぜなら、これらの遺伝子の一部は限定された量で発現される場合に有益な用途があるからである。
【００１２】
細菌発現システムの設計のもう一つの重要な局面は転写の調節である。多くの生物にとって、遺伝子発現のタイミングは特定の転写調節タンパク質の生産により調節されることが知られている。これが多くの異なるバクテリオファージについて特に当てはまり、それらのライフサイクルを通しての進展は、それらの発達の段階に対応する全種類の遺伝子の発現をもたらす異なった転写タンパク質の出現により調節される。例えば、バクテリオファージＴ４はそのライフサイクルをこのようにして進展することが古くから知られており、その実際の機構は最近になって解明された（Ｂｒｏｄｙｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＭｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２８：１−８（１９９５））。この溶菌ファージは、初期、中期および後期の３種類の遺伝子を有する。初期遺伝子プロモーターは強力な大腸菌プロモーターに非常に類似しており、感染直後に宿主ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。二つの初期遺伝子産物のｍｏｔＡとａｓｉＡの蓄積は転写を中期態様にシフトさせる。
【００１３】
ｍｏｔＡタンパク質は、プロモーターの〜３０領域の配列を認識することによりＲＮＡポリメラーゼをＴ４中期プロモーターに導く２３．５ｋＤａのタンパク質である。ａｓｉＡタンパク質は、大腸菌のシグマ７０に結合してそれを非機能的とする抗シグマ因子タンパク質であると元々は考えられた１０．５ｋＤａのタンパク質である。しかし、現在は、ａｓｉＡのシグマ７０への結合は、実際には、大腸菌プロモーターの〜３５領域の認識を止めさせる高次構造の変化を引き起こし、ａｓｉＡタンパク質はｍｏｔＡタンパク質とシグマ７０サブユニットとの橋渡しとして作用すると考えられている。さらに、ａｓｉＡタンパク質はＴ４初期プロモーターの認識も抑制する。ｍｏｔＡとａｓｉＡはＴ４中期プロモーターからの転写を特定するのには必要かつ十分である。これらの詳細は精製されたｍｏｔＡとａｓｉＡおよび未修飾の大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写アッセイにより決定された（Ｏｕｈａｍｍｏｕｃｈｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１４５１−１４５５（１９９５））。
【００１４】
本発明は前核宿主細胞にクローニングされた遺伝子の転写を調節するＴ４中期プロモーターの新規で新しい使用を提供する。本プロモーターシステムの主要な利点は、このシステムが大腸菌プロモーターからの転写を抑制しながら、特定のプロモーターからの転写を指令することにあり、このようにして翻訳装置に対する競合を最小化し、かつプロテアーゼ遺伝子の転写を誘導することにより細胞が標的タンパク質の生産に応答するのを抑制する。ここに記載のＴ４中期プロモーターシステムを用いることにより、単一シグナルにより誘導可能な「段階化」発現サイクルにおいて標的タンパク質の誘導前にある種の付属タンパク質を発現することもできるので、そのような発現を達成するために通常は多誘導を必要とする最近の発現方法の複雑な性質を低減させている。Ｔ４中期プロモーターシステムの詳細はここで提供する実施例に記載する。
【００１５】
本発明は、翻訳を厳密に調節するＭＳ２システムの利用と、転写を調節するＴ４中期プロモーターの利用により、大腸菌および他の宿主細胞において、毒性遺伝子を含む外来遺伝子を発現することができる効率のよい厳密に調節された発現ベクターシステムを提供する。ここに記載されたシステムは、他の公知のシステムに伴う問題に取り組んだことに加えて、前に記載されたシステムよりもさらに普遍性のある段階化プロモーターシステムを初めて提供する。これらのシステムは細菌発現システム設計の領域の研究者らには非常に大きな価値があろう。
【００１６】
発明の要約
本発明は、構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーを含む、宿主細胞における異種遺伝子のクローニングまたは発現に用いられる翻訳抑制システムを提供する。好ましい実施態様において、該翻訳リプレッサーはバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である。
【００１７】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための改良された方法を提供する。この方法は、プラスミドベクターにより形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該ベクターは、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位に連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節する。好ましい実施態様において、翻訳リプレッサーはＭＳコートタンパク質である。一実施態様において、該ベクターは、バクテリオファージＴ７の０．３〜０．７初期遺伝子をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）をさらに有する。
【００１８】
さらに、本発明は、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列と翻訳リプレッサー認識部位に連結された異種遺伝子を含む第一のプラスミドベクターおよび構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を含む第二のプラスミドベクターにより共形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節する、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための改良された方法を提供する。好ましい実施態様において、翻訳リプレッサーはＭＳ２コートタンパク質である。
【００１９】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための改良された方法であって、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列および翻訳リプレッサー認識部位に連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターにより形質転換され、構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節する、該方法を提供する。好ましい実施態様において、翻訳リプレッサーはＭＳ２コートタンパク質である。
【００２０】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現ののための改良された方法であって、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位に連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節する、方法を提供する。好ましい実施態様において、翻訳リプレッサーはＭＳコートタンパク質である。
【００２１】
さらに、本発明は、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、Ｔ７遺伝子１に連結されたＭＳ２認識部位、および弱い構成プロモーターの調節下のＭＳ２コートタンパク質遺伝子を含む「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、異種遺伝子を発現することができ、「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」を有する宿主細胞を提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、異種遺伝子の発現のための改良された方法であって、該異種遺伝子をＴ７プロモーターの調節下にコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターで形質転換され、「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」を有する宿主細胞を適切な条件下で培養することを含む該方法を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、異なる濃度のＭＳ２ＣＰを作るように設計された異種遺伝子のクローニングまたは発現が可能な一連の宿主細胞を提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための段階化された誘導プロモーターシステムであって、細菌宿主プロモーターからの一般的な転写を抑制しながら、特定のプロモーターからの直接の転写を指令する制御転写調節タンパク質を有する該システムを提供する。好ましい実施態様において、転写調節タンパク質はｍｏｔＡおよびａｓｉＡであり、該タンパク質はＭＳ２ＣＰにより制御されている。
【００２６】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための改良された方法であって、Ｔ４中期プロモーターの調節下の該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第一のプラスミドベクター、および誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位にそれぞれ連結されたｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子の配列、および構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーを含む第二のプラスミドベクターにより共形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該翻訳リプレッサーは該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子の発現を調節し、かつ該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子は該誘導プロモーターからの転写を抑制しながらＴ４中期プロモータからの直接の転写を指示する、該方法を提供する。好ましい実施態様において、翻訳リプレッサーはＭＳ２コートタンパク質である。一実施態様において、第二プラスミドベクターがさらに付属タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する。
【００２７】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための改良された方法であって、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位にそれぞれ連結されたｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子配列、および構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーを有する宿主細胞であって、該翻訳リプレッサーは該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子の発現を調節し、該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子は誘導プロモーターからの転写を抑制しながらＴ４中期プロモータからの直接の転写を指示する、Ｔ４中期プロモーターの調節下の連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列からなるプラスミドベクターにより形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含む該方法を提供する。好ましい実施態様において、翻訳リプレッサーはＭＳ２コートタンパク質である。
【００２８】
さらに、本発明は、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、ＭＳ２認識配列にそれぞれ連結されたｍｏｔＡおよびａｓｉＡ遺伝子配列、および構成プロモーターの調節下のＭＳ２コートタンパク質遺伝子を含む「ＭＳ−２に基づくＴ４カセット」を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、異種遺伝子を発現することが可能で、「ＭＳ２に基づくＴ４カセット」を有する前核宿主細胞を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、異種遺伝子のクローニングまたは発現のための改良された方法であって、Ｔ４プロモーターの調節下に該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターにより形質転換され、「ＭＳ−２に基づくＴ４カセット」を有する宿主細胞を適切な条件下に培養することを含む、該方法を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列および配列番号２のＤＮＡ配列を提供する。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１は、本発明のシステムに用いられる野生型ＭＳ２コートタンパク質の完全遺伝子配列（配列番号１）である。該遺伝子は５’末端にＮｄｅＩ部位を有し、３’末端にＢａｍＨＩ部位を有する。
【００３３】
図２は、ｗｔＭＳ２ＣＰ発現実験の結果を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１は０．６のＯＤまで増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞（ｐＴ７−７中にｗｔＭＳ２ＣＰ遺伝子を有する）からの非誘導の推定陽性クローンであり；レーン２〜１４は３７℃での４時間の誘導後にＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞（ｐＴ７−７中にｗｔＭＳ２ＣＰ遺伝子を有する）からの多様な推定陽性クローンである。レーン１５は低範囲のＡｍｅｒｓｈａｍレインボーマーカーである。
【００３４】
図３は、本発明で開発されたｐＲＩＮプラスミドベクターの模式図である。
【００３５】
図４は、Ｔ７遺伝子１がクローニングされた種々のｐＲＩＮプラスミドベクターを用いて実施された発現およびリーク実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。この特別なブロットは一晩の静置培養物のものであり、レーンの各セットは、同一ベクター中において下流ボックスをプラスまたはマイナス（ｍ）したＴ７遺伝子１である。レーンの最初の３セットは、多様なＭＳ２ＣＰを有するｐＲＩＮ１１（ＰＳ４プロモーター）を用いている。レーンの最後の３セットは、多様なＭＳ２ＣＰを有するｐＲＩＮ２０（ＵＶ５ｌａｃプロモーター）を用いている。レーン４は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００３６】
図５は、Ｔ７遺伝子１がクローニングされた種々のｐＲＩＮプラスミドベクターを用いて実施された発現およびリーク実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。この特定のブロットは指数増殖期の前誘導培養物（ｐｒｅＩ）のものであり、レーンの各セットは、同一ベクター中において下流ボックスをプラスまたはマイナス（ｍ）したＴ７遺伝子１である。レーンの最初の３セットは多様なＭＳ２ＣＰを有するｐＲＩＮ１１（ＰＳ４プロモーター）を用いている。レーンの最後の３セットは多様なＭＳ２ＣＰを有するｐＲＩＮ２０（ＵＶ５ｌａｃプロモーター）を用いている。レーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００３７】
図６は、Ｔ７遺伝子１がクローニングされた種々のｐＲＩＮプラスミドベクターを用いて実施された発現およびリーク実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。この特定のブロットは２８℃で増殖させたＩＰＴＧ誘導培養物のものであり、レーンの各セットは、同一ベクター中において下流ボックスをプラスまたはマイナス（ｍ）した遺伝子１である。レーンの最初の３セットは多様なＭＳ２ＣＰを有するｐＲＩＮ１１（ＰＳ４プロモーター）を用いている。レーンの最後の３セットは多様なＭＳ２ＣＰを有するｐＲＩＮ２０（ＵＶ５ｌａｃプロモーター）を用いている。レーン２は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００３８】
図７は、「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」の模式図である。
【００３９】
図８は、市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン３〜５）、第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン１〜２）、ＥＥ１１−２０株（レーン６〜８）、および第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０株（レーン９〜１０）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの写真である。比較は標的産物遺伝子としてＮＴ−３の発現に基づいた。レーン１、５、６および１０は一晩（ＯＮ）培養物を表し、レーン４と７は前誘導（ＰｒｅＩ）培養物を表し、そしてレーン２、３、８および９は、（２８℃でＩＰＴＧを用いる）誘導（Ｉ−２８）培養物を表す。
【００４０】
図９は、市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン３〜５）、第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン１〜２）、ＥＥ１１−２０株（レーン６〜８）、および第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０株（レーン９〜１０）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの写真である。比較は標的産物遺伝子としてＢＤＮＦの発現に基づいた。レーン１、５、６および１０は一晩（ＯＮ）培養物を表し、レーン４と７は前誘導（ＰｒｅＩ）培養物を表し、そしてレーン２、３、８および９は、（２８℃でＩＰＴＧを用いる）誘導（Ｉ−２８）培養物を表す。
【００４１】
図１０は、市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン３〜５）、第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン１〜２）、ＥＥ１１−２０株（レーン６〜８）、および第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０株（レーン９〜１０）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの写真である。比較は標的産物遺伝子としてＢＤＮＦの発現に基づいた。レーン１、５、６および１０は一晩（ＯＮ）培養物を表し、レーン４と７は前誘導（ＰｒｅＩ）培養物を表し、そしてレーン２、３、８および９は、（２８℃でＩＰＴＧを用いる）誘導（Ｉ−２８）培養物を表す。
【００４２】
図１１は市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン５〜７）とＥＥ１１−１１Ｍ株（レーン２〜４）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの図である。これらの比較は標的産物遺伝子としてＢＤＮＦの発現に基づいた。レーン４と５は一晩（ＯＮ）培養物を表し、レーン３と７は前誘導（ｐｒｅＩ）培養物を表し、そしてレーン２と６は（２８℃でＩＰＴＧを用いる）誘導（Ｉ−２８）培養物を表す。レーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００４３】
図１２は標的産物遺伝子としてＮＴ−３の発現を用いたＥＥ１１−１１Ｍ株のリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン５は一晩（ＯＮ）培養物を表し、レーン４は前誘導（ｐｒｅＩ）培養物を表し、そしてレーン２と３は２８℃でＩＰＴＧ（Ｉ−２８）または３７℃でＩＰＴＧ（Ｉ−３７）を用いた培養物をそれぞれ表す。レーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００４４】
図１３は株ＥＥ１１−１１ＭでのｐＡＭＧ２５においてＧＣＳＦの１０リットル発酵誘導の時間経過を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１は誘導時の培養物である。レーン２は誘導時の培養物である。レーン３〜９は誘発物質（ＩＰＴＧ）の存在下でさらなる増殖時間後の培養物であり、例えばレーン３は１時間後、レーン４は２時間後、等々である。レーン１０は、Ａｍｅｒｓｈａｍの低分子量レインボーマーカーである。最後のレーンはＧＣＳＦマーカーである。
【００４５】
図１４は、株ＥＥ１１−１１ＭでのｐＡＭＧ２５においてレプチンの１０リットル発酵誘導の時間経過を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１はＡｍｅｒｓｈａｍの低分子量レインボーマーカーである。レーン２は誘導時の培養物である。レーン３〜８は誘発物質（ＩＰＴＧ）の存在下でさらなる増殖時間後の培養物であり、例えばレーン３は１時間後、レーン４は２時間後、等々である。レーン９はレプチンマーカーである。
【００４６】
図１５は、Ｔ７の０．４初期遺伝子がクローニングされたＭＳ２に基づくシステムを用いて実施された発現実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。レーン２、４、６および８は４２℃での４時間の誘導後の４種類の異なる０．４を有する培養物を表し、レーン３、５、７および９は同一培養物の非誘導試料である。レーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００４７】
図１６は、Ｔ７の０．６初期遺伝子がクローニングされたＭＳ２に基づくシステムを用いて実施された発現実験の結果を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン２と４は２種類の異なる０．６を有する培養物を表し、レーン３と５は４２℃での４時間の誘導後の同一試料である。レーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００４８】
図１７は、Ｔ７の初期遺伝子（０．３〜０．７）を有するように構築された３−７ｔオペロンの完全な遺伝子配列（配列番号２）である。
【００４９】
図１８は、Ｔ７初期タンパク質の非存在および存在下でのＮＤＦアルファ／ベータの発現を比較するＳＤＳゲルの写真である。３−７ｔオペロンはｐＲＩＮ１０中に存在し、２８℃から３７℃への温度変化により誘導された。ＮＤＦアルファ／ベータはプラスミドｐＡＭＧ３３中に存在し、温度が２８℃に戻るときにＩＰＴＧの添加により誘導される。ゲルの左半分はＴ７初期遺伝子の非存在下でのＮＤＦアルファ／ベータの時間経過である。レーン１は初期タンパク質の誘導後であるが、ＮＤＦアルファ／ベータの誘導前である。レーン２〜４は誘発物質（ＩＰＴＧ）の存在下でさらなる増殖時間後の培養物で、例えばレーン２は１時間後、レーン３は２時間後、等々である。レーン５はＡｍｅｒｓｈａｍの低分子量レインボーマーカーである。ゲルの右半分はＴ７初期タンパク質の存在下でのＮＤＦアルファ／ベータ発現の時間経過である。レーン６は初期タンパク質の誘導後であるが、ＮＤＦアルファ／ベータの誘導前である。レーン７〜９は誘発物質（ＩＰＴＧ）の存在下でのさらなる増殖時間後の培養物である。
【００５０】
図１９は、Ｔ７初期タンパク質の存在下および非存在下におけるヒトテロメラーゼサブユニットＴＰ２（３０１〜９４１ＴＰ２）の末端切除物の発現を比較するゲルのウエスタンブロットの写真である。３−７ｔオペロンはｐＲＩＮ１０中に存在し、２８℃から３７℃への温度変化により誘導された。３０１−９４１ＴＰ２はプラスミドｐＡＭＧ２２中に存在し、温度を２８℃に戻すときにＩＰＴＧの添加により誘導される。レーン１はＴ７初期タンパク質の存在下における３０１−９４１ＴＰ２の前誘導試料である。レーン２はＴ７初期タンパク質の存在下における２８℃での２時間の誘導後の３０１−９４１ＴＰ２の発現である。レーン３はＴ７初期タンパク質の存在下における３７℃での２時間の誘導後の３０１−９４１ＴＰ２の発現である。レーン４はＴ７初期タンパク質の非存在下における３０１−９４１ＴＰ２の前誘導試料である。レーン５はＴ７初期タンパク質の非存在下における３７℃での２時間の誘導後の３０１−９４１ＴＰ２の発現である。
【００５１】
図２０は、株ＧＭ３１５、ＧＭ３２０、ＧＭ３４０およびＧＭ３５０による種々の量のＭＳ２コートタンパク質の受動的な生産を示すゲルのウエスタンブロットの写真である。これらの株を、それらが作られた元の親株に対して比較した。レーン１はＧＭ３１５の対数期培養物を示す。レーン２、４、６、８および１０は親株３９３である。レーン３と５はＧＭ３２０であり、レーン７はＧＭ３４０であり、レーン９はＧＭ３５０である。
【００５２】
図２１は、種々の量のＭＳ２コートタンパク質を有する株においてＣ型肝炎ポリメラーゼ（ＨｅｐＣｐｏｌ）の発現を示すゲルの写真である（各発現実験の可溶性および不溶性フラクションも比較する）。レーン１は分子量マーカーである。レーン２は、ＭＳ２コートタンパク質を有さない株ＧＭ２２１で発現されたｐＡＭＧ２１におけるＨｅｐＣｐｏｌの誘導培養物の全細胞抽出物である。レーン３はこの実験からの不溶性フラクションであり、レーン４は可溶性フラクションである。レーン５は、ＭＳ２コートタンパク質を有する株ＧＭ３１５で発現されたｐＡＭＧ２１におけるＨｅｐＣｐｏｌの誘導培養物の全細胞抽出物である。レーン６はこの実験からの不溶性フラクションであり、レーン７は可溶性フラクションである。レーン８はＧＭ３１５よりもさらに多くのＭＳ２コートタンパク質を有する株３２０で発現されたｐＡＭＧ２１におけるＨｅｐＣの誘導培養物の全細胞抽出物である。レーン９はこの実験からの不溶性フラクションであり、レーン１０は可溶性フラクションである。
【００５３】
図２２は、本発明のシステムに用いられるＴ４ＰｕｖｓＸ中期プロモーターの完全ＤＮＡ配列（配列番号３）である。該遺伝子は５’末端にＡａｔＩＩ部位を有し、３’末端にＣｌａＩ部位を有する。
【００５４】
図２３は、本発明のシステムに用いられるＴ４ＰＸ中期プロモーターの完全ＤＮＡ配列（配列番号４）である。該遺伝子は５’末端にＡａｔＩＩ部位を有し、３’末端にＣｌａＩ部位を有する。
【００５５】
図２４は、（ラムダプロモーターの調節下にある）標的産物遺伝子としてのＴ７遺伝子１の発現を用いたｐＡＭＧ１３のリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン５は２８℃で一晩増殖させた静置試料を表し、レーン４は４２℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン３は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００５６】
図２５は、Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧ１３のリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン４は２８℃で一晩増殖させた静置試料を表し、レーン３は４２℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、そしてレーン１は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表す。
【００５７】
図２６は、（ｕｖｓＸＴ４中期プロモーターの調節下にある）Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン４は２８℃で一晩増殖させた静置試料を表し、レーン３は４２℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、そしてレーン１は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表す。
【００５８】
図２７は、Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン５は２８℃で一晩増殖させた静置試料を表し、レーン４は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン３は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００５９】
図２８は、（ｕｖｓＸＴ４中期プロモーターの調節下にある）ＮＴ−３がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン４は４２℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン３は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００６０】
図２９は、（ｕｖｓＸＴ４中期プロモーターの調節下にある）ＢＤＮＦがＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン５は４２℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン４は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン３は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００６１】
図３０は本発明で開発されたｐＣＢプラスミドベクターの模式図である。
【００６２】
図３１は本発明で開発されたｐＡＷプラスミドベクターの模式図である。
【００６３】
図３２は、（Ｔ４Ｘ中期プロモーターの調節下にある）Ｔ７遺伝子１がｐＡＷ２０と共発現させられたｐＡＭＧＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン４は２８℃で一晩誘導させた静置試料を表し、レーン３は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００６４】
図３３は、（Ｔ４Ｘ中期プロモーターの調節下にある）ＳＰＩがｐＡＷ２０と共発現させられたｐＡＭＧＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン３は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００６５】
図３４は、（Ｔ４ｕｖｓＸ中期プロモーターの調節下にある）ＯＰＧがｐＡＷ２０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン４は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００６６】
図３５は、（Ｔ４ｕｖｓＸ中期プロモーターの調節下にある）ＢＤＮＦがｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１は非誘導試料を表し、レーン２は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、そしてレーン３は３７℃で４時間誘導させた試料を表す。
【００６７】
図３６は、（Ｔ４ｕｖｓＸ中期プロモーターの調節下にある）ＯＰＧがｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１はＡｍｅｒｓｈａｍの低分子量レインボーマーカーであり、レーン２は非誘導試料を表し、レーン３は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、そしてレーン４は３７℃で４時間誘導させた試料を表す。
【００６８】
図３７は、（Ｔ４ｕｖｓＸ中期プロモーターの調節下にある）ＮＴ３がｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１は非誘導試料を表し、レーン２は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、そしてレーン３は３７℃で４時間誘導させた試料を表す。
【００６９】
図３８は、（Ｔ４Ｘ中期プロモーターの調節下にある）３ＭＮＤＦがｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン１は非誘導試料を表し、レーン２は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、そしてレーン３は３７℃で４時間誘導させた試料を表す。
【００７０】
図３９は、（Ｔ４ｕｖｓＸ中期プロモーターの調節下にある）ＢＤＮＦが、０．６遺伝子をさらに付属タンパク質として有するＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。レーン５は４２℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン４は３７℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン３は２８℃で４時間誘導させた試料を表し、レーン２は０．６のＯＤになるまで２８℃で増殖させた非誘導試料を表し、そしてレーン１は低範囲のバイオラッド分子量マーカーである。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明の目的のために、「翻訳リプレッサー」はＲＮＡ片上の認識部位に特異的に結合して翻訳を抑制することのできるタンパク質と定義される。本発明において、ＭＳ２コートタンパク質およびＭＳ２認識部位は翻訳リプレッサーシステムを提供するために用いられる。簡単に説明すれば、ＭＳ２ＣＰの発表された配列を用いて、完全な遺伝子を構築するためのオリゴヌクレオチドを作った。次に、ＭＳ２ＣＰが、大腸菌内で細胞増殖に対し明らかな効果を有しなく非常に高いレベルで受入れられることを決定した後、種々のコピー数のプラスミド中の弱い構成プロモーターの調節下にＭＳ２ＣＰを置く。この発想は低いレベルのＭＳ２ＣＰを連続的に作ることにあり、ＭＳ２認識部位を有するクローニングされた遺伝子は、それらの遺伝子を発現するのが有用になるまで完全な休止状態で維持できる。
【００７２】
このアプローチを用いて、このＭＳ２に基づくシステムが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を伴う厳密に調節された改良されたシステムを提供するために用いることができることが示された。クローニングされたＴ７遺伝子１はＴ７プロモーターの調節下に標的遺伝子の選択的な高レベルの発現を指令するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ源を提供する。しかし、重要なことは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは非常に活性があり、選択性があるので、活性のあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの基本レベルを調節すること、すなわちＴ７遺伝子１を非誘導状態で停止させ、標的遺伝子の早すぎる発現を妨げる。
【００７３】
このように、本発明で利用される手法は、コード配列に連結させたＭＳ２認識部位を有するＴ７遺伝子１のクローニング、および、弱い構成プロモーターの調節下にあるＭＳコートタンパク質のコピーとともに、この構築物の染色体への挿入を伴った。これらの２遺伝子はそれぞれのプロモーターが反対の方向に向けられるように末端同士を合わせてクローニングした。これにより、この「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１」構築物の染色体コピーを有する宿主細胞は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを効果的に生産するようになり、それにより標的遺伝子の発現を誘発するために用いることができることが示された。
【００７４】
本発明のシステムにおいて首尾よく試験された標的遺伝子としては、Ｔ７遺伝子１、神経栄養因子−３（ＮＴ−３）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、セリンプロテアーゼインヒビター（ＳＰＩ）およびオステオプロテグリン（ＯＰＧ）、神経分化因子（ＮＤＦ）アルファ／ベータ、Ｃ型肝炎ポリメラーゼ、ヒトテロメラーゼおよびそれらの類似体、誘導体および変種が含まれる。種々のＭＳ２により調節されたシステムが、前核宿主細胞中において、クローニングされた遺伝子の、毒性のあるなしにかかわらず、向上した調節を提供できると考えられる。
【００７５】
このＭＳ２に基づくシステムは、ある種の毒性遺伝子を安定にクローン化し、発現するために用いることができることがさらに示された。ここで用いられる毒性遺伝子とは、宿主細胞におけるその発現によって、毒性遺伝子の発現がない場合に培養中の宿主細胞が達成したであろう正常な対数増殖を妨げる遺伝子である。本発明での例として、バクテリオファージＴ７の初期遺伝子を、ｍｏｔＡとａｓｉＡとして、クローニングし、発現した。バクテリオファージＴ７の初期遺伝子のいくつかは毒性があることが知られている（ＳｔｕｄｉｅｒａｎｄＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５３：５０３−５２５（１９８１））。特に、０．７遺伝子は大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを抑制する機能をコードしていて致死的である。ｍｏｔＡとａｓｉＡも毒性があることが現在知られている（Ｈｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，２７４：４３−５７（１９９６）。そのような遺伝子を発現する能力は、これらの遺伝子のいくつかがファージ感染による大腸菌での異種遺伝子の発現に対して正の効果を有することが示されたので顕著な価値を有する。言い換えれば、標的遺伝子の発現直前に発現用細胞に存在するこれら遺伝子のクローニングされたコピーを持つのが有用な場合がある。
【００７６】
ここに提供される実施例において、Ｔ７遺伝子１はＵＶ５ｌａｃプロモーター（Ｆｕｌｌｅｒ，Ｆ．，Ｇｅｎｅ，１９：４３−５４（１９８２）、ＰＳ４プロモーター（１９９５年１０月１２発行のＷＯ９５／２６７２４６（Ｂａｒｔｌｅｙら）およびｌｕｘプロモーター（１９９３年３月２３日発行の米国特許第５，１９６，３１８号（Ｂａｌｄｗｉｎら））の調節下にあった。しかし、重要なことは、Ｔ７遺伝子１は、ｔｒｐまたはｌｐｐ等の細菌プロモーターを含めた誘導プロモーター、ラムダＰ_ＬまたはＰ_Ｒ等のファージプロモーター、またはｔａｃまたはｔｒｃ等の合成プロモーターの調節下に置くことができたことである。
【００７７】
本発明のシステムに効果的なものとしてここに開発、記載されるのはＭＳ２ＣＰの変異体である。例えば、２９位のバリン残基のコドンがイソロイシンのコドンに変わったＭＳ２ＣＰの変異体が構築された。この変異は、コートタンパク質の二量体がキャプシドサイズの凝集体へ会合する能力をもたらす（Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄＥｌｙ，Ｒ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，２０（７）：１６４９−１６５５（１９９２））。コートタンパク質は二量体としてそのｍＲＮＡ標的に結合し、二量体の多量化がｍＲＮＡとの会合を抑制すると考えられているので、この変異はさらに多くのコートタンパク質を多量体よりも二量体の状態で保持することにより、実際のタンパク質濃度を高めることなく、存在する翻訳リプレッサーの効果的な濃度を増加させると期待されよう。ＭＳ２ＣＰの他の変異体が本発明のシステムに効果的であることは、当業者らは理解するであろう。
【００７８】
ここに提供される実施例は、具体的にはバクテリオファージＭＳ２システムを利用するが、他の類似のシステム、例えば、Ｑβ、ＧＡ、ＳＰ、Ｒ１７、ｆ２およびｆｒが翻訳リプレッサーシステムとして同様に用いることができるとは予想できないことではなかろう。
【００７９】
本発明で使用され評価された宿主細胞としては大腸菌Ｂ株ＢＬ２１（ＤＥ３）±ｐＬｙｓＳおよび大腸菌Ｋ株ＥＥ１１２０±ｐＬｙｓＳが含まれる。他の通常用いられる大腸菌Ｂ株およびＫ株は本発明の実施に効果的であることが当業者らにより明確に理解されよう。多様な真核宿主細胞は本発明の実施に利用できることも理解されよう。
【００８０】
強い転写ターミネーターももちろん本発明のシステムに用いられる。そのようなターミネーターを興味のあるプロモーター（例えば、Ｔ７遺伝子１の発現を指令するプロモーター）の上流に挿入することにより、隠れたプロモーター配列からのリードスルー転写が行なわれないので、さらに厳密に調節されたシステムが提供される。Ｔ１Ｔ２ターミネーター（Ａｍｍａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５：１６７−１７８（１９８３））が本発明の実施例で用いられたが、他の強力なターミネーター、例えば本発明のシステムで効果的に働くことが明らかに期待されるｔ_ＨＰがある（Ｎｏｈｎｏｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：２６０−２６９（１９８６））。
【００８１】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが本発明の実施例で用いられたが、Ｔ７様ファージに由来する同等のＲＮＡポリメラーゼも機能するであろう。そのようなファージが当分野において詳細に記載されている（例えば、Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｒ．、「バクテリオファージにおけるＴ７グループ」（“ＴｈｅＴ７ＧｒｏｕｐｉｎＴｈｅＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ”）、第８章、２５９−２８３ページ、プレナムプレス、ニューヨーク（１９８８）を参照されたい）。
【００８２】
さらに、本発明において、誘導プロモーターの調節下のｍｏｔＡおよびａｓｉＡ遺伝子からなる特別に構築されたオペロンを用いたクローン化Ｔ４中期プロモーターのインビボ活性化のためのシステムの構築が述べられる。このプロモーターシステムの主要な利点は、大腸菌プロモーターからの転写を抑制しながら特定のプロモーターの転写を指令することにあり、こうして翻訳装置に対する競合を最小化し、かつプロテアーゼ遺伝子の転写を誘導することにより細胞が標的タンパク質の生産に応答するのを抑制する。該システムが、なかでも、標的タンパク質の生産に役立つある種の付属タンパク質の発現に有用でありうる「計画」発現サイクルを提供することも示された。
【００８３】
さらに具体的には、この発想は、付属タンパク質がｍｏｔＡとａｓｉＡプロモーターと同じように誘導されるプロモーター下にクローニングできることであり、またはそれらがすべて単一のオペロン構造の同一プロモーターの調節下に置くことができることにあった。その誘導シグナルが与えられるとき、これらの付属タンパク質およびｍｏｔＡとａｓｉＡが同時に作られるであろう。ｍｏｔＡとａｓｉＡが飽和レベル（存在するＲＮＡポリメラーゼ分子数と等しいかまたはそれより若干高い）に達したときに、大腸菌プロモーターからの転写が抑制され、発現サイクルの当該段階を終わらせる。次に、ＲＮＡポリメラーゼは標的タンパク質の発現を導くＴ４中期プロモーターのみに向けられよう。大腸菌においてこれを行いうる利用可能なシステムは現在のところ存在しない。
【００８４】
そのような付属タンパク質をこのように発現する能力は前核生物システムでタンパク質の発現を向上させるのに大きな利点を持ちうる。例えば、Ｙａｓｕｋａｗａら（ＴｈｅＪｏｕｒｎ．ｏｆＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（４３２）：２５３２８−２５３３１（１９９５））は、大腸菌チオレドキシン（Ｔｒｘ）または大腸菌シャペロン類ＧｒｏＥＳＬの共生産が、大腸菌で作られる多様な脊椎動物タンパク質の溶解性を高めた（Ｔｒｘが最も効果的であった）ことを報告した。これが重要で、有用な発見であるのは、真核生物のタンパク質がしばしば不溶性の会合体として大腸菌で作られ、これが巨大分子構造物の研究に対する障壁の一つであるためである。
【００８５】
本発明において、ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子はラムダＰ_Ｌプロモーター下にクローニングされ、またｌａｃ由来のプロモーター下にもクローニングされた。しかし、重要なことは、ｔｒｐ、またはｌｐｐを含む細菌プロモーター、ラムダＰ_ＬまたはＰ_Ｒ等のファージプロモーター、またはｔａｃまたはｔｒｃ等の合成プロモーターを含めた誘導プロモーターが機能しうることある。
【００８６】
Ｔ４中期プロモーターが「リーク」しやすいことがわかり、さらに重要なことに毒性遺伝子のｍｏｔＡとａｓｉＡは注意深く調節する必要があるために、ＭＳ２システムとＴ４中期プロモーターシステムの特徴が組み合わされた。ｍｏｔＡ／ａｓｉＡオペロンは、それらの両遺伝子がＭＳ２認識部位に連結させないかぎりクローニングできないことがわかった。よって、宿主細胞染色体に挿入される最適な「ＭＳ２−に基づくＴ４カセット」は、ＭＳ２コートタンパク質の認識配列に連結させたｍｏｔＡおよびａｓｉＡ遺伝子配列（±付属タンパク質配列）を持つｍｏｔＡ−ａｓｉＡ誘導プロモーター、および弱い構成プロモーターに機能的に連結させたＭＳ２コートタンパク質を含有する。
【００８７】
このシステムを利用すれば、低いレベルのＭＳ２ＣＰの生産によって、ｍｏｔＡ／ａｓｉＡの生産（および望むなら付属タンパク質の生産）を引き起こして大腸菌転写を止めた後に、Ｔ４中期プロモーターにより引き起こされる標的遺伝子の生産の誘導が起こるまでＴ４中期プロモーターのリークとｍｏｔＡ／ａｓｉＡの生産が妨げられる。
【００８８】
さらに、ここで開発され記載されるのは、異なる濃度のＭＳ２ＣＰを産生するように設計された一連の大腸菌株である。これらの株は、それらの染色体ＤＮＡの特定の部位に組み込まれた修飾ＴＥＴプロモーター配列の調節下にＭＳコートタンパク質を有している。ＴＥＴプロモーター配列は、〜１０および〜３５領域の塩基を変更して、強力な大腸菌プロモーターのこれらの領域の共通配列と配列を相同化することにより修飾した。さらに、それらＴＥＴプロモーター配列はリボソーム結合部位の配列をランダム化させるオリゴヌクレオチドを用いて変更した。これらの変更はウエスタン分析により測定されたように、さらに高いレベルのＭＳ２コートタンパク質を作る多くの形態の同定を可能とした。
【００８９】
本発明の種々のＭＳ−２含有株を利用して、慣用の技術ではクローニングできない毒性遺伝子や他の遺伝子をクローニングすることができる。例えば、毒性遺伝子を用いた研究の場合、最初の連結の達成は、毒性に最も影響を受ける工程であるために、クローニング法において最も困難な工程であることがわかっている。しかし、安定なクローンがいったん単離されたならば、次にそれを他の細胞系を無事に形質転換することができる。ＧＭ３５０を用いて、毒性または「クローニングできない」遺伝子をＭＳ２認識部位に連結し、次にその連結物を用いてＧＭ３５０を形質転換することができよう。ＧＭ３５０は最大生産量のＭＳ２コートタンパク質を有するために（実際、非常に多くのＭＳ２ＣＰが作られるので誘導の際に発現が効果的に失われる）、ＧＭ３５０を用いて安定なクローンを同定し、得ることができる。いったん安定なクローンが得られ、その配列が決定されたならば、その組み換えプラスミドを用いて、少ない量のコートタンパク質を作る他のＭＳ２株を形質転換することができる。各株におけるクローンの安定性が測定でき、該タンパク質が最終的にそのような一つの株で発現する。最初のクローンを得た後に毒性が持続する場合、低いレベルのＭＳ２ＣＰ生産菌、例えば、ＧＭ３１５やＧＭ３２０がこれらの構築物を安定化するのに有用であろう。
【００９０】
下記の実施例は本発明をさらに十分に説明するために提供されるものであるが、その範囲を限定するものとして理解されるべきではない。実施例１は野生型ＭＳ２コート（ｗｔＭＳ２ＣＰ）タンパク質遺伝子の構築を説明し、次に大腸菌でのその発現能およびそのような発現が細胞増殖に対してもつ効果についてのｗｔＭＳ２ＣＰの試験結果を提供する。実施例２はＭＳ２コートタンパク質遺伝子の２種類の変異体の構築を説明する。実施例３は翻訳抑制システムの開発に用いられるｗｔＭＳ２ＣＰまたはＭＳ２ＣＰ変異体を有するｐＲＩＮプラスミドベクターの構築を説明する。実施例４はＴ７遺伝子１のｐＲＩＮプラスミドベクターへのクローニング、およびそれに続く該ベクターの発現およびシステムのリークに関する試験を説明する。実施例５は「ＭＳ２で調節されるＴ７遺伝子１カセット」の宿主細胞染色体への染色体挿入を説明し、次に多様な標的遺伝子を発現する宿主株の利用を示し、ならびに新しく開発された株のリークと発現特性が市販のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを有する株と比較される試験結果を提供する。実施例６は新しく開発された株の高密度の大規模発酵を説明する。実施例７は多様なＴ７初期遺伝子をクローニングするためのＭＳ２システムの利用を説明する。実施例８は異種タンパク質生産を増強する際のＴ７初期遺伝子の試験を説明する。実施例９は、異なる濃度のＭＳ２ＣＰを作るように設計された株を作るために、多様な変更ＴＥＴプロモーターの調節下にあるＭＳ２コートタンパク質遺伝子の染色体挿入、および毒性遺伝子をクローニングする能力についてこれら株の試験結果を説明する。実施例１０は、ｐＡＭＧｕｖｘｓプラスミド、ｐＡＭＧＸプラスミド、および多コピープラスミドを用いるＴ４中期プロモーター系システムを開発するために用いられるオペロンｐＲＩＮシステムの構築を説明する。実施例１１は、実施例１０で調製、記載されたｐＡＭＧｕｖｘｓプラスミド、ｐＡＭＧＸプラスミドおよびＴ４オペロンｐＲＩＮシステムの試験を説明する。実施例１２は、ＭＳ２システムを有する単一コピープラスミドへのｍｏｔＡ／ａｓｉＡオペロンのクローニングを説明する。実施例１３は実施例１２で調製、説明された単一コピープラスミドの試験を説明する。実施例１４は付属タンパク質を効率的に発現することにより標的タンパク質の発現を増強するＭＳ２／Ｔ４に基づくシステムの利用を説明する。
【００９１】
材料と方法
下記の実施例において、下記の細菌プラスミド／発現ベクターを利用する：ｐＡＭＧ１３、ｐＡＭＧ２１、ｐＡＭＧ２２、ｐＡＭＧ２５、ｐＡＭＧ３３、および３００２ｎａｈＧ（それぞれが本出願に関連して既に寄託されたか、または寄託されている）；ｐＴ７−７（ＴａｂｏｒａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４−１０７８（１９８５））；ｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３４：１１４１−１１５６（１９７８）；Ｒｏｓｅ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１６：３５５（１９８８ａ））；ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｍａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５：１６７−１７８（１９８３））；ｐＧＰ１−２（ＴａｂｏｒａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４−１０７８（１９８５））；およびｐＳＣ１０１（ＢｅｒｎａｒｄｉａｎｄＢｅｒｎａｒｄｉ，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：９４１５−９４２６）。
【００９２】
下記の実施例において、特に示されない場合は以下に提供される方法が用いられた。
【００９３】
１．連結
すべての連結を４０μｌの最終容積で行った。約５０ｎｇ〜５００ｎｇの各ベクターを用い、５００ｎｇ〜２μｌの各挿入物が用いられた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１ユニットの活性で加え、反応物を１６℃で一晩インキュベートする。次に、反応物を２．５Ｍまでの酢酸アンモニウムの添加により沈殿させ、２．５容量のエタノールを加えた。次に、反応混合物を−８０℃で少なくとも１時間インキュベートし、次に１５，０００ｒｐｍ（４℃）で３０分間遠心した。得られたペレットを当初の４０μｌに再懸濁し、４μｌのアリコートを電気泳動に用いた。
【００９４】
２．オリゴヌクレオチドのキナーゼ反応とアニーリング
オリゴヌクレオチドを水に２０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で再懸濁した。各オリゴヌクレオチドの１２．５μｌのアリコートをキナーゼ反応に用いた。これに２μｌのＡＴＰを加え、２μｌの連結緩衝液と２．５μｌの水を加える。この反応を１μｌのＰＮＫの添加により開始し、３７℃で１時間インキュベートする。次に、試料を１５分間６５℃に加熱する。次に、相補対を混合し、１分間１００℃まで加熱し、室温まで冷却し、次に氷上に置く。この時点で、アニールされたオリゴヌクレオチドは連結する準備ができている。特に長い配列のために、全領域にまたがり、３末端に６〜１２個の相補塩基を有する二種類のオリゴヌクレオチドが注文されよう。これらは１００μｌのＰＣＲ反応物中で鋳型とプライマー（１ｐｍｏｌ／μｌの最終濃度）の両者として用いられ、ゲル精製後の連結前に制限消化されよう。
【００９５】
３．ＰＣＲ反応
幾つかの標準的なプログラムをＰＣＲ操作のためにいつものように用いた。遺伝子またはオペロン断片を増幅する場合、その反応容量は１００μｌであった。１０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマーの１０μｌのアリコートを各反応物に添加して、鋳型を５０ｎｇ〜２５０ｎｇ加える。反応を２５サイクルで行う。最初の工程は９４℃で３０秒間であり、次に５０℃で２分間であり、その後は７２℃で３分間である。増幅された断片はＳｅａＫｅｍＧＴＧ（ＦＭＣ）アガロースゲルでゲル精製した。該ＤＮＡをＱｉａｅｘＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてアガロースから回収した。
【００９６】
陽性クローンを同定するためのコロニーのスクリーニング反応は２０μｌ容量で実施する。オリゴヌクレオチドは０．２５ｐｍｏｌ／μｌの最終濃度で存在する。コロニーをピペットの先を用いて採取し、反応混合物に溶解する。１μｌのアリコートを取って、これを適当な抗生物質を有するＬＢの５ｍｌチューブに接種する。ＰＣＲ反応は３０サイクル行う。最初の工程は９４℃で３０秒間であり、その後は３０秒間の３７℃でのアニ−リングおよび３０秒間の７２℃での伸長である。大きな挿入物（＞１０００塩基）に関しては、伸長時間は１分間に延長する。次に、反応物をアガロースゲル（０．８〜１．０％）にかけ、陽性物をスタンダードに対する移動とベクター模擬反応により同定する。
【００９７】
実施例１
本実施例は、野生型ＭＳ２コートタンパク質遺伝子（ｗｔＭＳ２ＣＰ）の構築を記載し、次に大腸菌での発現能およびその発現が宿主細胞の増殖に与える効果についてｗｔＭＳ２ＣＰの試験結果を提供する。
【００９８】
ＭＳ２コートタンパク質の発表されたタンパク質の配列（Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｄ．，ＥＭＢＯＪ．，１２（２）：５９５−６００（１９９３））を用いて、大腸菌の好ましい利用コドンを用いる遺伝子を設計した。オリゴヌクレオチド９０９〜３４および９０９〜５３（表１を参照）を設計し、これらを用いて遺伝子を構築した。その全遺伝子配列を図１に示す。これらオリゴヌクレオチドは遺伝子の５’末端にＮｄｅＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を包含するように設計した。次に、この遺伝子をＢａｍＨＩとＮｄｅＩの制限酵素で消化し、プラスミドｐＴ７−７にクローニングした（ＴａｂｏｒａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４−１０７８（１９８５））。いったん陽性クローンが同定され、その配列が確認されたら、この遺伝子を、同し制限部位を用いて、プラスミド３００２ｎａｈＧにサブクローニングした。
【００９９】
市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（ウイスコンシン州、マディソン、ノバゲン社）を、ｗｔＭＳ２ＣＰの大腸菌における発現能力を調べるために用いた。ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ＵＶ５ｌａｃプロモーターの調節下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有する大腸菌Ｂ株である。ｐＴ７−７にｗｔＭＳ２ＣＰ遺伝子を有するＢＬ２１（ＤＥ３）のコロニーをプレートから取り、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中の５ｍｌのＬＢ−ａｍｐのアリコートに接種した。この調製物を一晩２８℃で振盪しながら増殖させた。この一晩培養物を、１５ｍｌのチューブに１：１００希釈（５ｍｌに対して５μｌ）にて新しい培地に接種した。これらを０．６の適切なＯＤになるまで振盪しながら２８℃で増殖させた。
【０１００】
ｗｔＭＳ２ＣＰ遺伝子の発現はＩＰＴＧを０．４ｍＭまで加えることにより誘導した。インキュベーションは３７℃で４時間振盪しながら続けた。１ｍｌの試料を取り、細胞を遠心によりペレット化した。それらペレットを０．０１ＯＤ単位／μｌの破砕緩衝液に再懸濁し、試料を５分間沸騰させた。各試料の６μｌのアリコートを４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）で泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色してタンパク質を可視化した。ゲルの写真（図２）で示されているように、レーン８、１０、１１および１２はｗｔＭＳ２ＣＰの生産を示す。これらの生産培養物は、ｐＴ７−７中に機能的ＭＳ２ＣＰ遺伝子を有しないものよりも高い光学密度に達し、宿主細胞の成長に対して明らかな影響なしにＭＳ２ＣＰが効果的に発現できることを示した。
【０１０１】
実施例２
本実施例はＭＳ２コートタンパク質遺伝子の二種類の変異体遺伝子の構築を記載する。
【０１０２】
２９位のバリン残基のコドンがイソロイシンのコドンに変化したＭＳ２コートタンパク質遺伝子の変異体タンパク質を、オリゴヌクレオチド１４５６〜５５とオリゴヌクレオチド１４５６〜５６（表１を参照）を用いたオーバーラップＰＣＲにより構築した。以下、この特定の変異体をＭＳ２ＣＰ−１１と称する。
【０１０３】
１０１位のシステイン残基のコドンがアルギニンのコドンに変化したＭＳ２コートタンパク質遺伝子の変異体タンパク質を、オリゴヌクレオチド１４５６〜６１とオリゴヌクレオチド１４５６〜６２（表１を参照）を用いたオーバーラップＰＣＲにより構築した。以下、この特定の変異体をＭＳ２ＣＰ−１４と称する。
【０１０４】
実施例３
本実施例は翻訳抑制システムの開発に用いられるｗｔＭＳ２ＣＰまたはＭＳ２ＣＰ変異体を有するｐＲＩＮプラスミドベクターの構築を記載する。これらのｐＲＩＮベクターは、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４に基づく多コピーベクター（１５コピー）である（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３４：１１４１−１１５６（１９７８）；Ｒｏｓｅ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１６：３５５（１９８８ａ））。
【０１０５】
ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドを制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。オリゴヌクレオチド９４０〜２９とオリゴヌクレオチド９４０〜３０（表１を参照）をこれらの部位に連結するように設計し、後の利用のために新しい特有の部位を導入した。具体的には、アニールされたオリゴヌクレオチドを切断されたｐＡＣＹＣ１８４ベクターにクローニングすることで、ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を消して、唯一のＰｓｔＩとＳａｃＩ部位ならびに第二のＳｐｈＩ部位を導入した。次に、このプラスミドを制限酵素ＥａｇＩで消化し、オリゴヌクレオチド９４１〜４３および９４１〜４４（表１を参照）を、ＥａｇＩ部位を壊して唯一のＡａｔＩＩ制限部位が導入されたベクターにクローニングした。
【０１０６】
ｎａｈＧプロモーターに連結させた野生型ＭＳ２コートタンパク質遺伝子を有する１０３６〜９９断片（表１を参照）を、実施例１に記載の３００２ｎａｈＧクローンから、ＳａｃＩ部位がプロモーター配列の上流に存在し、ＢａｍＨＩ部位が遺伝子の末端に存在するようにＰＣＲにより構築した。次に、この断片をｐＡＣＹＣ１８４由来のベクター（前の段落に記載）のＳａｃＩからＢａｍＨＩにクローニングした。
【０１０７】
次に、ｎａｈＧプロモーター配列を、下記のようにＴＥＴプロモーター配列で置換した：合成ＴＥＴプロモーターをオリゴヌクレオチド１０１６〜２０および１０１６〜２１（表１を参照）を用いて構築した。ＴＥＴ遺伝子の天然の出発点にＮｄｅＩ部位の導入の変更を行って、ｐＡＣＹＣ１８４に元々あるＴＥＴプロモーター配列を用いて、プロモーターを設計した。プロモーターを構築物のＳａｃＩからＮｄｅＩまでに挿入して、ｗｔＭＳ２ＣＰ遺伝子をＴＥＴプロモーターに機能的に連結させた。
【０１０８】
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２終結配列を有するＤＮＡ断片を、プラスミドｐＫＫ２２３−３（Ａｍｍａｎｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ，２５：１６７−１７８（１９８３））を鋳型として用い、オリゴヌクレオチド１０３６〜６および１０５３〜７１（表１を参照）を用いるＰＣＲにより構築した。この断片を両末端に制限酵素ＡａｔＩＩとＡｖａＩの部位を有するように構築した。上記のｐＡＣＹＣ１８４由来のベクターをこれらの酵素で切断して、この断片を連結した。
【０１０９】
ラムダプロモーターの合成物およびベクターｐＡＭＧ１３からの多クローニング部位をＡａｔＩＩからＢａｍＨＩまでの範囲で切り出した。ｐＡＣＹＣ１８４由来のベクターをこれらの酵素で切断し、ｐＡＭＧ１３からの断片を連結した。得られたプラスミドはｐＲＩＮ１０（ｗｔ）と命名した（図３）。３種類の類似のｐＡＣＹＣ１８４由来のプラスミドも構築し、そのうちの一つはラムダプロモーターの代わりにＰＳ４プロモーターを有し（ｐＲＩＮ１１（ｗｔ）と命名）、一つはラムダプロモーターの代わりにＵＶ５ｌａｃプロモーターを有し（ｐＲＩＮ２０（ｗｔ）と命名）、そして一つはｌｕｘプロモーターを有した（ｐＲＩＮ２２（ｗｔ）と命名）（図３）。
【０１１０】
ＭＳ２ＣＰ−１１およびＭＳ２ＣＰ−１４変異体を有するｐＲＩＮ構築物も構築した。ＴＥＴプロモーターにまだ連結している変異体の断片を、プロモーターの末端にＳｐｈＩ部位、およびＭＳ２ＣＰ変異体遺伝子の末端にＢａｍＨＩを有するように作られた。上記のｐＲＩＮプラスミドをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、プラスミド部分をゲルで精製してｗｔＭＳ２ＣＰ断片を除去した。次に、それらの変異体断片をＳｐｈＩとＢａｍＨＩ部位を用いて連結した。ＭＳ２ＣＰ−１１変異体を有する構築物はｐＲＩＮ１０（１１）、ｐＲＩＮ１１（１１）、ｐＲＩＮ２０（１１）、およびｐＲＩＮ２２（１１）とそれぞれ命名され、ＭＳ２ＣＰ−１４変異体を有する構築物はｐＲＩＮ１０（１４）、ｐＲＩＮ１１（１４）、ｐＲＩＮ２０（１４）およびｐＲＩＮ２２（１４）とそれぞれ命名された。
【０１１１】
実施例４
本実施例は、Ｔ７遺伝子１の種々のｐＲＩＮプラスミドベクターへのクローニング、およびそれに続くプラスミドベクターの発現およびシステムリークに関する試験を記載する。
【０１１２】
Ｔ７遺伝子１を上記の種々のｐＲＩＮプラスミドにクローニングした。Ｔ７遺伝子１遺伝子は、そのコード配列に連結させたＭＳ２コートタンパク質認識配列を有するように、オリゴヌクレオチド９４９〜１および９４９〜２（表１を参照）を用いるＰＣＲで構築した。使用された鋳型はプラスミドｐＧＰ１−２であった（ＴａｂｏｒａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４−１０７８（１９８５））。該遺伝子を種々のｐＲＩＮプラスミドのＸｂａＩからＢａｍＨＩまでにクローニングした。多量化を抑制することで翻訳レプレッサーの効果的濃度の増加を導く能力についてＭＳ２ＣＰ変異体を調べた。調べられたもう一つのパラメーターは遺伝子１の下流ボックス配列（オリゴヌクレオチド１４７７〜８４）（表１を参照）の存在または非存在であった（この配列はリボソームに対する結合を高めることにより翻訳を増強することが示された（Ｓｐｒｅｎｇａｒｔｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８（７）：１７１９−１７２３（１９９０））。
【０１１３】
種々の構築物の一晩培養物を５０ｍｌチューブ内の５ｍｌのＬＢ−ｃａｍ中で２８℃にて増殖させた。これらを、１５ｍｌチューブ内の新しい５ｍｌのＬＢ−ｃａｍに１：１００の希釈で接種した。これらすべてを２８℃シェーカーに戻した。培養物の試料を誘導直前に採取し、この場合の誘導工程はＩＰＴＧの０．４ｍＭの最終濃度までの添加によるものであった。誘導された培養物のインキュベーションは３時間続け、１ｍｌの試料を取った。すべての試料を遠心によりペレット化し、それらペレットを破砕緩衝液に再懸濁させた。５分間の沸騰後、６μｌのそれぞれのアリコートを４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）で泳動した。
【０１１４】
次に、タンパク質をニトロセルロースに電気泳動により移した。ブロットをブロット−ツイーン中で２％の非脂肪乾燥ミルクにより一晩ブロックした（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，ＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第１２章，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８８））。該ブロットにＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対するウサギ由来ポリクローナル抗体をプローブとして１時間反応させた。洗浄後、ブロットに、ロバ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をプローブとして１時間反応させた。これを洗浄し、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、Ｘ線フィルムに露出させた。この露出は、感度を最大化する１５分間とした。このフィルムをコダックのフィルムプロセッサーを用いて現像した。
【０１１５】
図４〜６は、種々の構築物を用いて実施したリークと発現実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。図４は一晩の静置培養物のブロットであり、図５は対数増殖期の前インキュベーション培養物（ｐｒｅＩ）のブロットであり、図６は２８℃で増殖させたＩＰＴＧ誘導培養物のブロットである。これらのブロットの写真により証拠付けられるように、コートタンパク質の存在が一晩のリークに対して劇的な効果を有することは明らかであり（図４と図５を比較されたい）、リークの最も高いコントロールを示す細胞中ではタンパク質蓄積レベルの若干の減少が見られる。より具体的には、そのシグナルは、対応するシステムにより実行されるコントロールの厳密性や程度の関数として、ブロットの左側のレーンでさらに強く、右側レーンで減少している；ＰＳ４プロモーターはＵＶ５ｌａｃプロモーターよりもリークしやすい；下流ボックスの変異はリークを低下させるが、ＰＳ４プロモーターに関する誘導レベルに対してはほとんど影響を持たない；ＭＳ２ＣＰ変異体は一晩の指数増殖培養物においてＴ７遺伝子１のリークに対して野生型よりも厳密な調節を示す；変異体は誘導の際の蓄積レベルに影響を与え、さらに厳密に調節された一晩培養物（ＵＶ５ｌａｃ）は誘導後に低いレベルのＲＮＡポリメラーゼを示す；そしてＭＳ２ＣＰ１４変異体はＭＳ２ＣＰ１１変異体よりも高い効果を有するように思われ、その効果はｗｔＭＳ２ＣＰとＭＳ２ＣＰ１４との中間にある。
【０１１６】
実施例５
本実施例は宿主細胞の染色体への「ＭＳで調節されたＴ７遺伝子１カセット」の染色体挿入を説明し、次に種々の標的遺伝子を発現させるそのような宿主株の利用を示し、ならびに新しく開発された株のリークと発現特性が、市販のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを有する株と比較された試験結果を提供する。
【０１１７】
「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」（上流ターミネーター配列、誘導プロモーター配列、ＭＳ２認識部位、Ｔ７遺伝子１、ＭＳ２コートタンパク質遺伝子（ｗｔＭＳ２ＣＰ、またはＭＳ２ＣＰ−１１またはＭＳ２ＣＰ−１４）および弱い構成プロモーター、例えばＴＥＴを有する）（図７を参照）を、制限酵素ＳｐｈＩとＰｐｕＭＩを用いて種々のｐＲＩＮプラスミドから切り出し、次に宿主染色体への部位特異的組込みのために特別に構築したＭ１３ベクターのＭＭＥｂｇ（Ｂｌｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７１（１）：５３８−５４６（１９８９）；Ｍｉｃｈｅａｌｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ，９３：１−７（１９９０））にクローニングした。ｗｔＭＳ２ＣＰ、ＭＳ２ＣＰ−１１、またはＭＳ２ＣＰ−１４のいずれかを有する種々のカセットが得られた。
【０１１８】
この組込みは強制組換え機構により進行する。最初に、オリゴヌクレオチド１５５３〜７３および１５５３〜７４（表１を参照）をＭＭｅｂｇのＢａｍＨＩとＮｏｔＩ部位に連結した。これらのオリゴヌクレオチドは唯一のＳｐｈＩとＰｐｕＭＩ部位をベクターに導入する。次に、「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」をＳｐｈＩとＰｐｕＭＩ部位に連結した。次に、ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞を１ｍｌのＳＯＣに入れ、１５０μｌのＭＯＣＫ連結物、および３００μｌのＸＬ１Ｂｌｕｅの一晩培養物＋３．５ｍｌＬＢ＋０．８％のトップアガーとともに１５０μｌと３０μｌの挿入連結物を塗布することにより、該細胞を連結物によって形質転換させた。この混合物をＬＢプレートに注ぎ、３７℃で一晩インキュベートした。プラークを採取して１００μｌの１×ＴＥに入れた。
【０１１９】
プラークからの７０μｌの再懸濁ファージと５ｍｌＬＢ中の２００μｌのＸＬ１ＢｌｕｅＯＮによるＰＣＲスクリーニング前に一晩の培養を開始した。これらの培養物は３７℃で一晩振盪した。ＰＣＲによる各プラークのスクリーニングを行った。２０μｌＰＣＲ反応物中の２μｌの再攪拌プラークを用いた。オリゴヌクレオチド３０５〜３と３０５〜１４（Ｔ７遺伝子１にとっては内部塩基）（表１を参照）をこのスクリーニングに用いた。陽性クローンを１．０％アガロースゲルでの泳動反応により同定した。各一晩培養物の１ｍｌのアリコートを遠心して、ファージを有する８００μｌの上清をエッペンドルフチューブに収容した。次に、各上清の２００μｌのアリコートを７０℃で２０分間インキュベートした。次に、１００μｌの熱処理ファージを、一晩培養物からのｌａｃｉ^Ｑの表現型を有する大腸菌の独立栄養Ｋ株（Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１２０細胞と命名）の１００μｌに加える。（ＧＭ１２０はＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．５５７６４を有する）。これらの試料を３７℃で約１時間インキュベートした。次に、２５μｌのコントロールＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１２０、２５μｌの熱処理ファージのみ、および各交差物の１：１０希釈物の２５μｌをＬＢ＋Ｋｎ^４０プレートに塗布した。次に、これらプレートを３７℃で一晩インキュベートした。交差物（または溶原化）から得られた精製コロニーをＬＢ＋Ｋｎ^４０プレート上で２回筋状に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、コロニーを０．３％のウシ胆汁とＬＢに２回継代培養し、次に３７℃で一晩攪拌した。次に、該細胞を、ＬＢからＬＢ＋Ｋｎに塗布するレプリカとともにＬＢプレートに筋状に接種してカナマイシン感受性コロニーを同定した（ファージはカナマイシン感受性のコロニーにはもはや存在しないはずである）。
【０１２０】
次に、染色体への挿入を調べるためにＰＣＲスクリーニングを下記のように行った：コロニーをプレートから採取して２０μｌのＰＣＲ混合物に接種した（陽性コロニーが同定された場合、同一のチップを用いて５ｍｌのＬＢにも接種して一晩培養物に用いる）。１５μｌの各ＰＣＲ試料を１．０％アガロースゲルで泳動して陽性コロニーを調べた。陽性コロニーがゲル上のサイズにより同定された場合、その対応する一晩培養物の３７℃での振盪を開始した。次に、これらをＬＢプレートに塗布して３７℃で一晩インキュベートした。
【０１２１】
細胞からＦ’因子を除くために、５ｍｌのＬＢ中のプレートの単一コロニーからの培養物の３７℃で４時間の振盪を開始した。次に、アクリジンオレンジを用いた除去の発表された手法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ｐｐ．１０４−１０６（１９７２））にしたがった。基本的には、細胞をＬＢに、レプリカプレートをＬＢ＋テトラサイクリンに塗布する。テトラサイクリン感受性細胞はＦ’マイナスとして単離されよう。これらプレートからのコロニーの一晩培養を開始し、次にＭ１３ｍｐ１８で再感染させて、Ｆ’因子が確実に存在しない細胞とする。次に、３００μｌの一晩培養物をトップアガーと混合し、２μｌのＭ１３ｍｐ１８ファージ保存物とともにスポットする。プラークは存在しないはずである。この手法を用いて構築された二つの株をそれぞれＥＥ１１−１１Ｍ（ＰＳ４プロモーター）とＥＥ１１−２０（ＵＶ５ｌａｃプロモーター）と名付けた。
【０１２２】
ＥＥ１１−１１ＭとＥＥ１１−２０のリークと発現特性を、産物遺伝子ＮＴ−３または産物遺伝子ＢＤＮＦをマーカーとして用いて、（既に記載の）市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株と比較した。ＮＴ−３（またはＢＤＮＦ）は、Ｔ７プロモーターと対象遺伝子との間にｌａｃｉ部位を有し、かつリークを減少させるｌａｃｉ^Ｑ遺伝子を有する市販のｐＥＴ２２ｂベクター（米国、ウイスコンシン州、マディソン、Ｎｏｖａｇｅｎ社）中に存在する。第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）と第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ−１１Ｍと第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０がさらに比較された（既に述べたように、ｐＬｙｓＳはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、リークを減少させる推薦される方法であるＴ７リゾチーム遺伝子を有する）。最後に、ＢＤＮＦ遺伝子を有するｐＡＭＧ２５プラスミドを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）とＥＥ１１−２０を比較した。
【０１２３】
具体的には、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中のＬＢ＋抗生物質（Ｋｎ^４０またはＣｍ^３０）の一晩培養（５ｍｌ）を開始し、これらの培養物を２８℃で振盪した。１４ｍｌガラスチューブ中の５ｍｌのＬＢ＋抗生物質の新しいチューブに一晩培養物の１：１００希釈物を接種した。チューブを２８℃でそれらがＯＤ_６００＝〜０．８に達するまで振盪した。一晩培養物は実験の終わりまで２８℃で振盪し続けた。各試料のアリコートを誘導前に取った。培養物を、２０μｌの１００ｍＭＩＰＴＧの添加（ＩＰＴＧに関して０．４ｍＭの最終濃度を与えた）により誘導した。誘導された培養物を２８℃で４時間の振盪しながらインキュベートした。１ｍｌの培養試料を取り、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で１５，０００ｒｐｍ（４℃）（ＴｏｍｙＭＴＸ−１６０）で５分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを保持した。次に、ペレットを破砕緩衝液に０．０１ＯＤ単位／μｌにて再懸濁した。次に、試料を熱ブロック中で５分間１００℃まで加熱し、次に２〜３分間冷却し、次に６μｌの各試料を、２％ＳＤＳを加えた１×トリス−グリシン泳動緩衝液中の４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルに載せた。ゲルを１５０Ｖで１．３時間泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色してタンパク質を可視化した。
【０１２４】
ＮＴ−３を標的遺伝子として用いる図８に示されているように、ＥＥ１１−２０株は一晩培養物（ＯＮ）または誘導前（ｐｒｅＩ）のいずれでも検出可能なリークを有さない一方で、ＢＬ２１（ＤＥ３）は明らかに有する。ＮＴ−３に関する誘導レベルは株間で比較できる。ＢＤＮＦを標的遺伝子として用いる図９を見ると、ＥＥ１１−２０は再び誘導前に産物リークを示さないが、ＢＬ２１（ＤＥ３）はＢＬ２１（ＤＥ３）は明らかに示す。ＥＥ１１−２０はＢＬ２１（ＤＥ３）よりもｐＥＴ２２ｂのＢＤＮＦのレベルを減少した。図１０を見ると、ｐＡＭＧ２５ベクターを用いて発現させたＢＤＮＦのレベルはＥＴ１１−２０とＢＬ２１（ＤＥ３）に関して同様であった。図８〜１０に示された各実験について、ｐＬｙＳの存在はリークを減少させたが、（以前に文献で報告されたように）産物の発現も抑制した。最後に、図１１と１２を見ると、ＥＥ１１−１１Ｍは一晩または前誘導のリークを示さないが、ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して相当するレベルのタンパク質を作ることが示される。さらに、ＥＥ１１−１１Ｍ株は、ベクター上のｌａｃｉの存在がタンパク質の蓄積に効果を有さず、実際、高いレベルの一部の産物を作る点においてＥＥ１１−２０株よりも優れている（例えば、図８と図１２を比較されたい）。
【０１２５】
市販の株の対照リークに導入された付加的な要素が本発明で開発された株には必要ではなく、本発明の株はリークの高い調節および誘導の際に相当なレベルの産物発現を示すことがこれらの結果から明らかである。
【０１２６】
実施例６
高密度発酵における異種タンパク質の発現に対してＭＳ２コートタンパク質の存在が持つ効果を決定するために幾つかの産物を調べた。最初に、これらの条件は、小規模な振盪フラスコ、低い光学密度誘導のために用いられた条件を反映した。ｐＡＭＧ２５にＧＣＳＦを含有するＥＥ１１−１１Ｍの指数増殖培養物（光学密度＝１．４）を用いて１０リットルの発酵槽に接種した。これを２８℃で０．８の光学密度まで増殖させてＩＰＴＧの添加により誘導した。最終光学密度１２に達した誘導後に培養物をさらに１０時間増殖させ、試料を毎時間採取した。図１３に示されるように、ＧＣＳＦの検出可能な前誘導リークが存在せず（レーン１）、タンパク質は誘導中生産され続けた。
【０１２７】
（ｐＡＭＧ２５中のレプチンを用いて）第二の発酵を行ってＥＥ１１−１１Ｍ株の性能を高密度で調べた。対数増殖接種材料（光学密度＝１．３２）を用いて１０リットルの発酵を開始した。これを２８℃で光学密度１０まで増殖させた。次に、培養物をＩＰＴＧの添加により誘導した。増殖を６時間続け、培養物は最終光学密度４１に達した。図１４に示されるように、誘導前に明らかなリークは存在せず、レプチンは誘導時間にわたってよく産生される。
【０１２８】
これらの実験はＭＳ２コートタンパク質の存在が大規模または高密度発酵に対して否定的な影響を有さないことを示す。
【０１２９】
実施例７
本実施例は、種々のＴ７初期遺伝子をクローニングするためにＭＳ２システムの使用を記載する。Ｔ７遺伝子を単独で、およびオペロンとしてクローニングする。
【０１３０】
バクテリオファージＴ７の０．４と０．６初期遺伝子を、Ｔ７３５６−ＤＮＡ（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３５：９１７−９３７（１９７９）；Ｄｕｎｎ＆Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：４７７−５３５（１９８３））を鋳型として用いたＰＣＲで増幅させた。各遺伝子は遺伝子の最初のコドンに（オリゴヌクレオチド１０４９〜５および１０４９〜７）（表１を参照）隣接してＥｃｏＲＩ部位を有するようにＰＣＲで構築し、ＭＳ２コートタンパク質認識部位およびポリヒスチジンタグを多クローニング領域（オリゴヌクレオチド１０３５〜３０および１０３５〜３１）（表１を参照）のフレーム内に有するように修飾しておいたｐＡＭＧ１３にクローニングした。オリゴヌクレオチド１４８２〜１８と１２６６〜６９（表１を参照）を０．４遺伝子のために用い、オリゴヌクレオチド１２６６〜７１と１４４３〜４１（表１を参照）を０．６遺伝子のために用いた。
【０１３１】
ＭＳ２コートタンパク質はｐＲＩＮ１０からトランスで供給された。ｐＲＩＮ１０を有するエレクトロコンピテント細胞をｐＡＭＧ１３との初期遺伝子連結物によって形質転換した。陽性クローンは形質転換体コロニーのＰＣＲスクリーニングにより同定した。陽性培養物は一晩発現実験のスターターとして一晩増殖させた。ＬＢＫａｎ／Ｃａｍの新しいチューブを１：１００希釈（５ｍｌに対して５０μｌ）で接種し、２８℃で約０．７のＯＤになるまで振盪しながら増殖させた。これらを４２℃シェーカーに変えることにより誘導し、インキュベーションを４時間続けた。１ｍｌのアリコートを除去し、細胞をペレット化した。ペレットを破砕緩衝液で０．０１ＯＤ単位／μｌで再懸濁し、５分間沸騰させた。これらを氷上で冷却し、６μｌの各アリコートを１０〜２７％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで泳動した。
【０１３２】
次に、タンパク質をニトロセルロースに電気泳動により移した。ブロットをブロット−ツイーン中で２％の非脂肪乾燥ミルクにより一晩ブロックした。該ブロットに、予想されたタンパク質配列に基づく合成ペプチドに対するウサギ由来ポリクローナル抗体をプローブとして１時間反応させた。この血清を１：２０００に希釈した。洗浄後、ブロットに、ロバ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をプローブとして１時間反応させた。これを洗浄し、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、Ｘ線フィルムに露出させた。この露出は４分間であった。このフィルムをコダックのフィルムプロセッサーを用いて現像した。図１５に示されているように、０．４遺伝子の発現はＭＳ２調節システムを用いて得られた。同様に、０．６遺伝子の発現が得られた（図１６）。
【０１３３】
２種類のタイプの０．７遺伝子が構築された：１）オリゴヌクレオチド１０５３〜６６と１２６６〜７３（表１を参照）を用いて完全長遺伝子を構築し；そして２）オリゴヌクレオチド１０５３〜６６および１２６６〜７２（表１を参照）を用いて末端が切除された遺伝子を構築した。この末端切除は、単一コピーベクター中にＭＳ２部位のない完全長の遺伝子をクローニングしようと試みて単離され、コドン２４２にオーカー変異を有する変異遺伝子に基づいた。この初期終止はファージから単離された変異とコドン２４３の点で類似し（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７９：２２７−２３６（１９７３））、当該変異体は宿主停止活性を失っていることが示されたが、キナーゼ活性を保持した（ＭｉｃｈａｌｅｗｉｃｚａｎｄＮｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８６：４５２−４６２（１９９２））。
【０１３４】
初期遺伝子のオペロンも連続的なＰＣＲにより構築した。オリゴヌクレオチド１５１１〜３２、１５３９〜６０、１８０３〜８６、１３１９〜５９、１５７７〜８３、１５７７〜８４、１５３９〜６５、１０６６〜７２および１４３５〜９３（表１を参照）を、各初期遺伝子に隣接する遺伝子と重なる配列を有し、かつ各コード領域の開始部位に隣接するＭＳ２部位を導入するように設計した。各遺伝子はこれらのオリゴヌクレオチドを用いて個々にＰＣＲで増幅した。次に、初期遺伝子をともに連続的に加えた。０．４遺伝子と０．５遺伝子を、それら両者を鋳型として用いて、外側プライマーを用いるだけで最初に連結した。これにより０．４〜０．５断片を得、次にこれを０．３断片などとともに半分の鋳型として用いて、３−７ｔオペロンと命名された完全な０．３〜０．７構築物を作った（配列番号２）（図１７）。オペロン中の初期遺伝子のリークをさらに減少させるために、「下流ボックス」配列を０．３、０．６および０．７遺伝子中で変異させた。「下流ボックス」の相同性を減少させるために行われたほとんどの塩基変化は何の変化ももたらさなかったが、一つの保存アミノ酸の置換が各遺伝子で起こった。
【０１３５】
実施例８
本実施例は、実施例７で構築され記載された３−７ｔオペロンを用いて大腸菌における異種タンパク質の発現を増強させた実験の結果を示す。下記のシステムの発現特性を比較した：１）ｐＡＭＧ３３にクローニングされ、大腸菌ＧＭ２２１で発現されるか、または大腸菌ＧＭ２２１で発現されるｐＲＩＮ１０の３−７ｔオペロンとともにクローニングされたＮＤＦアルファ／ベータ；２）ｐＡＭＧ２２にクローニングされ、大腸菌ＧＭ２２１で発現されるか、またはｐＲＩＮ１０の３−７ｔオペロンとともにクローニングされて大腸菌ＧＭ２２１で発現される３０１−９４１ＴＰ２。
【０１３６】
各実験に関して、単一のコロニーをプレートから採取し、カナマイシンとクロラムフェニコールを含有するＫａｎａｍｙｃｉｎｏｒＬＢを有する二つの５ｍｌのＬＢ中で成長させた。チューブを一晩２８℃で振盪した。カナマイシンを有する２ＸＹＴまたはカナマイシンとクロラムフェニコールを有する２ＸＹＴの１Ｌを有する４リットルのフラスコを準備した。これらに１０ｍｌの出発培養物を接種した。これらを２８℃で振盪しながら０．８のＯＤになるまで増殖させた。次に、１時間振盪しながら培養物を３７℃に変えた。次に、これらを２８℃に戻してＩＰＴＧを０．４ｍＭで加えた。これらを１時間ごとに取り出しながらさらに３時間増殖させた。１ｍｌの試料を５分間１５Ｋおよび４℃で遠心した。上清をデカントし、ペレットを凍結した。５００μｌの各培養物を５００μｌの２ＸＹＴ中に希釈し、その光学密度を測定した。次に、ペレットを解凍し、０．０１ＯＤ単位／μｌの破砕緩衝液に再懸濁した。次に、６μｌのこれらの破砕ペレットをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）にかけた。１５０Ｖで１．３時間の泳動後、ゲルをクマシーブルーで染色してタンパク質を可視化した。
【０１３７】
図１８に示されているように、Ｔ７初期タンパク質の存在はＮＤＦアルファ／ベータをタンパク質分解から保護する。Ｔ７初期タンパク質が存在しないとき、ＮＤＦアルファ／ベータは１時間の誘導により作られるが（レーン２）、２時間の誘導によっては検出できない（レーン３）。Ｔ７初期タンパク質が存在する場合、検出可能なさらに多いＮＤＦアルファ／ベータが存在し、３時間の誘導にわたって蓄積し続ける（レーン７〜９）。
【０１３８】
図１９に示されているように、宿主細胞はＴ７初期タンパク質の非存在下での誘導後に３０１−９４１ＴＰ２を作らない（レーン５）。Ｔ７初期タンパク質が存在する場合、誘導後のタンパク質の生産は劇的に増加する（レーン２および３）。
【０１３９】
実施例９
本実施例は、異なる濃度のＭＳ２ＣＰを産生するように設計された一連の前核宿主株の構築と試験を記載する。これらの宿主株は、それらの染色体に挿入された修飾ＴＥＴプロモーターに連結させたＭＳ２ＣＰを有する。
【０１４０】
株の構築。ＴＥＴプロモーターに連結させたＭＳ２ＣＰ−１４変種のカセットを、オリゴヌクレオチド１６７４〜９６とオリゴヌクレオチド１６７４〜９７（表１を参照）を用いて構築した。このカセットをＭＭｅｂｇのＮｏｔＩとＢａｍＨＩ部位にクローニングしてＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ−１４を作った。次に、ＴＥＴプロモーターを下記の段階で最適化した：１）〜１０領域をオーバーラップＰＣＲにより共通配列とした。変異体の半分は、オリゴヌクレオチド１０１１〜９６と１７８４〜８９および１７５８〜６６と１６７４〜９７を用いて構築した。次にそれら半分をオリゴヌクレオチド１６７４〜９６と１６７４〜９７を用いてともにＰＣＲにかけた。次に、これをＭＭｅｂｇのＮｏｔＩからＢａｍＨＩまでの領域に再クローニングしてＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ１４（〜１０）を得た；２）〜３５領域を共通領域にして完全に最適化させたＴＥＴプロモーターを作った。これを、ＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ１４（〜１０）が鋳型として働く半反応ＰＣＲを用いて再び行った。変異体の半分はオリゴヌクレオチド対の１０１１〜９６と１７８４〜８８および１８０３〜１５と１６７４〜９７（表１を参照）を用いて構築した。次に、これら半分の二つをオリゴヌクレオチド１６７４〜９６と１６７４〜９７を用いてともにＲＣＲにかけた。これを、ＭＭｅｂｇのＮｏｔＩからＢａｍＨＩまでの領域に再クローニングして（完全に最適化された）ＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ１４を得た。ＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ１４（〜１０）とＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ１４（完全に最適化されたもの）の両方が野生型のプロモーター構築物よりもＭＳ２コートタンパク質の増加生産を示した（（〜１０）については小さい増加および完全に最適化されたものについては非常に大きな増加）。
【０１４１】
ＭＳ２コートタンパク質中間体を既に記載した変異体に移送する変異型のプロモーターを構築するために、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の配列をランダム化する技法を用いた。〜１０共通配列変化を有するプロモーター領域の配列とＫｐｎＩ部位までのＭＳ２コートタンパク質遺伝子とを用いてオリゴヌクレオチド１８２２〜０１、１８２２〜０２および１８６３〜８１を設計した。これらのオリゴヌクレオチドはリン酸化し、オリゴヌクレオチド１８２１〜９９、１８２２〜０３、１８２２〜０４および１８２２〜０５とアニールした。次に、連結生成物は、オリゴヌクレオチド１８２２〜０６と１８２２〜０７を用いたＰＣＲ鋳型として機能した。ここで、リボソーム結合配列中でランダム化されたこの断片はＮｏｔＩからＢａｍＨＩまでに連結することが可能であった。
【０１４２】
タンパク質生産に対するリボソーム結合部位の変化の効果を調べるために、ベータガラクトシダーゼアッセイを用いた。具体的には、ＭＳ２ＣＰ−１４−ＬａｃＺ融合物を、オリゴヌクレオチド１８０３〜５２とオリゴヌクレオチド１８０３と５３を有するＬａｃＺ断片を作り、これをＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ−１４のＫｐｎＩからＢａｍＨＩに連結することにより構築した。この構築物は、ベータガラクトシダーゼ遺伝子ＬａｃＺにフレーム内で融合させたＭＳ２コートタンパク質遺伝子の始めに連結させた野生型ＴＥＴプロモーターを含有する。前の段落に記載したこのランダム化ＲＢＳ断片を次にこの構築物のＮｏｔＩからＫｐｎＩに連結した。この最初の融合物とランダム化融合連結物を、実施例５に記載の手法の後に、染色体に組み込んだ。使用された宿主株は、ベータガラクトシダーゼ活性を欠如したＦ’ｔｅｔ／３９３ＡＥｌａｃＺ１４５Ｎであった。分解された溶原菌のベータガラクトシダーゼ活性を記載されたように（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎｍｏｌｅｕｃｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ｐｐ．３５２−３５５（１９７２））評定した。異なるレベルの活性を有する一連の変異体を同定した。これらのうち、３変異体のナンバー１、３および１５を株の生産のために選択した。これらの特別な株をもたらしたＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ−１４−ＬａｃＺをＫｐＩからＢａｍＨＩの範囲で消化してＬａｃＺ融合物を除去した。次に、ＭＳ２ＣＰ−１４遺伝子を、ＫｐｎＩ〜ＢａｍＨＩ断片のこれらベクターへの連結により再生した。宿主株３９３に組み込むことによりこれらの３変異体と（十分に最適化された）ＭＭｅｂｇ−ＭＳ２ＣＰ−１４から株を構築した。得られた株はＧＭ３１５（変異体１）、ＧＭ３２０（変異体３）、ＧＭ３４０（変異体１５）およびＧＭ３５０（完全に最適化）と命名した。
【０１４３】
ＭＳ２ＣＰを作る株の試験。これらの株のＭＳ２コートタンパク質を作る能力は指数増殖培養物のウエスタン分析により決定した。各株のコロニーをプレートから取り、これらを５ｍｌのＬＢに接種した。これらを３０℃で振盪しながら０．７の光学密度まで成長させた。１ｍｌの試料を取った。すべての試料を遠心によりペレット化し、それらペレットを１ｍｌの破砕緩衝液に再懸濁させた。５分間の沸騰後、６μｌのそれぞれのアリコートを４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で泳動した。次に、ブロットをブロット−ツイーン中で２％の非脂肪乾燥ミルクにより一晩ブロックした（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，ＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第１２章，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８８））。該ブロットにＭＳ２コートタンパク質に対するウサギ由来のポリクローナル抗体をプローブとして１時間反応させた。洗浄後、ブロットに、ロバ抗ウサギ西洋ワサビパーオキシダーゼ複合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をプローブとして１時間反応させた。これを洗浄し、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、Ｘ線フィルムに露出させた。このフィルムをコダックのフィルムプロセッサーを用いて現像した。図２０に示されているように、対数期増殖中に受動的に発現されたＭＳ２コートタンパク質の量はＧＭ３１５とＧＭ３２０において低いレベルでバックグランドにわたって検出でき、ＧＭ３４０とＧＭ３５０においてかなり増加する。
【０１４４】
株を用いた異種遺伝子のクローニング。慣用の技術を用いて、Ｃ型肝炎のｎｓ５ｂ遺伝子（ＨｅｐＣポリメラーゼ）のＮ末端のｈｉｓタグ融合物をクローニングするのが非常に難しいことがわかった。該遺伝子の完全長のものが単離されたときに、それらは、翻訳の初期停止を導くか、またはＡＴＧに存在する変異を有し、翻訳の開始をともに妨げた。この遺伝子のクローニングを容易にするために、ＭＳ２認識配列をそれに連結し、その連結物を用いてまず株ＧＭ３５０を形質転換した。完全長挿入物が検出され、それらの配列決定がなされ、正しいことが決定された。
【０１４５】
次に、ＧＭ３５０から得られた組換えｈｉｓ付加ｎｓ５ｂ遺伝子をｐＡＭＧ２１に置き、ＧＭ２２１、ＧＭ３１５およびＧＭ３２０を形質転換するために用いた（ＧＭ２２１はＭＳ２コートタンパク質を有さないが、ＧＭ３１５とＧＭ３２０はＧＭ３５０よりも少ない量のタンパク質を作った）。遺伝子はすべての３細胞系で安定であることがわかった。
【０１４６】
ｈｉｓ付加ｈｅｐＣポリメラーゼを作る種々の株の能力を次に測定した。一晩培養物を、２５０ｍｌ三角フラスコ中で５０ｍｌの２ＸＹＴに１：１００の希釈で接種した。これらを０．６の光学密度になるまで３０℃で振盪しながら増殖させた。ｐＡＭＧ２１ベクターはｌｕｘプロモーターを有しているので、ｈｅｐＣポリメラーゼの生産は自己誘発物質の３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度での添加により達成する。インキュベーションを４時間続け、試料を採取する。細胞を遠心によりペレット化する。ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、これをマイクロ液化する。試料を遠心して可溶性と不溶性のフラクションに分けた。これらを破砕緩衝液と混合し、試料を４〜２０％のＳＤＳゲルで泳動した。１５０Ｖで１．３時間後の泳動後に、ゲルをクマシーブルーで染色して、タンパク質を可視化した。
【０１４７】
図２１に示されているように、ｈｅｐＣポリメラーゼがすべての３株で作られている。作られたタンパク質のほとんどが不溶性である。ＭＳ２コートタンパク質を含有する株にはいくぶんか高い発現があろう。このように、本実施例はこれらの株を用いうる方法を示す：最も高い生産株のＧＭ３５０は不安定な遺伝子を最初にクローニングするために用い、いったん安定なクローンが得られて正しいことが確認されたら、それを用いて残りの株を形質転換し、タンパク質産物の産生能力ならびに遺伝子の保持安定性が決定できる。
【０１４８】
実施例１０
本実施例はｐＡＭＧｕｖｘｓプラスミドベクター、ｐＡＭＧＸプラスミドベクター、およびＴ４中期プロモーター系システムを開発するために用いられたＴ４オペロンｐＲＩＮプラスミドベクターの構築を記載する。
【０１４９】
バクテリオファージＴ４中期プロモーターはＰｕｖｓＸとＰＸの発表された配列（Ｈｉｎｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（２７）：１８０３４−１８０４４（１９９１））を用いた合成により構築した（ｕｖｓＸ：オリゴヌクレオチド１０８４〜６６とオリゴヌクレオチド１０８４〜６７（表１を参照）、Ｘ：オリゴヌクレオチド１０８４〜６８と１０８４〜６９）（表１を参照）。ＰｕｖｓＸプロモーターをそれが有するＮｄｅＩ部位を除去するために再構築した（オリゴヌクレオチド１２０２〜１１とオリゴヌクレオチド１５５０〜８５（表１を参照）。各構築物はＡａｔＩＩとＣｌａＩ認識部位を有するように設計された。ＰｕｖｓＸプロモーター構築物の完全な塩基配列を図２２に示し、ＰＸプロモーター構築物の完全な遺伝子配列を図２３に示す。プラスミドｐＡＭＧ１３をＡａｔＩＩとＣｌａＩで消化して合成ラムダプロモーターを除去し、ベクターをゲルで精製した。次に、Ｔ４中期プロモーターをこのプラスミドに連結してプラスミドベクターのｐＡＭＧｕｖｓＸとｐＡＭＧＸを作った。
【０１５０】
ｍｏｔＡ／ａｓｉＡオペロンを、各遺伝子の前にＭＳ２コートタンパク質認識配列が来るように構築した。ｍｏｔＡの発表された配列（Ｕｚａｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４（９）：１４８７−１４９６（１９９０）、およびａｓｉＡ；Ｏｒｓｉｎｉｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５（１）：８５−９３（１９９３））をその構築のために用いた。該断片の始めにＸｂａＩ部位があり、終わりにＸｈｏＩ部位があった（オリゴヌクレオチド１０８４〜６３、１５２８〜１９、１５２８〜２０および１７０３〜５３）（表１を参照）。この断片をＸｂａＩとＸｈｏＩで消化し、次にいくつかのｐＲＩＮプラスミドに連結して、例えば、Ｔ４オペロンｐＲＩＮ１０プラスミドベクター、Ｔ４オペロンｐＲＩＮ１１プラスミドベクター等を得た。
【０１５１】
実施例１１
本実施例は、実施例１０で調製、記載されたｐＡＭＧｕｖｘｓ、ｐＡＭＧＸおよびＴ４オペロンｐＲＩＮプラスミドベクターの試験を記載する。具体的には、リークを妨げ、産物遺伝子の発現を可能とするシステムの能力を調べるために発現実験を実施した。下記のシステムの発現とリーク特性を比較した：１）ｐＡＭＧ１３ベクターを有する大腸菌宿主ＧＭ２２１（ＡＴＣＣ寄託番号２０２０７７）にクローニングされ発現されたＴ７遺伝子１（すなわち、ラムダプロモーター調節下のＴ７遺伝子１）；２）ｐＡＭＧ１３を有する大腸菌宿主ＧＭ２２１中にＴ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされ共発現されたＴ７遺伝子１；３）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌宿主ＧＭ２２１のＴ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされ共発現されたＴ７遺伝子１（すなわち、ｕｖｓＸＴ４中期プロモーター調節下のＴ７遺伝子１）；４）ｐＡＭＧＸｕｖｓＸを有する大腸菌宿主ＧＭ２２１中にＴ４オペロンｐＲＩＮ１１とともにクローニングされ共発現されたＴ７遺伝子１；５）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌宿主ＧＭ２２５中にＴ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされ共発現されたＮＴ−３；および６）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌宿主ＧＭ２２５中にＴ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされ共発現されたＢＤＮＦ。
【０１５２】
各実験のために、単一コロニーをプレートから取り、クロラムフェニコールとカナマイシンを有する５ｍｌの２ＸＹＴで生育させた。チューブを一晩２８℃で振盪した。クロラムフェニコールとカナマイシンを含有する５ｍｌの２ＸＹＴを有する５０ｍｌのチューブを準備した。新しいチューブに５０μｌの出発培養物を接種した。これらのチューブを２８℃で振盪しながら０．６〜１．２のＯＤになるまで増殖させた。ＰＳ４プロモーターを有する培養物（ｐＲＩＮ１１）は２０μｌのＩＰＴＧで誘導する一方で、ラムダプロモーターを有する培養物（ｐＡＭＧ）は３７℃または４２℃のいずれかに変えることにより誘導した。これらすべての発現実験の誘導時間は４．０時間であった。１ｍｌの各培養物を１０分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを凍結した。５００μｌの各培養物を５００μｌの２ＸＹＴに希釈し、その光学密度を測定した。次に、ペレットを解凍し、０．０１ＯＤ単位／μｌの破砕緩衝液に再懸濁した。次に、６μｌのこれらの破砕ペレットをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（４〜２０％または１６％）にかけた。１５０Ｖで１．３時間の泳動後、ゲルをクマシーブルーで染色してタンパク質を可視化した。
【０１５３】
図２４〜図２９のデータは下記のとおりに要約することができる：１）ｐＡＭＧ１３ベクターは、Ｔ７遺伝子がラムダプロモーターの調節下にある場合、誘導の際に大量のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作ることができる（図２４のレーン３と４を参照）；２）Ｔ４オペロンのタンパク質産物は大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによるラムダプロモーターの認識を十分なくす（図２５のレーン２と３を図２４のレーン３と４に比較されたい）；３）Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧｕｖｓＸにおいて大量のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを得ることができる（図２４のレーン３と４を図２６のレーン２と３に比較されたい）；４）Ｔ４オペロンｐＲＩＮ１１との共発現がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と同じくＴ７遺伝子１の生産に効果的である（図２７のレーン３と４を図２６のレーン２と３に比較されたい）；および５）ＮＴ−３／ＢＤＮＦがＴ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧｕｖｓＸから大量のＮＴ−３とＢＤＮＦを得ることもできる（図２８と図２９を図２６と比較されたい）。
【０１５４】
実施例１２
本実施例は、ＭＳ２システムを有する単一コピープラスミドへのｍｏｔＡ／ａｓｉＡオペロンのクローニングを記載する。
【０１５５】
単一コピーベクターはｐＳＣ１０１から得られた（ＢｅｒｎａｒｄｉａｎｄＢｅｒｎａｒｄｉ，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：９４１５−９４２６）。このベクターをＮｄｅＩで消化し、次に再環状化してプラスミドｐＳＣ１０１ｄＮｄｅを得た。ＢｇｌＩＩとＮｓｉＩ部位を有するＤＮＡリンカーをこのプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に導入した。次に、Ｔ１Ｔ２、ＰＳ４プロモーターおよび多クローニング部位を有する、ＮｓｉＩからＢｇｌＩＩまでのｐＡＭＧ２２の断片をそれにクローニングしてプラスミドｐＴＳ２を作った。次に、ｐＴＳ２をＭｌｕＩとＸｍｎＩで切断し、その末端を、クレノウ断片を用いて平滑化し（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ｐｐ．５．４０−５．４１（１９８９））、そして該プラスミドを再環状化してｐＴＳ２ｄを作った。標的プロモーター、ＭＳ２認識部位、ＭＳ２ＣＰ遺伝子およびＴＥＴプロモーターを有するｐＲＩＮプラスミドベクターの断片を、オリゴヌクレオチド８２８〜３１およびオリゴヌクレオチド１５５３〜７２（表１を参照）を用いるＰＣＲにより作った。これらの断片をＡａｔＩＩとＢｇｌＩＩで消化し、次にｐＴＳ２ｄに連結して、ｐＣＢプラスミドベクター（図３０を参照）を作った。次に、実施例１０に記載されたｍｏｔＡ／ａｓｉＡオペロンをこれらのｐＣＢプラスミドベクターのＸｂＩ〜ＸｈｏＩにクローニングしてｐＡＷプラスミドベクター（図３１を参照）を作った。
【０１５６】
もう一つの単一ｐＣＢプラスミドを、ＭＳ２コートタンパク質の調節用変異ＴＥＴプロモーターを用いて構築した。ＴＥＴプロモーターに連結させたＭＳ２コートタンパク質遺伝子のカセットを、オリゴヌクレオチド１８７０〜９７およびオリゴヌクレオチド１９０６〜２７（表１を参照）を用いるＰＣＲにより構築した。この断片をＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化し、そしてｐＴＳ２ｄに連結してｐＣＢ１１を作った。次に、実施例１０で記載されたｍｏｔＡ／ａｓｉＡオペロンをこのベクターのＸｂａＩ〜ＸｈｏＩにクローニングしてｐＡＷ１１（Ｐｓ４プロモーター）を作った。
【０１５７】
実施例１３
本実施例は実施例１２で調製、記載されたｐＡＷプラスミドベクターの試験を記載する。産物遺伝子をＴ４ｕｖｓＸプロモーターかＸプロモーター下にクローニングしたときの発現実験を実施した。下記のシステムの発現とリーク特性を比較した：１）ｐＡＭＧＸを有する大腸菌ＧＭ２２１中で、ｐＡＷ２０とともにクローニングされ共発現されるＴ７遺伝子１（すなわち、Ｔ４Ｘプロモーターの調節下のＴ７遺伝子）；２）ｐＡＭＧＸを有する大腸菌ＧＭ２２５中で、ｐＡＷ２０とともにクローニングされ共発現されるＳＰＩ（すなわち、Ｔ４Ｘプロモーターの調節下のＳＰＩ）；３）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌ＧＭ２２５中で、ｐＡＷ２０とともにクローニングされ共発現されるＯＰＧ（すなわち、Ｔ４ｕｖｓＸプロモーターの調節下のＯＰＧ）；４）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌ＧＭ２２５中で、ｐＡＷ１１とともでクローニングされ共発現されるＢＤＮＦ（すなわち、Ｔ４ｕｖｓＸプロモーターの調節下のＢＤＮＦ）；５）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌ＧＭ２２５中で、ｐＡＷ１１とともにクローニングされ共発現されるＯＰＧ（すなわち、Ｔ４Ｘプロモーターの調節下のＯＰＧ）；６）ｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌ＧＭ２２５中で、ｐＡＷ１１とともにクローニングされ共発現されるＮＴ３（すなわち、Ｔ４ｕｖｓＸプロモーターの調節下のＮＴ３）；および７）ｐＡＭＧＸを有する大腸菌ＧＭ２２５中で、ｐＡＷ１１とともにクローニングされ共発現される３ＭＮＤＦ（すなわち、Ｔ４Ｘプロモーターの調節下の３ＭＮＤＦ）。
【０１５８】
各実験のために、単一コロニーをプレートから取り、テトラサイクリンとカナマイシンを有する５ｍｌの２ＸＹＴで生育させた。チューブを一晩２８℃で振盪した。５０ｍｌのチューブをテトラサイクリンとカナマイシンを有する５ｍｌの２ＸＹＴを用いて準備した。新しいチューブに５０μｌの出発培養物を接種した。これらのチューブを２８℃で振盪しながら０．６〜１．２のＯＤになるまで増殖させた。ＰＳ４プロモーターを有する培養物とＵＶ５ｌａｃプロモーターを含有する培養物は２０μｌのＩＰＴＧで誘導する一方で、ラムダプロモーターを有する培養物は３７℃または４２℃のいずれかに変えることにより誘導した。これらすべての発現実験の誘導時間は４．０時間であった。１μｌの各培養物を１０分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを凍結した。５００μｌの各培養物を５００μｌのＬＢに希釈し、その光学密度を測定した。次に、ペレットを解凍し、０．０１ＯＤ単位／μｌの破砕緩衝液に再懸濁した。次に、６μｌのこれらの破砕ペレットをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（４〜２０％または１６％）にかけた。１５０Ｖで１．３時間の泳動後、ゲルをクマシーブルーで染色してタンパク質を可視化した。
【０１５９】
図３２〜図３４のデータは下記のとおりに要約することができる：１）大量のＴ７遺伝子１を、Ｔ７遺伝子１がｐＡＭ２０とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧＸ中に得ることができる（図３２）；２）大量のＳＰＩを、ＳＰＩがｐＡＭ２０とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧＸ中に得ることができる（図３３）；および３）大量のＯＰＧを、ＯＰＧがｐＡＭ２０とともにクローニングされ共発現されるｐＡＭＧｕｖｓＸ中に得ることができる（図３４）。
【０１６０】
図３５〜図３８のデータは下記のとおりに要約することができる：１）大量のＢＤＮＦを、ＢＤＮＦがｐＡＷ１１とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧｕｖｓＸ中に得ることができる（図３５）；２）大量のＯＰＧを、ＯＰＧがｐＡＭ１１とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧｕｖｓＸ中に得ることができる（図３６）；３）大量のＮＴ３を、ＮＴ３がｐＡＷ１１とともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧｕｖｓＸ中に得ることができる（図３７）；そして４）大量の３ＭＮＤＦを、３ＭＮＤＦがｐＡＷ１１ともにクローニングされて共発現されるｐＡＭＧＸ中に得ることができる（図３８）。
【０１６１】
単一コピーｐＡＷプラスミドを用いた試験は、ＭＳ２に基づくＴ４カセットが染色体に置かれている場合に生じるシステムと類似のものを提供するので、必要とされるＭＳ２−Ｔ４中期プロモーター要素のそれぞれを宿主細胞の染色体に置いて、効果的で、厳密に調節されたシステムを提供することができることが本発明で期待される。
【０１６２】
実施例１４
本実施例は、付属タンパク質を効率的に発現し、それにより標的タンパク質の発現を増強するＭＳ２に基づくＴ４システムの利用を記載する。
【０１６３】
ｍｏｔＡとａｓｉＡを有するＴ４オペロンを、開始部にＸｈｏＩ部位を有し、その後にＭＳ２認識部位およびａｓｉＡ遺伝子（これもＭＳ２認識部位よりも後に位置する）の末端にＢａｍＨＩ部位を有するようにＰＣＲで構築した（オリゴヌクレオチド１３５１〜０１および１２６０〜８６）（表１を参照）。次に、この断片を、（Ｔ４オペロンｐＲＩＮ１０を与える）ｐＲＩＮ１０の対応する部位にクローニングした。
【０１６４】
Ｔ７の０．６遺伝子を、ＸｈｏＩ部位を有し、その後にＭＳ２認識部位を有しＸｈｏＩ部位（オリゴヌクレオチド１４４３〜４１および１４６５〜３１）（表１を参照）で終わるように構築した。次に、この０．６断片を、対応する部位を用いてＴ４オペロンｐＲＩＮ１０に挿入した。これは、０．６遺伝子とＴ４転写因子の両方を発現することのできるプラスミド（０．６Ｔ４オペロンｐＲＩＮ１０）を作る。次に、ＢＤＮＦがｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌宿主ＧＭ２２５中に０．６Ｔ４オペロンｐＲＩＮ１０とともにクローニングされて共発現されるシステム（すなわち、Ｔ４ｕｖｓＸ中期プロモーターの調節下のＢＤＮＦ）を用いて、発現実験を行った（実施例１１に記載した同じ実験方法にしたがって）。
【０１６５】
図３９に示されるように、大量のＢＤＮＦがこのシステムを用いて得ることができ、これらの得られた量は０．６遺伝子を欠くＴ４オペロンｐＲＩＮ１０システムを用いて得られた量よりも優れていた（図２９のレーン４と５を図３９のレーン４と５に比較されたい）。したがって、付属タンパク質（０．６）は段階化プロモーター発現システムにおいて標的タンパク質の発現を増強した。
【０１６６】
これらの実施例で利用されたオリゴヌクレオチドを下記の表１に示す。
【０１６７】
【表１】

【０１６８】
【表２】

【０１６９】
【表３】

【０１７０】
【表４】

【０１７１】
【表５】

【０１７２】
ＤＮＡ／宿主細胞の寄託
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２／ＧＭ３５０宿主細胞は、１９９９年１月２０日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されている。
【０１７３】
大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号２０２８１が与えられている。
【０１７４】
プラスミドベクターｐＡＭＧ１３を有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４１が与えられている。
【０１７５】
プラスミドベクターｐＡＭＧ２５を有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４２が与えられている。
【０１７６】
プラスミドベクター３００２ｎａｈＧを有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４５が与えられている。
【０１７７】
プラスミドベクターｐＲＩＮ１０（ｗｔ）を有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６３９が与えられている。
【０１７８】
大腸菌ＥＥ１１−１１Ｍ宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号２０２０８３が与えられている。
【０１７９】
大腸菌ＥＥ１１−２０宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号２０２０８２が与えられている。
【０１８０】
プラスミドベクターｐＡＭＧｕｖｓＸを有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４４が与えられている。
【０１８１】
プラスミドベクターｐＡＭＧＸを有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４３が与えられている。
【０１８２】
プラスミドベクターＴ４オペロンｐＲＩＮ１０を有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５は、１９９８年１月２７日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４０が与えられている。
【０１８３】
プラスミドベクターｐＡＷ２０を有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２５宿主細胞は、１９９８年１月２８日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６３８が与えられている。
【０１８４】
プラスミドベクターｐＡＭＧ２１を有する大腸菌Ｋ−１２／ＦＭ−１５宿主細胞はＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託され、寄託番号９８１１３が与えられている。
【０１８５】
プラスミドベクターｐＡＭＧ３３を有する大腸菌Ｋ−１２／ＧＭ２２１宿主細胞はＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に１９９９年１月２０日寄託された。
【０１８６】
プラスミドベクターｐＡＭＧ２２は、１９９８年１月２８日にＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture collection）に寄託されており、寄託番号９８６４６が与えられている。
【０１８７】
本発明は、ここまでに本発明を実施するための好ましい態様を有することが分かったか、もしくは提案される特別な実施態様を用いて説明してきた。本開示を鑑みて、当業者らは、多くの改良と変更が本発明の意図する範囲から離れることなく、例示した特定の実施態様で行いうることを理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のシステムに用いられる野生型ＭＳ２コートタンパク質の完全遺伝子配列（配列番号１）である。
【図２】ｗｔＭＳ２ＣＰ発現実験の結果を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３】本発明で開発されたｐＲＩＮプラスミドベクターの模式図である。
【図４】Ｔ７遺伝子１がクローニングされた種々のｐＲＩＮプラスミドベクターを用いて実施された発現およびリーク実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図５】Ｔ７遺伝子１がクローニングされた種々のｐＲＩＮプラスミドベクターを用いて実施された発現およびリーク実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図６】Ｔ７遺伝子１がクローニングされた種々のｐＲＩＮプラスミドベクターを用いて実施された発現およびリーク実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図７】「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」の模式図である。
【図８】市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン３〜５）、第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン１〜２）、ＥＥ１１−２０株（レーン６〜８）、および第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０株（レーン９〜１０）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの写真である
【図９】図９は、市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン３〜５）、第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン１〜２）、ＥＥ１１−２０株（レーン６〜８）、および第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０株（レーン９〜１０）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの写真である。
【図１０】市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン３〜５）、第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン１〜２）、ＥＥ１１−２０株（レーン６〜８）、および第二ベクターとしてｐＬｙｓＳを有するＥＥ１１−２０株（レーン９〜１０）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの写真である。
【図１１】市販のＢＬ２１（ＤＥ３）株（レーン５〜７）とＥＥ１１−１１Ｍ株（レーン２〜４）のリークと発現特性を比較するＳＤＳゲルの図である。
【図１２】標的産物遺伝子としてＮＴ−３の発現を用いたＥＥ１１−１１Ｍ株のリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図１３】株ＥＥ１１−１１ＭでのｐＡＭＧ２５においてＧＣＳＦの１０リットル発酵誘導の時間経過を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図１４】株ＥＥ１１−１１ＭでのｐＡＭＧ２５においてレプチンの１０リットル発酵誘導の時間経過を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図１５】Ｔ７の０．４初期遺伝子がクローニングされたＭＳ２に基づくシステムを用いて実施された発現実験の結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図１６】Ｔ７の０．６初期遺伝子がクローニングされたＭＳ２に基づくシステムを用いて実施された発現実験の結果を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図１７Ａ】Ｔ７の初期遺伝子（０．３〜０．７）を有するように構築された３−７ｔオペロンの完全な遺伝子配列（配列番号２）である。
【図１７Ｂ】Ｔ７の初期遺伝子（０．３〜０．７）を有するように構築された３−７ｔオペロンの完全な遺伝子配列（配列番号２）である。
【図１８】Ｔ７初期タンパク質の非存在および存在下でのＮＤＦアルファ／ベータの発現を比較するＳＤＳゲルの写真である。
【図１９】Ｔ７初期タンパク質の存在下および非存在下におけるヒトテロメラーゼサブユニットＴＰ２（３０１〜９４１ＴＰ２）の末端切除物の発現を比較するゲルのウエスタンブロットの写真である。
【図２０】株ＧＭ３１５、ＧＭ３２０、ＧＭ３４０およびＧＭ３５０による多様な量のＭＳ２コートタンパク質の受動的な生産を示すゲルのウエスタンブロットの写真である。
【図２１】種々の量のＭＳ２コートタンパク質を有する株においてＣ型肝炎ポリメラーゼ（ＨｅｐＣｐｏｌ）の発現を示すゲルの写真である。
【図２２】本発明のシステムに用いられるＴ４ＰｕｖｓＸ中期プロモーターの完全ＤＮＡ配列（配列番号３）である。
【図２３】本発明のシステムに用いられるＴ４ＰＸ中期プロモーターの完全ＤＮＡ配列（配列番号４）である。
【図２４】標的産物遺伝子としてのＴ７遺伝子１の発現を用いたｐＡＭＧ１３のリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図２５】Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧ１３のリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図２６】Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図２７】Ｔ７遺伝子１がＴ４オペロンｐＲＩＮ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図２８】ＮＴ−３がＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図２９】ＢＤＮＦがＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３０】本発明で開発されたｐＣＢプラスミドベクターの模式図である。
【図３１】本発明で開発されたｐＡＷプラスミドベクターの模式図である。
【図３２】Ｔ７遺伝子１がｐＡＷ２０と共発現させられたｐＡＭＧＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３３】ＳＰＩがｐＡＷ２０と共発現させられたｐＡＭＧＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３４】ＯＰＧがｐＡＷ２０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３５】ＢＤＮＦがｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３６】ＯＰＧがｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３７】ＮＴ３がｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３８】３ＭＮＤＦがｐＡＷ１１と共発現させられたｐＡＭＧＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【図３９】ＢＤＮＦが、０．６遺伝子をさらに付属タンパク質として有するＴ４オペロンｐＲＩＮ１０と共発現させられたｐＡＭＧｕｖｓＸのリークと発現特性を示すＳＤＳゲルの写真である。
【配列表】

Claims

構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーを含み、該異種遺伝子は誘導プロモーターおよびリプレッサー認識部位に機能的に連結されている、特定の異種遺伝子のクローニングまたは発現に用いられる翻訳抑制システムであって、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質（ＭＳ２ＣＰ）である該システム。
異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法であって、プラスミドベクターにより形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該ベクターは、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位および該誘導プロモーターに連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節し、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である、該方法。
異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法であって、第一のプラスミドベクターおよび第二のプラスミドベクターにより共形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、第一のプラスミドベクターは誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列ならびに翻訳リプレッサー認識部位および該誘導プロモーターに連結された該異種遺伝子を含み、第二のプラスミドベクターは構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節し、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である該方法。
異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法であって、プラスミドベクターにより形質転換され、構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該ベクターは、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、ならびに翻訳リプレッサー認識部位および誘導プロモーターに連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節し、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である、該方法。
異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法であって、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位および該誘導プロモーターに連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列、ならびに構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーをコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該翻訳リプレッサーは該異種遺伝子の発現を調節し、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である、該方法。
ベクターがさらに配列番号２を有する請求項２から４の何れか１項に記載の方法。
Ｔ７遺伝子１をコードするＤＮＡ配列、誘導プロモーター、ＭＳ２認識部位、および構成プロモーターの調節下のＭＳ２コートタンパク質遺伝子を含み、該Ｔ７遺伝子１は該誘導プロモーターおよび該ＭＳ２認識部位に連結されている「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」。
染色体に挿入された、請求項７に記載の「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」を有し、異種遺伝子を発現することができる宿主細胞。
Ｔ７プロモーターの調節下の異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドベクターで形質転換され、染色体に挿入された、請求項７に記載の「ＭＳ２で調節されたＴ７遺伝子１カセット」を有する宿主細胞を適当な条件下で培養することを含む、異種遺伝子の発現のための方法。
異種遺伝子がＴ７初期遺伝子である請求項９に記載の方法。
異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法であって、第一のプラスミドベクターおよび第二のプラスミドベクターにより共形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、第一のプラスミドベクターは、Ｔ４中期プロモーターの調節下の該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含み、第二のプラスミドベクターは、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位および該誘導プロモーターにそれぞれ連結されたｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子の配列、ならびに構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーを含み、該翻訳リプレッサーは該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子の発現を調節し、かつ該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子は該誘導プロモーターからの転写を抑制しながらＴ４中期プロモータからの直接の転写を指示し、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である該方法。
第二のプラスミドベクターがさらに付属タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する請求項１１に記載の方法。
異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法であって、誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、翻訳リプレッサー認識部位および該誘導プロモーターにそれぞれ連結されたｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子配列、ならびに構成プロモーターに機能的に連結された翻訳リプレッサーを有する宿主細胞であって、Ｔ４中期プロモーターの調節下に連結された該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列からなるプラスミドベクターにより形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養することを含み、該翻訳リプレッサーは該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子の発現を調節し、かつ該ｍｏｔＡとａｓｉＡ遺伝子は誘導プロモーターからの転写を抑制しながらＴ４中期プロモータからの直接の転写を指示し、該リプレッサーがバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質である該方法。
誘導プロモーターをコードするＤＮＡ配列、それぞれがＭＳ２認識配列および該誘導プロモーターに連結されたｍｏｔＡおよびａｓｉＡ遺伝子配列、ならびに構成プロモーターの調節下のＭＳ２コートタンパク質遺伝子遺伝子を含む「ＭＳ−２に基づくＴ４カセット」。
異種遺伝子を発現する能力を有し、請求項１４に記載の「ＭＳ２に基づくＴ４カセット」を有する前核宿主細胞。
Ｔ４プロモーターの調節下の該異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターにより形質転換され、染色体に挿入された、請求項１４に記載の「ＭＳ−２に基づくＴ４カセット」を有する宿主細胞を適切な条件下に培養することを含む異種遺伝子のクローニングまたは発現のための方法。