JP4354223B2 - Actinomycetes expression vector - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は放線菌発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の放線菌における発現ベクターとしては、放線菌由来の誘導性プロモーターを利用した例が幾つか報告されている。抗生物質のチオストレプトン添加により転写が誘導されるtipAプロモーター（Smokvina T. et al., 1990, Gene 94:53-59; Kuhstoss S., and Rao R.N., 1991, Gene 103: 97-99; Takano E. et al., 1995, Gene 166: 133-137）、グリセロールにより誘導されるglyCABプロモーター（Hindle Z., and Smith C. P., 1994, Mol. Microbiol. 12: 737-745）およびマイトマイシンCにより誘導されるmcrABプロモーター（August P.R. et al., 1996, Gene 175: 261-267）が発現ベクターに利用されている。tipAやmcrABプロモーターを利用する場合には、誘導に薬剤を用いるため発現タンパクを実用化する際に精製段階でこれら薬剤を除去する必要がある。また構成的プロモーターを利用した発現ベクターとしては、人工的に変異させたermE*プロモーター(Schmitt-John, T., and Engels, J.W., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 493-498; Bibb, M. J. et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 533-545)を用いたものが報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】
Smokvina T. et al., 1990, Gene 94: 53-59
【非特許文献２】
Kuhstoss S., and Rao R.N., 1991, Gene 103: 97-99
【非特許文献３】
Takano E. et al., 1995, Gene 166: 133-137
【非特許文献４】
Hindle Z., and Smith C. P., 1994, Mol. Microbiol. 12: 737-745
【非特許文献５】
August P.R. et al., 1996, Gene 175: 261-267
【非特許文献６】
Schmitt-John, T., and Engels, J.W., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 493-498
【非特許文献７】
Bibb, M. J. et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 533-545
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、増殖期の放線菌において高レベルで遺伝子を発現させることができる発現ベクターを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
増殖期の放線菌において外来遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターを開発するため、本発明者らは放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子のプロモーターに着目した。リボゾームは生命に必須のタンパク合成装置であり、L11蛋白質の遺伝子は生育初期から発現され、生育の盛んな対数増殖期にはその発現は最大となると考えられる。本発明者らは以前、ストレプトミセス属 Streptomyces griseus由来のL11蛋白質遺伝子（rplK遺伝子）を含むDNA断片を単離している (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560)。また、S.coelicolorでのみrplK上流領域の転写開始点に関する報告がされている（Puttikhunt,C., T. Nihira, and Y. Yamada. 1995. Mol. Gen. Genet. 247: 118-122）。しかしプロモーター領域を含むrplK遺伝子断片を多コピープラスミドに挿入して放線菌に導入しても、形質転換体を得ることはできなかった (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560)。
【０００６】
そこで本発明者らは、約280塩基対からなるL11蛋白質遺伝子のプロモーター断片を選び出し、これに異種遺伝子を連結して新たな発現ベクターを構築した。ベクターからの遺伝子発現を測定した結果、このDNAの下流に連結した異種遺伝子の発現を非常に強く誘導することを突き止めた。すなわち、L11蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンから上流3番目から277番目のDNA断片を用い、さらに本来連結されているL11蛋白質コード配列ではなく異種遺伝子を連結することにより、放線菌内で起こる転写抑制または他の有害な効果を回避することが可能となり、異種遺伝子を高発現するベクターを構築できることを実証した。このとき、転写終結配列 (ターミネーター) として、ssgA遺伝子由来のターミネーター配列 (Kawamoto, S., and J.C. Ensign, 1995, Actinomycetologica 9:136-151; Kawamoto, S et al., 1997. Microbiology 143:1077-1086) を用いることにより、異種遺伝子の持続的な高発現をより確実に実現させることに成功した。ssgA遺伝子のターミネーターは大きなステムループを形成し得るパリンドローム配列を含んでおり、これにより転写終結因子に依存しないで強力に転写を終結させることができた。rplKプロモーターとssgA遺伝子のターミネーター配列を組み合わせることにより、目的とする外来遺伝子の発現を生育期間中持続でき、しかも生育の栄養条件を変化させる事により、その発現量を調節可能にし、なおかつ、強力なターミネーターの利用によりmRNAの安定化の向上を可能とする新たな発現ベクターを構築することに成功した。
【０００７】
上記のrplKプロモーター−異種遺伝子の発現カセットは、低コピープラスミドの複製起点（ori）を持つプラスミド中に組み込むことにより低コピー型の発現プラスミドとして構築できたのみならず、多コピープラスミドの複製起点を持つプラスミド中に組み込むことにより、多コピー型の発現プラスミドとして構築することにも成功した。このように、本発明においてrplK遺伝子由来のプロモーター断片を持つ多コピー型の発現プラスミドが初めて提供された。
【０００８】
この発現ベクターにEGFPのコード配列を組み込み、放線菌に導入して発現を解析したところ、菌体からEGFPの強い発現が観察された。また、分泌性蛋白質であるアガラーゼ蛋白質のコード配列を組み込み、放線菌に導入して培養したところ、培養上清中に140 U/mlを超えるアガラーゼが分泌された。本来のアガラーゼ遺伝子の発現は、グルコースによるカタボライト抑制およびリプレッサー蛋白質による転写抑制などを受けるため高発現は期待できないが、本発明の発現ベクターを利用することにより、発現させる遺伝子が本来受けるはずの発現抑制を受けることなく、高レベルで蛋白質を発現させることができた。
【０００９】
また本発明者らは、この発現ベクターに宿主ゲノムへの組み込みに必要なφ31ファージのint遺伝子とattPを挿入し、ゲノム組み込み型の発現ベクターを構築した。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤等により選択する必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。このゲノム組み込み型ベクターにそれぞれssgA遺伝子およびeshA遺伝子の部分配列をアンチセンスに組み込み、放線菌に導入して発現量の測定と表現型の変化を観察した。形質転換株におけるアンチセンスRNAの転写をRT-PCRにより解析したところ、それぞれssgAおよびeshAのアンチセンスRNAが生育期を通じて発現されていることが明らかとなった。アンチセンスRNAの転写レベルは、内在性のhrdB遺伝子の転写レベルに匹敵していた。すなわち、ゲノムに組み込んだ形態においても、本発明のベクターは高いレベルで異種遺伝子を発現できることが証明された。ssgA遺伝子およびeshA遺伝子は共に必須遺伝子ではなく、これらの遺伝子を破壊した株は共に青色抗生物質アクチノロージンの生産が抑制される。上記のアンチセンスRNAを発現する形質転換株では青色抗生物質アクチノロージンの生産が明らかに抑制されたことから、アンチセンスRNA発現により、eshA遺伝子およびssgA遺伝子の機能が実際に抑制されたことが確認された。このように、本発明のベクターは、ゲノムに組み込まれ、安定に維持され、しかも遺伝子を高レベルで発現することもできる。本発明のベクターは遺伝子の高発現用ベクターとして、またはアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制用のベクターとして極めて有用であることが証明された。
【００１０】
すなわち本発明は、新規な放線菌発現ベクター、該ベクターを保持する宿主細胞、および該ベクターによる蛋白質の製造方法等に関し、より具体的には、
（１）放線菌において異種遺伝子を発現させるためのDNAベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された該異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含むDNAベクター、
（２）放線菌において遺伝子を発現させるためのDNAベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）（ｂ）のクローニング部位の下流に転写終結配列を含むDNAベクター、
（３）転写終結配列が、配列番号：３に記載の塩基配列、または該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつ転写を終結させる活性を有するDNAの塩基配列である、（１）または（２）に記載のDNAベクター、
（４）低コピープラスミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のDNAベクター、
（５）多コピープラスミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のDNAベクター、
（６）ゲノム組み込みベクターである、（１）から（３）のいずれかに記載のDNAベクター、
（７）（１）から（６）のいずれかに記載のDNAベクターで形質転換された宿主細胞、
（８）蛋白質の製造方法であって、該蛋白質をコードする（１）から（６）のいずれかに記載のDNAベクターで形質転換した宿主細胞を培養する工程、および該宿主細胞またはその培養液から生産された該蛋白質を回収する工程を含む方法、
（９）遺伝子の機能を抑制する方法であって、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする（１）から（６）のいずれかに記載のDNAベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む方法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、L11蛋白質遺伝子プロモーター配列を利用した、放線菌で遺伝子を発現する発現ベクターに関する。L11蛋白質遺伝子（rplK遺伝子）はリボゾーム蛋白質L11をコードする遺伝子であり、放線菌において高度に保存されている（図１参照）。本発明のベクターは、このL11蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンの上流領域のDNAを含む。本発明のベクターの１つの態様は、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含む組み換えDNAであって、放線菌において該遺伝子を検出可能に発現するDNAベクターである。本発明者らは、配列番号：１に示した塩基配列からなるDNAが、下流に連結した異種遺伝子を増殖期の放線菌において高レベルで発現させることを見いだした。本発明のDNAベクターは、放線菌で所望の遺伝子を発現させるために用いる発現ベクターとして有用である。
【００１２】
本発明においてプロモーター活性とは、下流に連結した遺伝子を転写する活性を言う。プロモーター活性は、プロモーター活性について調べたい配列の下流に、発現を検出するための適当な指標遺伝子（例えばマーカー蛋白質をコードする遺伝子など）を連結し、放線菌等の宿主に導入する。宿主においてその指標遺伝子の発現（例えばマーカー蛋白質の活性など）が検出されれば、その配列はプロモーター活性を有すると判断される。また遺伝子の転写は、蛋白質を検出するかわりにRNAの転写をRT-PCR等により検出して測定することもできる。なお、下流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の3'方向のことであり、上流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の5'方向のことである。
【００１３】
また本発明において遺伝子とは、転写されるべき塩基配列を含む核酸を言う。また本発明において異種遺伝子とは、本発明のベクターのプロモーター配列が由来するL11蛋白質遺伝子とは異なる遺伝子のことを言う。遺伝子は蛋白質をコードしていてもよく、していなくてもよい。蛋白質をコードする核酸は、本発明において、その蛋白質の遺伝子と呼ぶ。アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードする核酸は、本発明においてそれらの遺伝子と呼ぶ。本発明のDNAベクターに組み込む異種遺伝子はL11蛋白質遺伝子以外の所望の遺伝子であってよく、好ましくはL11蛋白質、L1蛋白質、およびL10蛋白質のいずれもコードしない遺伝子である。ベクターに組み込む異種遺伝子は蛋白質をコードしていてもよく、あるいはアンチセンスRNAまたはリボザイムなどの蛋白質をコードしない配列であってよい。蛋白質としては、所望の酵素、構造蛋白質、調節因子などであってよく、天然の蛋白質、変異蛋白質、人工的に作り出した蛋白質などであってよい。例えば、分泌蛋白質を本発明のベクターを利用して発現させれば、この蛋白質を培養液中に大量に分泌させることができる。天然には分泌されない蛋白質であっても、分泌シグナルを付加した融合蛋白質を発現させることで、その蛋白質を菌体外等に分泌させることができる。本発明のベクターは、挿入する遺伝子がコードする蛋白質を分泌するように、予めベクター配列中に分泌シグナル配列をコードしていてもよい。配列番号：１または２の塩基配列を含む本発明のベクターはSD配列（AGGA）を含むが、目的の遺伝子の蛋白質コード配列の開始コドンからSDまでが離れている場合は、開始コドンの近くに適宜SD配列を挿入してよい。なお、本発明のDNAベクターは通常は２本鎖DNAであるが、放線菌に導入した時に２本鎖DNAを生じる限り、どちらか一方の鎖からなるDNAを含むベクター（例えば一本鎖DNAを含むファージなど）であってもよい。すなわち本発明においてある塩基配列を含むDNAベクターとは、その塩基配列を含む２本鎖DNAを生じることができるように、該塩基配列および／またはその相補配列を含むDNAベクターのことである。
【００１４】
本発明において放線菌とは、放線菌目（order Actinomycetales）に属する菌を言う。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり主に土壌などに生息する。原核生物でありながら、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Frankiaceae）、ミクロモノスポラ科（Micromonosporaceae）、プロピオニバクトリウム科（Propionibacteriaceae）、シウドノカルジア科（Psuodonocardiaceae）、ストレプトミセス科（Streptomyceae）、ストレプトスポランギウム科（Streptosporanguaceae）、テルモモノスポラ科（Thermomonosporaceae）、コリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）、マイコバクテリウム科（Mycobacteriuaceae）、およびノカジア科（Nocaudiaceae）が含まれる。本発明において放線菌とは、特に好ましくは、ストレプトミセス科（Streptomyceae）、より好ましくはストレプトミセス属（Streptomyces）に属する菌である。
【００１５】
本発明において好適に用いられるL11遺伝子プロモーター断片の塩基配列を配列番号：１に示す。この配列は、放線菌 S.griseusのL11遺伝子のプロモーター断片であって、強力なプロモーター活性を持っている。本発明者らが、S.griseus, S.lavendulae, S.virginia, および S.coelicolorを含む放線菌においてL11遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ、この領域の配列は極めて保存性が高いことが判明した（図１）。調べた放線菌４菌株で、-10領域、転写開始点、およびShine-Dalgarno (SD) 配列は100%保存されており、それ以外の領域の保存性も極めて高かった。本発明においては、これらの放線菌のL11蛋白質遺伝子のプロモーター配列を好適に用いることができる。例えば、本発明のベクターは、所望の放線菌のリボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に結合された所望の異種遺伝子の塩基配列および転写終結配列を含む発現カセットを有する組み換えDNAが含まれる。
【００１６】
また、本発明のベクターは、L11遺伝子上流領域を、翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列よりも広範囲にわたって有していてもよい。例えば、配列番号：１より長くL11遺伝子の上流領域を含むDNA断片である配列番号：２を好適に用いることができる。より具体的に例示すれば、本発明のベクターは、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流、約3塩基から約197塩基までの塩基配列、より好ましくは約3塩基から約277塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に結合された所望の遺伝子の塩基配列および転写終結配列を含む発現カセットを有する組み換えDNAが含まれる。
【００１７】
また、本発明のベクターにおいては、放線菌L11蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（例えば配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を用いることもできる。このような塩基配列としては、図１に示した S.lavendulae, S.virginia, および S.coelicolor由来の配列（それぞれ配列番号：36、37、および39）を含むDNAが挙げられる。また、このような配列は人為的に変異させたものであってもよく、または天然に変異した配列であってもよい。例えば部位特異的変異導入による塩基置換、あるいは１または複数の塩基の欠失または挿入などにより塩基配列を改変し、プロモーター活性を上昇させたり、あるいはプロモーター活性に影響を与えない配列を除去することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。このように改変した配列のプロモーター活性は、実施例に示したように発現ベクターを構築し、下流に連結した遺伝子の発現を調べることにより評価することができる。改変前の配列とプロモーター活性を比較し、プロモーター活性が維持された（またはより強い）配列を適宜選択することができる。
【００１８】
本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、具体的には、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（特に配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）において、50塩基以内、好ましくは40塩基以内、より好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、最も好ましくは10塩基以内（例えば5塩基以内）の塩基が置換、欠失、および/または付加した塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、野生型L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約60塩基目から約84塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より特定すれば、放線菌L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約57塩基目から約84塩基目までで保存された 5'-ATACCCGTTATCGT[G/T]GTGCGGTATGCCT-3' (配列番号：５) を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。さらに好ましい態様では、野生型L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約101塩基目から約115塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より具体的に記載すれば、L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約98塩基目から約115塩基目までで保存された 5'-TCTGACCTGCT[G/C]GGTTTT-3' (配列番号：６) を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。
【００１９】
また、本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（例えば配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）（ここでは、これらを基準配列と称す）と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、最も好ましくは90%以上（例えば95%以上）の同一性を有する塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、比較したい２つの配列を、塩基がなるべく一致するように適宜ギャップを挿入して整列させ、基準配列全長に対する一致する塩基の割合として算出することができる。塩基配列の整列（アライメント）は、所望のコンピュータプログラムを利用することができ、例えばCLUSTAL W（Higgins, D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）、またはBLAST（National Center for Biothchnology Information）などを用いることができる。ギャップはミスマッチした塩基と同様に扱い、アライメントにおける基準配列全長の塩基数（ギャップを含む）のうち、両者の配列で一致した塩基数の割合として同一性が決定される。但し、両方の配列の同じ位置に共にギャップを入れた場合には、そのギャップは計算から除外する。後述するアミノ酸配列の同一性の算出も同様に行うことができる。
【００２０】
例えばBLASTにより塩基配列またはアミノ酸配列の同一性を決定する場合は、文献「Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410」に記載の方法に従って実施することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはblastnプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはblastpプログラムを用い、例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて"Low complexity"などのフィルターの設定は全てOFFにして計算を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）。パラメータの設定は、例えばopen gapのコストはヌクレオチドは5で蛋白質は11、extend gapのコストはヌクレオチドは2で蛋白質は1、nucleotide mismatchのペナルティーは-3、nucleotide matchの報酬は1、expect valueは10、wordsizeはヌクレオチドは11で蛋白質は2、Dropoff (X) for blast extensions in bitsはblastnでは20で他のプログラムでは7、X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastn以外では15、final X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastnでは50で他のプログラムでは25 にする。アミノ酸配列の比較においては、スコアのためのマトリックスとしてBLOSUM62を用いることができる。２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。
【００２１】
また本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（特に配列番号：１）またはその相補配列を含むDNAまたはRNA、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）またはその相補配列を含むDNAまたはRNA（ここではこれらを基準核酸と称す）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、互いにハイブリダイズさせる核酸のうち、一方の核酸をプローブとして、対象とする配列を持つ核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した20塩基以上、好ましくは25塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、さらに好ましくは80塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上を用いる。ハイブリダイズに用いる基準核酸にL11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００２２】
上記のストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００２３】
なお、本発明のベクターは、L11蛋白質の蛋白質コード配列の全長を含まない。また好ましくは、本発明のベクターはL11蛋白質遺伝子とゲノム上でオペロンを構成するL1蛋白質の蛋白質コード配列の全長を含まない（Kuberski,S. et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 119 (1-2), 33-39; Kuster,C. et al. (1998) Mol. Gen. Genet. 257 (2), 219-229; Accession No. X72787）。より好ましくは、本発明のベクターはL10蛋白質のコード配列の全長を含まない。具体的には、本発明のベクターは、例えば配列番号：８（L11蛋白質）のアミノ酸からなる蛋白質またはこの蛋白質のアミノ酸配列と10アミノ酸以内、好ましくは20、30、40、または50アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、および/または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号：８のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは80、70、または60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNAを含まないことが好ましい。アミノ酸配列の同一性は上記の通りに算出することができる。また、本発明のベクターには、配列番号：７（L11蛋白質 CDS）からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含まない。また好ましくは、本発明のベクターは、配列番号：１０（L1蛋白質）、および/または１２（L10蛋白質）、あるいはこれらの蛋白質のアミノ酸配列と10アミノ酸以内、好ましくは20、30、40、または50アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、および/または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号：１０または１２のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは80、70、または60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNAを含まないことが好ましい。アミノ酸配列の同一性は上記の通りに算出することができる。また、本発明のベクターには、配列番号：９（L1蛋白質 CDS）または１１（L10蛋白質 CDS）からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含まないことが好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は上記の通りである。
【００２４】
本発明のベクターは、異種遺伝子の下流に転写終結配列（ターミネーター）を含む。転写終結配列は、その上流のプロモーターからの転写を終結させる能力を持つ所望の配列を用いることができ、例えば所望の放線菌遺伝子の転写終結配列を用いることができる。但し、本発明のベクターにおいては、Rho因子非依存的に転写を終結させることができる転写終結配列（すなわちintrinsic terminator）を用いることでより優れた効果を発揮する。このような転写終結配列は、一般に 7 bpから20 bpまたはそれ以上のステムループ構造をつくるパリンドローム配列を有している。また一般にGCに富む。特に、ステムループを形成させたときの自由エネルギー低下（ΔG）が-50 Kcal以下、より好ましくは-55 Kcal以下、より好ましくは-60 Kcal以下、より好ましくは-65 Kcal以下、より好ましくは-70Kcal以下となる配列が好ましい。ステムループのΔGは、例えばRNA二次構造予測プログラムを用いて計算することができる。具体的には、DNASIS（Hitachi Software Engineering Co., Ltd.）を利用することができる。
【００２５】
ステム部分は全域にわたって塩基対を形成しなくてもよい。好ましくは、20塩基以上の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、30塩基の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、35塩基の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。ループ部分の大きさは特に制限はないが、典型的には2〜100塩基、例えば3〜50塩基である。
【００２６】
より好ましい態様では、転写終結配列としては放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列が用いられる。ssgAの転写終結配列は20塩基対以上のステムを形成しRho非依存的に転写を終結させることができる。ssgAの転写終結配列を用いることによって、より性能の高い発現ベクターを構築することが可能である。好適に用いられるssgAのRho非依存的転写終結配列を配列番号：３に例示した。この配列はS. griseus ssgAの転写終結配列に由来し、20塩基以上のステムを形成する。本発明のベクターにおいては、ssgAの翻訳停止コドンの次の塩基から200、250、または300塩基を含む領域を用いてよい。例えば、配列番号：４に示した塩基配列を含むDNAを転写終結配列として好適に用いることができる。また本発明においては、放線菌 ssgAの転写終結配列（例えば配列番号：３または４）の塩基配列、または該配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を含み、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。
【００２７】
具体的に例示すれば、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）において50塩基以内、好ましくは40塩基以内、より好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、最も好ましくは10塩基以内（例えば5塩基以内）の塩基が置換、欠失、および/または付加した塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、上記したように、ΔGが-50 Kcal以下、好ましくは-55 Kcal以下、より好ましくは-60 Kcal以下、より好ましくは-65 Kcal以下、より好ましくは-70 Kcal以下となるように調整する。また、ステムの長さおよび塩基対の割合も上記に従うことが好ましい。あるいは、本発明のベクターに用いる転写終結配列は、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、最も好ましくは90%以上（例えば95%以上）の同一性を有する塩基配列、あるいは、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）またはその相補配列を含むDNAまたはRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。塩基配列の同一性の算出、およびハイブリダイゼーションの条件は、本明細書に記載した通りである。
【００２８】
また本発明は、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有する塩基配列を含み、（ｂ）その下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）その下流に転写終結配列を含む組み換えDNAであって、該クローニング部位に挿入した遺伝子を放線菌において検出可能に発現することができるDNAベクターを提供する。このクローニング部位に所望の遺伝子を挿入することによって、増殖期の放線菌においてその遺伝子を高発現させることができる。このようなベクターは、例えば上記の異種遺伝子を有する本発明のDNAベクターにおいて、異種遺伝子が除去され、その部分にクローニング部位が残されたようなベクターが挙げられる。
【００２９】
クローニング部位とは、発現させたい核酸をベクターに組み込むための配列を言う。クローニング部位は、典型的には制限酵素認識配列を含む。クローニング部位は、複数の制限酵素認識配列（すなわちマルチクローニングサイト）を含むことが好ましい。別の態様では、クローニング部位は、例えば3'にチミジンが一塩基突出したDNA末端とすることもできる。このような発現ベクターは、直鎖状の二本鎖DNAとして提供される。このベクターには、PCRにより増幅したDNA断片を、T:A塩基対を利用したライゲーションにより簡便に組み込むことができる。また、クローニング部位は、例えば相同組み換えを利用してベクターに核酸を組み込むための配列であってもよい。クローニング部位以外の配列の構成は、本明細書に記載した通りである。
【００３０】
本発明のベクターの１つの態様はプラスミドベクターである。プラスミドには、放線菌で増幅するための複製起点（ori）が含まれている。さらに大腸菌で増幅するための複製起点を有していてもよい。放線菌と大腸菌の両方で増幅可能なベクターは、大腸菌−放線菌シャトルベクターとして利用することができる。放線菌で増幅するための複製起点（ori）は、低コピー型であっても多コピー型であってもよい。低コピープラスミドとは、放線菌内で1から10コピー程度のプラスミド増幅をもたらすプラスミドを言い、多コピープラスミドとはそれ以上、具体的には40コピーから400コピー程度またはそれ以上のコピー数をもたらすプラスミドを言う。低コピーのoriを例示すれば、例えば SCP2* ori（Lydiate, D.J. et al. (1985) Gene 35(3):223-235）が挙げられる。高コピーのoriとしては、例えば pIJ101 ori（Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714）が挙げられる。またプラスミドベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適当な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびアプラマイシン耐性遺伝子などが含まれ、これらはいずれも当業者にはよく知られている。また、放線菌プラスミドの構築には、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995))、pIJ702（Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714）、pIJ8600（Sun, J. et al. (1999) Microbiology 145:2221-2227）などの配列を利用することができる。
【００３１】
本発明のDNAベクターは、好ましい態様において、異種遺伝子としてS.coelicolorのdagA遺伝子を挿入した場合、pIJ101 oriなどを含む多コピープラスミドの形態で放線菌S.coelicolor M145株 (ATCC Number: BAA-471）に形質転換したときに、適当な培地（例えばYEME培地）で30℃での振盪培養条件において、培養上清中のアガラーゼ活性の最大値が、dagA遺伝子を持たない空ベクターを挿入した対照におけるアガラーゼ活性との差として、50 U/ml以上、好ましくは60 U/ml以上、より好ましくは70 U/ml以上、より好ましくは80 U/ml以上、より好ましくは90 U/ml以上、より好ましくは100 U/ml以上となる発現能力を持つ。
【００３２】
また本発明のベクターの他の１つの態様は、ゲノム組み込み型ベクターである。ゲノム組み込み型ベクターとは、放線菌に導入されたときに、放線菌ゲノムに組み込まれて、ゲノム上から組み込んだ遺伝子を発現できるベクターである。放線菌に導入する前では、このベクターは、プラスミドの形態で調製することもできる。ゲノム組み込み型ベクターの作成においては、放線菌ファージが持つ、宿主ゲノムへのファージDNAの組み込みに必要な組み換え配列を利用することができる。具体的には、例えばφ31ファージのint遺伝子とattPをベクターに挿入すればよい（Bierman, M. et al., (1992) Gene 116: 43-49）。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤により選択し続ける必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。
【００３３】
本発明のベクターは蛋白質の製造に有用である。製造する蛋白質としては、例えばL11蛋白質、L10蛋白質、またはL1蛋白質以外の所望の蛋白質が挙げられる。また、蛋白質自体の製造ではなく、例えば抗生物質など、形質転換菌から生産される有用物質の生産量が、ある蛋白質を発現させることにより上昇する場合には、本発明のベクターを用いてこの蛋白質を発現させ、有用物質の生産を高めることができる。蛋白質の生産は、目的の蛋白質を発現する本発明のベクターで形質転換した放線菌を培養し、該蛋白質を含む培養物または培養上清を回収することにより得ることができる。得られる蛋白質溶液から、公知の方法により該蛋白質をさらに精製することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００３４】
具体的には、炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用する放線菌の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００３５】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、宿主として使用する放線菌が増殖し、目的の蛋白質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節する。温度は宿主とする放線菌の生育に適した温度を適宜選択する。培養時間は、十分量の蛋白質が宿主放線菌が得られれば特に制限はなく、通常は1日から14日、このましくは1日から3日培養する。遺伝子発現に伴って生産蓄積された蛋白質は、次のような方法で採取、分取することができる。
【００３６】
蛋白質が放線菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、放線菌をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチーム処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより放線菌を破砕し、発現させた蛋白質を抽出することができる。こうして得られた粗蛋白質は、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００３７】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories、1989年; 微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版）。例えば、ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って実施することができる。形質転換は、例えば文献（Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D.J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom）記載の方法に準じて実施することができる。
【００３８】
製造された蛋白質は、精製蛋白質および部分精製蛋白質として得ることもできる。また、蛋白質を公知の方法により不溶性の担体に固定化してもよい。本発明においては、このようにして製造された蛋白質も包含する。また、本発明においては、本発明のベクターで形質転換された放線菌にも関する。また本発明は、形質転換放線菌の処理物にも関する。処理物とは、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理処理、リゾチームなどの酵素処理のような生化学的処理、もしくは界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などの化学的処理等を行った産物を指す。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた放線菌、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００３９】
また本発明は、本発明のベクターを用いて、所望の遺伝子の機能を抑制する方法に関する。この方法は、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする核酸が組み込まれた本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む。アンチセンスとしては、標的遺伝子の転写領域全体のアンチセンスを用いることもできるし、あるいは該遺伝子の転写領域の連続した少なくとも15塩基、好ましくは20塩基以上、より好ましくは50塩基以上、より好ましくは80塩基以上、より好ましくは100塩基以上（例えば150塩基以上）に対するアンチセンス配列を用いる。例えば、翻訳開始コドンを含む領域に対するアンチセンス配列は特に好ましい。
【００４０】
細菌でのmRNAの代謝回転は極めて速い。従ってアンチセンスRNAを用いて遺伝子の発現を抑制するには、恒常的に高いレベルでアンチセンスRNAを発現することが必要である。本発明の発現ベクターを用いれば、効果的に目的の遺伝子の発現をアンチセンス効果により抑制することができる。この系は、所望の遺伝子機能抑制への活用が期待される。特に二次代謝等の生育後期に開始される遺伝子の抑制（制御遺伝子のアンチセンスRNAの発現による機能抑制）には、生育初期からアンチセンスRNAの高発現が必要である。アンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制を利用した解析手法は、ポストゲノム解析の一手法として活用が期待される。従来の遺伝子破壊による解析では、その遺伝子の機能が失われるため、必須遺伝子の解析は不可能であった。一方アンチセンスRNA発現は、発現条件をコントロールすることにより必須遺伝子の解析も可能である。本発明のベクターからの発現は、増殖速度と比例すると考えられるため、培養条件を検討することにより、必須の未知機能遺伝子の解析も可能である。また本発明のベクターを用いた遺伝子サイレンシング手法は、放線菌における有用物質生産のためのメタボリックエンジニアリングにも応用可能である。
【００４１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
[実施例１] 放線菌Streptomyces griseus由来のL11リボゾームタンパク遺伝子(rplK)プロモーター領域を用いた発現カセットの構築
本発明者らは、L11リボゾームタンパク遺伝子（rplK）プロモーターとssgA遺伝子のターミネーター配列の特性を巧みに利用した新たな発現ベクターを開発するため、rplK遺伝子プロモーター・マルチクローニング部位・ssgA遺伝子由来の強力な転写ターミネーターの配置を持つ発現カセットを構築した。
【００４２】
放線菌Streptomyces属において、rplK遺伝子の推定プロモーター領域の塩基配列は極めて保存性が高いことを見出した（図１）。RNAポリメラーゼによる転写に必要な-35と-10認識配列および転写開始点を含む塩基配列領域の相同性は極めて高い。また翻訳に必要なリボゾーム結合SD配列を含む領域も100%保存されている。ハウスキーピング遺伝子のL11プロモーターを用いることにより、目的とする外来遺伝子の発現を生育期間中持続でき、しかも生育の栄養条件を変化させる事により、その発現量を調節可能にした。
また、本発明者らは、発現カセットの構築において、放線菌由来の転写終結因子非依存型のステム・ループ構造を持つターミネーターの中でも最強の一つと考えられる S. griseus由来ssgA遺伝子 (Kawamoto,S., and J.C.Ensign.1995. Actinomycetologica 9:136-151. Kawamoto,S., H.Watanabe, A.Hesketh, J.C.Ensign, and K.Ochi.1997. Microbiology 143:1077-1086) のターミネーター配列を組み合わせることにした (図２)。すなわち強力なターミネーターの利用によりmRNAの安定化の向上を図った。
【００４３】
発現カッセトの構築に際しては、S. griseusのrplK遺伝子プロモーター領域（図１に示した配列に加えさらに上流域120bpを含む計約280bp配列領域) (配列番号：２) を、組換えプラスミドpP34 (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560) を鋳型としてPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BamHIとEcoRIを導入した。S. griseusのssgA遺伝子ターミネーター領域 (図２に示した配列に加えさらに下流域 50 bpを含む計約 340 bp配列領域) (配列番号：４) を組換えプラスミド pNY22 (Kawamoto, S. and J.C. Ensign, 1995, Actinomycetologica 9:136-151)を鋳型としてPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列EcoRIとBamHIを導入した。ベクターpGEM3Zf(-) (Promega社) をEcoRIで切断し、Klenow enzymeでfill inした後、セルフライゲーションして、クローニング部位のEcoRI認識配列を潰したプラスミドpGΔEを文献（Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sanbrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）記載の方法に準じて構築した。次に、プライマー L11PBamF (5'-GCCAGGATCCACGAGATCAACGCCG-3'／配列番号：13) (下線部は制限酵素部位) および L11PEcoR (5'-TTGGGAGGAATTCCTCTCTCCGGG-3'／配列番号：14) を用いて、rplKプロモーター領域をPCRにより増幅し、280bpのPCR産物を得た後、BamHIおよびEcoRIで切断した。また、プライマー SsgATerEF (5'-GGGTGAATTCGACGGCAACCTG-3'／配列番号：15) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：16) を用いて、ssgAターミネーター領域をPCRにより増幅し、350 bp産物を得た後、BamHIおよびEcoRIで切断した。pGΔEをBamHI切断後、BAP処理し、制限酵素処理したrplKプロモーター領域とssgAターミネーター領域のPCR産物をライゲーションし、組換えプラスミドpSK200を作製した。5'末端をキナーゼでリン酸化したプライマー PlinkF (5'-AATTCAGATCTTTAAATATTACTAGTAAGCTTG-3'／配列番号：17)および PlinkR (5'-AATTCAAGCTTACTAGTAATATTTAAAGATCTG-3'／配列番号：18) をアニーリングして、複数の制限酵素認識配列（高GC含量のDNAを持つ放線菌では稀にしか存在しないATリッチな制限酵素認識配列）を持つ合成DNAリンカーを作成し、これを制限酵素EcoRI（rplK遺伝子プロモーター領域とssgA遺伝子ターミネーター領域の接続部に唯一認識配列が存在）で切断したpSK200に挿入して組換えプラスミドpSK201を作製した。このプラスミドには、制限酵素BamHIで切り出し可能なrplK遺伝子プロモーター - クローニング部位 - ssgA遺伝子ターミネーターから構成される約700bp発現DNAカセットが挿入されている。
【００４４】
[実施例２] 各種発現プラスミドの構築
１．発現ベクターpSK210
pSK201を鋳型として、プライマー L11PSK (5'-GTCGGGATCCTCGGCCGCGAG-3'／配列番号：19) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：16)を用いて発現DNAカセットをPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端に制限酵素認識配列BamHIを導入した。5'末端のBamHI認識配列は、DNA発現カセットのrplK遺伝子プロモーター5'末端部に存在するBglII認識配列を除去するため導入した。BamHIで切断した650bp PCR産物を放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpV1（Kawamoto, S. et al., 1997, Microbiology 143:1077-1086）のBglIIクローニングサイトに挿入し発現ベクターpSK210を作製した（図３）。
pSK210は放線菌で低コピー型であり、選択マーカーはアンピシリン耐性（amp;大腸菌）、チオストレプトン耐性（tsr; 放線菌）およびハイグロマイシン耐性（hyg; 放線菌）である。
【００４５】
２．発現ベクターpSK220
上記のBamHIで切断した650bp PCR産物を放線菌多コピーベクターpIJ702 (Katz E. et al., 1983, J. Gen. Microbiol., 129: 2703-2714）のBglIIクローニングサイトに挿入し、多コピー型の発現ベクターpSK220を作製した（図４A）。本プラスミドの選択マーカーはチオストレプトン耐性である。
【００４６】
３．放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpSK1955
ベクターpBluescript SK(+) (Stratagene社製) を鋳型として、プライマー PBlueT7C (5'-CGCTGGCATATGTAGCGGTCACGCTGCGCG-3'／配列番号：20) および PBlueT3N (5'-GCTGGGACGTCAGGTTTCCCGACTGGAAAG-3'／配列番号：21) を用いて、このプラスミドの約580bpのマルチクローニング部位-lacZ遺伝子領域をPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列AatIIとNdeIを導入した。AatIIとNdeI で切断したPCR産物、放線菌多コピーベクターpIJ702から調製した約2.9 kbのNdeI-PstI DNA断片（放線菌での複製に必要なrep遺伝子とpIJ101 oriを含む）および放線菌ゲノム組込型ベクターpIJ8600 (Sun, J. et al., Microbiology 145: 2221-2227) から調製した約2.4 kbのAatII-PstI DNA断片（アプラマイシン耐性遺伝子であるacc(3)IVとpUC18 oriを含む）を連結することにより、放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpSK1955を作製した（図４B）。pSK1955は放線菌で多コピー型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４７】
４．発現ベクターpSK1127
pSK220を鋳型として、プライマー L11ClaF (5'-CCTCATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3'／配列番号：22) (BglII siteの除去のため) およびSsgATmNde (5'-CTGGCATATGCGGGCGCGGCGCTGCCACTG-3'／配列番号：23) を用いてPCRにより605bp発現DNAカセットを増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列ClaIとNdeIを導入した。ClaIとNdeI で切断したPCR産物、およびベクターpSK1955から調製した約5.1 kbのClaI-NdeI DNA断片（rep遺伝子, pIJ101 ori, acc(3)IV遺伝子とpUC18 oriを含む）を連結することにより発現ベクターpSK1127を作製した（図５A）。放線菌 - 大腸菌シャトルベクターのpSK1127は放線菌で多コピー型のであり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４８】
５．発現ベクターpSK811
pSK220を鋳型として、プライマー L11ClaF (5'-CCTCATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3'／配列番号：22) (BglII siteの除去のため) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：16)を用いてPCRにより655bp発現DNAカセットを増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列ClaIとBamHIを導入した。ClaIとBamHI で切断したPCR産物、およびゲノム組込型ベクターpIJ8600から調製した約6.3 kbのClaI-BglII DNA断片（ゲノム組込に必要なφ31ファージのint遺伝子とattP, RK2 oriT, acc(3)IV遺伝子およびpUC18 oriを含む）を連結することにより発現ベクターpSK811を作製した（図５B）。放線菌-大腸菌シャトルベクターのpSK811はゲノム組込型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４９】
[実施例３] 発現ベクターpSK210とpSK220による蛍光タンパク質の発現
クラゲ由来の改変緑色蛍光タンパク質EGFPの構造遺伝子をプラスミドpEGFP（Clontech社）を鋳型としてPCR増幅した。ベクター上の発現DNAカセットへの挿入のためPCR産物（約770bp）の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BglIIとHindIIIを導入した。具体的には、HindIIIサイトおよびEcoRIサイトの間にRBS (B. subtilis用)−EGFPコード配列 (ベーリンガー pSPT19由来。ただし、開始コドンを含むNcoIサイトからEcoRIサイトまでは、Clontech社のpEGFP由来。RBSは、合成DNAリンカーを作って挿入したものである) を含む断片 (図６A) を含むプラスミド (pSPT19) を鋳型に、プライマー EGFP-N (5'-GACCGAAGATCTGTTTAACTTTAAGAAG-3'／配列番号：24) (HindIIIサイトをBglIIサイトに変換するため) およびEGFP-C(5'-TACACGGAATTCAAGCTTCGCGGCCGC-3'／配列番号：25) を用いてRBS-EGFP遺伝子のPCRを行った。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、上記で構築した発現ベクターpSK210（低コピーベクター）とpSK220（多コピーベクター）に挿入してそれぞれ組換えプラスミドpLEGFPとpMEGFPを作製した。これらプラスミドおよび空ベクター (対照) を、S. coelicolor M145株 (ATCC Number: BAA-471, Hopwood, D.A., Microbiology 145: 2183-2202, 1999; Bentley, S.D. et al., Nature 417: 141-147, 2002; Hopwood, D.A. et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual (The John Innes Foundation, Norwich, U.K.) に文献（Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D.J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom）記載の方法に準じて形質転換した。得られた形質転換株をYEME培地（組成：マルトエキス 0.3%, Difco酵母エキス 0.5%, Difcoバクトペプトン 0.3%, 5 mM MgCl2, グルコース 1%, ショ糖 34%）を用いて30℃で振盪培養し経時的に蛍光顕微鏡（Leica社製：蛍光フィルターブロックN3;S(NEW)励起光グリーンを使用）を用いて菌体を観察した。図６B〜Dは、各形質転換株の対数増殖中期の菌糸細胞の蛍光顕微鏡写真である。図６から明らかなようにpLEGFPとpMEFGP形質転換株では、蛍光タンパク質EGFPの発現により菌糸全体に渡り緑色蛍光が観察された。一方、対照として用いたベクターpSK220形質転換株の菌糸細胞では蛍光は全く観察されなかった。多コピー型ベクター由来のpMEFGP形質転換株の方が低コピー型ベクター由来のpLEGFP形質転換株に比べ遺伝子増幅効果によりはるかに高い蛍光強度を示した。なお、発現DNA カッセトのrplKプロモーター配列は、S. griseus由来であるが図１に示した配列の高い相同性からも予想されたようにS. coelicolor においても機能することが明らかとなった。
【００５０】
[実施例４] 発現ベクターpSK220による放線菌寒天分解酵素アガラーゼの高発現
S. coelicolor M145株のSD配列（リボゾーム結合配列）を含む寒天分解酵素アガラーゼ構造遺伝子（dagA遺伝子）を本菌株ゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅した。ベクター上の発現DNAカセットへの挿入のためPCR産物（約970bp）の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BglIIとHindIIIを導入した。具体的には、M145株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー dagASD (5'-CGGGAGATCTGAAGAAGGAGAACGATCGTG-3'／配列番号：26) および dagATer(5'-ACTTGAAAGCTTCCGTTCCGTGAGGTGCTG-3'／配列番号：27) を用いてdagA遺伝子のPCRを行った。得られた約970bpのPCR産物をBglIIおよびHindIIIで切断し、上記で構築したpSK220（多コピーベクター）に挿入して組換えプラスミドpMDagAを作製した。
【００５１】
dagA 遺伝子産物のアガラーゼは、細胞内で前駆体タンパク質（30 kDa）として合成され細胞外に分泌される分泌酵素（28 kDa）である (Bibb, M.J. et al., 1987, J. Gen. Microbiol., 133:2089-2096)。また本来のdagA遺伝子の発現は、グルコースによる強力なカタボライト抑制や形態分化と連動した複雑な転写発現制御を受けることが知られている（Gonzalez, L.S. et al., 1994, Microbiology 140:2555-2565）。
【００５２】
S. coelicolor M145株のpMDagA形質転換株をYEME培地（組成前述）を用いて対数増殖後期まで30℃で振盪培養した。遠心分離により得た培養上清のアガラーゼ活性を文献 (Bibb, M.J.et al., 1987. J. Gen. Microbiol. 133:2089-2096) 記載の方法に準じて測定したところ、対照のpSK220形質転換株（2.5 U/ml）に比べてpMDagA形質転換株は約60倍高い 143 U/ml の活性を示した。また2%寒天固形培地のウェルに培養上清を添加し30℃一晩反応を行うことにより活性染色を行った（図７A）。さらに培養上清中の分泌タンパク質を60%硫酸アンモニウムで沈殿させ、Tricine-SDS PAGEにより電気泳動分析を行った（図７B）。図７Aから明らかなように上述のアガラーゼ活性測定結果と一致してpMDagA形質転換株では中央部が陥没した大きな透明ハローを形成した。一方対照のpSK220形質転換株でのハロー形成は極めて小さかった。また図７Bから明らかなようにpMDagA形質転換株では、アガラーゼ分子量から予想される位置に分泌タンパク質バンドが観察された。
【００５３】
以上結果から、pMDagA形質転換株では、対数増殖期からアガラーゼが高発現され培地中に大量に分泌されることが明らかとなった。対照のベクターpSK220形質転換株とpMDagA形質転換株共にゲノム中には本来のdagA 遺伝子が存在する。しかしながら用いた培地にはグルコースが炭素源として1%添加されているためカタボライト抑制によりゲノム上のdagA遺伝子発現が強く抑制されることは、ベクターpSK220形質転換株の活性測定結果から明らかである。従ってpMDagA形質転換株のアガラーゼ活性のほとんどはプラスミドpMDagA中のdagA遺伝子の発現によるものと考えられる。
放線菌Streptomyces属のカタボライト抑制等の複雑な遺伝子発現制御を受ける有用分泌タンパクの大量発現には、本発明の発現DNAカセットを持つベクターの利用が極めて効果的であることは明らかである。
また、本来分泌されな蛋白質であっても、放線菌の分泌シグナル配列を挿入したベクターにこの蛋白質をコードする遺伝子を組み込めば、放線菌の分泌系を利用して細胞内酵素の大量生産も可能である。これにより、異種タンパク質の細胞内大量発現による生産菌への悪影響を回避することができる。
【００５４】
[実施例５] ゲノム組み込み型ベクターpSK811を用いたアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制
本発明の発現DNAカセットのマルチクローニング部位に目的の遺伝子を挿入することにより、放線菌で培養初期から恒常的に発現できることが前述のように明らかとなった。高等動植物では、アンチセンスRNA発現による特定遺伝子機能の抑制（遺伝子機能サイレンシング：遺伝子を破壊することなくアンチセンスRNAの発現によりmRNAからのタンパク合成すなわち遺伝子産物生成を阻害することにより遺伝子機能を抑制する方法）が基礎・応用面で利用されている。しかしながらmRNAの代謝回転が極めて速い細菌でのアンチセンスRNA発現利用は困難であった。そこで発現DNAカセットを持つゲノム組込型ベクターpSK811を用いてアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制効果の検証を行った。放線菌S. coelicolorの二次代謝誘発制御に関与する既知遺伝子ssgA（Kawamoto, S. et al., 1997. Microbiology 143:1077-1086; Wezel, G. P. et al., 2000. J. Bacteriol., 182:5653-5662）とeshA（Kawamoto, S. et al., 2001. J. Bacteriol., 183:6009-6016）遺伝子をモデルとして用いて実験を行った。
ssgAとeshA遺伝子は必須遺伝子ではないが、いずれの遺伝子を破壊してもS. coelicolorの青色抗生物質アクチノロージン生産が極端に低下する。一方、赤色抗生物質ウンデシルプロディギオシンの生産はほとんど影響を受けない。SsgA（135アミノ酸よりなる酸性タンパク質）とEshA（471 アミノ酸よりなるタンパク質）遺伝子産物共に二次代謝が開始される生育後期に出現し、その発現は転写レベルで時期特異的に制御されている。従って両遺伝子はRNAの代謝回転が速い放線菌でアンチセンスRNA発現による機能抑制が特に困難と考えられる。
【００５５】
S. coelicolor M145株のゲノムDNAを鋳型として、ssgA遺伝子（N-末端から約75アミノ酸に相当する塩基配列領域：約235bp）とeshA遺伝子（N-末端から約85アミノ酸に相当する塩基配列領域：約280bp）の一部をPCR増幅した。両PCR産物の5'末端 と3'末端にはそれぞれ制限酵素認識配列BglIIとSpeIを導入した。具体的には、M145株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーSCp52-Bg (5'-TCCGGAGATCTCCCGGACCCGGGCG-3'／配列番号：28) および SCp52-Spe (5'-CTCCCACTAGTGCAAGGAGAAGGCC-3'／配列番号：29) を用いてeshA遺伝子 (アンチセンス発現方向へ挿入)のPCRを行い、得られた280bp産物をBglIIおよびSpeI で切断した。この断片は、5'-上流領域約20bpとEshAタンパク質(471アミノ酸)のN末端から約85アミノ酸配列に相当する塩基配列領域にあたる。また、M145株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー SCssgA-Bg (5'-GTCAGATCTGCACCTCGGCCAGCGG-3'／配列番号：30) および SCssgA-Spe (5'-GGCACTAGTCATGATGAGCTTTCTC-3'／配列番号：31) を用いてssgA遺伝子(アンチセンス発現方向へ挿入)のPCRを行い、得られた235bp産物をBglIIおよびSpeIで切断した。この断片は、SsgAタンパク質(135アミノ酸)のN末端から約75アミノ酸配列に相当する塩基配列領域にあたる。これらをBglIIおよびSpeI 処理したゲノム組込型ベクターpSK811にアンチセンスRNA発現方向に挿入して組換えプラスミドpEL7（anti-eshA RNA発現）とpSE1（anti-ssgA RNA発現）を作製した。これらプラスミドをS. coelicolor J1051株 (Chater, K.F. et al. (1982) Gene 19, 21-32; Chater, K.F. et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 97, 69-95; Kelemen, G.H. et al. (1995) Mol. Microbiol. 17, 221-230) に形質転換し、アプラマイシン耐性で組換えプラスミドがゲノムに挿入された形質転換株を選択した。得られた形質転換株を0.1% Difcoカザミノ酸を添加したR5寒天培地（1リットル当たりの組成：K2SO4 0.25g, MgCl2・6H20 10.12g, Difco酵母エキス 5g, TES 5.73g, グルコース10g, 寒天20g, 微量元素溶液* 2ml）で30℃、４日間培養して抗生物質生産性を調べた（図８）。*微量元素溶液（1リットル当たりの組成）：ZnCl2 10mg, FeCl3.6H2O 200mg, CuCl2・2H2O 10mg, MnCl2・4H2O 10mg, Na2B4O7・10H2O 10mg, (NH4)6Mo7O24・H2O 10mg
【００５６】
図８から明らかなようにベクターpSK811形質転換株では赤色抗生物質ウンデシルプロディギオシンと青色抗生物質アクチノロージンが生産されるのに対して、pEL7およびpSE1形質転換株共に予想されたように青色抗生物質アクチノロージンの生産が著しく抑制された。すなわちゲノムに挿入された組換えプラスミドからのアンチセンスRNA発現がeshAおよびssgA遺伝子機能を抑制したことが強く示唆された。pSK811はゲノム組込み型であり、培養する際に選択マーカーの抗生物質を添加しなくても安定に維持される利点がある。この様な条件でも遺伝子機能を充分抑制可能なアンチセンスRNA発現が行われることが証明された。
【００５７】
次に形質転換株のアンチセンスRNA発現に関するRT（逆転写）-PCR解析を行った（図９）。0.2% カザミノ酸を添加したR5培地で各形質転換株を30℃で振盪培養した。対数増殖の初期・中期・後期の培養菌糸から全RNAをRNeasy Mini Kit（Qiagen社）を用いて調製した。さらにRNA試料中に微量存在するDNAをRNase-free DNase I（Qiagen社）により分解した。RNA 濃度は、波長260nm の吸光度測定により定量した。RT-PCRはOne Step RT-PCR Kit（Qiagen社）を使用し、製造社のプロトコールに従い反応を行った。アンチセンスRNA検出のための特異的プライマーは図９Aに示したものを用いた。具体的にはanti-senseRNA検出用プライマー (pSK811, pEL7, pSE1) としては、RT-L11F (5'-GGACCCGGAGAGAGGAATTCAGATC-3'／配列番号：32) (予想されるmRNAのRT-PCR産物のサイズ：pSK811, 114bp; pEL7, 400bp)、および RT-ssgAR (5'-GTCAGCCGGCGTTCTGCTCCTCG-3'／配列番号：33) (予想されるmRNAのRT-PCR産物のサイズ：pSE1, 350bp) を用いた。放線菌で生育期を通じて比較的高レベルで発現されており、転写解析に際して内部標準として用いられるhrdB遺伝子に関するmRNAのRT-PCR反応も同時に行った。使用したプライマーは、RT-hrdBF (5'-AGAGCCCAAGCGCACCCGAAAGAG-3'／配列番号：34)および RT-hrdBR (5'-CTCGTCCTCGTCGGACAGCACGAAG-3'／配列番号：35) である (Kelemen, G.H. et al., 1991, Gene 98:53-60; Kelemen, G.H. et al., 1996, Mol. Microbiol., 21:593-603)。hrdBのRT-PCR反応に用いたプライマーで増幅される産物のサイズは370 bpである。
【００５８】
RT-PCRは50μl反応容量で行い、反応に添加した全RNA量は10 pg或いは100 pgであった。One Step RT-PCRは、50℃, 30min（逆転写酵素反応）次いで95℃ 15min (逆転写酵素の不活性化と耐熱性DNA Polymeraseの活性化)、そして95℃ 30 sec, 64℃ 30 sec, 72℃ 1 minを5サイクルと95℃ 30sec, 62℃ 30sec, 72℃ 1min を30サイクル、さらに72℃ 10minの反応条件で行った。なおOne Step RT-PCRにおいて最初の逆転写酵素反応を行わずに進めた場合には、増幅産物は全く得られないことから全RNA試料へのDNAの混入がないことを確認した。図９B から明らかなようにpSE1とpEL7形質転換株においてそれぞれ予想されるサイズのanti-ssgAとanti-eshA mRNAが生育期を通じて内部標準として同時に測定したhrdB遺伝子発現に匹敵するレベルで発現していた。以上の結果から、前述のpSE1とpEL7形質転換株の表現型は、アンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制効果に起因することが明らかとなった。
pSK811ベクターはゲノム組込型であり形質転換株において発現DNAカセットは１コピーで存在する。前述の結果から１コピーで存在しても遺伝子機能を抑制するのに充分なアンチセンスRNA発現が可能であることを示している。
発現DNAカセットを持つ放線菌低コピーベクターpSK210や多コピーベクターpSK220とpSK1127 を活用することにより今回検証したssgAやeshA遺伝子に比べさらに発現レベルの高い遺伝子の機能抑制を充分期待できる。
従って本発明の発現DNAカセットを持つベクターは目的遺伝子の放線菌における高発現に有効なばかりでなく今まで細菌で困難であったアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制（遺伝子サイレンシング）をも可能にするものである。
これらベクターを用いた遺伝子サイレンシング手法は、放線菌における有用物質生産のためのメタボリックエンジニアリングにも応用可能である。また放線菌のポストゲノム解析の遺伝子機能解析の手法として利用できる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、放線菌で所望の遺伝子を高レベルで発現させることが可能な発現ベクターが提供された。このベクターは、プラスミドとして、あるいはゲノム組み込み型ベクターとして使用することができる。本発明のベクターを用いれば、放線菌を宿主として所望の蛋白質を生産させることが可能であるほか、アンチセンスRNAやその他の所望の遺伝子を放線菌において高レベルで発現させることが可能である。
【００６０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】放線菌株間のrplK（リボゾームタンパク質L11遺伝子）プロモーター領域塩基配列の相同性を示す図である。S.lavendulae (S. lav), S.virginia (S. vir), S.griseus (S. g), S.coelicolor (S. c) のrplKプロモーターの塩基配列を示した（順に配列番号：36〜39）。４種で同一の塩基はアルタリスクで示した。-35、-10、およびSD配列を囲みで示した。主要な転写開始点を太矢尻で、マイナーは転写開始点を小矢印で示した。
【図２】ベクターpSK811に挿入した、S. griseusのssgA遺伝子のターミネーター配列（配列番号：40）を示す図である。ΔG=-71.7 kcalのステムループを形成するパリンドローム配列を含む。塩基対を形成する塩基を囲みで示した。
【図３】 pSK210の構造を示す図である。
【図４】 pSK220（パネルA）およびpSK1955（パネルB）の構造を示す図である。
【図５】 pSK1127（パネルA）およびpSK811（パネルB）の構造を示す図である。
【図６】 pSK220とpSK210による蛍光タンパク質の S. coelicolorでの高発現を示す図である。Aは放線菌用EGFP発現カセットの構造、B〜Dは S. coelicolorのEGFPの発現の蛍光顕微鏡観察を示す。Aにおいて、EGFPの5'側および3'側に示した配列を、それぞれ配列番号：41および42とした。
【図７】アガラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換した放線菌からのアガラーゼの発現を示す図である。(A) 形質転換株の培養上清のアガラーゼ活性を示す図である。培養上清10μlをR2YE寒天培地のウェルに添加し、30℃で一晩インキュベートした。(B) 形質転換株の培養上清のTricine SDS-PAGE分析を示す図である。1, 分子量マーカー; 2, pSK220形質転換株; 3, pMDagA形質転換株。矢印はアガラーゼタンパク質のバンドを示す。
【図８】アンチセンスRNA発現によるeshAおよびssgA遺伝子機能の抑制を示す図である。空ベクター (pSK811) 形質転換株と比較すると、pSE1形質転換株およびpEL7形質転換株共に、青色抗生物質アクチノロージンの生産が明らかに抑制された。
【図９】アンチセンスRNA発現をRT-PCRにより解析した結果を示す図である。AはRT-PCRの増幅断片の位置を、BはRT-PCRの結果を示す。EL, 対数増殖初期; ML, 対数増殖中期; LL, 対数増殖後期。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an actinomycete expression vector.
[0002]
[Prior art]
As an expression vector in conventional actinomycetes, several examples using an inducible promoter derived from actinomycetes have been reported. Transcription is induced by the addition of the antibiotic thiostrepton.tipAPromoter (Smokvina T. et al., 1990, Gene 94: 53-59; Kuhstoss S., and Rao RN, 1991, Gene 103: 97-99; Takano E. et al., 1995, Gene 166: 133-137 ), Induced by glycerolglyCABInduced by promoter (Hindle Z., and Smith C. P., 1994, Mol. Microbiol. 12: 737-745) and mitomycin CmcrABA promoter (August P.R. et al., 1996, Gene 175: 261-267) is used as an expression vector.tipAAndmcrABWhen promoters are used, since drugs are used for induction, it is necessary to remove these drugs at the purification stage when the expressed protein is put to practical use. As an expression vector using a constitutive promoter, it was artificially mutated.ermE *Promoter (Schmitt-John, T., and Engels, JW, 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 493-498; Bibb, MJ et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 533-545) was used. Things have been reported.
[0003]
[Non-Patent Document 1]
Smokvina T. et al., 1990, Gene 94: 53-59
[Non-Patent Document 2]
Kuhstoss S., and Rao R.N., 1991, Gene 103: 97-99
[Non-Patent Document 3]
Takano E. et al., 1995, Gene 166: 133-137
[Non-Patent Document 4]
Hindle Z., and Smith C. P., 1994, Mol. Microbiol. 12: 737-745
[Non-Patent Document 5]
August P.R. et al., 1996, Gene 175: 261-267
[Non-Patent Document 6]
Schmitt-John, T., and Engels, J.W., 1992, Appl.Microbiol. Biotechnol. 36: 493-498
[Non-Patent Document 7]
Bibb, M. J. et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 533-545
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an expression vector capable of expressing a gene at a high level in actinomycetes in the growth phase.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to develop an expression vector capable of expressing a foreign gene at a high level in the actinomycetes in the growth phase, the present inventors focused on the promoter of actinomycetes ribosomal protein L11 gene. Ribosome is an essential protein synthesizer, and the gene of L11 protein is expressed from the early stage of growth, and its expression is considered to be maximized in the growing logarithmic phase. We have previously described the genus Streptomyces.Streptomyces griseusL11 protein gene (rplKA DNA fragment containing the gene) has been isolated (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255: 549-560). Also,S.coelicolorOnly inrplKThere has been a report on the transcription initiation site in the upstream region (Puttikhunt, C., T. Nihira, and Y. Yamada. 1995. Mol. Gen. Genet. 247: 118-122). But contains the promoter regionrplKEven when the gene fragment was inserted into a multicopy plasmid and introduced into actinomycetes, transformants could not be obtained (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255: 549-560 ).
[0006]
Therefore, the present inventors selected a promoter fragment of the L11 protein gene consisting of about 280 base pairs, and constructed a new expression vector by ligating a heterologous gene thereto. As a result of measuring the gene expression from the vector, it was found that the expression of the heterologous gene linked downstream of this DNA was very strongly induced. In other words, by using the 3rd to 277th DNA fragments upstream from the translation initiation codon of the L11 protein gene and further linking a heterologous gene rather than the originally linked L11 protein coding sequence, It became possible to avoid other harmful effects and demonstrated that a vector that highly expresses a heterologous gene can be constructed. At this time, as a transcription termination sequence (terminator),ssgABy using gene-derived terminator sequences (Kawamoto, S., and JC Ensign, 1995, Actinomycetologica 9: 136-151; Kawamoto, S et al., 1997. Microbiology 143: 1077-1086) We succeeded in realizing high expression more reliably.ssgAThe terminator of the gene contains a palindromic sequence that can form a large stem loop, and thus was able to terminate transcription strongly without depending on the transcription termination factor.rplKWith promoterssgABy combining the terminator sequence of the gene, the expression of the desired foreign gene can be sustained throughout the growth period, and the expression level can be adjusted by changing the nutritional conditions of growth, and the use of a powerful terminator We have succeeded in constructing a new expression vector that can improve the stabilization of mRNA.
[0007]
aboverplKThe promoter-heterologous gene expression cassette is the origin of replication of the low copy plasmid (ori) Can be constructed as a low copy type expression plasmid by incorporating it into a plasmid having a replication origin), or it can be constructed as a multi copy type expression plasmid by incorporating into a plasmid having the origin of replication of a multicopy plasmid. Successful. Thus, in the present inventionrplKFor the first time, a multi-copy expression plasmid having a gene-derived promoter fragment was provided.
[0008]
When the EGFP coding sequence was incorporated into this expression vector, introduced into actinomycetes and analyzed for expression, strong expression of EGFP was observed from the cells. Moreover, when the coding sequence of the agarase protein which is a secretory protein was incorporated, introduced into actinomycetes and cultured, agarase exceeding 140 U / ml was secreted into the culture supernatant. The expression of the original agarase gene is not expected to be highly expressed because it is subject to catabolite repression by glucose and transcription repression by repressor protein. However, by using the expression vector of the present invention, the expression gene should be originally received The protein could be expressed at a high level without being suppressed.
[0009]
In addition, the present inventors also added the φ31 phage necessary for integration into the host genome into this expression vector.intA gene and attP were inserted to construct a genome-integrated expression vector. In order to keep the plasmid in the fungus body, it is usually necessary to select with a drug corresponding to the drug resistance gene incorporated into the plasmid, but since the genome-integrated expression vector is stable, a recombinant bacterium was obtained once. Later, it is excellent in that there is no need for drug selection. Each of these genomic integration vectorsssgAGenes andeshAA partial sequence of the gene was incorporated into antisense and introduced into actinomycetes, and the expression level was measured and phenotypic changes were observed. When the transcription of antisense RNA in the transformant was analyzed by RT-PCR,ssgAandeshAIt was revealed that the antisense RNA was expressed throughout the growing season. The transcription level of antisense RNA is endogenoushrdBIt was comparable to the transcription level of the gene. That is, it was proved that the vector of the present invention can express a heterologous gene at a high level even in a form integrated in the genome.ssgAGenes andeshABoth genes are not essential genes, and both strains that have disrupted these genes suppress the production of the blue antibiotic actinorhodin. Since the production of the blue antibiotic actinorhodin was clearly suppressed in the transformant expressing the above antisense RNA,eshAGenes andssgAIt was confirmed that the function of the gene was actually suppressed. Thus, the vector of the present invention is integrated into the genome, stably maintained, and can also express a gene at a high level. It has been proved that the vector of the present invention is extremely useful as a vector for high gene expression or as a vector for gene function suppression by antisense RNA expression.
[0010]
That is, the present invention relates to a novel actinomycetes expression vector, a host cell holding the vector, a method for producing a protein using the vector, and more specifically,
(1) A DNA vector for expressing a heterologous gene in actinomycetes, wherein (a) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or more bases in the base sequence is substituted, deleted, and / or Or (b) a base sequence of the heterologous gene functionally linked downstream of the base sequence of (a), including a base sequence of DNA having an inserted base sequence and having promoter activity, (c) ( a DNA vector comprising a transcription termination sequence downstream of the base sequence of b),
(2) a DNA vector for expressing a gene in actinomycetes, wherein (a) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or more bases in the base sequence is substituted, deleted, and / or (B) including a base sequence of DNA containing the inserted base sequence and having promoter activity, (b) including a cloning site for linking a desired gene downstream of the base sequence of (a), (c) of (b) A DNA vector containing a transcription termination sequence downstream of the cloning site,
(3) The transcription termination sequence contains the base sequence described in SEQ ID NO: 3, or a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, and / or inserted in the base sequence, and has an activity of terminating transcription. The DNA vector according to (1) or (2), which is a base sequence of DNA having
(4) The DNA vector according to any one of (1) to (3), which is a low copy plasmid,
(5) The DNA vector according to any one of (1) to (3), which is a multicopy plasmid,
(6) The DNA vector according to any one of (1) to (3), which is a genome integration vector,
(7) A host cell transformed with the DNA vector according to any one of (1) to (6),
(8) A method for producing a protein, the step of culturing a host cell transformed with the DNA vector according to any one of (1) to (6) encoding the protein, and the host cell or a culture solution thereof A method comprising a step of recovering the protein produced from
(9) A method for suppressing the function of a gene, comprising the step of transforming a host cell with the DNA vector according to any one of (1) to (6) encoding an antisense of the gene or a part thereof Method.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to an expression vector for expressing a gene in actinomycetes using an L11 protein gene promoter sequence. L11 protein gene (rplKGene) encodes the ribosomal protein L11 and is highly conserved in actinomycetes (see FIG. 1). The vector of the present invention contains DNA in the upstream region of the translation initiation codon of this L11 protein gene. One aspect of the vector of the present invention includes (a) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence in which one or more bases are substituted, deleted, and / or inserted in the nucleotide sequence, and a promoter (B) includes a base sequence of a heterologous gene functionally linked downstream of the base sequence of (b) (a), and (c) terminates transcription downstream of the base sequence of (b). A recombinant DNA comprising a sequence, which is a DNA vector that detectably expresses the gene in actinomycetes. The present inventors have found that DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 expresses a heterologous gene linked downstream at a high level in actinomycetes in the growth phase. The DNA vector of the present invention is useful as an expression vector used for expressing a desired gene in actinomycetes.
[0012]
In the present invention, the term “promoter activity” refers to the activity to transcribe a gene linked downstream. For promoter activity, an appropriate indicator gene for detecting expression (for example, a gene encoding a marker protein) is linked downstream of the sequence to be examined for promoter activity and introduced into a host such as actinomycetes. If the expression of the indicator gene (for example, the activity of the marker protein) is detected in the host, the sequence is determined to have promoter activity. Moreover, gene transcription can be measured by detecting RNA transcription by RT-PCR or the like instead of detecting protein. The downstream means the 3 ′ direction of the transcribed polynucleotide chain, and the upstream means the 5 ′ direction of the transcribed polynucleotide chain.
[0013]
In the present invention, a gene refers to a nucleic acid containing a base sequence to be transcribed. In the present invention, the heterologous gene refers to a gene different from the L11 protein gene from which the promoter sequence of the vector of the present invention is derived. A gene may or may not encode a protein. A nucleic acid encoding a protein is referred to as a gene for the protein in the present invention. Nucleic acids encoding antisense RNA or ribozyme are referred to as those genes in the present invention. The heterologous gene to be incorporated into the DNA vector of the present invention may be a desired gene other than the L11 protein gene, preferably a gene that does not encode any of the L11 protein, L1 protein, and L10 protein. The heterologous gene to be incorporated into the vector may encode a protein, or may be a sequence that does not encode a protein such as antisense RNA or ribozyme. The protein may be a desired enzyme, a structural protein, a regulatory factor, or the like, and may be a natural protein, a mutant protein, an artificially produced protein, or the like. For example, if a secreted protein is expressed using the vector of the present invention, this protein can be secreted in a large amount into the culture medium. Even a protein that is not secreted naturally can be secreted outside the cell body by expressing a fusion protein to which a secretion signal is added. The vector of the present invention may encode a secretory signal sequence in advance in the vector sequence so as to secrete the protein encoded by the inserted gene. The vector of the present invention comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 contains an SD sequence (AGGA), but if the protein coding sequence of the gene of interest is separated from the start codon to SD, it is near the start codon. An SD sequence may be inserted as appropriate. The DNA vector of the present invention is usually a double-stranded DNA. However, as long as a double-stranded DNA is produced when introduced into actinomycetes, a vector containing a DNA consisting of either one of the strands (for example, a single-stranded DNA) Including phage). That is, in the present invention, a DNA vector comprising a certain base sequence is a DNA vector comprising the base sequence and / or its complementary sequence so that a double-stranded DNA comprising the base sequence can be generated.
[0014]
In the present invention, actinomycetes refer to bacteria belonging to the order Actinomycetales. Actinomycetes are a taxonomic group belonging to Gram-positive bacteria and mainly inhabit soil. Although it is a prokaryote, many actinomycetes show filamentous growth with branching and take various forms. In addition, there are species that generally form spores, including sporangia and motile spores. In addition, various antibiotics and other biologically important compounds have been discovered from actinomycetes. For Actinomycetes, the family Franciaceae (Frankiaceae), Micromonospora (Micromonosporaceae), Propionibacterium (Propionibacteriaceae), Ciudonocardiaaceae (Psuodonocardiaceae), Streptomyces (Streptomyceae), Streptosporangium (Streptosporanguaceae), Terumomonospora (Thermomonosporaceae), Corynebacterium (Corynebacteriaceae), Mycobacterium family (Mycobacteriuaceae), And Nocaceae (Nocaudiaceae) Is included. In the present invention, actinomycetes are particularly preferably Streptomyces (StreptomyceaeAnd more preferably a bacterium belonging to the genus Streptomyces.
[0015]
The base sequence of the L11 gene promoter fragment preferably used in the present invention is shown in SEQ ID NO: 1. This sequence is actinomycetesS.griseusThe L11 gene promoter fragment has strong promoter activity. The inventorsS.griseus,S.lavendulae,S.virginia, and S.coelicolorWhen the base sequence of the promoter region of the L11 gene was analyzed in actinomycetes containing, the sequence of this region was found to be extremely conserved (FIG. 1). Of the four actinomycetes examined, the -10 region, transcription start point, and Shine-Dalgarno (SD) sequence were 100% conserved, and the other regions were also highly conserved. In the present invention, the promoter sequence of the L11 protein gene of these actinomycetes can be preferably used. For example, the vector of the present invention comprises a desired heterologous gene comprising a base sequence from about 3 bases to about 176 bases upstream from the translation initiation codon of a desired actinomycete ribosomal protein L11 gene and functionally linked downstream thereof. A recombinant DNA having an expression cassette comprising the nucleotide sequence of and a transcription termination sequence.
[0016]
Further, the vector of the present invention may have the L11 gene upstream region over a wider range than the base sequence from about 3 bases upstream to about 176 bases upstream from the translation initiation codon. For example, SEQ ID NO: 2, which is a DNA fragment longer than SEQ ID NO: 1 and including the upstream region of the L11 gene, can be preferably used. More specifically, the vector of the present invention is a base sequence from about 3 bases to about 197 bases upstream from the translation initiation codon of actinomycete ribosome protein L11 gene, more preferably from about 3 bases to about 277 bases. And a recombinant DNA having an expression cassette comprising a base sequence of a desired gene and a transcription termination sequence operably linked downstream thereof.
[0017]
In the vector of the present invention, the base sequence from about 3 bases to about 176 bases upstream from the translation initiation codon of the actinomycete L11 protein gene (for example, SEQ ID NO: 1), more preferably about 3 bases upstream from the translation start codon. To a base sequence from 1 to about 277 bases (for example, SEQ ID NO: 2), a base sequence having a promoter activity including a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, and / or added can also be used. Such a base sequence is shown in FIG.S.lavendulae,S.virginia, and S.coelicolorAnd DNA containing the derived sequences (SEQ ID NOs: 36, 37, and 39, respectively). Such a sequence may be artificially mutated or may be a naturally mutated sequence. For example, the base sequence may be modified by base substitution by site-directed mutagenesis, or deletion or insertion of one or more bases to increase promoter activity or remove sequences that do not affect promoter activity. (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, FM et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publisher Associates / John Wiley and Sons, New York. NY). The promoter activity of the sequence thus modified can be evaluated by constructing an expression vector as shown in the Examples and examining the expression of the gene linked downstream. By comparing the promoter activity with the sequence before modification, a sequence in which the promoter activity is maintained (or stronger) can be appropriately selected.
[0018]
As a base sequence suitable for use in the vector of the present invention, specifically, a base sequence from about 3 bases to about 176 bases upstream from the translation initiation codon of the actinomyces ribosomal protein L11 gene (particularly SEQ ID NO: 1) More preferably, in a base sequence from about 3 bases to about 277 bases upstream from the translation initiation codon (eg, SEQ ID NO: 2), it is within 50 bases, preferably within 40 bases, more preferably within 30 bases, and even more preferably 20 A base sequence in which a base within, most preferably within 10 bases (for example, within 5 bases) is substituted, deleted, and / or added, and has a promoter activity. Substitutions, deletions, and additions may be combined arbitrarily. In the base modification, it is preferable that the sequence from about the 60th base to about the 84th base upstream from the translation start codon of the wild type L11 gene is retained without being modified. More specifically, it contains 5'-ATACCCGTTATCGT [G / T] GTGCGGTATGCCT-3 '(SEQ ID NO: 5) conserved from about 57 to about 84 bases upstream from the translation initiation codon of Actinomyces L11 gene (A slash indicates any base). In a more preferred embodiment, it is preferable that the sequence from about the 101st base to about the 115th base upstream from the translation start codon of the wild type L11 gene is retained without modification. More specifically, 5′-TCTGACCTGCT [G / C] GGTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) conserved from about 98 to about 115 bases upstream from the translation initiation codon of L11 gene It is preferable to include (slash indicates any base).
[0019]
Further, as a base sequence suitable for use in the vector of the present invention, a base sequence from about 3 bases to about 176 bases upstream from the translation initiation codon of the actinomyces ribosomal protein L11 gene (for example, SEQ ID NO: 1) is more preferable. Is a base sequence from about 3 bases to about 277 bases upstream from the translation initiation codon (eg, SEQ ID NO: 2) (herein, these are referred to as reference sequences) and 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80 % Or more, more preferably 85% or more, and most preferably 90% or more (for example, 95% or more) of the base sequence having promoter activity. The identity of the base sequences can be calculated as the ratio of matching bases relative to the total length of the reference sequence by properly aligning the two sequences to be compared so that the bases match as much as possible. For the alignment of the nucleotide sequences, a desired computer program can be used. For example, CLUSTAL W (Higgins, D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) or BLAST (National Center) for Biothchnology Information). The gap is handled in the same manner as mismatched bases, and the identity is determined as the ratio of the number of bases that match in both sequences out of the total number of base sequences (including gaps) in the alignment. However, if a gap is inserted at the same position in both sequences, the gap is excluded from the calculation. The calculation of the identity of the amino acid sequence described later can be performed in the same manner.
[0020]
For example, when the identity of a base sequence or amino acid sequence is determined by BLAST, it can be carried out according to the method described in the literature “Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410”. . Specifically, the blastn program is used to determine the identity of the base sequence, and the blastp program is used to determine the identity of the amino acid sequence. For example, in the BLAST web page of NCBI (National Center for Biothchnology Information) Calculation is performed with all filter settings such as “complexity” turned OFF (Altschul, SF et al. (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, TL et al. (1996) Meth. Enzymol. 266: 131 Altschul, SF et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J. & Madden, TL (1997) Genome Res. 7: 649-656). For example, the open gap cost is 5 for nucleotides and 11 for proteins, the cost for extend gaps is 2 for nucleotides and 1 for proteins, the penalty for nucleotide mismatch is -3, the reward for nucleotide match is 1, and the expect value is 10, wordsize is 11 nucleotides, protein is 2, Dropoff (X) for blast extensions in bits is 20 for blastn, 7 for other programs, X dropoff value for gapped alignment (in bits) is 15, other than blastn, final X The dropoff value for gapped alignment (in bits) is 50 for blastn and 25 for other programs. In comparing amino acid sequences, BLOSUM62 can be used as a matrix for scoring. The blast2sequences program (Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250), which compares two sequences, can create alignments of two sequences and determine sequence identity.
[0021]
The base sequence suitable for use in the vector of the present invention includes a base sequence (particularly SEQ ID NO: 1) from about 3 bases to about 176 bases upstream from the translation initiation codon of Actinomyces ribosomal protein L11 gene or its complementary sequence. More preferably, DNA or RNA comprising a nucleotide sequence (for example, SEQ ID NO: 2) from about 3 bases to about 277 bases upstream from the translation initiation codon or a complementary sequence thereof (herein these are referred to as reference nucleic acids) ) And a base sequence of DNA that hybridizes under stringent conditions, and has a promoter activity. In hybridization, one of nucleic acids to be hybridized with each other is used as a probe to hybridize to a nucleic acid having a target sequence, and after washing under stringent conditions, the probe becomes a target nucleic acid. Check for significant hybridization. The length of the probe is, for example, continuous 20 bases or more, preferably 25 bases or more, more preferably 30 bases or more, more preferably 40 bases or more, further preferably 80 bases or more, more preferably 100 bases or more. Negative if the reference nucleic acid used for hybridization includes a base sequence from about 3 bases to about 277 bases upstream from the translation start codon of the L11 gene or an irrelevant sequence (such as a sequence derived from a vector) other than its complementary sequence. As a control, hybridization may be similarly performed using only the sequence as a probe, and it may be confirmed that the probe does not significantly hybridize to the target sequence after washing under the same conditions. Hybridization can be performed by a conventional method using nitrocellulose membrane or nylon membrane (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, FM et al. (1994) Current. Protocols in Molecular Biology, Greene Publisher Associates / John Wiley and Sons, New York. NY).
[0022]
The above stringent conditions are specifically exemplified, for example, 6 × SSC, 0.5% (W / V) SDS, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA, 5 × Denhardt solution (1 × Denhardt solution is 0.2% polyvinyl) In a solution containing pyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and 0.2% ficoll) at 45 ° C., preferably 55 ° C., more preferably 60 ° C., and even more preferably 65 ° C. overnight. Is a condition in which 4 × SSC, 0.5% SDS, and 20 minutes are washed three times at the same temperature as the hybridization. More preferably, the post-hybridization washing is performed under the same conditions as washing at 4 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes twice, 2 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once at the same temperature as the hybridization. is there. More preferably, the conditions are such that washing after hybridization is performed twice at 4 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes, followed by 1 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes at the same temperature as hybridization. . More preferably, post-hybridization washing is performed at the same temperature as the hybridization, 2 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once, followed by 1 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once, then 0.5 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once. More preferably, post-hybridization washing is performed at the same temperature as the hybridization, 2 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once, followed by 1 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once, then 0.5 This is a condition in which × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once, followed by 0.1 × SSC, 0.5% SDS, 20 minutes once.
[0023]
The vector of the present invention does not include the full length of the protein coding sequence of the L11 protein. Preferably, the vector of the present invention does not include the L11 protein gene and the full length of the protein coding sequence of the L1 protein constituting the operon on the genome (Kuberski, S. et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 119 (1 -2), 33-39; Kuster, C. et al. (1998) Mol. Gen. Genet. 257 (2), 219-229; Accession No. X72787). More preferably, the vector of the present invention does not include the full length of the coding sequence of the L10 protein. Specifically, the vector of the present invention is, for example, a protein comprising the amino acid of SEQ ID NO: 8 (L11 protein) or the amino acid sequence of this protein and within 10 amino acids, preferably within 20, 30, 40, or 50 amino acids. A protein comprising an amino acid sequence substituted, deleted and / or added, a protein comprising an amino acid sequence having an identity of 90% or more, preferably 80, 70 or 60% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 Preferably it does not contain the encoding DNA. Amino acid sequence identity can be calculated as described above. Further, the vector of the present invention does not include DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of SEQ ID NO: 7 (L11 protein CDS). Also preferably, the vector of the present invention is SEQ ID NO: 10 (L1 protein) and / or 12 (L10 protein), or the amino acid sequence of these proteins and within 10 amino acids, preferably 20, 30, 40, or 50 A protein comprising an amino acid sequence in which amino acids within the amino acid are substituted, deleted, and / or added, and having at least 90%, preferably 80, 70, or 60% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12 It is preferable not to include DNA encoding a protein containing an amino acid sequence. Amino acid sequence identity can be calculated as described above. Moreover, it is preferable that the vector of the present invention does not contain DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of SEQ ID NO: 9 (L1 protein CDS) or 11 (L10 protein CDS). The conditions for stringent hybridization are as described above.
[0024]
The vector of the present invention contains a transcription termination sequence (terminator) downstream of a heterologous gene. As the transcription termination sequence, a desired sequence having the ability to terminate transcription from the upstream promoter can be used. For example, a transcription termination sequence of a desired actinomycete gene can be used. However, in the vector of the present invention, a more excellent effect is exhibited by using a transcription termination sequence (that is, an intrinsic terminator) that can terminate transcription independently of Rho factors. Such a transcription termination sequence generally has a palindromic sequence that forms a stem loop structure of 7 bp to 20 bp or more. It is also generally rich in GC. In particular, the decrease in free energy (ΔG) when a stem loop is formed is −50 Kcal or less, more preferably −55 Kcal or less, more preferably −60 Kcal or less, more preferably −65 Kcal or less, more preferably − A sequence of 70 Kcal or less is preferred. The ΔG of the stem loop can be calculated using, for example, an RNA secondary structure prediction program. Specifically, DNASIS (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) can be used.
[0025]
The stem portion may not form base pairs over the entire region. Preferably, a stem in which 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more of bases form a base pair over a region of 20 bases or more is preferable. More preferably, a stem in which 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more of bases form a base pair over a region of 30 bases is preferable. More preferably, a stem in which 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more of bases form a base pair over a region of 35 bases is preferable. The size of the loop portion is not particularly limited, but is typically 2 to 100 bases, for example 3 to 50 bases.
[0026]
In a more preferred embodiment, the transcription termination sequence is actinomycetes.ssgAA transcription termination sequence for the gene is used.ssgAThis transcription termination sequence forms a stem of 20 base pairs or more and can terminate transcription independently of Rho.ssgAThus, it is possible to construct a higher performance expression vector. Preferably usedssgAThis Rho-independent transcription termination sequence is exemplified in SEQ ID NO: 3. This array isS. griseus ssgAIt forms a stem of 20 bases or more. In the vector of the present invention,ssgAA region containing 200, 250, or 300 bases from the base next to the translation stop codon may be used. For example, DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be suitably used as the transcription termination sequence. In the present invention, actinomycetesssgAA transcription termination sequence (for example, SEQ ID NO: 3 or 4), or a base sequence having promoter activity, including a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, and / or added in the sequence, A base sequence having an activity to terminate transcription can be preferably used.
[0027]
Specifically, actinomycetesssgAWithin a gene transcription termination sequence (eg, SEQ ID NO: 3, more preferably SEQ ID NO: 4), within 50 bases, preferably within 40 bases, more preferably within 30 bases, still more preferably within 20 bases, most preferably 10 bases Within the base sequence (for example, within 5 bases), the base sequence has substitution, deletion, and / or addition, and has the activity of terminating transcription. Substitutions, deletions, and additions may be combined arbitrarily. In the base modification, as described above, ΔG is −50 Kcal or less, preferably −55 Kcal or less, more preferably −60 Kcal or less, more preferably −65 Kcal or less, more preferably −70 Kcal or less. Adjust as follows. The stem length and base pair ratio are also preferably in accordance with the above. Alternatively, the transcription termination sequence used in the vector of the present invention is actinomycetes.ssgA60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, most preferably 90% with the transcription termination sequence of the gene (eg, SEQ ID NO: 3, more preferably SEQ ID NO: 4) Nucleotide sequences having the above identity (for example, 95% or more) or actinomycetesssgAA nucleotide sequence of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA or RNA containing a gene transcription termination sequence (eg, SEQ ID NO: 3, more preferably SEQ ID NO: 4) or its complementary sequence, and terminates transcription The base sequence having the activity to be used can be preferably used. Calculation of nucleotide sequence identity and hybridization conditions are as described in this specification.
[0028]
The present invention also includes (a) a nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence obtained by substituting, deleting and / or adding one or more nucleotides in the nucleotide sequence and having promoter activity. (B) a cloning site for linking a desired gene downstream thereof, and (c) a recombinant DNA containing a transcription termination sequence downstream thereof, wherein the gene inserted into the cloning site is DNA vectors that can be detectably expressed are provided. By inserting a desired gene into this cloning site, it can be highly expressed in actinomycetes in the growth phase. An example of such a vector is a vector in which the heterologous gene is removed and a cloning site is left in the DNA vector of the present invention having the above heterologous gene.
[0029]
A cloning site refers to a sequence for incorporating a nucleic acid to be expressed into a vector. The cloning site typically includes a restriction enzyme recognition sequence. The cloning site preferably contains a plurality of restriction enzyme recognition sequences (ie, multiple cloning sites). In another embodiment, the cloning site can be, for example, a DNA end with a single base of thymidine at 3 ′. Such an expression vector is provided as a linear double-stranded DNA. A DNA fragment amplified by PCR can be easily incorporated into this vector by ligation using T: A base pairs. The cloning site may be a sequence for incorporating a nucleic acid into a vector using, for example, homologous recombination. The structure of the sequence other than the cloning site is as described in this specification.
[0030]
One embodiment of the vector of the present invention is a plasmid vector. The plasmid contains an origin of replication for amplification by actinomycetes (ori)It is included. Furthermore, it may have an origin of replication for amplification in E. coli. A vector that can be amplified by both actinomycetes and E. coli can be used as an E. coli-actinomycetes shuttle vector. Origin of replication for amplification with actinomycetes (ori) May be a low copy type or a multi-copy type. A low copy plasmid refers to a plasmid that results in plasmid amplification of 1 to 10 copies in actinomycetes, and a multicopy plasmid results in a copy number of more, specifically 40 to 400 copies or more. Says a plasmid. Low copyoriFor example,SCP2 * ori(Lydiate, D.J. et al. (1985) Gene 35 (3): 223-235). High copyoriFor example, pIJ101ori(Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714). The plasmid vector preferably contains a marker gene such as an appropriate drug resistance gene or metabolic enzyme so that a host holding the plasmid vector can be selected. Such marker genes include, for example, ampicillin resistance gene, thiostrepton resistance gene, hygromycin resistance gene, and apramycin resistance gene, all of which are well known to those skilled in the art. In addition, for the construction of actinomycete plasmids, pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986), pKC1064 (Gene 103,97-99 (1991)), pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )), PIJ702 (Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714), pIJ8600 (Sun, J. et al. (1999) Microbiology 145: 2221-2227) Arrays can be used.
[0031]
In a preferred embodiment, the DNA vector of the present invention is used as a heterologous gene.S.coelicolorofdagAPIJ101 when the gene is insertedoriActinomycetes in the form of a multicopy plasmid containingS.coelicolor When transformed into the M145 strain (ATCC Number: BAA-471), the maximum value of the agarase activity in the culture supernatant under shaking culture conditions at 30 ° C. in an appropriate medium (for example, YEME medium)dagAAs the difference from the agarase activity in the control in which the empty vector without the gene was inserted, 50 U / ml or more, preferably 60 U / ml or more, more preferably 70 U / ml or more, more preferably 80 U / ml or more, The expression ability is more preferably 90 U / ml or more, and more preferably 100 U / ml or more.
[0032]
Another embodiment of the vector of the present invention is a genome integration type vector. A genome integration type vector is a vector that, when introduced into actinomycetes, is integrated into the actinomycetes genome and can express the integrated gene from the genome. Prior to introduction into actinomycetes, this vector can also be prepared in the form of a plasmid. In preparing a genome integration type vector, a recombination sequence necessary for integration of phage DNA into a host genome can be used. Specifically, for example, φ31 phageintThe gene and attP may be inserted into the vector (Bierman, M. et al., (1992) Gene 116: 43-49). In order to keep the plasmid in the fungus body, it is usually necessary to continue selection based on the drug corresponding to the drug resistance gene incorporated in the plasmid, but since the genome-integrated expression vector is stable, a recombinant bacterium was obtained once. Later, it is excellent in that there is no need for drug selection.
[0033]
The vector of the present invention is useful for protein production. Examples of the protein to be produced include a desired protein other than the L11 protein, the L10 protein, and the L1 protein. In addition, if the production amount of useful substances produced from transformed bacteria such as antibiotics is increased by expressing a certain protein instead of producing the protein itself, the protein of the present invention is used to express this protein. To increase production of useful substances. Protein production can be obtained by culturing actinomycetes transformed with the vector of the present invention that expresses the protein of interest, and recovering the culture or culture supernatant containing the protein. The protein can be further purified from the obtained protein solution by a known method. As a medium, any medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and other nutrients, and either a synthetic medium or a natural medium can be used, and a liquid medium or a solid medium can be used.
[0034]
Specifically, as a carbon source, glucose, fructose, maltose, galactose, starch, starch hydrolysate, molasses, sugars such as molasses, natural carbohydrates such as wheat, corn, alcohols such as glycerol, methanol, ethanol, Considering the assimilation of microorganisms used from general carbon sources such as fatty acids such as acetic acid, gluconic acid, pyruvic acid and citric acid, hydrocarbons such as normal paraffin, and amino acids such as glycine, glutamine and asparagine Thus, one or more kinds are appropriately selected and used. Nitrogen sources include meat extract, peptone, yeast extract, soy hydrolyzate, milk casein, casamino acid, various amino acids, corn steep liquor, other animal, plant, microbial hydrolyzate, nitrogen compounds, ammonia, In consideration of the assimilation ability of actinomycetes used from ammonium salts such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, and sodium chloride, nitrates such as sodium nitrate, and inorganic nitrogen compounds such as urea, one or more kinds are appropriately selected and used.
Furthermore, as an inorganic salt, one or two or more kinds can be appropriately selected and used from a trace amount of magnesium, manganese, potassium, calcium, sodium, copper, zinc and other phosphates, hydrochlorides, nitrates, acetates and the like. . Moreover, you may add antifoamers, such as vegetable oil, surfactant, and silicone, as needed.
[0035]
Culturing can be performed in a liquid medium containing the above-mentioned medium components by using a normal culture method such as shaking culture, aeration and agitation culture, continuous culture, or fed-batch culture. The culture conditions may be appropriately selected depending on the type of culture and the culture method, and are not particularly limited as long as the actinomycetes used as a host can grow and produce the target protein. Usually, the pH at the start of the culture is adjusted to 4 to 10, preferably 6 to 8. As the temperature, a temperature suitable for the growth of actinomycetes as a host is appropriately selected. The culture time is not particularly limited as long as a sufficient amount of protein can be obtained as a host actinomycete, and it is usually cultured for 1 to 14 days, preferably 1 to 3 days. The protein produced and accumulated with gene expression can be collected and collected by the following method.
[0036]
When the protein is accumulated in the actinomycetes, after completion of the culture, the actinomycetes are collected by a method such as filtration and centrifugation, and the cells are washed with a buffer solution, physiological saline, etc. Perform physical means such as ultrasonic treatment, pressure treatment, osmotic pressure difference treatment, grinding treatment, or chemical treatment such as biochemical treatment such as lysozyme treatment or contact treatment with a surfactant alone or in combination. Can disrupt actinomycetes and extract the expressed protein. The crude protein thus obtained is subjected to salting out, fractional precipitation with an organic solvent, salting out chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, dye chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, etc. Separation performed by open column, medium pressure chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), and separation by electrophoretic methods such as isoelectric focusing and native-electrophoresis are used singly or in combination. Can be purified.
[0037]
The procedure for producing transformants and the construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1989; Microbiology Basic Course 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan). For example, in the genus Streptomyces, it can be carried out according to the method described in Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985). Transformation is described, for example, in the literature (Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D. J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation ofStreptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom).
[0038]
The produced protein can also be obtained as a purified protein and a partially purified protein. In addition, the protein may be immobilized on an insoluble carrier by a known method. In the present invention, the thus produced protein is also included. The present invention also relates to actinomycetes transformed with the vector of the present invention. The present invention also relates to a processed product of transformed actinomycetes. Processed substances include freeze-thaw treatment, ultrasonic treatment, pressure treatment, osmotic pressure difference treatment, physical treatment such as grinding treatment, biochemical treatment such as enzyme treatment such as lysozyme, or surfactant, toluene, xylene Or a product subjected to chemical treatment such as contact treatment with an organic solvent such as acetone. Actinomycetes whose permeability of the cell membrane has been changed by such treatment, cell-free extract obtained by crushing bacterial cells by glass beads or enzyme treatment, and partially purified products thereof are included in the treated product.
[0039]
The present invention also relates to a method for suppressing the function of a desired gene using the vector of the present invention. This method includes the step of transforming a host cell with the vector of the present invention in which a nucleic acid encoding the antisense of the gene or a part thereof is incorporated. As the antisense, antisense of the entire transcription region of the target gene can be used, or at least 15 bases, preferably 20 bases or more, more preferably 50 bases or more, more preferably, the transcription region of the gene. An antisense sequence for 80 bases or more, more preferably 100 bases or more (for example, 150 bases or more) is used. For example, an antisense sequence for a region containing a translation initiation codon is particularly preferred.
[0040]
The turnover of mRNA in bacteria is extremely fast. Therefore, in order to suppress gene expression using antisense RNA, it is necessary to constantly express antisense RNA at a high level. By using the expression vector of the present invention, the expression of the target gene can be effectively suppressed by the antisense effect. This system is expected to be used to suppress the desired gene function. In particular, suppression of genes that are initiated in the late stage of growth such as secondary metabolism (function suppression by expression of antisense RNA of the regulatory gene) requires high expression of antisense RNA from the early stage of growth. The analysis method using gene function suppression by antisense RNA expression is expected to be used as a method of post-genome analysis. In the conventional analysis by gene disruption, since the function of the gene is lost, it is impossible to analyze the essential gene. On the other hand, for antisense RNA expression, essential genes can be analyzed by controlling expression conditions. Since expression from the vector of the present invention is considered to be proportional to the growth rate, it is possible to analyze essential unknown functional genes by examining the culture conditions. The gene silencing technique using the vector of the present invention can also be applied to metabolic engineering for the production of useful substances in actinomycetes.
[0041]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. References cited in this specification are incorporated as a part of this specification.
[Example 1] ActinomycetesStreptomyces griseusL11 ribosomal protein gene fromrplK) Construction of expression cassette using promoter region
The present inventors have used the L11 ribosomal protein gene (rplK) Promoter andssgAIn order to develop a new expression vector that skillfully utilizes the characteristics of the terminator sequence of the gene,rplKGene promoter, multiple cloning site,ssgAAn expression cassette with a gene-derived strong transcription terminator arrangement was constructed.
[0042]
ActinomycetesStreptomycesIn the genusrplKIt has been found that the nucleotide sequence of the putative promoter region of the gene is extremely conserved (FIG. 1). The homology between the -35 and -10 recognition sequences necessary for transcription by RNA polymerase and the nucleotide sequence region including the transcription start site is extremely high. The region containing the ribosome-binding SD sequence necessary for translation is also 100% conserved. By using the L11 promoter of the housekeeping gene, the expression of the target foreign gene can be maintained throughout the growth period, and the expression level can be adjusted by changing the nutritional conditions of growth.
In addition, the present inventors are considered to be one of the strongest terminators having a stem-and-loop structure independent of actinomycetes-derived transcription termination factor in constructing an expression cassette.S. griseusOriginssgAGene (Kawamoto, S., and JCEnsign. 1995. Actinomycetologica 9: 136-151. Kawamoto, S., H. Watanabe, A. Hesketh, JCEnsign, and K. Ochi. 1997. Microbiology 143: 1077-1086) It was decided to combine the terminator sequences (Fig. 2). In other words, mRNA stabilization was improved by using a strong terminator.
[0043]
When constructing an expression cassette,S. griseusofrplKThe gene promoter region (a total of about 280 bp sequence region including 120 bp upstream in addition to the sequence shown in FIG. 1) (SEQ ID NO: 2) was transformed into the recombinant plasmid pP34 (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255: 549-560) was used as a template for PCR amplification. Restriction enzyme recognition sequences BamHI and EcoRI were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product, respectively.S. griseusofssgARecombinant plasmid pNY22 (Kawamoto, S. and JC Ensign, 1995, Actinomycetologica 9) was transformed into the gene terminator region (approximately 340 bp in total including 50 bp downstream in addition to the sequence shown in FIG. 2) (SEQ ID NO: 4). : 136-151) as a template. Restriction enzyme recognition sequences EcoRI and BamHI were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product, respectively. The vector pGEM3Zf (-) (Promega) was digested with EcoRI, filled in with Klenow enzyme, self-ligated, and the plasmid pGΔE in which the EcoRI recognition sequence at the cloning site was crushed was obtained from the literature (Maniatis, T., EF Fritsch, and J. Sanbrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Next, primer L11PBamF (5'-GCCAGGATCCACGAGATCAACGCCG-3 '/ SEQ ID NO: 13) (underlined part is a restriction enzyme site) and L11PEcoR (5'-TTGGGAGGAATTCThe rplK promoter region was amplified by PCR using CTCTCTCCGGG-3 ′ / SEQ ID NO: 14) to obtain a 280 bp PCR product, which was then cleaved with BamHI and EcoRI. Primer SsgATerEF (5'-GGGTGAATTCGACGGCAACCTG-3 '/ SEQ ID NO: 15) and SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCThe ssgA terminator region was amplified by PCR using GGAGGGACC-3 ′ / SEQ ID NO: 16) to obtain a 350 bp product, which was then cleaved with BamHI and EcoRI. pGΔE was cleaved with BamHI, BAP-treated, and the restriction enzyme-treated rplK promoter region and ssgA terminator region PCR products were ligated to prepare a recombinant plasmid pSK200. Primers PlinkF (5'-AATTCAGATCTTTAAATATTACTAGTAAGCTTG-3 '/ SEQ ID NO: 17) and PlinkR (5'-AATTCAAGCTTACTAGTAATATTTAAAGATCTG-3' / SEQ ID NO: 18) that were phosphorylated at the 5 'end with a kinase were used for multiple restriction enzymes. A synthetic DNA linker with a recognition sequence (AT-rich restriction enzyme recognition sequence rarely found in actinomycetes with high GC content DNA) was created, and this was used as a restriction enzyme EcoRI (rplKGene promoter region andssgARecombinant plasmid pSK201 was prepared by inserting it into pSK200 cleaved at the junction of the gene terminator region. This plasmid can be excised with the restriction enzyme BamHI.rplKGene promoter-Cloning site-ssgAAn about 700 bp expression DNA cassette composed of a gene terminator is inserted.
[0044]
[Example 2] Construction of various expression plasmids
1. Expression vector pSK210
Primer L11PSK (5'-GTCG with pSK201 as templateGGATCCTCGGCCGCGAG-3 '/ SEQ ID NO: 19) and SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCThe expression DNA cassette was PCR amplified using GGAGGGACC-3 ′ / SEQ ID NO: 16). The restriction enzyme recognition sequence BamHI was introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product. The BamHI recognition sequence at the 5 'end isrplKIt was introduced to remove the BglII recognition sequence present at the 5 ′ end of the gene promoter. The 650 bp PCR product cleaved with BamHI was inserted into the BglII cloning site of the actinomycetes-E. Coli shuttle vector pV1 (Kawamoto, S. et al., 1997, Microbiology 143: 1077-1086) to prepare the expression vector pSK210 (FIG. 3). .
pSK210 is actinomycete, a low copy type, and selectable markers are ampicillin resistance (amp; Escherichia coli), thiostrepton resistance (tsr; actinomycete) and hygromycin resistance (hyg; actinomycetes).
[0045]
2. Expression vector pSK220
The above-mentioned 650 bp PCR product cleaved with BamHI is inserted into the BglII cloning site of the actinomyces multicopy vector pIJ702 (Katz E. et al., 1983, J. Gen. Microbiol., 129: 2703-2714) to obtain a multicopy type. The expression vector pSK220 was prepared (FIG. 4A). The selection marker for this plasmid is thiostrepton resistance.
[0046]
3. Actinomycetes-E. coli shuttle vector pSK1955
Primer PBlueT7C (5'-CGCTGG) using vector pBluescript SK (+) (Stratagene) as a templateCATATGTAGCGGTCACGCTGCGCG-3 '/ SEQ ID NO: 20) and PBlueT3N (5'-GCTGGGACGTCUsing AGGTTTCCCGACTGGAAAG-3 ′ / SEQ ID NO: 21), an approximately 580 bp multiple cloning site of this plasmid −lacZThe gene region was PCR amplified. Restriction enzyme recognition sequences AatII and NdeI were introduced at the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product, respectively. A PCR product cleaved with AatII and NdeI, an approximately 2.9 kb NdeI-PstI DNA fragment prepared from the actinomycete multicopy vector pIJ702 (required for replication in actinomycetes)repGene and pIJ101oriAbout 2.4 kb AatII-PstI DNA fragment (which is an apramycin resistance gene) prepared from pIJ8600 (Sun, J. et al., Microbiology 145: 2221-2227)acc (3)IV and pUC18ori) Was ligated to produce actinomycetes-E. Coli shuttle vector pSK1955 (FIG. 4B). pSK1955 is a multi-copy type actinomycete and the selection marker is apramycin resistance (E. coli / actinomycetes).
[0047]
4). Expression vector pSK1127
Primer L11ClaF (5'-CCTC with pSK220 as templateATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3 '/ SEQ ID NO: 22) (for removal of BglII site) and SsgATmNde (5'-CTGGCATATGA 605 bp expression DNA cassette was amplified by PCR using CGGGCGCGGCGCTGCCACTG-3 ′ / SEQ ID NO: 23). Restriction enzyme recognition sequences ClaI and NdeI were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product, respectively. A PCR product cleaved with ClaI and NdeI, and an approximately 5.1 kb ClaI-NdeI DNA fragment prepared from the vector pSK1955 (repGene, pIJ101ori,acc (3)IV gene and pUC18oriExpression vector pSK1127 was prepared (see FIG. 5A). Actinomycetes-The E. coli shuttle vector pSK1127 is actinomycetes and is multicopy and the selectable marker is apramycin resistance (E. coli / actinomycetes).
[0048]
5). Expression vector pSK811
Primer L11ClaF (5'-CCTC with pSK220 as templateATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3 '/ SEQ ID NO: 22) (for removal of BglII site) and SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCA 655 bp expression DNA cassette was amplified by PCR using GGAGGGACC-3 ′ / SEQ ID NO: 16). Restriction enzyme recognition sequences ClaI and BamHI were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product, respectively. A PCR product cleaved with ClaI and BamHI and an approximately 6.3 kb ClaI-BglII DNA fragment prepared from the genomic integration vector pIJ8600 (of the φ31 phage required for genomic integration).intGene and attP, RK2oriT,acc (3)IV gene and pUC18oriExpression vector pSK811 was prepared (FIG. 5B). The actinomycetes-Escherichia coli shuttle vector pSK811 is a genome integration type, and the selection marker is apramycin resistance (E. coli / actinomycetes).
[0049]
[Example 3] Expression of fluorescent protein by expression vectors pSK210 and pSK220
The structural gene of jellyfish-derived modified green fluorescent protein EGFP was PCR amplified using plasmid pEGFP (Clontech) as a template. For insertion into the expression DNA cassette on the vector, restriction enzyme recognition sequences BglII and HindIII were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product (about 770 bp), respectively. Specifically, RBS (between the HindIII site and the EcoRI siteB. subtilis-EGFP coding sequence (derived from Boehringer pSPT19. However, from the NcoI site including the start codon to the EcoRI site, it is derived from Clontech's pEGFP. RBS is inserted by making a synthetic DNA linker) Using the plasmid (pSPT19) containing the template (Figure 6A) as a template, primer EGFP-N (5'-GACCGAAGATCTGTTTAACTTTAAGAAG-3 '/ SEQ ID NO: 24) (for converting HindIII site to BglII site) and EGFP-C (5'-TACACGGAATTCAAGCTTPCR of RBS-EGFP gene was performed using CGCGGCCGC-3 ′ / SEQ ID NO: 25). This was cleaved with BglII and HindIII and inserted into the expression vectors pSK210 (low copy vector) and pSK220 (multicopy vector) constructed as described above to prepare recombinant plasmids pLEGFP and pMEGFP, respectively. These plasmids and empty vector (control)S. coelicolor M145 strain (ATCC Number: BAA-471, Hopwood, DA, Microbiology 145: 2183-2202, 1999; Bentley, SD et al., Nature 417: 141-147, 2002; Hopwood, DA et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual (The John Innes Foundation, Norwich, UK) (Hopwood, DA, MJ Bibb, KF Chater, T. Kieser, CJ Bruton, HM Kieser, DJ Lydiate, CP Smith, JM Ward, and H Schrempf. 1985. Genetic manipulation ofStreptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom). YEME medium (composition: malto extract 0.3%, Difco yeast extract 0.5%, Difco bactopeptone 0.3%, 5 mM MgCl2,
[0050]
[Example 4] High expression of actinomycete agar-degrading enzyme agarase by expression vector pSK220
S. coelicolor Agarase agarase structural gene containing SD sequence (ribosome binding sequence) of M145 strain (dagAThe gene was amplified by PCR using the genomic DNA of this strain as a template. For insertion into the expression DNA cassette on the vector, restriction enzyme recognition sequences BglII and HindIII were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of the PCR product (about 970 bp), respectively. Specifically, primer dagASD (5'-CGGG) using genomic DNA of M145 strain as a templateAGATCTGAAGAAGGAGAACGATCGTG-3 '/ SEQ ID NO: 26) and dagATer (5'-ACTTGAAAGCTTPCR of the dagA gene was performed using CCGTTCCGTGAGGTGCTG-3 ′ / SEQ ID NO: 27). The obtained approximately 970 bp PCR product was cleaved with BglII and HindIII, and inserted into pSK220 (multi-copy vector) constructed as described above to prepare a recombinant plasmid pMDagA.
[0051]
dagA The gene product agarase is a secreted enzyme (28 kDa) that is synthesized as a precursor protein (30 kDa) and secreted outside the cell (Bibb, MJ et al., 1987, J. Gen. Microbiol., 133: 2089-2096). Also originaldagAIt is known that gene expression is subject to complex transcriptional expression control linked to strong catabolite repression and morphological differentiation by glucose (Gonzalez, L.S. et al., 1994, Microbiology 140: 2555-2565).
[0052]
S. coelicolor The pMDagA transformed strain of M145 strain was cultured with shaking at 30 ° C. until late in logarithmic growth using YEME medium (composition described above). The agarase activity of the culture supernatant obtained by centrifugation was measured according to the method described in the literature (Bibb, MJ et al., 1987. J. Gen. Microbiol. 133: 2089-2096). Compared to the strain (2.5 U / ml), the pMDagA transformant showed an activity of 143 U / ml which was about 60 times higher. In addition, the culture supernatant was added to a well of a 2% agar solid medium and reacted overnight at 30 ° C. to perform activity staining (FIG. 7A). Furthermore, the secreted protein in the culture supernatant was precipitated with 60% ammonium sulfate, and electrophoretic analysis was performed by Tricine-SDS PAGE (FIG. 7B). As is clear from FIG. 7A, the pMDagA transformed strain formed a large transparent halo in which the central portion was depressed, in agreement with the above-described measurement results of agarase activity. On the other hand, halo formation in the control pSK220 transformant was extremely small. As is clear from FIG. 7B, a secreted protein band was observed at the position expected from the agarase molecular weight in the pMDagA transformed strain.
[0053]
From the above results, it was clarified that in the pMDagA transformed strain, agarase is highly expressed from the logarithmic growth phase and secreted in a large amount in the medium. Both the control vector pSK220 transformant and pMDagA transformantdagA Gene exists. However, since 1% glucose was added to the medium used as a carbon source,dagAIt is clear from the activity measurement result of the vector pSK220 transformed strain that the gene expression is strongly suppressed. Therefore, most of the agarase activity of the pMDagA transformant is in the plasmid pMDagA.dagAThis is thought to be due to gene expression.
ActinomycetesStreptomycesIt is clear that the use of the vector having the expression DNA cassette of the present invention is extremely effective for the large-scale expression of useful secreted proteins subject to complicated gene expression control such as catabolite suppression of the genus.
In addition, even if the protein is originally secreted, mass production of intracellular enzymes is possible using the secretory system of actinomycetes by incorporating the gene encoding this protein into a vector into which the secretory signal sequence of actinomycetes is inserted. It is. Thereby, the bad influence on the production microbe by the large-scale intracellular expression of a heterologous protein can be avoided.
[0054]
[Example 5] Inhibition of gene function by antisense RNA expression using genome-integrated vector pSK811
As described above, it has been clarified that the gene can be constantly expressed in the actinomycetes from the beginning of the culture by inserting the gene of interest into the multicloning site of the expression DNA cassette of the present invention. In higher animals and plants, suppression of specific gene function by expression of antisense RNA (gene function silencing: suppression of gene function by inhibiting protein synthesis, ie, gene product production, from mRNA by expression of antisense RNA without disrupting the gene Is used for basic and applied purposes. However, it was difficult to use antisense RNA in bacteria with extremely fast mRNA turnover. Thus, we verified the effect of gene function suppression by antisense RNA expression using the genome-integrated vector pSK811 with an expressed DNA cassette. ActinomycetesS. coelicolorGenes involved in the regulation of secondary metabolismssgA(Kawamoto, S. et al., 1997. Microbiology 143: 1077-1086; Wezel, G. P. et al., 2000. J. Bacteriol., 182: 5653-5662) andeshA(Kawamoto, S. et al., 2001. J. Bacteriol., 183: 6009-6016) Experiments were performed using the gene as a model.
ssgAWheneshAA gene is not an essential gene, but if you destroy any geneS. coelicolorThe production of blue antibiotic actinorosin is extremely reduced. On the other hand, the production of red antibiotic undecylprodigiosin is hardly affected. Both SsgA (an acidic protein consisting of 135 amino acids) and EshA (a protein consisting of 471 amino acids) gene products appear in the late growth phase when secondary metabolism is initiated, and their expression is time-specifically controlled at the transcriptional level. Therefore, both genes are actinomycetes with fast RNA turnover, and functional suppression by antisense RNA expression is considered particularly difficult.
[0055]
S. coelicolor Using M145 strain genomic DNA as a template,ssgAA gene (base sequence region corresponding to about 75 amino acids from the N-terminus: about 235 bp) andeshAA part of the gene (base sequence region corresponding to about 85 amino acids from the N-terminus: about 280 bp) was PCR amplified. Restriction enzyme recognition sequences BglII and SpeI were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of both PCR products, respectively. Specifically, using the genomic DNA of the M145 strain as a template, primer SCp52-Bg (5'-TCCGGAGATCTCCCGGACCCGGGCG-3 '/ SEQ ID NO: 28) and SCp52-Spe (5'-CTCCCACTAGTGCAAGGAGAAGGCC-3 ′ / SEQ ID NO: 29) was used to PCR the eshA gene (inserted in the direction of antisense expression), and the resulting 280 bp product was cleaved with BglII and SpeI. This fragment corresponds to a base sequence region corresponding to about 20 amino acids from the N-terminus of the EshA protein (471 amino acids) and about 20 bp of the 5′-upstream region. The primer SCssgA-Bg (5'-GTCAGATCTGCACCTCGGCCAGCGG-3 ′ / SEQ ID NO: 30) and SCssgA-Spe (5′-GGCACTAGTCATGATGAGCTTTCTC-3 ′ / SEQ ID NO: 31) were used to perform PCR of the ssgA gene (inserted in the antisense expression direction), resulting in 235 bp The product was cut with BglII and SpeI. This fragment corresponds to a nucleotide sequence region corresponding to a sequence of about 75 amino acids from the N-terminus of the SsgA protein (135 amino acids). These were inserted into the genomic integration vector pSK811 treated with BglII and SpeI in the direction of antisense RNA expression and recombinant plasmid pEL7 (anti-eshA RNA expression) and pSE1 (anti-ssgA RNA expression). These plasmidsS. coelicolor J1051 strain (Chater, KF et al. (1982) Gene 19, 21-32; Chater, KF et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 97, 69-95; Kelemen, GH et al. (1995 ) Mol. Microbiol. 17, 221-230), and a transformant resistant to apramycin and having a recombinant plasmid inserted into the genome was selected. The resulting transformant was added to an R5 agar medium supplemented with 0.1% Difco casamino acid (composition per liter: K2SOFour 0.25g, MgCl2・ 6H2Antibiotic productivity was examined by culturing at 10.12 g, Difco yeast extract 5 g, TES 5.73 g, glucose 10 g, agar 20 g, trace element solution * 2 ml) at 30 ° C. for 4 days (FIG. 8). * Trace element solution (composition per liter): ZnCl2 10mg, FeClThree.6H2O 200mg, CuCl2・ 2H2O 10mg, MnCl2・ 4H2O 10mg, Na2BFourO7・ 10H2O 10mg, (NH4) 6Mo7Otwenty four・ H2O 10mg
[0056]
As is clear from FIG. 8, the vector pSK811 transformant produces the red antibiotic undecylprodigiosin and the blue antibiotic actinorhodin, whereas the blue antibiotics as expected for both pEL7 and pSE1 transformants. Production of the substance actinorhodin was significantly suppressed. That is, antisense RNA expression from a recombinant plasmid inserted into the genomeeshAandssgAIt was strongly suggested that the gene function was suppressed. pSK811 is a genome-integrated type, and has an advantage that it can be stably maintained without adding a selective marker antibiotic during culturing. It was proved that antisense RNA expression capable of sufficiently suppressing gene function was performed even under such conditions.
[0057]
Next, RT (reverse transcription) -PCR analysis on antisense RNA expression of the transformant was performed (FIG. 9). Each transformant was cultured with shaking at 30 ° C. in R5 medium supplemented with 0.2% casamino acid. Total RNA was prepared from cultured hyphae at the early, middle and late stages of logarithmic growth using RNeasy Mini Kit (Qiagen). Furthermore, DNA present in a trace amount in the RNA sample was digested with RNase-free DNase I (Qiagen). The RNA concentration was quantified by measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm. RT-PCR was performed using One Step RT-PCR Kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. Specific primers for detecting antisense RNA were those shown in FIG. 9A. Specifically, as an anti-sense RNA detection primer (pSK811, pEL7, pSE1), RT-L11F (5'-GGACCCGGAGAGAGGAATTCAGATC-3 '/ SEQ ID NO: 32) (expected mRNA RT-PCR product size: pSK811, 114 bp; pEL7, 400 bp), and RT-ssgAR (5′-GTCAGCCGGCGTTCTGCTCCTCG-3 ′ / SEQ ID NO: 33) (expected mRNA RT-PCR product size: pSE1, 350 bp) were used. Actinomycetes are expressed at relatively high levels throughout the growing season and are used as internal standards for transcriptional analysishrdBThe mRNA RT-PCR reaction for the gene was also performed simultaneously. The primers used were RT-hrdBF (5'-AGAGCCCAAGCGCACCCGAAAGAG-3 '/ SEQ ID NO: 34) and RT-hrdBR (5'-CTCGTCCTCGTCGGACAGCACGAAG-3' / SEQ ID NO: 35) (Kelemen, GH et al., 1991, Gene 98: 53-60; Kelemen, GH et al., 1996, Mol. Microbiol., 21: 593-603).hrdBThe size of the product amplified with the primers used in the RT-PCR reaction is 370 bp.
[0058]
RT-PCR was performed in a 50 μl reaction volume, and the total RNA added to the reaction was 10 pg or 100 pg. One Step RT-PCR consists of 50 ℃, 30min (reverse transcriptase reaction), then 95 ℃ 15min (inactivation of reverse transcriptase and activation of thermostable DNA Polymerase), 95 ℃ 30 sec, 64 ℃ 30 sec, 72 °
The pSK811 vector is a genome integration type, and the expression DNA cassette is present in one copy in the transformed strain. The above results indicate that even when present in one copy, sufficient antisense RNA expression to suppress gene function is possible.
We verified this by using the actinomycetes low-copy vector pSK210 and multi-copy vectors pSK220 and pSK1127 with the expression DNA cassettessgAAndeshASufficient suppression of the function of genes with higher expression levels than genes can be expected.
Therefore, the vector having the expression DNA cassette of the present invention is not only effective for high expression of the target gene in actinomycetes, but also enables suppression of gene function (gene silencing) by antisense RNA expression, which has been difficult in bacteria so far. To do.
Gene silencing techniques using these vectors can also be applied to metabolic engineering for the production of useful substances in actinomycetes. It can also be used as a gene function analysis method for post-genome analysis of actinomycetes.
[0059]
【The invention's effect】
The present invention provides an expression vector capable of expressing a desired gene at a high level in actinomycetes. This vector can be used as a plasmid or a genome integration type vector. By using the vector of the present invention, a desired protein can be produced using actinomycetes as a host, and antisense RNA and other desired genes can be expressed at a high level in actinomycetes.
[0060]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
[Figure 1] Between actinomycetesrplK(Ribosome protein L11 gene) It is a figure which shows the homology of a promoter region base sequence.S.lavendulae (S. lav),S.virginia (S. vir),S.griseus (S. g),S.coelicolor (S. c)rplKThe base sequences of the promoters are shown (in order of SEQ ID NOs: 36 to 39). The same bases in the four species are indicated with an altarisk. The -35, -10, and SD sequences are boxed. The major transcription start point is indicated by a thick arrowhead, and the minor transcription start point is indicated by a small arrow.
FIG. 2: Inserted into vector pSK811,S. griseusofssgAIt is a figure which shows the terminator sequence (sequence number: 40) of a gene. It contains a palindromic sequence that forms a stem loop of ΔG = -71.7 kcal. Bases forming base pairs are shown in boxes.
FIG. 3 is a diagram showing the structure of pSK210.
FIG. 4 shows the structure of pSK220 (panel A) and pSK1955 (panel B).
FIG. 5 shows the structure of pSK1127 (panel A) and pSK811 (panel B).
[Figure 6] Fluorescent protein by pSK220 and pSK210S. coelicolorIt is a figure which shows the high expression in. A is the structure of the EGFP expression cassette for actinomycetes, B to D areS. coelicolorThe fluorescence microscope observation of the expression of EGFP of is shown. In A, the sequences shown on the 5 ′ side and 3 ′ side of EGFP are shown as SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively.
FIG. 7 shows the expression of agarase from actinomycetes transformed with a vector containing an agarase gene. (A) It is a figure which shows the agarase activity of the culture supernatant of a transformed strain. 10 μl of culture supernatant was added to a well of R2YE agar and incubated at 30 ° C. overnight. (B) Tricine SDS-PAGE analysis of the culture supernatant of the transformed strain. 1, molecular weight marker; 2, pSK220 transformant; 3, pMDagA transformant. Arrows indicate agarase protein bands.
FIG. 8 is a diagram showing suppression of eshA and ssgA gene functions by antisense RNA expression. Compared with the empty vector (pSK811) transformant, the production of blue antibiotic actinorhodin was clearly suppressed in both pSE1 and pEL7 transformants.
FIG. 9 shows the results of analysis of antisense RNA expression by RT-PCR. A shows the position of the amplified fragment of RT-PCR, and B shows the result of RT-PCR. EL, early log growth; ML, mid log growth; LL, late log growth.
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