JP4354403B2 - マロンジアルデヒドを検出するための試薬、その製造方法及びそれを使用するための検査キット - Google Patents

Description

本発明は、一般に、水溶液、血液、尿、及び他の体液のようなメディアに含まれるアルデヒドの検出、より明確には、アルデヒド（より明確にはマロンジアルデヒド）の検出の試薬、その試薬の製造方法及びその試薬を使用するための検査キットに関する。

哺乳類被験者におけるストレスが、直接又は間接的に、通常の体の緩和状態を急速に変える酸素化活性を拡げていくのは今や周知の事実である。この過酸素供給の状態は、病理学的な状態へ変化する可能性がある重大な肉体的な不均衡と実際の肉体的なダメージとをもたらす可能性がある、アテローム性動脈硬化プラークを発現させる。そのようなプラークは、心臓発作に帰着する心臓への血流の休止の原因となる可能性がある動脈閉塞における、特に高い脂質レベルの沈殿を結果として生じる。これは、ストレスによって起こされた過酸化供給の状態からのフリーラジカル（遊離基）攻撃によって起こされる、多くの人間がかかる病気状態の一つである。

酸化ストレス状態は、アルデヒドの遊離、特にジアルデヒドのように、長連鎖多価不飽和脂肪酸の分解から測定可能である。

私たちは、少量の尿に後述の試薬を使用することによって、迅速で容易に実行される家庭用検査キットにおいて、フクシンに基づいた比色分析検査が遊離アルデヒドを測定できると気付いた。形成された結果の色は、ストレスのレベルを評価するために負の値から＋１のレベルを経て＋３までの目盛りがつけられたテスト片（テストストリップ）と比較される。

勿論、アルデヒドに対する様々な検査が知られている。例えば、F.Feiglによって著されて、エルゼビア出版社によって出版された「斑点検査による定性的な分析」第３版の３９５頁に示されるように、アルデヒドを含むであろう微量のサンプル溶液を試験管の中の２ｍｌの７２％硫酸と混ぜる。少量の個体のクロマトロピック（chromatropic）酸(1,8-dihydrooxynapthianene-3 6 disulfate)が加えられ、試験管は約１０分間６０℃の水浴において熱せられる。伝えられるところによれば、検査でアルデヒド感度があるときに現れる明るいすみれ色は、約３ppmのアルデヒドである。

Feiglの出版物の３３９−３４０頁に示された他のアルデヒド検査では、アルデヒドを含んでいると推測される微量の水溶性（またはアルコール性）溶液は、微量の亜硫酸と、微量のフクシン／硫酸と一緒に点滴板の上で扱われ、静置される。検査されている検査溶液に含まれるアルデヒドの存在の量により、赤から青の色が約２から３０分以内に出現する。伝えられるところでは、そのような検査は、検査される微量の溶液に含まれる約１マイクログラムのホルムアルデヒドに反応する。そのような検査と他の既知のアルデヒド検査の問題は、検査が迅速で容易に行われないことである。例えば、上記の第一の検査は、１０分間の恒温の水浴において溶液の試験管の加熱を必要としている。迅速で容易に実施されないアルデヒド検査の結果として、それらをすべきか、さもなければテストされるであろうほど頻繁にはアルデヒドのための検査が行われない傾向があるかもしれない。

詳細なアルデヒド検査は、米国特許No.6,165,797の中で開示される。そこで明らかにされるように、尿は、約９０−１１０重量部の２０％酢酸と、約１３．５から１６．５重量部の成分Ａと、約４．５から５．５重量部の成分Ｂとから構成される試薬と混合することにより、マロンジアルデヒドの存在が検査される。尚、成分Ａは、ピロ亜硫酸ナトリウム、リン酸及びイオン化された水から構成され、その比率は約１８−２２ｇのピロ亜硫酸ナトリウム、９−１１ｍｌの濃縮されたリン酸、及び約４５０−５５０ｍｌのイオン化された水であり、そして、成分Ｂは、塩基性フクシンと成分Ａから構成され、その比率は約０．４５−０．５５ｇの塩基性フクシン、約９０−１１０ｍｌの成分Ａである。このようにして形成された試薬は酢酸の使用のために酸性が強くなり、尿がそこに加えられた時の反応時間は非常に迅速で、尿のｐＨ値として色変化が起こるという結果に終わることがわかっている。従って、偽陽性が起こり、しっかりした信頼できる基準で尿に含まれるアルデヒドの存在を検出することは不可能でないにしても非常に難しくなる。

これら及び他の理由で、有害な生体酸化の検出と、その為の医学的なコストを減少させるために、生物学的流体に含まれる非常に少量のアルデヒドの存在を確実に検出するための改良された試薬が要求される。家庭の自己検査において、個人がそれを容易に使用できるより、ある意味、そのような試薬がパッケージされることが必要である。

本発明の目的は、検査標本に含まれるアルデヒドの存在を測定するための簡単な検査を提供することである。

別の目的は、アルデヒドを含んでいる検査標本と混ぜた時に、色変化を引き起こす検査試薬を提供することである。

本発明によると、特に水溶液、尿及び他の体液に含まれるアルデヒドの存在を検出するための検査溶液または試薬は、リン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム、塩基性フクシン及び脱イオン水の水溶液を含む。１リッターあたりの成分の好ましい比率は、１０ｇのピロ亜硫酸ナトリウム、１０ｍｌの濃縮されたリン酸、５ｇの塩基性フクシン及び約１０００ｍｌの水である。

塩基性フクシンは、検査される標本に含まれるアルデヒドの存在量に比例して酸性溶液の色を変える。塩基性フクシンは、皮膚、尿、又は血漿中のアルデヒドと反応する紫色のパウダーである。少量か、またはアルデヒドが全くなければ、変色を得ることはできない。中程度か高レベルのアルデヒドで、アルデヒドの存在レベルに概略依存している色の変化を得る。血液又は尿などの生物学的体液に含まれるアルデヒドの存在量に概略依存してピンクから紫の色を作り出すために、フクシンのアミノ基はアルデヒドと結合する。発生する色は、酸の存在量によってコントロールされるｐＨに依存する。

ピロ亜硫酸ナトリウムは、空気からの酸素の干渉を妨げる還元剤である。ピロ亜硫酸塩は、アルデヒドだけがフクシン基と反応するように、自由酸素を縛る。試薬混合物の上に窒素被膜を設けることは、試薬とのどんな酸素反応も止めることによって、より長い貯蔵期間を試薬に与える。リン酸は、ｐＨを安定させる。

アルデヒドは、フリーラジカル（遊離基）攻撃による長鎖多価不飽和脂肪酸の分解から遊離される。

ハイレベルのアルデヒドは、冠状動脈疾患、糖尿病及びパーキンソン病のような様々な疾病と異常な代謝状態とにおいて見られる。

水溶液、尿、血液、及び他の体液に含まれるアルデヒドについての検査をするための方法は、上で説明した検査試薬の中に、微量のアルデヒドが含まれる疑いのある尿のような検査標本を混ぜ、少なくとも２分、好ましくは２−５分後に色構成を観察することを含む。好ましい比率は、およそ０．９から１．１ｍｌの検査標本に対して、およそ０．１−０．２ｍｌの検査試薬である。もし、混合物がそのような時間中に有色にならないならば、検査標本は約２ｐｐｍ未満のアルデヒドを含む。しかしながら、もし混合物が特定の時間内に、或いはすぐに着色（例えば桃色がかっている紫色）されるなら、その試験標本には２ｐｐｍ以上のアルデヒドの存在が推定され、アルデヒドの濃度が高い程、より激しい色調になる。

好ましくは、検査試薬は、密封されたアンプルかバイアルに含まれる。検査標本は、スナップタイプアンプルの中の試薬に導入される。水溶液に含まれるアルデヒドの存在に対する、単純で、効率的で、信頼できて、迅速な検査は、それによって提供される。一般に、スポイトかピペットなどの適切なディスペンサーと、標本を収集するためのコンテナに伴うアンプルは、カラーチャートが入っているパッケージに収納される。これは、個人が各自の尿に含まれるアルデヒドの存在について検査する、簡単で、信頼できる方法を提供する。

本発明によると、試薬を作る方法は以下の通りである。まず最初に、約９９５−１００５ｍｌの脱イオン水に約８−１２ｇのピロ亜硫酸ナトリウムを溶解する。次に、１０ｍｌのリン酸と約４．８−５．２ｇの塩基性フクシンを加える。塩基性フクシンは、スペクトラム・ケミカルからＢＡ１３０と同定される。混合物は、少なくとも１０分間混合され、次に、約２８−３２ｇの動物骨炭を加える方が良い。混合物はそのときよく混ぜ合わされ、少なくとも２４時間から最大３６時間置いておく方が良い。その後、骨炭は、混合物を遠心分離し、濾過することによって取り除かれる。動物骨炭は、混合物から着色を取り除き、その結果、脱色された溶液を提供する。次に、この脱色された溶液は、リン酸をゆっくり加え、この手順の間中よく混ぜることによって、ｐＨが１．７５から１．９３の間で調整される。

本発明によると、試薬を作る好ましい方法は、以下の通りである。まず最初に、１０ｇのピロ亜硫酸ナトリウムを１０００ｍｌの脱イオン水に溶解する。次に、１０ｍｌのリン酸と５ｇの塩基性フクシン（ＢＡ１３０）を加える。混合物は、少なくとも１０分間混合される方が良い。次に、３０ｇの動物骨炭を加える。混合物はそのときよく混ぜ合わされ、少なくとも２４時間置いておく方が良い。この時、骨炭は、混合物を遠心分離し、濾過することによって取り除かれる。

この時、脱色された溶液はｐＨのために調整される方が良い。ｐＨは、１．８８のレベルに達するまでリン酸を加えることによって徐々に調整される方が良い。リン酸がゆっくりと加えられ、この手順の間中よく混ぜられることが重要である。

上記の検査溶液は、好ましくは、従来の医薬の溶液タイプの、個々に密封されたテストサイズアンプル又はバイアルに格納される。そのような方法でパッケージされ、涼しく、乾燥した場所に格納されると、密封されたボトルまたはバイアルは、少なくとも１２ヶ月の貯蔵期間が予期される。正確な検査溶液の保証は、陽性アルデヒド検査手順によって、以下で発見されるように達成されるかもしれない。

そして、水溶液に含まれるアルデヒドの存在のための検査は、約０．９ｍｌの検査溶液（微量のアルデヒドを含んでいる）を、上記で処理した約０．１ｍｌの検査する溶液に混ぜることによって行われる。検査キットの好適な実施例の中で、アンプルは、密封されたその中に試薬を０．１ｍｌ含んでいる１ｍｌの容積のアンプルである。アンプルの先端は、スコア線で折られ、捨てられる。ディスペンサーは、約０．９ｍｌの尿をアンプルに詰めるために使われる。検査サンプルと検査溶液の混合物が約２−５分間待った後、無色のままであれば、その検査は陰性であり、従って、検査サンプルはアルデヒドを２ｐｐｍ未満含んでいる。混合物のどのような色変化も、検査溶液中に約２ｐｐｍより高い濃度のアルデヒドの存在を示す。

陽性アルデヒド検査は、好ましくは、テストする溶液が適切に処理されるか、例えば、試薬ボトルが非検査溶液の入っている他のボトルと取り替えられることがないことを保証するために、検査サンプルを検査する前に品質管理技術により行われたものである。

陽性アルデヒド検査は、好ましくは１ｍｌの入手可能な「陽性アルデヒド検査溶液（基準物資）」を、約０．２−０．６ｍｌの検査溶液を含んでいるボトルに注入することによって行われる。およそ２−５分で、ボトルが適切に処方されたアルデヒド検査溶液を含んでいるならば、ボトルの中の溶液は、桃色がかった紫色を発する。さもなければ、検査ボトルから選ばれた「検査溶液」のボトルは、廃棄されるべきである。アルデヒドのための上記で説明された陽性検査は、１０ｐｐｍ又はそれ以上のアルデヒドに敏感である。アルデヒドのための陽性検査５ｐｐｍに対して、０．５ｍｌの脱イオン水が使用される。１０ｐｐｍのアルデヒド検査のものよりも極度の無色は、５ｐｐｍのアルデヒド検査のから得られる。

このようにして、生物学的体液に含まれるアルデヒドの存在を検出するのに使用される試薬、その試薬の製造方法及び個人による使用のためのその試薬を含む検査キットが明らかにされた。

Claims (14)

1. 尿に含まれるマロンジアルデヒドの存在を検出するために個人で使用するための検査キットであって、
   規定量の試薬であって、およそ１リットルあたり、約８−１２ｇのピロ亜硫酸ナトリウム、約９９５から１００５ｍｌの脱イオン水、１０ｍｌのリン酸、約４．８から５．２ｇの塩基性フクシンを含み、ｐＨは１．７５から１．９３の間である試薬が入っている密封コンテナと、
   尿の標本を集めるための容器と、
   前記容器から前記尿を規定量取り出し、前記コンテナの密封を破った後、前記コンテナにそれを入れるためのディスペンサーと、
   ２−５分間の待ち時間の後の試薬と尿との混合物の色と、尿に含まれるアルデヒドの存在があるか否かを示している試薬と尿との混合物の色とを比較するためのカラーチャートとを含むことを特徴とする検査キット。
2. 前記密封コンテナは、１ｍｌの体積容量を有し、その中に含まれた前記規定量の試薬は０．１ｍｌである請求項１記載の検査キット。
3. 前記ピロ亜硫酸ナトリウムは１０ｇの量で存在している請求項１記載の検査キット。
4. 前記塩基性フクシンが５．０ｇの量で存在している請求項１記載の検査キット。
5. 前記試薬のｐＨが１．８８である請求項１記載の検査キット。
6. 尿に含まれるアルデヒドの存在を検出するために使用される試薬であって、約８−１２ｇのピロ亜硫酸ナトリウムと、約９９９−１００５ｍｌの脱イオン水と、１０ｍｌのリン酸と、約４．８−５．２ｇの塩基性フクシンとを含み、ｐＨは１．７５から１．９３の間であることを特徴とする試薬。
7. ピロ亜硫酸ナトリウムが１０ｇ存在している請求項６記載の試薬。
8. 塩基性フクシンが５ｇ存在している請求項７記載の試薬。
9. ｐＨが１．８８である請求項８記載の試薬。
10. 尿に含まれるアルデヒドの存在を検出するのに使用するための試薬のおよそ１リットルあたりの製造方法であって、
    約９９５−１００５ｍｌの脱イオン水に約８−１２ｇのピロ亜硫酸ナトリウムを溶かし、１０ｍｌのリン酸を加え、約４．８−５．２ｇの塩基性フクシンを加え、上記の成分を少なくとも１０分間混合し、約２８−３２ｇの動物骨炭を加え、その骨炭がよく分配されるまで混合し、混合した結果物を２４時間から３６時間置いたままにし、骨炭を取り除き、そして、ｐＨが１．７５−１．９３の間に達するまでリン酸を加えることによって混合物のｐＨを調整するステップを含むことを特徴とする製造方法。
11. 前記ピロ亜硫酸ナトリウムが１０ｇ存在している請求項１０記載の方法。
12. 前記塩基性フクシンが５ｇ存在している請求項１０記載の方法。
13. 前記動物骨炭が３０ｇ存在している請求項１０記載の方法。
14. リン酸をゆっくり加え、よく撹拌することによって、前記ｐＨレベルが１．８８に調整される請求項１０記載の方法。