JP4359497B2 - Nucleic acid amplification primer, nucleic acid amplification primer set, and cancer testing method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、癌の臨床検査の分野において用いられる、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（以下、「ＭＧＭＴ」という。）をコードする遺伝子（以下、「ＭＧＭＴ遺伝子」という。）のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別する方法、特に１回の操作で、２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別する方法、これに用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無の識別キットに関する。 The present invention relates to the CpG region of a gene (hereinafter referred to as “MGMT gene”) encoding O 6 -methylguanine-DNA methyltransferase (hereinafter referred to as “MGMT”), which is used in the field of clinical examination of cancer. A method for identifying the presence or absence of cytosine methylation, in particular, a method for identifying the presence or absence of cytosine methylation in each CpG region of two or more CpG regions in a single operation, a nucleic acid amplification primer for use therein, The present invention relates to a primer set for nucleic acid amplification and a kit for identifying the presence or absence of methylation of cytosine in the CpG region of the MGMT gene.
癌は遺伝子病であり、遺伝子変異の蓄積によって発症するという概念が確立されている。この遺伝子変異のうち、遺伝子配列を変化させない変異として、遺伝子にあるＣｐＧ領域に存在するシトシンのメチル化が知られている。即ち、癌患者の多くにおいて、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンが異常な割合でメチル化されていることが分かっている。そのため、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を効率良く、高い精度で検出できる方法が求められている。
こうした、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出する方法として、ＣｐＧ含有ＤＮＡをＰＣＲで増幅して測定する方法（特許文献１）、プライマーとプローブを併用してメチル化を検出する方法（特許文献２）が知られている。
As a method for detecting methylation of cytosine in the CpG region, a method for measuring CpG-containing DNA by PCR (Patent Document 1), a method for detecting methylation using a primer and a probe in combination (Patent Document 2). )It has been known.
しかしながら、上述の特許文献１及び２の技術においては、１つの遺伝子試料のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するのに、メチル化ＤＮＡを検出するためのＰＣＲと、非メチル化ＤＮＡを検出するためのＰＣＲとの２回のＰＣＲを必要とし、検出効率が低いという問題がある。
さらに、ＭＧＭＴ発現の消失の多くは、ＭＧＭＴ遺伝子のプロモーター領域の分離したＣｐＧ領域のシトシンのメチル化であることが明らかにされている。その意味で、ＭＧＭＴ遺伝子の分離した複数のＣｐＧ領域のメチル化を検出する方法は、ＭＧＭＴ遺伝子の変異に起因する癌の診断において重要な意味があり、かかるＭＧＭＴ遺伝子の分離した複数のＣｐＧ領域のメチル化の検出方法が求められている。
However, in the techniques of
Furthermore, much of the disappearance of MGMT expression has been shown to be cytosine methylation in the isolated CpG region of the promoter region of the MGMT gene. In that sense, a method for detecting methylation of a plurality of CpG regions separated from the MGMT gene has an important meaning in the diagnosis of cancer caused by a mutation in the MGMT gene. There is a need for a method of detecting methylation.
そこで、本発明の課題は、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を効率良く、高い精度で検出する方法として、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出する方法を提供することである。さらに、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、検査用試薬キットを提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for efficiently and highly accurately detecting cytosine methylation in two or more CpG regions of the MGMT gene, in a single operation, for each of the two or more CpG regions of the MGMT gene. It is to provide a method for detecting cytosine methylation in the CpG region. Furthermore, it is to provide a nucleic acid amplification primer, a nucleic acid amplification primer set, and a test reagent kit for use in this detection method.
かかる実情において、１）ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域に存在するメチル化されたシトシンを特異的に認識する核酸増幅用プライマー（以下、「メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマー」という。）であって、それぞれの核酸増幅用プライマーが異なるＣｐＧ領域に存在するメチル化されたシトシンを特異的に認識して核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するものを２以上、２）当該メチル化の有無によらずＭＧＭＴ遺伝子のいずれかの領域（前記ＣｐＧ領域以外の領域が好ましい。）に結合し、当該ＣｐＧ領域を含む領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成する核酸増幅用プライマー（以下、「メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマー」という。）を２以上含む核酸増幅用プライマーセットを用いれば、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を精度よく検出でき、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を精度よく識別することできることを見出した。 Under such circumstances, 1) a nucleic acid amplification primer that specifically recognizes methylated cytosine present in the CpG region of the MGMT gene (hereinafter referred to as “methylated cytosine-specific nucleic acid amplification primer”), 2 or more that each nucleic acid amplification primer specifically recognizes methylated cytosine present in different CpG regions and forms an oligonucleotide by nucleic acid amplification 2) MGMT gene regardless of the presence or absence of the methylation A primer for nucleic acid amplification (hereinafter referred to as “methylated cytosine non-specific nucleic acid”) that binds to any of the above regions (regions other than the CpG region are preferred) and forms an oligonucleotide by nucleic acid amplification in the region containing the CpG region. When using a primer set for nucleic acid amplification containing two or more “primers for amplification”)) By the operation, cytosine methylation in each CpG region of the two or more CpG regions of the MGMT gene can be detected with high accuracy, and cytosine in each of the CpG regions of the two or more CpG regions of the MGMT gene can be detected by one operation. It was found that the presence or absence of methylation of can be accurately identified.
また、これら核酸増幅用プライマーセットとして、２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とするものを用いれば、擬陽性の結果を生ずることを防止できるので好ましい。 In addition, as a primer set for nucleic acid amplification, the difference in melting temperature between two or more methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primers is within 1 to 3 degrees, and two or more methylated cytosine-specific nucleic acid amplifications are performed. It is preferable to use a primer for which the difference in melting temperature of each primer is within 1 to 3 degrees because it can prevent a false positive result.
また、これら核酸増幅用プライマーセットとして、核酸増幅用プライマー同士のＧＣ含有率（グアニンとシトシンのプライマー中の含有率）の差が２０％以内であるものを用いれば、擬陽性の結果を生ずることを防止できるので好ましい。 In addition, if these nucleic acid amplification primer sets are used in which the difference in GC content between the nucleic acid amplification primers (the content of guanine and cytosine in the primer) is within 20%, a false positive result will be produced. Since it can prevent, it is preferable.
また、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析（immunohistochemical analysis;以下適宜「ＩＨＣ」という。）を併用することにより、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を精度よく検出でき、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を精度よく識別することできるので好ましい。 Further, by using together with immunohistochemical analysis (hereinafter referred to as “IHC”) of DNA mismatch repair protein, cytosine methylation in each CpG region of two or more CpG regions of the MGMT gene can be accurately performed. This is preferable because the presence or absence of cytosine methylation in each CpG region of two or more CpG regions of the MGMT gene can be accurately detected by a single operation.
また、本発明においては、２つの前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのみにより増幅された核酸増幅産物の量と、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーと１つの前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーにより増幅された核酸増幅産物の量とを比較することにより、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の程度を判定することができるので好ましい。 In the present invention, the amount of the nucleic acid amplification product amplified by only the two methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primers, the methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer, and one methylated cytosine Determining the degree of cytosine methylation in each CpG region of two or more CpG regions in a gene encoding MGMT by comparing the amount of nucleic acid amplification product amplified by a specific nucleic acid amplification primer Is preferable.
その際、前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーの濃度を、前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの濃度より高くすることが好ましい。 At that time, the concentration of the methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer is preferably higher than the concentration of the methylated cytosine-specific nucleic acid amplification primer.
また、前記核酸増幅用プライマーセットを含む検査用試薬キットと合わせて本発明を完成した。 In addition, the present invention was completed together with the test reagent kit containing the nucleic acid amplification primer set.
本発明に係る核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びこれを用いた検出方法によれば、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を精度よく検出でき、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を精度よく識別することできる。 According to the nucleic acid amplification primer, the nucleic acid amplification primer set, and the detection method using the nucleic acid amplification primer according to the present invention, cytosine methylation of each CpG region of two or more CpG regions of the MGMT gene can be performed in one operation. It is possible to accurately detect the presence or absence of cytosine methylation in each CpG region of two or more CpG regions of the MGMT gene.
（検出原理）
ＭＧＭＴ遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のＣｐＧ領域（主としプロモーター領域）においては、メチル化されたシトシンは重亜硫酸修飾によって脱アミノ化されにくく、シトシンのままで存在するとされる。一方、メチル化されないシトシンは、そのすべて又はその殆んどが重亜硫酸修飾によって一旦ウラシルに転換され、この転換されたウラシルは、これを含む一本鎖ＤＮＡを増幅すると、チミンとして発現される。
(Detection principle)
In the CpG region (mainly the promoter region) of the MGMT gene (single-stranded DNA), methylated cytosine is unlikely to be deaminated by bisulfite modification and is present as cytosine. On the other hand, all or most of the unmethylated cytosine is once converted to uracil by bisulfite modification, and this converted uracil is expressed as thymine when a single-stranded DNA containing it is amplified.
（２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の一回検出）
そこで、基本的に、（１）いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンである場合にのみ前記ＭＧＭＴ遺伝子に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にウラシルに変換されれば当該ＭＧＭＴ遺伝子に結合しなくなるプライマー（前記「メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマー」に相当する。）であって、それぞれの核酸増幅用プライマーが、異なるＣｐＧ領域に存在するシトシンであって、重亜硫酸修飾の後でもシトシンのままであるもの（前記「メチル化されたシトシン」に相当する。）を特異的に認識して核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するものを２以上用い、（２）この２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの認識する２以上のＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる。）に転換されても，当該ＭＧＭＴ遺伝子に結合し、当該重亜硫酸修飾の後でもシトシンのままであるものの存在するＣｐＧ領域の何れをも含む領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するプライマー（前記「メチル化シトシン非特異的プライマー」に相当する。）を２以上用い、（１）で表される核酸増幅用プライマーと（２）で表される核酸増幅用プライマーとの少なくとも２種を用いて、核酸増幅方法にて増幅した産物を検出すると、１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、１のメチル化シトシン特異的プライマーとメチル化シトシン非特異的プライマー由来の２種の増幅産物（Ｓ１とＮＳ）が検出され、他の１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、他の１のメチル化シトシン特異的プライマーとメチル化シトシン非特異的プライマー由来の２種の増幅産物（Ｓ２とＮＳ）が検出され、当該１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンと当該他の１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、１のメチル化シトシン特異的プライマーと、他の１のメチル化シトシン特異的プライマーと、メチル化シトシン非特異的プライマー由来の３種の増幅産物（Ｓ１、Ｓ２、ＮＳ）が検出されるが、メチル化されないシトシンのみを含む遺伝子に対しては、メチル化シトシン非特異的プライマー由来の１種の増幅産物のみが検出される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、１度の操作で、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出し、１度の操作で、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することができる。
(Single detection of cytosine methylation in two or more CpG regions)
Therefore, basically, (1) cytosine in any CpG region binds to the MGMT gene only when it is cytosine after bisulfite modification, and cytosine in any CpG region is bisulfite modified. A primer that does not bind to the MGMT gene when converted to uracil later (corresponding to the “primer for amplification of methylated cytosine-specific nucleic acid”), and each nucleic acid amplification primer exists in a different CpG region. 2 which specifically recognizes cytosine that remains cytosine after bisulfite modification (corresponding to the “methylated cytosine”) and forms an oligonucleotide by nucleic acid amplification. (2) The two or more CpG regions recognized by the two or more methylated cytosine-specific primers for nucleic acid amplification are used. Even if the syn remains cytosine after the bisulfite modification, even if it is converted to uracil (in the oligonucleotide amplified by gene amplification, thymine is placed at the site of uracil), the MGMT gene is not changed. A primer that binds and forms an oligonucleotide by nucleic acid amplification in a region containing any of the CpG regions that are present in cytosine even after the bisulfite modification (corresponding to the “methylated cytosine non-specific primer”) .) Is used, and the product amplified by the nucleic acid amplification method is detected using at least two of the nucleic acid amplification primer represented by (1) and the nucleic acid amplification primer represented by (2). For a gene containing said methylated cytosine in one CpG region, one methylated cytosine-specific primer and Two amplification products (S1 and NS) derived from non-specific cytosine-specific primers were detected, and for other genes containing the methylated cytosine in one CpG region, the other methylation Two amplification products (S2 and NS) derived from a cytosine-specific primer and a non-methylated cytosine-specific primer were detected, and the methylated cytosine of the one CpG region and the one of the other CpG region For a gene containing methylated cytosine, three amplification products derived from one methylated cytosine-specific primer, another one methylated cytosine-specific primer, and a non-methylated cytosine-specific primer ( S1, S2, NS), but for genes that contain only unmethylated cytosine, one amplification from a methylated cytosine non-specific primer Only the product is detected. Therefore, cytosine methylation in each CpG region of each of the two or more CpG regions is detected in one operation based on the difference in the detected amplification product, and the two or more CpG in one operation. The presence or absence of cytosine methylation in each CpG region of the region can be identified.
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーであれ、メチル化シトシン非特異的プライマーであれ、２以上のＣｐＧ領域（その各々のＣｐＧ領域中にメチル化シトシンが存在する）を含むオリゴヌクレオチドを選択する。ここで、プライマーが２以上のＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドを選択するとは、そのプライマーが２以上のＣｐＧ領域を含むヌクレオチドのいずれかの領域に結合し、前記２以上のＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅により前記ＣｐＧ領域に対応する領域（一般には前記ＣｐＧ領域に対して相補的である。）を含むオリゴヌクレオチドを形成することをいう。
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーは、検出しようとするメチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するように設計される。また、本発明においては、それぞれのメチル化シトシン特異的プライマーは、異なるメチル化シトシンの存在する異なるＣｐＧ領域に結合するように設計される。
一方、メチル化シトシン非特異的プライマーは、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合しないように設計されるが、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するものとなってもよい。
In the present invention, whether a methylated cytosine-specific primer or a methylated cytosine non-specific primer, an oligonucleotide containing two or more CpG regions (methylated cytosine is present in each CpG region) is selected. To do. Here, selection of an oligonucleotide containing two or more CpG regions as a primer means that the primer binds to any region of nucleotides containing two or more CpG regions, and an oligonucleotide containing two or more CpG regions is selected. As a template, it means that an oligonucleotide containing a region corresponding to the CpG region (generally complementary to the CpG region) is formed by nucleic acid amplification.
In the present invention, the methylated cytosine-specific primer is designed to bind to the CpG region where the methylated cytosine to be detected is present. In the present invention, each methylated cytosine-specific primer is designed to bind to a different CpG region where a different methylated cytosine is present.
On the other hand, the methylated cytosine non-specific primer is designed not to bind to the CpG region where the methylated cytosine exists, but may bind to the CpG region where the methylated cytosine exists.
本発明においては、ＭＧＭＴ遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のプロモーター領域中で、塩基番号７８１から１４８４の間の領域（配列番号１の１から７００で表されるＭＧＭＴ遺伝子の領域）の２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出できるプライマーセットを見出した。 In the present invention, in the promoter region of the MGMT gene (single-stranded DNA), two or more CpGs in the region between base numbers 781 to 1484 (region of MGMT gene represented by 1 to 700 in SEQ ID NO: 1) We found a primer set that can detect cytosine methylation in the region.
（プライマーとプライマー用のオリゴヌクレオチド）
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーは、メチル化解析の対象となるＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンに対応する部位のみがシトシンに対応した塩基であり、前記シトシン以外のシトシンに対応する部位は、ウラシル若しくはチミンに対応するように設計される。一方、メチル化シトシン非特異的プライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンがウラシル若しくはチミンに転換された配列、シトシンのままの配列の双方に対応するように設計される。
(Primers and oligonucleotides for primers)
In the present invention, in the methylated cytosine-specific primer, only the site corresponding to cytosine in the CpG region of the MGMT gene to be subjected to methylation analysis is a base corresponding to cytosine, and corresponds to cytosine other than cytosine. The site is designed to correspond to uracil or thymine. On the other hand, a non-specific primer for methylated cytosine is designed to correspond to both a sequence in which cytosine in the CpG region of the MGMT gene is converted to uracil or thymine and a sequence that remains as cytosine.
一般に、メチル化特異的ＰＣＲでは、プライマー配列と重亜硫酸修飾後のＤＮＡ配列とが完全に相補的にアニーリングしたときにのみＤＮＡの増幅が起こり、プライマー配列と重亜硫酸修飾後のＤＮＡ配列との間に１塩基以上のミスマッチが存在するときにはＤＮＡの増幅がおこらないようにプライマー及びＰＣＲの反応系を設計する。このことによって、メチル化特異的ＰＣＲでは、１塩基のメチル化の有無も識別することができる。 In general, in methylation-specific PCR, DNA amplification occurs only when the primer sequence and the bisulfite-modified DNA sequence are annealed in a completely complementary manner, and between the primer sequence and the bisulfite-modified DNA sequence. The primer and PCR reaction system is designed so that DNA amplification does not occur when there is a mismatch of 1 base or more. Thus, methylation-specific PCR can also identify the presence or absence of single-base methylation.
本発明において核酸増幅用プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、各種の核酸合成反応において必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる。
具体的には、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を１回の操作で検出する検出方法に用いられる核酸増幅用プライマーであって、
以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーである。
１）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
２）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、１）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
３）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
４）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、３）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
５）配列番号２〜５に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。プライマーが別のプライマーを認識して結合すれば、核酸増幅に好適である。
６）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの１）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。メチル化シトシン特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
７）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、６）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化シトシン特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
８）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの３）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
９）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、８）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち１又は複数のオリゴヌクレオチドについて、１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
The oligonucleotide used as a primer for nucleic acid amplification in the present invention can perform base pairing with a complementary strand while maintaining the specificity required for various nucleic acid synthesis reactions.
Specifically, a primer for nucleic acid amplification used in a detection method for detecting methylation of cytosine in each CpG region of each of two or more CpG regions in a gene encoding MGMT in one operation,
A primer for nucleic acid amplification that selects at least one of the oligonucleotides according to any one of 1) to 10) below.
1) An oligonucleotide comprising a base sequence in which two or more CpG regions in a gene encoding MGMT are contained, and cytosine other than cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions is converted to thymine or uracil.
This oligonucleotide is derived, for example, from single-stranded DNA after bisulfite modification in double-stranded DNA of a gene collected from a biological sample. A methylation-specific primer can select this oligonucleotide, but the primer for selecting this oligonucleotide is not limited to a methylated cytosine-specific primer, and may be a methylated cytosine non-specific primer.
2) A base sequence complementary to a base sequence comprising two or more CpG regions in a gene encoding MGMT, and cytosine other than cytosine present in each of the two or more CpG regions converted to thymine or uracil An oligonucleotide consisting of
This oligonucleotide has the same base sequence as that of the amplification product formed when nucleic acid is amplified using the oligonucleotide represented by 1) as a template. The amplified product is used as a template in the next stage of nucleic acid amplification. A methylation-specific primer can select this oligonucleotide, but the primer for selecting this oligonucleotide is not limited to a methylated cytosine-specific primer, and may be a methylated cytosine non-specific primer.
3) An oligonucleotide comprising a base sequence in which two or more CpG regions in a gene encoding MGMT are contained, and cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions is converted to thymine or uracil.
This oligonucleotide is derived from a single-stranded DNA after bisulfite modification in a double-stranded DNA of a gene collected from a biological sample. The primer for selecting this oligonucleotide is a methylated cytosine non-specific primer.
4) an oligonucleotide comprising two or more CpG regions in a gene encoding MGMT and having a base sequence complementary to a base sequence obtained by converting cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions into thymine or uracil .
This oligonucleotide has the same base sequence as that of the amplified product formed when nucleic acid is amplified using the oligonucleotide represented by 3) as a template. The amplified product is used as a template in the next stage of nucleic acid amplification. The primer for selecting this oligonucleotide is a methylated cytosine non-specific primer.
5) An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 2 to 5. If a primer recognizes and binds to another primer, it is suitable for nucleic acid amplification.
6) From the base sequence in which two or more CpG regions in the complementary strand of the sequence of the gene encoding MGMT are contained, and cytosine other than cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions is converted to thymine or uracil An oligonucleotide.
This oligonucleotide is derived from, for example, a single-stranded (opposite strand) DNA that has been complementarily bound to the single-stranded DNA shown in 1) of the double-stranded DNA of a gene collected from a biological sample. is there. Although a methylated cytosine-specific primer can select this oligonucleotide, the primer for selecting this oligonucleotide is not limited to a methylated cytosine-specific primer, and may be a methylated cytosine non-specific primer.
7) a nucleotide sequence comprising two or more CpG regions in the complementary strand of the sequence of the gene encoding MGMT, and cytosine other than cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions converted to thymine or uracil An oligonucleotide consisting of a complementary base sequence.
This oligonucleotide has the same base sequence as that of the amplification product formed when nucleic acid is amplified using the oligonucleotide represented by 6) as a template. The amplified product is used as a template in the next stage of nucleic acid amplification. Although a methylated cytosine-specific primer can select this oligonucleotide, the primer for selecting this oligonucleotide is not limited to a methylated cytosine-specific primer, and may be a methylated cytosine non-specific primer.
8) An oligonucleotide comprising a base sequence in which two or more CpG regions in a complementary strand of a sequence of a gene encoding MGMT are contained, and cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions is converted to thymine or uracil.
This oligonucleotide is derived from, for example, a single-stranded (opposite strand) DNA that has been complementarily bound to the single-stranded DNA shown in 3) of the double-stranded DNA of a gene collected from a biological sample. is there. The primer for selecting this oligonucleotide is a methylated cytosine non-specific primer.
9) A base complementary to the base sequence comprising two or more CpG regions in the complementary strand of the sequence of the gene encoding MGMT, and cytosine present in each CpG region of the two or more CpG regions converted to thymine or uracil An oligonucleotide consisting of a sequence.
This oligonucleotide has the same base sequence as that of the amplification product formed when nucleic acid is amplified using the oligonucleotide represented by 8) as a template. The amplified product is used as a template in the next stage of nucleic acid amplification. The primer for selecting this oligonucleotide is a methylated cytosine non-specific primer.
10) One or more oligonucleotides of the oligonucleotide according to any one of 1) to 9) above, wherein one or more bases include a mutated base sequence such as substitution, deletion, insertion or addition , An oligonucleotide having a primer function capable of detecting cytosine methylation in each CpG region of the two or more CpG regions.
より、具体的には、２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化シトシン特異的プライマーは、２以上のＣｐＧ領域を含み、少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンをウラシル又はチミンに変換した配列を持ったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
詳しくは、このプライマーは、当該１つのＣｐＧ領域中のシトシンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、当該１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にウラシルに変換されても（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる。）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配列をもったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
本実施形態においては、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーとしては、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドとがある。前者のプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８７６から９０１に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。後者のプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１０７０から１０９２の部位を認識して、その遺伝子に結合する。
More specifically, the methylated cytosine-specific primer used for identifying the presence or absence of cytosine methylation in two or more CpG regions comprises two or more CpG regions, and cytosine in at least one CpG region An oligonucleotide having a sequence obtained by converting other cytosine into uracil or thymine is selected.
Specifically, in this primer, cytosine in the one CpG region remains cytosine after bisulfite modification, and cytosines other than cytosine in the one CpG region are converted to uracil after bisulfite modification. Even in the case of oligonucleotides amplified by gene amplification, thymine is placed at the uracil site. Even if the cytosine remains unconverted, the oligonucleotide having the sequence is selected. Is.
In this embodiment, as a methylation specific primer used for identifying the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region, an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 4 There is. The former primer recognizes a site corresponding to the base sequence 876 to 901 of the MGMT gene and binds to that gene. The latter primer recognizes the base sequence 1070 to 1092 of the MGMT gene and binds to that gene.
２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーは、前記ＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無によらず、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するように設計されるものである。
詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、前記ＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、当該ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無に影響を受けないように、すなわち、ＣｐＧ領域中のシトシンがウラシルに変換された場合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設計されることが好ましい。具体的には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンの部位に対応するメチル化非特異的プライマーの部位に混合塩基、またはイノシン３リン酸（ＩＴＰ）由来のイノシン（ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種のメチル化非特異的プライマーである。
本実施形態においては、２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーとしては、配列番号２又は５で表されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号２で表されるプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８０２から８２５に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。また、配列番号５で表されるプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１１８２から１２０６に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
It is preferable that the non-methylated primer used for identifying the presence or absence of cytosine methylation in two or more CpG regions is designed to bind to a region other than the CpG region. If it is necessary to bind to the region containing the CpG region, it is designed to bind to the region containing the CpG region regardless of the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region. It is.
Specifically, this non-methylated primer is preferably designed to bind to a region other than the CpG region. If it must be bound to the region containing the CpG region, it is not affected by the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region, that is, cytosine in the CpG region is converted into uracil. It is preferably designed to amplify both sequences when converted and when cytosine remains unconverted. Specifically, it consists of a base sequence in which a mixed base or inosine (hypoxanthine) derived from inosine triphosphate (ITP) is placed at the site of the methylation non-specific primer corresponding to the cytosine site in the CpG region. Oligonucleotides are this type of non-methylated primer.
In the present embodiment, the methylation non-specific primer used for identifying the presence or absence of cytosine methylation in two or more CpG regions includes an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 or 5. The primer represented by SEQ ID NO: 2 recognizes a site corresponding to the base sequence 802 to 825 of the MGMT gene and binds to that gene. The primer represented by SEQ ID NO: 5 recognizes a site corresponding to the base sequence 1182 to 1206 of the MGMT gene and binds to that gene.
上記配列番号３で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号４で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号２で表されるメチル化非特異的プライマーと、配列番号５で表されるメチル化非特異的プライマーとの合計４種のプライマーセットを用いれば、２以上のＣｐＧ領域の各々の領域のシトシンのメチル化を検出でき、２以上のＣｐＧ領域の各々の領域のシトシンのメチル化の有無を識別できる。 The methylation specific primer represented by SEQ ID NO: 3, the methylation specific primer represented by SEQ ID NO: 4, the methylation non-specific primer represented by SEQ ID NO: 2, and the SEQ ID NO: 5 The methylation of cytosine in each region of two or more CpG regions can be detected by using a total of four types of primer sets together with non-methylated non-specific primers. It can be identified whether or not.
即ち、図１の模式図に示されるように、メチル化シトシン特異的プライマーである配列番号３で表されるＰ１−ＡＳ（メチル化シトシン特異的上流プライマー）と、メチル化シトシン特異的プライマーである配列番号４で表されるＰ２−Ｓ（メチル化シトシン特異的下流プライマー）と、メチル化シトシン非特異的プライマーである配列番号２で表されるＮＳ−Ｓ（メチル化シトシン非特異的上流プライマー）と、メチル化シトシン非特異的プライマーである配列番号５で表されるＮＳ−ＡＳ（メチル化シトシン非特異的下流プライマー）の４種のプライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅する。メチル化の相違による増幅産物の相違は以下のようになる（図２）。
（１）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ１−ＡＳの３種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとから核酸増幅して形成される９６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＰ１で表されるレーン）。
（２）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されている試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ２−Ｓの３種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される１３６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＰ２で表されるレーン）。
（３）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されている試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ１−ＡＳと、Ｐ２−Ｓの４種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとから核酸増幅して形成される９６塩基のメチル化断片と、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される１３６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の３つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＦで表されるレーン）。
（４）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されていない試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳの２種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片のみが形成される（図２のＵで表されるレーン）。
このように、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することができる。
That is, as shown in the schematic diagram of FIG. 1, it is a methylated cytosine specific primer P1-AS (methylated cytosine specific upstream primer) represented by SEQ ID NO: 3 and a methylated cytosine specific primer. P2-S (methylated cytosine specific downstream primer) represented by SEQ ID NO: 4 and NS-S (methylated cytosine non-specific upstream primer) represented by SEQ ID NO: 2, which is a methylated cytosine non-specific primer Then, the nucleic acid is amplified by the nucleic acid amplification method using four kinds of primers of NS-AS (methylated cytosine non-specific downstream primer) represented by SEQ ID NO: 5 which is a methylated cytosine non-specific primer. Differences in amplification products due to differences in methylation are as follows (FIG. 2).
(1) In a sample in which cytosine in one upstream CpG region is methylated and cytosine in one downstream CpG region is not methylated, NS-S, NS-AS, and P1-AS Three primers bind to the gene. A 96-base methylated fragment formed by nucleic acid amplification from NS-S and P1-AS, and a 404-base non-methylated fragment formed by nucleic acid amplification from NS-S and NS-AS Are formed (lane represented by P1 in FIG. 2).
(2) In a sample in which cytosine in the upstream one CpG region is not methylated and cytosine in the downstream one CpG region is methylated, NS-S, NS-AS, and P2-S The three types of primers bind to the gene. A 136-base methylated fragment formed by nucleic acid amplification from P2-S and NS-AS, and a 404-base unmethylated fragment formed by nucleic acid amplification from NS-S and NS-AS Are formed (lane represented by P2 in FIG. 2).
(3) In a sample in which cytosine in one upstream CpG region is methylated and cytosine in one downstream CpG region is also methylated, NS-S, NS-AS, P1-AS, and , 4 types of P2-S primers bind to the gene. A 96-base methylated fragment formed by nucleic acid amplification from NS-S and P1-AS; a 136-base methylated fragment formed by nucleic acid amplification from P2-S and NS-AS; Three DNA fragments of a 404 base unmethylated fragment formed by nucleic acid amplification from NS-S and NS-AS are formed (lane represented by F in FIG. 2).
(4) In a sample in which cytosine in the upstream one CpG region is not methylated and cytosine in the downstream one CpG region is not methylated, two primers, NS-S and NS-AS Binds to a gene. Then, only a 404-base unmethylated fragment formed by nucleic acid amplification from NS-S and NS-AS is formed (lane represented by U in FIG. 2).
Thus, based on the difference in the detected amplification products, the presence or absence of cytosine methylation in each of the two or more CpG regions can be identified.
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により設計することができ、例えば、リン酸トリエステル法や、リン酸アミダイト法、リン酸基部位無保護法といった固相化学的合成法を用いることができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（Applied Biosystem社製、Expedite Model 8909）等を用いて合成することができる。また、１ないし複数個の塩基を置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドも公知の固相化学的合成法で合成することができる。 Oligonucleotides can be designed by a known method, and for example, a solid phase chemical synthesis method such as a phosphate triester method, a phosphate amidite method, or a phosphate group site unprotected method can be used. Specifically, it can be synthesized using an oligonucleotide synthesizer (Applied Biosystem, Expedite Model 8909) or the like. Oligonucleotides in which one or more bases are mutated by substitution, deletion, insertion or addition can also be synthesized by a known solid phase chemical synthesis method.
（プライマーセット）
本発明で、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられる核酸増幅用プライマーセットにおいては、１）２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とする、及び／又は、２）核酸増幅用プライマー同士のＧＣ含有率（グアニンとシトシンのプライマー中の含有率）の差が２０％以内であるものを用いることも可能である。
(Primer set)
In the present invention, in the primer set for nucleic acid amplification used for identifying the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region of the MGMT gene, 1) melting of each of the two or more methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primers The difference in temperature is within 1 to 3 degrees, and the difference in melting temperature between two or more methylated cytosine-specific nucleic acid amplification primers is within 1 to 3 degrees, and / or 2) for nucleic acid amplification It is also possible to use a primer having a difference in GC content between the primers (content of guanine and cytosine in the primer) within 20%.
ここに、プライマーの融解温度とは、プライマーがオリゴヌクレオチドに結合する至適温度のことをいう。２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とすることにより、あるＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンでないにもかかわらず、メチル化シトシン特異的プライマーが鋳型のオリゴヌクレオチドと結合して、擬陽性の結果を生ずることを防止することができる。
また、このようにプライマーを設計すればメチル化の有無を考慮しない、ＰＣＲにおけるコントロール産物（すなわち、２種類のメチル化シトシン非特異的プライマーにより合成される産物）を検出しやすくなる。
Here, the melting temperature of the primer means the optimum temperature at which the primer binds to the oligonucleotide. The difference between the melting temperatures of two or more methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primers is within 1 to 3 degrees, and the difference between the melting temperatures of two or more methylated cytosine specific nucleic acid amplification primers is Within 1 to 3 degrees, a methylated cytosine-specific primer binds to the template oligonucleotide and produces a false positive result even though cytosine in a CpG region is not cytosine after bisulfite modification This can be prevented.
In addition, if the primer is designed in this manner, it becomes easy to detect a control product in PCR (that is, a product synthesized by two types of methylated cytosine non-specific primers) without considering the presence or absence of methylation.
また、プライマーのＧＣ含有率とは、プライマーの全塩基配列中グアニンとシトシンを合わせた塩基数の割合のことをいう。例えば、１００塩基からなる２つのプライマーがあり、１つ目のプライマーのＧＣの数が４５で、もう１つのプライマーのＧＣの数が５０であればＧＣ含有率の差は５％であるとされる。このとき、プライマーのＧＣ含有率は、メチル化シトシン特異的プライマーの方においてより低くするとよい。このように、プライマーを設計すれば、擬陽性の結果を生ずることを防止することができ、かつ再現性のよい結果を得やすくなるので好ましい。 In addition, the GC content of the primer refers to the ratio of the number of bases combined with guanine and cytosine in the entire base sequence of the primer. For example, if there are two primers consisting of 100 bases, the first primer has 45 GCs and the other primer has 50 GCs, the difference in GC content is 5%. The At this time, the GC content of the primer is preferably lower than that of the methylated cytosine-specific primer. Thus, it is preferable to design a primer because it can prevent a false positive result and easily obtain a reproducible result.
本発明の検出方法においては、修飾剤を用いてメチル化されていないシトシンを一旦ウラシルに変換し、核酸増幅用プライマーセットにより、遺伝子産物を検出する。前述のように、１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化される毎に、それに対応する断片（以下、適宜「メチル化シトシン特異的断片」という。）が検出される。また、メチル化の有無によらず、それに対応する断片（以下、適宜「メチル化シトシン非特異的断片」という。）が検出される。
例として、試料中の１００ＤＮＡのうちの２０ＤＮＡにおいて、ある１のＣｐＧ領域においてシトシンがメチル化されており、修飾剤により、メチル化されていない８０ＤＮＡのうち７５ＤＮＡがウラシルに変換されたとしても、本発明の検出方法によれば、メチル化シトシン非特異的断片と、メチル化シトシン特異的断片との、強度の比は、ほぼ７５対２５となるであろうことから、このＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化のおおよその程度を判定することができる。
即ち、本発明においては、２つの前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのみにより増幅された核酸増幅産物の量と、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーと１つの前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーにより増幅された核酸増幅産物の量とを比較することにより、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の程度を判定することができる。
In the detection method of the present invention, cytosine that is not methylated using a modifying agent is once converted to uracil, and a gene product is detected using a primer set for nucleic acid amplification. As described above, every time cytosine in one CpG region is methylated, a corresponding fragment (hereinafter referred to as “methylated cytosine-specific fragment” as appropriate) is detected. Further, regardless of the presence or absence of methylation, a corresponding fragment (hereinafter referred to as “methylated cytosine non-specific fragment” as appropriate) is detected.
For example, even if 20 out of 100 DNAs in a sample have cytosine methylated in one CpG region and 75 DNA of 80 unmethylated DNA is converted to uracil by a modifying agent, According to the detection method of the invention, the intensity ratio between the methylated cytosine non-specific fragment and the methylated cytosine specific fragment will be approximately 75 to 25, so that the methyl of cytosine in this CpG region The approximate degree of conversion can be determined.
That is, in the present invention, the amount of the nucleic acid amplification product amplified by only the two methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primers, the methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer, and one methylated cytosine Determining the degree of cytosine methylation in each CpG region of two or more CpG regions in a gene encoding MGMT by comparing the amount of nucleic acid amplification product amplified by a specific nucleic acid amplification primer Can do.
しかし、前述の場合、ある１のＣｐＧ領域におけるメチル化の割合が大きいと、メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーが、より多くのメチル化シトシン特異的断片の生成に寄与し、メチル化シトシン非特異的断片の生成量が低下し、メチル化の程度を正確に判定することができなくなる恐れがある。
このような不都合を回避するために、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーの濃度を、前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの濃度より高くすることにより、メチル化シトシン非特異的断片の生成量を維持することができ、メチル化の程度を正確に判定することができるようになる。
具体的には、各々のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーを同濃度となるように添加し、各々のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーをそのメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの１．５から２．５倍、好ましくは２倍の濃度となるように添加することにより、メチル化シトシン特異的断片と、メチル化シトシン非特異的断片とを、安定的に生成させることができる。
However, in the case described above, if the ratio of methylation in a certain CpG region is large, the methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer contributes to the generation of more methylated cytosine-specific fragments, and methylated cytosine There is a possibility that the amount of non-specific fragments produced decreases, and the degree of methylation cannot be accurately determined.
In order to avoid such inconveniences, the concentration of the methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer is set higher than the concentration of the methylated cytosine-specific nucleic acid amplification primer, whereby a methylated cytosine non-specific fragment Thus, the amount of methylation can be maintained, and the degree of methylation can be accurately determined.
Specifically, each methylated cytosine-specific nucleic acid amplification primer is added to the same concentration, and each methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer is added to the methylated cytosine-specific nucleic acid amplification primer. By adding at a concentration of 1.5 to 2.5 times, preferably 2 times, a methylated cytosine-specific fragment and a methylated cytosine non-specific fragment can be stably generated. .
（検査方法）
本発明における検査方法は、試料の準備、ＭＧＭＴ遺伝子の抽出、ＭＧＭＴ遺伝子の修飾、プライマーを用いた遺伝子増幅、ＭＧＭＴ遺伝子の検出の過程からなる。
(Inspection method)
The test method in the present invention comprises the steps of sample preparation, MGMT gene extraction, MGMT gene modification, gene amplification using primers, and MGMT gene detection.
（検査用試料・病理検体の準備）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料はＭＧＭＴ遺伝子を含むものであればよく、特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、精液、唾液、脳脊髄液等が挙げられる。生体から採取した組織としては、例えば、手術により切除した大腸癌の組織や、手術前の内視鏡検査等に用いる生体検査材料等が、試料の有効利用の点で好適に用いられる。
(Preparation of test samples and pathological specimens)
The human sample used in the test method of the present invention is not particularly limited as long as it contains the MGMT gene. Specifically, blood, serum, feces, semen, saliva, cerebrospinal fluid and the like can be mentioned in addition to tissues collected from a living body. As a tissue collected from a living body, for example, a colon cancer tissue excised by surgery, a biopsy material used for endoscopic examination before surgery, and the like are preferably used in terms of effective use of a sample.
（ＭＧＭＴ遺伝子の抽出）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料は、ブレンダーを用いて組織を破砕し、次いで、フェノール・クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、ＭＧＭＴ遺伝子を抽出し、検査用試料として用いる。
(Extraction of MGMT gene)
The human sample used in the test method of the present invention is disrupted by using a blender, and then the MGMT gene is extracted by a known gene extraction method such as the phenol / chloroform method and used as a test sample. .
（ＭＧＭＴ遺伝子の修飾）
前記ＭＧＭＴ遺伝子は重亜硫酸塩によって修飾される。これにより、メチル化されたシトシンは、シトシンのまま存在するが、メチル化されていないシトシンは、一旦ウラシルに転換された後、チミンとして発現することになる。本発明に使用される重亜硫酸塩は特に限定されないが、重亜硫酸ナトリウムが好適に用いられる。
(Modification of MGMT gene)
The MGMT gene is modified with bisulfite. As a result, methylated cytosine remains as cytosine, but unmethylated cytosine is once converted to uracil and then expressed as thymine. The bisulfite used in the present invention is not particularly limited, but sodium bisulfite is preferably used.
（具体的な修飾方法等）
まず、２００ｐｇから５０μｇのＤＮＡをアルカリ条件下にて変性させる。変性の条件は、ＰＣＲの測定系に適した条件であればよいが、例えば、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＯＨ溶液中にて、３７℃で５〜３０分インキュベーションさせる。次いで、ハイドロキノン溶液及びｐＨ５．０の重亜硫酸ナトリウム溶液を終濃度がそれぞれ０．５ｍＭ及び３．１ｍＭになるように添加し、５０〜５５℃にて１６〜４０時間インキュベートすることで、非メチル化シトシンが修飾される。さらに、段階的な透析を行うことで余剰の重亜硫酸を除去する。透析された試料は、真空オーブンによる濃縮又はエタノール沈殿の後、適当な緩衝液又は純水に溶解し、通常のＰＣＲ又はメチル化特異的ＰＣＲに用いることができる。
(Specific modification method etc.)
First, 200 pg to 50 μg of DNA is denatured under alkaline conditions. The denaturation condition may be any condition suitable for the PCR measurement system. For example, the denaturation is carried out in a 0.2 M to 0.3 M NaOH solution at 37 ° C. for 5 to 30 minutes. Subsequently, a hydroquinone solution and a sodium bisulfite solution having a pH of 5.0 are added so that the final concentrations are 0.5 mM and 3.1 mM, respectively, and incubated at 50 to 55 ° C. for 16 to 40 hours, thereby being unmethylated. Cytosine is modified. Furthermore, excess bisulfite is removed by performing gradual dialysis. The dialyzed sample is concentrated in a vacuum oven or ethanol precipitated, dissolved in an appropriate buffer or pure water, and can be used for normal PCR or methylation-specific PCR.
（遺伝子・核酸増幅）
本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。好ましくは、ＰＣＲ法が用いられる。
ＰＣＲ法により増幅された産物の塩基配列を決定する方法としては、Frommer et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1827-1831(1992))及び、Clark et. al. (Nucleic Acids Research 22, 2990-2997 (1994))等の方法がある。
(Gene / Nucleic acid amplification)
In the present invention, a known method can be used as a gene amplification method, and examples thereof include a PCR method, a NASBA method, a LAMP method, and the like. Preferably, the PCR method is used.
As a method for determining the base sequence of the product amplified by the PCR method, Frommer et. Al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1827-1831 (1992)) and Clark et. Al. (
（ＭＧＭＴ遺伝子の検出）
メチル化特異的ＰＣＲによって増幅されたＭＧＭＴ遺伝子の検出は、一般的なアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ＭＧＭＴ遺伝子の染色によって検出される。染色方法としては、銀染色による方法、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＲ Ｇｒｅｅｎ等の蛍光性染色剤等による方法がある。また、電気泳動以外の方法として、５’エキソヌクレアーゼアッセイや蛍光共鳴エネルギー転移を利用したホモジニアス検出も可能である。
(Detection of MGMT gene)
Detection of the MGMT gene amplified by methylation-specific PCR is detected by staining the MGMT gene after general agarose gel or polyacrylamide gel electrophoresis. Examples of the staining method include silver staining, ethidium bromide, SYBRR Green, and other fluorescent staining agents. As a method other than electrophoresis, homogeneous detection using a 5 ′ exonuclease assay or fluorescence resonance energy transfer is also possible.
（ＭＧＭＴの免疫染色）
本発明の検査方法は、前記ＭＳＩ分析に加えて、ＭＧＭＴの免疫染色分析（ＩＨＣ）を併用することにより、メチル化の有無をさらに精度よく識別することできる。ＭＧＭＴの免疫染色分析においては、ＣｐＧ領域がメチル化されていれば、ＭＧＭＴが発現されにくくなり、免疫染色において陰性となる率が高くなる。一方、ＣｐＧ領域がメチル化されていなければ、ＭＧＭＴは発現されやすくなるので、免疫染色において陽性となる率が高くなる。ＭＧＭＴの免疫染色分析においては、抗体としてＭＧＭＴのモノクローナル抗体を用い、色素としてダイアミノベンチジン（diaminobenzidine）を用いるのが好適である。
(MGMT immunostaining)
The test method of the present invention can identify the presence or absence of methylation more accurately by using together with the MSI analysis, an immunostaining analysis (IHC) of MGMT. In the immunostaining analysis of MGMT, if the CpG region is methylated, MGMT becomes difficult to be expressed, and the rate of negative in immunostaining increases. On the other hand, if the CpG region is not methylated, MGMT is easily expressed, and the rate of positive in immunostaining increases. In the immunostaining analysis of MGMT, it is preferable to use an MGMT monoclonal antibody as an antibody and diaminobenzidine as a dye.
（検査用試薬及び検査用試薬キット）
本発明はまた、組織中のＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域におけるＣｐＧのシトシンのメチル化を検出する方法に用いられる検査試薬キットを含む。検査試薬としては、メチル化特異的核酸増幅用のプライマー、エキソヌクレアーゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。
(Inspection reagents and inspection reagent kits)
The present invention also includes a test reagent kit for use in a method for detecting cytosine methylation of CpG in the CpG region of the MGMT gene in tissue. The test reagent may be any reagent used in the method of the present invention, such as a primer for amplifying methylation-specific nucleic acid, an exonuclease, and a label for detecting nucleic acid.
また、検査用試薬キットは、本発明の検出方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであればよい。例えば、ＭＧＭＴ遺伝子（ＤＮＡ）のＣｐＧ領域のメチル化特異的プライマーとメチル化非特異的プライマーセット等が例示される。その他、蛍光標識をプローブしたＤＮＡも本キットに含めてもよい。 Moreover, the test reagent kit should just use at least 2 or more as a kit among all the reagents used for the detection method of this invention. For example, a methylation specific primer and a non-methylation specific primer set of the CpG region of the MGMT gene (DNA) are exemplified. In addition, a DNA probed with a fluorescent label may be included in the kit.
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１）
具体的な実施例として、大腸癌と診断された２２３症例の癌患者について、ＭＧＭＴ遺伝子のプロモーター領域のシトシンのメチル化の状態を調べた。これら被検体生体試料は手術切除後直ちに−８０℃にて凍結保存した。
(Example 1)
As a specific example, the state of cytosine methylation in the promoter region of the MGMT gene was examined for 223 cancer patients diagnosed with colorectal cancer. These specimen biological samples were stored frozen at −80 ° C. immediately after surgical resection.
生体試料からＭＧＭＴ遺伝子は、通常のフェノール・クロロフォルム法で抽出した。 The MGMT gene was extracted from the biological sample by the usual phenol / chloroform method.
生体試料より抽出したＭＧＭＴ遺伝子１μｇをＤＮＡ修飾キット「ＣｐＧｅｎｏｍｅ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）」を用いて重亜硫酸ナトリウムによる非メチル化シトシンの修飾を行った。 1 μg of MGMT gene extracted from a biological sample was modified with unmethylated cytosine with sodium bisulfite using a DNA modification kit “CpGenome (Intergen)”.
ＭＧＭＴのプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するために、以下の４つの核酸増幅用プライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅した。
ＮＳ−Ｓ：ＧＡＧＧＡＴＧＩＧＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＴ（配列番号２）
Ｐ１−ＡＳ：ＡＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＣＧ（配列番号３）
Ｐ２−Ｓ：ＴＴＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号４）
ＮＳ−ＡＳ：ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＩＣＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ（配列番号５）
ここに、配列番号２で表されるＮＳ−Ｓは、メチル化シトシン非特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８０２から８２５に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号３で表されるＰ１−ＡＳは、メチル化シトシン特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８７６から９０１に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号４で表されるＰ２−Ｓは、メチル化シトシン特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１０７０から１０９２に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号５で表されるＮＳ−ＡＳは、メチル化シトシン非特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１１８２から１２０６に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
上記、塩基の番号は、ＨＳＭＥＴＤＭＥＴ及びＨＳＵ９５０３８から引用された塩基番号に従った。
また、ＮＳ−Ｓにおいては、イノシン酸の代わりにシトシンとチミンの混合塩基を用いてもよく、ＮＳ−ＡＳにおいては、イノシン酸の代わりにグアニンとアデニンの混合塩基を用いてもよい。
In order to detect cytosine methylation in the two CpG regions of the MGMT promoter region, nucleic acids were amplified by the nucleic acid amplification method using the following four nucleic acid amplification primers.
NS-S: GAGGATGIGTAGTAGTTTTTAGGT (SEQ ID NO: 2)
P1-AS: AACTAAAAACGAAACCCCGAACGAAACG (SEQ ID NO: 3)
P2-S: TTTCGACGGTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 4)
NS-AS: AAAATAAAACICCTACAAAAACCACT (SEQ ID NO: 5)
Here, NS-S represented by SEQ ID NO: 2 is a methylated cytosine non-specific primer, recognizes a site corresponding to the base sequence 802 to 825 of the MGMT gene, and binds to that gene.
P1-AS represented by SEQ ID NO: 3 is a methylated cytosine-specific primer, recognizes a site corresponding to the base sequence 876 to 901 of the MGMT gene, and binds to that gene.
P2-S represented by SEQ ID NO: 4 is a methylated cytosine-specific primer that recognizes a site corresponding to the base sequence 1070 to 1092 of the MGMT gene and binds to that gene.
NS-AS represented by SEQ ID NO: 5 is a methylated cytosine non-specific primer, which recognizes a site corresponding to the base sequence 1182 to 1206 of the MGMT gene and binds to that gene.
The base numbers were in accordance with the base numbers quoted from HSMETDMET and HSU95038.
In NS-S, a mixed base of cytosine and thymine may be used instead of inosinic acid, and in NS-AS, a mixed base of guanine and adenine may be used instead of inosinic acid.
重亜硫酸修飾済みのＭＧＭＴ遺伝子の一部を１倍のＰＣＲ緩衝液（１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）、１．２５ＵのＤＮＡポリメラーゼ「Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎｎ−Ｅｌｍｅｒ社）」、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、０．４ｍＭのＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳ、０．２ｍＭのＰ１−ＡＳ、Ｐ２−Ｓを含む５０μｌのＰＣＲ反応液に加え、９５℃／０．５分、５８℃／０．５分、７２℃／０．５分、３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。 A part of the bisulfite-modified MGMT gene was mixed with 1 × PCR buffer (containing 15 mM MgCl 2 ), 1.25 U DNA polymerase “Ampli-TaqGold (Perkinn-Elmer)”, 200 μM each of dATP, dGTP, In addition to 50 μl of a PCR reaction solution containing dTTP, dCTP, 0.4 mM NS-S, NS-AS, 0.2 mM P1-AS, P2-S, 95 ° C./0.5 minutes, 58 ° C./0.0. PCR reaction was performed for 5 minutes, 72 ° C./0.5 minute, 35 cycles.
（ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の判断）
生体試料から抽出されたＭＧＭＴ遺伝子を用いた場合はＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無によらず、メチル化シトシン非特異的プライマーであるＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成される。
（メチル化されたシトシンを含まない場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のいずれにも、シトシンのメチル化がなければ、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成される。
（５’−側の領域のＣｐＧ領域のみにメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の５’−側の領域のＣｐＧ領域のみに、シトシンのメチル化があれば、ＮＳ−Ｓ、Ｐ１−ＡＳよって、９６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計２種の伝子増幅産物が生成される。
（３’−側の領域のＣｐＧ領域のみにメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の３’−側の領域のＣｐＧ領域のみに、シトシンのメチル化があれば、Ｐ２−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、１３６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計２種の伝子増幅産物が生成される。
（２つのＣｐＧ領域のいずれにもメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の５’−側の領域のＣｐＧ領域にも、３’−側の領域のＣｐＧ領域にもシトシンのメチル化があれば、ＮＳ−Ｓ、Ｐ１−ＡＳよって、９６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、Ｐ２−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、１３６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計３種の遺伝子増幅産物が生成される。
(Judgment of cytosine methylation in CpG region)
When MGMT gene extracted from a biological sample is used, a 404 bp gene amplification product is produced by NS-S and NS-AS, which are non-specific primers for methylated cytosine, regardless of the presence or absence of methylation of cytosine in the CpG region. Generated.
(Without methylated cytosine)
If there is no cytosine methylation in any of the two CpG regions of the promoter region described above, a 404 bp gene amplification product is generated by NS-S and NS-AS.
(When only the CpG region of the 5′-side region contains methylated cytosine)
If there is cytosine methylation only in the CpG region at the 5′-side of the two CpG regions of the promoter region described above, a 96 bp gene amplification product is generated by NS-S and P1-AS, and NS− By S, NS-AS, a gene amplification product of 404 bp is generated, and a total of two kinds of gene amplification products are generated.
(When only the CpG region of the 3′-side region contains methylated cytosine)
If cytosine methylation is present only in the
(When both of the two CpG regions contain methylated cytosine)
If there is cytosine methylation in the CpG region of the 5′-side region and the CpG region of the 3′-side region of the two CpG regions of the promoter region described above, NS-S, P1-AS A 96 bp gene amplification product is generated, a 136 bp gene amplification product is generated by P2-S and NS-AS, a 404 bp gene amplification product is generated by NS-S and NS-AS, and a total of three genes An amplification product is generated.
実際に生体試料を用いて、メチル化を検出した例を図３に示す。
これによると、Ｕで表されるレーンにおいては、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物のみが検出され、Ｐ１で表されるレーンにおいては、９６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の２種が検出され、Ｐ２で表されるレーンにおいては、１３６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の２種が検出され、Ｆで表されるレーンにおいては、９６ｂｐと、１３６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の３種が検出された。このように、本実施例においては、プロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を１度の操作で検出することができた。また、４０４ｂｐに対する、９６ｂｐ又は１３６ｂｐの断片の強度を比較することにより、試料のメチル化の度合いを判断することができた。
An example in which methylation is actually detected using a biological sample is shown in FIG.
According to this, in the lane represented by U, only a 404 bp gene amplification product was detected, and in the lane represented by P1, two kinds of 96 bp and 404 bp gene amplification products were detected and represented by P2. In the lane, two types of gene amplification products of 136 bp and 404 bp were detected, and in the lane represented by F, three types of gene amplification products of 96 bp, 136 bp, and 404 bp were detected. Thus, in this Example, cytosine methylation in the two CpG regions of the promoter region could be detected by a single operation. Further, the degree of methylation of the sample could be judged by comparing the intensity of the 96 bp or 136 bp fragment with respect to 404 bp.
（メチル化と免疫染色分析）
上記の方法による、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の検出方法により、メチル化の有無を判定した試料（メチル化有り：３２症例、メチル化なし：６１症例）に対し、免疫染色分析を行った。結果を表１に示す。
(Methylation and immunostaining analysis)
Immunostaining analysis was performed on the samples (with methylation: 32 cases, without methylation: 61 cases) determined for the presence or absence of methylation by the MGMT gene methylation detection method according to the above method. The results are shown in Table 1.
表２により、メチル化されたＭＧＭＴ遺伝子においては、ＭＧＭＴの発現の割合が低いのに対し、メチル化されないＭＧＭＴ遺伝子においては、ＭＧＭＴの発現の割合が高いことが分かる。 Table 2 shows that the MGMT gene expression rate is low in the methylated MGMT gene, whereas the MGMT gene expression rate is high in the non-methylated MGMT gene.
免疫染色の例を図６に示す。Ａは腫瘍組織のもので、完全に陰性であった。Ｂは腫瘍組織のもので左側が陽性、右側が陰性であった。Ｃは腫瘍組織であり、陽性部分と陰性部分が混在していた。Ｄは非腫瘍細胞のもので、陰性であった。 An example of immunostaining is shown in FIG. A was from tumor tissue and was completely negative. B was from a tumor tissue, positive on the left and negative on the right. C is a tumor tissue, and a positive part and a negative part were mixed. D was non-tumor cell and was negative.
（塩基配列との関係）
大腸癌患者３５症例の、腫瘍組織と正常粘膜のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化を、直接塩基配列決定法（ダイレクト・シークエンス法）により調べた。
(Relationship with nucleotide sequence)
The methylation of 66 CpG regions of the MGMT promoter region (No. 713 to No. 1168) of tumor tissue and normal mucosa in 35 colorectal cancer patients was examined by direct nucleotide sequencing (direct sequence method).
腫瘍組織のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化をメチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出したものを図５上欄に示し、正常粘膜のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化を上記と同様のプライマーを用いて検出したもの図５下欄に示す。
これによると、腫瘍組織ではＣ領域を除く全域でメチル化されているのに対し、正常粘膜においても、比較的低い割合であるが、Ｃ領域を除く全域でメチル化されていることが分かった。また、一部にはＣ領域の前後のどちらかのＣｐＧ領域にしかメチル化の認められない検体も認められた。
即ち、このことは、腫瘍組織であれ、正常粘膜であれ、Ｃ領域をは挟む２つのＣｐＧ領域のどちらかにメチル化があれば、当該プロモーター領域（７１３番から１１６８番）のＣ領域を除く全域でメチル化されている可能性が高いことを示している。よって、この意味において、本発明に係るＭＧＭＴ遺伝子の２つ以上のＣｐＧ領域における、各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の１回検出は、癌の診断方法において、重要な意義を有すると考えられる。
非メチル化シトシン特異的プライマーを用いた場合、メチル化シトシン特異的プライマーにてメチル化を認めた検体においても、メチル化はほとんど検出できなかった。これは、腫瘍が不均一であることを示している。
The detection of methylation of 66 CpG regions in the MGMT promoter region (No. 713 to 1168) of the tumor tissue using a methylated cytosine-specific primer is shown in the upper column of FIG. 5, and the MGMT promoter region of normal mucosa Methylation of 66 CpG regions (Nos. 713 to 1168) detected using the same primer as shown above is shown in the lower column of FIG.
According to this, it was found that the tumor tissue was methylated throughout the region excluding the C region, whereas the normal mucosa was methylated throughout the region excluding the C region, although at a relatively low rate. . In addition, some of the samples were found to have methylation only in one of the CpG regions before and after the C region.
That is, this indicates that the C region of the promoter region (from 713 to 1168) is excluded if there is methylation in either of the two CpG regions sandwiching the C region, whether it is tumor tissue or normal mucosa. This indicates that there is a high possibility that the entire region is methylated. Therefore, in this sense, one-time detection of cytosine methylation in each CpG region in two or more CpG regions of the MGMT gene according to the present invention is considered to have important significance in a method for diagnosing cancer. .
When an unmethylated cytosine-specific primer was used, methylation was hardly detected even in samples in which methylation was observed with the methylated cytosine-specific primer. This indicates that the tumor is heterogeneous.
直接塩基配列決定法（ダイレクト・シークエンス法）による例を図４（ａ）及（ｂ）に示す。メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出したものはＭレーンに、非メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出したものはＵレーンに示されている。
これによると、１１１Ｔ、１７５Ｔの腫瘍組織では、メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出した場合、メチル化は完全に起きている部分もあれば、メチル化が不完全に起こっている部分もあることが示されている。非メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出した場合、メチル化は検出さていない。また、Ｓ１０Ｔではメチル化シトシン特異的プライマー、非メチル化シトシン特異的プライマーを用いてもメチル化はまったく認められていない。Ｓ１０ＴのＭレーンの矢印はメチル化シトシン特異的プライマーのメチル化特異的シトシンを示している。
Examples of direct base sequence determination (direct sequence method) are shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b). Those detected using a methylated cytosine specific primer are shown in the M lane, and those detected using an unmethylated cytosine specific primer are shown in the U lane.
According to this, in the tumor tissues of 111T and 175T, when detected using a methylated cytosine-specific primer, there is a part where methylation is completely caused and a part where methylation is caused incompletely. It has been shown. Methylation is not detected when detected using unmethylated cytosine specific primers. In S10T, no methylation was observed even when using a methylated cytosine-specific primer or an unmethylated cytosine-specific primer. The arrow in the M10 lane of S10T indicates the methylation specific cytosine of the methylated cytosine specific primer.
（他の遺伝子のメチル化の関係）
大腸癌２２３症例につき、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３、ｐ１６遺伝子のメチル化との相関を調べた。結果を表２に示す。
(Relationship of methylation of other genes)
For 223 cases of colorectal cancer, the correlation with MINT2, MINT3, and p16 gene methylation was examined. The results are shown in Table 2.
これによると、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化とＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、ｐ１６遺伝子のメチル化は統計的には乖離していることがわかる。一方、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、ｐ１６遺伝子の各遺伝子のメチル化との間には相関関係があることが分かる。 This shows that the methylation of the MGMT gene and the methylation of the MINT2, MINT31, and p16 genes are statistically different. On the other hand, it can be seen that there is a correlation between the methylation of each of the MINT2, MINT31, and p16 genes.
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、コドン１３の突然変異との相関を調べた。結果を表３に示す。
The correlation with mutations in
これによると、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３、ｐ１６遺伝子のメチル化との間の相関関係以上に、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、コドン１３の突然変異の間には相関があることが分かる。
This shows that there is a correlation between the methylation of the MGMT gene and the mutations of
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、コドン１３の突然変異の検出例を図７（Ａ及びＢ）に示す。変異があるものをＭｔ、変異がないものをＷｔ、腫瘍組織由来のものをＴ、正常組織由来のものをＮとした。Ｍｔでは２つの断片が検出され、突然変異が起こっているのに対し、Ｗｔでは１つの断片が検出され、突然変異が起こっていないことが分かった。
Examples of detection of mutations in
ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、ｐ１６遺伝子のメチル化（１箇所のＣｐＧ領域）の検出例を図７（Ｃ）に示す。腫瘍組織由来のものをＴ、正常組織由来のものをＮとした。その結果、２つの断片が検出されたものは、メチル化されているとしてＭで示し、１つの断片が検出されたものは、メチル化されていないとしてＵで示している。このように、メチル化が検出されたものは、ほとんどが腫瘍組織由来のものであることが分かった。 FIG. 7C shows an example of detection of methylation (one CpG region) of the MINT2, MINT31, and p16 genes. The tumor tissue-derived one was designated as T, and the normal tissue-derived one as N. As a result, those in which two fragments were detected were indicated by M as being methylated, and those in which one fragment was detected were indicated by U as not being methylated. Thus, it was found that most of those in which methylation was detected were derived from tumor tissue.
腫瘍の段階とＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の頻度との関係を、図８に示す。Ａでは、ＴＮＭ段階１から４（図８中ではギリシャ数字で表示し、数字が大きいほど腫瘍が進行している。）、Ｂでは、進行度Ｔ１からＴ４（数字が大きいほど腫瘍が進行している。）におけるメチル化の度合いを表しており、白はメチル化なし、点部は部分的メチル化、斜線部は、完全メチル化を示す。この結果、腫瘍の進行が進むほどメチル化の度合いはむしろ低くなることが分かった。ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化は、腫瘍の発生に密接な関係があるとされるが、腫瘍の進行には、むしろ阻害的に作用する可能性もあることが分かる。 FIG. 8 shows the relationship between the tumor stage and the frequency of MGMT gene methylation. In A, TNM stages 1 to 4 (indicated in Greek numerals in FIG. 8, the tumor progresses as the number increases), and in B, the tumor progresses from T1 to T4 (the number increases as the number increases). The white represents no methylation, the point represents partial methylation, and the shaded portion represents complete methylation. As a result, it was found that the degree of methylation becomes rather low as the tumor progresses. MGMT gene methylation is thought to be closely related to tumor development, but it can be seen that it may also act in an inhibitory manner on tumor progression.
本発明の核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＭＧＭＴ遺伝子のメチル化検出キットの製造は、製薬業界、バイオテクノロジーの分野などで利用することができる。本発明のＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の検出方法、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＭＧＭＴ遺伝子のメチル化検出キット、医療業において有用に利用することができる。 The production of the nucleic acid amplification primer, nucleic acid amplification primer set, and MGMT gene methylation detection kit of the present invention can be used in the pharmaceutical industry, biotechnology field, and the like. The MGMT gene methylation detection method of the present invention, a nucleic acid amplification primer, a nucleic acid amplification primer set, a MGMT gene methylation detection kit for use in this detection method, and the MGMT gene methylation detection kit can be usefully used in the medical industry.
Claims (10)
ＭＧＭＴをコードする遺伝子に修飾剤を接触させることにより、メチル化されていないシトシンを修飾する工程、
メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーとして、配列番号３で表されるメチル化シトシン特異的上流プライマー（Ｐ１−ＡＳ）及び配列番号４で表されるメチル化シトシン特異的下流プライマー（Ｐ２−Ｓ）と、
メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーとして、ＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ１−ＡＳより上流に結合するメチル化シトシン非特異的上流プライマー及びＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ２−Ｓより下流に結合するメチル化シトシン非特異的下流プライマーであって、メチル化シトシン非特異的上流プライマーとメチル化シトシン非特異的下流プライマーとの増幅産物を形成しうる２つのプライマーと
からなる４つのプライマーを含むＰＣＲ反応液中で、当該ＭＧＭＴをコードする遺伝子の断片を核酸増幅する工程、及び
この増幅産物を検出する工程
を含むことを特徴とする検出方法。 A detection method of detecting methylation of cytosine in each CpG region of two or more CpG regions in a gene encoding MGMT in one operation,
The Rukoto contacting the modifying agent in a gene encoding a MGMT, step modifies cytosine unmethylated,
As a primer for amplifying methylated cytosine-specific nucleic acid , a methylated cytosine-specific upstream primer (P1-AS) represented by SEQ ID NO: 3 and a methylated cytosine-specific downstream primer (P2-S) represented by SEQ ID NO: 4 When,
Methylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer , methylated cytosine non-specific upstream primer that binds upstream from P1-AS of the gene encoding MGMT and methyl that binds downstream from P2-S of the gene encoding MGMT Two primers capable of forming an amplification product of a methylated cytosine non-specific upstream primer and a methylated cytosine non-specific downstream primer ,
A step of nucleic acid amplification of a fragment of a gene encoding the MGMT in a PCR reaction solution comprising four primers consisting of: and a step of detecting the amplification product
A detection method comprising :
（１）ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとからの増幅産物及びＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の２つのＤＮＡ断片であれば、ＭＧＭＴ遺伝子の上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない；(1) If there are two DNA fragments of an amplification product from NS-S and P1-AS and an amplification product from NS-S and NS-AS, cytosine in one CpG region upstream of the MGMT gene is methyl The cytosine of one downstream CpG region is not methylated;
（２）Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物及びＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の２つのＤＮＡ断片であれば、ＭＧＭＴ遺伝子の上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されている；(2) If there are two DNA fragments of the amplification product from P2-S and NS-AS and the amplification product from NS-S and NS-AS, cytosine in one CpG region upstream of the MGMT gene is methyl Not cytosine, and cytosine in one downstream CpG region is methylated;
（３）ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとからの増幅産物、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物及びＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の３つのＤＮＡ断片であれば、上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されている；(3) If it is three DNA fragments of the amplification product from NS-S and P1-AS, the amplification product from P2-S and NS-AS, and the amplification product from NS-S and NS-AS, The cytosine of the upstream 1 CpG region is methylated, and the cytosine of the downstream 1 CpG region is also methylated;
（４）ＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の１つのＤＮＡ断片のみであれば、上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されていない(4) If there is only one DNA fragment of the amplification product from NS-S and NS-AS, the cytosine in the upstream 1 CpG region is not methylated, and the cytosine in the downstream 1 CpG region is also Not methylated
と判定する工程をさらに含む、請求項３〜６のいずれか１項記載の検出方法。The detection method according to any one of claims 3 to 6, further comprising a step of determining that.
メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーとして、配列番号３で表されるメチル化シトシン特異的上流プライマー（Ｐ１−ＡＳ）及び配列番号４で表されるメチル化シトシン特異的下流プライマー（Ｐ２−Ｓ）と、As a primer for amplifying methylated cytosine-specific nucleic acid, a methylated cytosine-specific upstream primer (P1-AS) represented by SEQ ID NO: 3 and a methylated cytosine-specific downstream primer (P2-S) represented by SEQ ID NO: 4 When,
メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーとして、ＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ１−ＡＳより上流に結合するメチル化シトシン非特異的上流プライマー及びＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ２−Ｓより下流に結合するメチル化シトシン非特異的下流プライマーであって、メチル化シトシン非特異的上流プライマーとメチル化シトシン非特異的下流プライマーとの増幅産物を形成しうる２つのプライマーとMethylated cytosine non-specific nucleic acid amplification primer, methylated cytosine non-specific upstream primer that binds upstream from P1-AS of the gene encoding MGMT and methyl that binds downstream from P2-S of the gene encoding MGMT Two primers capable of forming an amplification product of a methylated cytosine non-specific upstream primer and a methylated cytosine non-specific downstream primer,
からなるプライマーセット。Primer set consisting of
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