JP4363986B2 - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Description

本出願は、３つの仮出願、米国特許出願第６０／３４３，３６３号（２００１年１２月２１日出願）、米国特許出願第６０／３４７，１８９号（２００２年１月８日出願）、米国特許出願第６０／３６４，２７２号（２００２年３月１２日出願）の優先権を主張し、それらの開示内容を本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は、タンパク質の精製、特にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いる精製に関する。

背景
プロテインＡおよびＧは、アフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製するためにしばしば用いられる。たとえばＲ．Ｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６；Ａｙｂａｙ ａｎｄ Ｉｍｉｒ（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（１−２）：７７−８１；Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ７５４：４２７−４３５参照。これらのタンパク質が有用であるのは、それらが多様な抗体の定常（Ｆｃ）部に結合するからである。ＩｇＧ抗体のＦｃ部を含む組換え融合タンパク質も、同様な方法で精製できる。

タンパク質を薬理学的用途のために製造する場合、有毒または免疫原性の混入物、たとえば他のタンパク質を除去することが重要である。特にプロテインＡは免疫原性であり、大量では有毒となる可能性がある。固体支持体に固定したプロテインＡを吸収剤として用いる場合、アフィニティークロマトグラフィーに際して若干のプロテインＡが試料中へ浸出する可能性がある。たとえばＢｅｎｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆ．３：３４７−３５１；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．７１（４）：４１１−４１３参照（両者の全体を本明細書に援用する）。

二重特異性モノクローナル抗体が、固体支持体に固定したプロテインＡを吸収剤として用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予備精製した後、ヒドロキシアパタイトに結合させてそれから溶離することにより、他の抗体から分離された。Ｔａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５９９：１３−２０；Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ７５４：４２７−４３５。モノクローナル抗体も、ヒドロキシアパタイトに結合させてそれから溶離された。Ａｈｍａｄ（１９９９），モノクローナル抗体精製のポリシング工程としてのセラミックヒドロキシアパタイト，ｔｈｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ ＃９の抄録，ブリティッシュコロンビア州ホイスラー。

本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを抗体その他のタンパク質の精製に用いるための簡略化した広く利用できる方法を提供する。

発明の概要
アフィニティークロマトグラフィーは、抗体およびＦｃ融合タンパク質などのタンパク質を精製するための有力な手段である。しかし、タンパク質を療法用として製造する場合は他のタンパク質の存在が問題であり、これにはアフィニティー吸収剤の一部として用いられ、アフィニティークロマトグラフィーに際して試料中へ浸出する可能性のあるタンパク質が含まれる。さらに、他のタンパク質混入物、たとえば精製されるタンパク質を産生する宿主細胞に由来するタンパク質が、試料中に存在する可能性もある。本発明は特に、最小限の操作を伴うフロースルー方式のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりこれらの問題を解決する、高収率の方法を提供する。

したがって本発明は１態様において、あるタンパク質を第２タンパク質から分離する方法であって、当該タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含む方法を提供する：その際（１）当該タンパク質は、固体支持体に固定された吸収剤としての第２タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予め精製されており、（２）第２タンパク質は抗体免疫グロブリン定常ドメインに結合でき、（３）使用条件下で当該タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合しないのに対し、第２タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合する。当該タンパク質は抗体のＦｃ部を含んでもよい。所望により、当該タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃであってもよい。第２タンパク質はプロテインＡまたはプロテインＧであってもよい。

本発明はさらに、あるタンパク質および少なくとも１種類のタンパク質混入物を含む試料から当該タンパク質を精製するための方法であって、試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含み、当該タンパク質を少なくとも１種類のタンパク質混入物から、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する溶液中でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離し、大部分の当該タンパク質分子はフロースルーおよび洗液中に回収され、当該タンパク質は、固体支持体に固定された吸収剤としての第２タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予め精製されており、そしてここで第２タンパク質は抗体免疫グロブリン定常ドメインに結合するものである方法を提供する。第２タンパク質は検出可能な濃度で試料中に存在し、または検出可能な濃度では存在せず、当該タンパク質を第２タンパク質から、使用溶液中でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離できる。当該タンパク質および少なくとも１種類のタンパク質混入物は、培養動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞により培地中へ分泌されたものであってもよい。当該タンパク質は抗体のＦｃ部を含んでもよく、たとえばＴＮＦＲ：Ｆｃまたは抗体であってもよい。第２タンパク質はプロテインＡおよびプロテインＧであってもよい。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行う溶液は、約５〜約５０ｍＭ濃度、所望により約１５〜約３５ｍＭ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液を含むことができ、約６．０〜約８．６のｐＨをもつことができる。

さらに本発明は他の態様において、組換え融合タンパク質を第２タンパク質から分離する方法であって、組換え融合タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含む方法を提供する：その際（１）組換え融合タンパク質は、固体支持体に固定された吸収剤としての第２タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予め精製されており、かつ（２）組換え融合タンパク質は抗体のＦｃ部および非抗体タンパク質の部分または全体を含む。１態様において、組換え融合タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃであってもよい。

さらに他の態様において本発明は、組換え融合タンパク質を第２タンパク質から分離する方法であって、組換え融合タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含む方法をさらに包含する：その際（１）使用条件下で、組換え融合タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合せず、第２タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合し、（２）組換え融合タンパク質は、固体支持体に固定された吸収剤としての第２タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予め精製されており、かつ（３）組換え融合タンパク質は抗体のＦｃ部を含む。

他の態様において本発明は、組換え融合タンパク質および少なくとも１種類のタンパク質混入物を含む試料から組換え融合タンパク質を精製する方法であって、試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含み、組換え融合タンパク質は抗体のＦｃ部および非抗体タンパク質の部分または全体を含み、組換え融合タンパク質は固体支持体に固定された吸収剤としての第２タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予め精製されている方法を提供する。大部分の組換え融合タンパク質分子を、フロースルーおよび洗液中に回収できる。組換え融合タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃであってもよく、第２タンパク質はプロテインＡまたはプロテインＧであってもよい。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、所望により約５〜約５０ｍＭまたは約１５〜約３５ｍＭの濃度の、そして所望によりｐＨ約６．０〜約８．６の、リン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中で実施できる。組換え融合タンパク質および／または少なくとも１種類のタンパク質混入物は、培養動物細胞、所望によりＣＨＯ細胞により培地中へ分泌されたものであってもよい。さらに他の態様において本発明は、ＴＮＦＲ：ＦｃをプロテインＡから分離する方法であって、固体支持体に固定された吸収剤としてのプロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、ＴＮＦＲ：Ｆｃをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含む方法を提供する。

さらに他の態様において本発明は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを精製する方法であって、大部分のＴＮＦＲ：Ｆｃ分子がフロースルーおよび洗液中に回収される条件下で、ＴＮＦＲ：Ｆｃおよび少なくとも１種類のタンパク質混入物を含む試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含む方法を提供する。

他の態様は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを精製する方法であって、ＴＮＦＲ：Ｆｃがヒドロキシアパタイトに結合しない条件下でＴＮＦＲ：Ｆｃをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理し、これによりＴＮＦＲ：Ｆｃが少なくとも１種類のタンパク質混入物から分離されることを含む方法を提供する。

本発明はさらに他の態様において、組換え融合タンパク質を宿主細胞タンパク質から分離する方法であって、組換え融合タンパク質を含む試料をヒドロキシアパタイトに装填し、組換え融合タンパク質がヒドロキシアパタイトに結合しない条件下で組換え融合タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理し、組換え融合タンパク質を含む試料をフロースルーおよび洗液中に回収することを含む方法を提供する。

さらに他の態様においては、あるタンパク質を宿主細胞タンパク質から分離する方法であって、当該タンパク質および少なくとも１種類の宿主細胞タンパク質を含む試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含み、これにより当該タンパク質を少なくとも１種類の宿主細胞タンパク質から分離し、当該タンパク質は抗体免疫グロブリン定常ドメインを含み、大部分の当該タンパク質分子がフロースルーおよび洗液中に回収され、そして当該タンパク質および宿主細胞タンパク質が両方とも、培養動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞により培地中へ分泌されたものである、前記方法を提供する。宿主細胞タンパク質の濃度は約１００ｐｐｍ未満であってよく、当該タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃであってもよい。

本発明は、精製されたＴＮＦＲ：Ｆｃ調製物であって、３ｐｐｍ未満のプロテインＡおよび１００ｐｐｍ未満の宿主動物細胞タンパク質、所望により２ｐｐｍ未満のプロテインＡおよび／または７５ｐｐｍ未満の宿主動物細胞タンパク質を含む調製物をも提供する。

発明の詳細な説明
定義
吸収剤：吸収剤は、固体支持体に固定した少なくとも１種類の分子、またはそれ自体が固体である少なくとも１種類の分子であって、クロマトグラフィーを実施するのに用いられるものである。

アフィニティークロマトグラフィー：アフィニティークロマトグラフィーは、クロマトグラフィー分離を行うために、分子の一般的な特性、たとえば等電点、疎水性またはサイズではなく、生体分子間の特異的な可逆的相互作用、たとえばプロテインＡがＩｇＧ抗体のＦｃ部に結合する能力、を利用するクロマトグラフィーである。実際には、アフィニティークロマトグラフィーは吸収剤、たとえば固体支持体に固定したプロテインＡを用いて、より強くまたはより弱く吸収剤に結合する分子をクロマトグラフィー分離することを伴う。Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３５７−３７９参照；その全体を本明細書に援用する。

抗体：抗体はタンパク質またはタンパク質複合体であり、それぞれが少なくとも１つの抗体免疫グロブリン可変ドメインおよび少なくとも１つの抗体免疫グロブリン定常ドメインを含む。抗体は一本鎖抗体、二量体抗体、またはいずれかの高次タンパク質複合体であってよく、これにはヘテロ二量体抗体が含まれるが、これらに限定されない。

クロマトグラフィー：クロマトグラフィーは、異なる分子をより強くまたはより弱く吸収または保持する吸収剤に混合物を浸透させることにより、混合物中の化学的に異なる分子を互いに分離するものである。吸収剤によって最も弱く吸収または保持される分子は、より強く吸収または保持される分子が放出されない条件下で、吸収剤から放出される。

抗体免疫グロブリン定常ドメイン：抗体免疫グロブリン定常ドメインは、ヒトまたは動物由来のＣ_L、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３またはＣ_H４ドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインである。たとえばＣｈａｒｌｅｓ Ａ Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｊ．Ｄｏｎａｌｄ Ｃａｐｒａ，免疫グロブリン：構造と機能，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，２０９，２１０−２１８（１９８９）参照；その全体を本明細書に援用する。

混入物：混入物は、精製されるタンパク質の試料中に存在する、精製されるタンパク質以外の異質または不都合な分子、特に生体高分子、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質である。混入物には、たとえば精製されるタンパク質を分泌する細胞に由来する他のタンパク質、またはアフィニティークロマトグラフィーに用いた吸収剤の一部であってアフィニティークロマトグラフィーに際して試料中へ浸出しうるプロテインＡなどのタンパク質が含まれる。

抗体のＦｃ部：抗体のＦｃ部には、ヒトまたは動物の免疫グロブリンドメインＣ_H２およびＣ_H３またはこれらと実質的に類似する免疫グロブリンドメインが含まれる。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するための抗体Ｆｃ部の生物学的活性は、抗体の天然Ｆｃ部に結合する第２タンパク質、たとえばプロテインＡまたはプロテインＧによる結合能である。考察については、Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，前掲，２１２−２１３参照。

宿主細胞タンパク質：宿主細胞タンパク質は、精製すべきタンパク質をコードするＤＮＡを導入した宿主細胞の天然ゲノムによりコードされるタンパク質である。宿主細胞タンパク質は、精製すべきタンパク質の混入物となる可能性があり、そのレベルを精製により低下させることができる。宿主細胞タンパク質は、特にゲル電気泳動と染色および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含めた、いずれか適切な方法でアッセイできる。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトを吸収剤として用いるクロマトグラフィーである。たとえばＭａｒｉｎａ Ｊ．Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ（１９９０），ヒドロキシアパタイトカラムによるタンパク質クロマトグラフィー，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｕｒｒａｙ Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３２９−３３９参照；その全体を本明細書に援用する。

ＩｇＧ抗体：本発明の目的に関して、ＩｇＧ抗体は少なくとも１つのγタイプ免疫グロブリン定常ドメインを含む抗体である。考察については、Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，前掲，２２６参照。

ポリペプチド：本発明の目的に関して、”ポリペプチド”は”タンパク質”と互換性をもって用いられる。
タンパク質：タンパク質は、ペプチド結合により連結した少なくとも５個のアミノ酸の鎖である。

プロテインＡ：プロテインＡは、最初にブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であって、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合するものである。本発明の目的に関して、”プロテインＡ”はブドウ球菌プロテインＡと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質であり、市販および／または組換え型のプロテインＡも含まれる。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するためのプロテインＡの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。

プロテインＧ：プロテインＧは、最初に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であって、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合するものである。本発明の目的に関して、”プロテインＧ”は連鎖球菌プロテインＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質であり、市販および／または組換え型のプロテインＧも含まれる。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するためのプロテインＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。

プロテインＬＧ：プロテインＬＧは、ＩｇＧ抗体に結合する組換え融合タンパク質であって、プロテインＧ（前記の定義を参照）とプロテインＬの両方の一部を含む。プロテインＬは、最初にペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁から単離された。プロテインＬＧはプロテインＬとＧの両方に由来するＩｇＧ結合ドメインを含む。Ｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６参照；その全体を本明細書に援用する。本発明の目的に関して、”プロテインＬＧ”はプロテインＬＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質であり、市販および／または組換え型のプロテインＬＧも含まれる。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するためのプロテインＬＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。

精製する：タンパク質を精製することは、タンパク質試料中に存在する可能性のある異質または不都合な要素、特にタンパク質またはＤＮＡなどの生体高分子の量を減らすことを意味する。異質タンパク質の存在は、ゲル電気泳動と染色および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含めた、いずれか適切な方法でアッセイできる。ＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動と染色および／またはポリメラーゼ連鎖反応を用いるアッセイを含めた、いずれか適切な方法でアッセイできる。

組換え融合タンパク質：組換え融合タンパク質は、それらの天然状態では融合していない２以上のタンパク質の部分または全体を含むいずれかのタンパク質である。そのようなタンパク質の例には、抗体のＦｃ部に融合したＮＦ−κＢのヒト受容体アクチベーター（ｈｕＲＡＮＫ：Ｆｃ）、抗体のＦｃ部に融合した内膜内皮細胞キナーゼ−δ（ＴＥＫδ：Ｆｃ）、および抗体のＦｃ部に融合した腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）が含まれるが、これらに限定されない。

分離する：少なくとも大部分のタンパク質分子が少なくとも大部分の第２タンパク質分子を含む混合物部分から分離されるような操作を、両タンパク質を含む混合物に施した場合、当該タンパク質は混合物中の第２タンパク質から分離される。

実質的に類似：本発明の目的に関して、タンパク質のアミノ酸配列が互いに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、かつ変化していないタンパク質の生物学的活性を保持するか、または望ましい様式で活性が変化している場合、それらのタンパク質は実質的に類似する。タンパク質が実質的に類似するかを判定する目的について同一とみなされるアミノ酸に含まれるのは、生物学的活性に影響を与える可能性がない保存的置換であり、下記のものが含まれる：ＡｌａがＳｅｒを、ＶａｌがＩｌｅを、ＡｓｐがＧｌｕを、ＴｈｒがＳｅｒを、ＡｌａがＧｌｙを、ＡｌａがＴｈｒを、ＳｅｒがＡｓｎを、ＡｌａがＶａｌを、ＳｅｒがＧｌｙを、ＴｙｒがＰｈｅを、ＡｌａがＰｒｏを、ＬｙｓがＡｒｇを、ＡｓｐがＡｓｎを、ＬｅｕがＩｌｅを、ＬｅｕがＶａｌを、ＡｌａがＧｌｕを、ＡｓｐがＧｌｙを置換、およびこれらの逆の交換。たとえばＮｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７９）参照。２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚検査と数学的計算により判定できる。あるいは、より好ましくはコンピュータープログラム、たとえばＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；ワイオミング州マディソン）ウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０ プログラム’ＧＡＰ’（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）またはこれに匹敵する他のコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することにより、比較を行う。’ＧＡＰ’プログラムに好ましいデフォルトパラメーターには下記のものが含まれる：（１）Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ（（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）の重み付きアミノ酸比較マトリックス：Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ編，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）により記載、または匹敵する他の比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の各ギャップにつきペナルティ３０、そして各ギャップ内の各記号につきさらにペナルティ１；（３）末端ギャップにはペナルティなし；（４）長いギャップについて最大ペナルティなし。配列比較の分野の専門家が用いる他のプログラムも利用できる。

ＴＮＦＲ：”ＴＮＦＲ”は、天然の哺乳動物の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の配列と同一または実質的に類似するアミノ酸配列を含むタンパク質を表わす。実質的類似性を判定するための生物学的活性とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合する、ＴＮＦの結合によりが開始する生物学的信号を細胞へ伝達する、または天然（すなわち非組換え）源由来ＴＮＦＲに対して産生された抗−ＴＮＦＲ抗体と交差反応する能力を意味する。ＴＮＦＲはいずれの哺乳動物ＴＮＦＲであってもよく、ネズミまたはヒトＴＮＦＲがこれに含まれる。そのようなＴＮＦＲは、米国特許第５，３９５，７６０号（その全体を本明細書に援用する）および米国特許第５，６１０，２７９号（その全体を本明細書に援用する）に記載されている。特に好ましいＴＮＦＲは米国特許第５，３９５，７６０号に記載のものであり、グリコシル化型でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見掛け分子量約８０キロダルトンをもつ。

ＴＮＦＲ：Ｆｃ ： ＴＮＦＲ：Ｆｃは、抗体のＦｃ領域に融合したＴＮＦＲの細胞外ドメインの全体または部分を含む組換え融合タンパク質である。そのような細胞外ドメインには、米国特許第５，３９５，７６０号の図２Ａのアミノ酸配列１〜１６３、１〜１８５または１〜２３５に実質的に類似するアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。

抗体免疫グロブリン可変ドメイン：抗体免疫グロブリン可変ドメインは、ヒトまたは動物由来のＶ_LまたはＶ_Hドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインである。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するための抗体免疫グロブリン可変ドメインの生物学的活性は、抗原結合性である。

方法の説明
タンパク質を精製する方法は、多数の工程を伴うことが多い。本発明は、精製されるタンパク質および第２タンパク質を含む混合物中の第２タンパク質の量を減らす方法であって、第２タンパク質は、第２タンパク質が吸収剤の一部であるアフィニティークロマトグラフィー工程で導入されたものである方法を包含する。そのような第２タンパク質の除去は、精製されるタンパク質の等電点と、第２タンパク質と精製されるタンパク質の複合体の等電点が近接する場合は、困難な可能性がある。イオン交換クロマトグラフィーはそのようなタンパク質の分離を行わないと思われるからである。ヒドロキシアパタイトを用いると、分離が可能かつ簡単になる。本発明方法は、他の不都合な物質を当該タンパク質から除去するという追加利点も備えている。さらに本発明には、当該タンパク質がフロースルーおよび洗液中に回収されかつ少なくとも１種類のタンパク質混入物がヒドロキシアパタイトに保持される条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて抗体のＦｃ領域を含むタンパク質を精製する方法が含まれる。

１態様において本発明方法は、精製されるタンパク質を含有する試料中へアフィニティークロマトグラフィーに際して導入された第２タンパク質および／または第２タンパク質と精製されるタンパク質の複合体の量を減らすことができる。この態様においては、精製されるタンパク質はヒドロキシアパタイトに結合しないが、第２タンパク質および／または第２タンパク質と精製されるタンパク質の複合体は結合する条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する。

本発明方法は、ある態様において少なくとも２工程を伴うこともできる。まず、固体支持体に固定した吸収剤としての第２タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーの予備精製工程を、当該タンパク質に施す。次いで、当該タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合しないが、第２タンパク質および／または第２タンパク質と精製されるタンパク質の複合体は結合する条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する。当該タンパク質を精製する全プロセスは、これらの各工程の前および／または後に他の工程を含むことができる。

平衡化およびクロマトグラフィーの前に、選択した溶液、たとえば塩類溶液および／または緩衝液中で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体を予備平衡化してもよい。予備平衡化は、クロマトグラフィー媒体を再生および／または保存するのに用いた溶液を置換する機能をもつ。予備平衡化溶液の組成が保存溶液および後続のクロマトグラフィーに用いる溶液の組成に依存することは、当業者には自明であろう。従って適切な予備平衡化溶液は、クロマトグラフィーの実施に用いるものと同じ緩衝液または塩類を、所望により、クロマトグラフィーの実施に用いるものより高い濃度で含有することができる。クロマトグラフィーに使用できる緩衝液および塩類について以下に述べる。たとえば、クロマトグラフィーの実施に用いる溶液が特定濃度のリン酸ナトリウムを含む場合、予備平衡化はこれより高い濃度のリン酸ナトリウムを含む溶液中で行うことができる。これの一例として、クロマトグラフィーの実施に用いる溶液が約０．５〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む場合、予備平衡化は約０．２〜約０．５Ｍ濃度のリン酸ナトリウム、より好ましくは約０．３〜約０．４Ｍ濃度のリン酸ナトリウムを含む溶液中で行うことができる。

試料をカラムに装填する前に、タンパク質のクロマトグラフィー処理に用いる予定の緩衝液または塩類中でヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体を平衡化することができる。後記のように、クロマトグラフィー（および精製すべきタンパク質の装填）は多様な緩衝液または塩類中で行うことができ、これにはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸塩および／またはクエン酸塩、ならびに／あるいはトリス緩衝液が含まれる。そのような緩衝液または塩類は、少なくとも約５．５のｐＨをもつ。ある態様では、トリス緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中で平衡化を行うことができる。所望により、リン酸ナトリウム緩衝液は約０．５〜約５０ｍＭの濃度、より好ましくは約１５〜３５ｍＭの濃度である。好ましくは、少なくとも約５．５のｐＨで平衡化を行う。ｐＨ約６．０〜約８．６、好ましくはｐＨ約６．５〜７．５で平衡化を行うことができる。最も好ましくは、溶液は約２５ｍＭ濃度のリン酸ナトリウムを含み、ｐＨ約６．８である。

本発明のクロマトグラフィー工程のいずれかまたは全部をいずれかの機械的手段で実施できる。クロマトグラフィーをカラム中で実施してもよい。カラムを加圧し、または加圧せずに、上から下へ、または下から上へ流すことができる。カラム内の流体の流動方向をクロマトグラフィー処理中に逆転させてもよい。バッチ法でクロマトグラフィーを実施することもできる。この場合、装填に用いた液体から固体支持体を分離し、洗浄し、重力、遠心または濾過を含めたいずれか適切な手段で試料を溶離する。試料中のある分子を他の分子より強く吸収または保持するフィルターと試料を接触させることにより、クロマトグラフィーを実施することもできる。

当該タンパク質は、そのタンパク質を産生するように遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生させることができる。当該タンパク質を産生するように細胞を遺伝子工学的に処理する方法は当技術分野で周知である。たとえばＡｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｅｙ，ニューヨーク）参照。そのような方法は、そのタンパク質をコードする核酸を宿主生細胞に導入して発現させることが含まれる。これらの宿主細胞は、培養増殖させた細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは動物細胞であってもよい。宿主細菌細胞には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞が含まれるが、これに限定されない。適切な大腸菌株の例には、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および外来ＤＮＡを開裂できないいずれかの大腸菌株が含まれる。使用できる宿主真菌細胞にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。使用できる動物細胞系のうち数例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８である。当業者に周知の方法を用いて、新規な動物細胞系を樹立することができる（たとえば形質転換、ウイルス感染および／または選択による）。所望により、当該タンパク質は宿主細胞により培地中へ分泌されてもよい。

精製の任意の段階で試料のタンパク質濃度を適切な方法により測定できる。そのような方法は当技術分野で周知であり、下記のものがこれに含まれる：１）比色法、たとえばローリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイ、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ、スミスアッセイおよび金コロイドアッセイ；２）タンパク質のＵＶ吸収特性を利用する方法；ならびに３）ゲル上の染色タンパク質バンドに基づき、同一ゲル上で既知量の標準タンパク質との比較に依存する視覚推定。たとえばＳｔｏｓｃｈｅｋ（１９９０），タンパク質の定量，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：５０−６８参照。

本発明の意図に従って精製しようとするタンパク質は、１以上の抗体免疫グロブリン定常ドメインを含む；１個または多数個の抗体免疫グロブリン可変ドメインを含むことができるが、その必要はない。それは天然タンパク質または組換え融合タンパク質であってもよい。それは抗体のＦｃ部を含むことができる。それは非抗体タンパク質をも含むことができる。

本発明に使用するための若干のタンパク質の具体例には、１以上の抗体免疫グロブリン定常ドメイン、所望により抗体のＦｃ部、および下記のタンパク質のいずれかと同一または実質的に類似するタンパク質を含む、組換え融合タンパク質が含まれる：ｆｌｔ３リガンド（国際特許出願ＷＯ９４／２８３９１に記載、その全体を本明細書に援用する）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号に記載、その全体を本明細書に援用する）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際特許出願ＷＯ９７／０１６３３に記載、その全体を本明細書に援用する）、胸腺ストローマ由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許Ｎｏ．５８８８１９に記載、その全体を本明細書に援用する）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（たとえばｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンド）。本発明方法により精製できるタンパク質の記載は、たとえば下記にみられる：Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．ＩＩ（Ａｇｇａｒｗａｌ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチュセッツ州ケンブリッジ，１９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ ａｎｄ Ｌｅｉｇｈ編，オックスフォード大学出版社，ニューヨーク，１９９３）；およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ，１９９１）。

本発明により考慮されるタンパク質には、１以上の抗体免疫グロブリン定常ドメイン、所望により抗体のＦｃ部、および前記タンパク質のいずれかに対する受容体またはそのような受容体と実質的に類似するタンパク質を含む、組換え融合タンパク質も含まれる。これらの受容体には下記のものが含まれる：両形態のＴＮＦＲ（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、Ｉ型およびＩＩ型インターロイキン−１受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７号および米国特許第５，７６７，０６４号に記載、それらの全体を本明細書に援用する）、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−４受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ３６７ ５６６および米国特許第５，８５６，２９６号に記載、それらの全体を本明細書に援用する）、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ、米国特許第６，２７１，３４９号に記載、それらの全体を本明細書に援用する）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４を含む）、ならびにデスドメインを含む受容体、たとえばＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）。

本発明方法を用いて精製できる他のタンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）もしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質が、少なくとも１つの抗体免疫グロブリン定常ドメイン、所望により抗体のＦｃ部に融合したものが含まれる。そのような抗原はＬｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．編，日本，神戸，１９９６）に示されている。同様なＣＤタンパク質がその後のワークショップで示された。そのような抗原の例には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、など）が含まれる。幾つかのＣＤ抗原はＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、これには４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０も含まれる。上記リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドと同様にＴＮＦファミリーのメンバーである。したがって、ＴＮＦファミリーおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーも本発明により精製できる。

酵素活性タンパク質またはそれらのリガンドも本発明により精製できる。その例には、少なくとも１つの抗体免疫グロブリン定常ドメイン、および下記のタンパク質のいずれかもしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質の全体または部分を含む、組換え融合タンパク質が含まれる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、前記酵素のいずれかに対するリガンド、ならびに他の多数の酵素およびそれらのリガンド。

本発明方法は、抗体またはその部分、およびキメラ抗体、たとえばヒト抗体免疫グロブリン定常ドメインが１以上のネズミ抗体免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントの精製にも使用できる。本発明方法は、抗体および細胞傷害性物質または発光物質を含む結合体の精製にも使用できる。そのような物質には下記のものが含まれる：メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）誘導体（たとえばＤＭ１）；エンテロトキシン（たとえばブドウ球菌エンテロトキシン）；ヨウ素同位体（たとえばＩ−１２５）；テクニウム同位体（たとえばＴｃ−９９ｍ）；シアニン蛍光色素（たとえばＣｙ５．５．１８）；およびリボソーム不活性化タンパク質（たとえばボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、またはサポリン−Ｓ６（ｓａｐｏｒｉｎ−Ｓ６））。本発明により考慮される抗体、または抗体／細胞毒素結合体、もしくは抗体／発光団結合体の例には、前記タンパク質および／または下記抗原のうちいずれか１種類またはその組合わせを認識するものが含まれる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌の患者血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および／または腎臓癌細胞、および／または黒色腫、グリオーマもしくは神経芽細胞に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍壊死コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシンＨ鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害薬）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｓ）。

本発明は、抗イディオタイプ抗体、または実質的に類似するタンパク質の精製にも使用でき、これには下記のものに対する抗イディオタイプ抗体が含まれるが、これらに限定されない：腫瘍抗原ｇｐ７２をターゲットとする抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；またはガングリオシドＧＤ２に対する抗体。

アフィニティークロマトグラフィーにおいて、吸収剤は第２タンパク質が固定された適切な固体支持体を含むことができる。精製すべきタンパク質を含むタンパク質試料をこの吸収剤に適用することができる。次いで、当該タンパク質の抗体免疫グロブリン定常ドメインに第２タンパク質が結合するのを妨害しない溶液中で、吸収剤を洗浄することができる。次いで、第２タンパク質による抗体免疫グロブリン定常ドメイン結合を妨害する溶液で、当該タンパク質を吸収剤から溶離することができる。

第２タンパク質は、抗体免疫グロブリン定常ドメインに結合するいずれかのタンパク質であり、組換え融合タンパク質であってもよいが、その必要はない。所望により、第２タンパク質はプロテインＧ、プロテインＬＧまたはプロテインＡであってもよい。第２タンパク質は、アガロース、セファロース、シリカ、コロジオン木炭、砂、および他のいずれか適切な材料を含めたいずれか適切な固体支持体に固定することができる。そのような材料は当技術分野で周知である。第２タンパク質を固体支持体に固定するためには、任意の適切な方法を使用できる。タンパク質を適切な固体支持体に固定する方法は当技術分野で周知である。たとえばＯｓｔｒｏｖｅ（１９９０）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３５７−３７１参照。さらに、既に第２タンパク質を固定した固体支持体が、バイオラッド、メルク、アマシャムファルマシアバイオテクおよびミリポアコーポレーションを含めたいくつかの製造業者から市販されている。

任意の工程で、精製すべきタンパク質と混入物を含むタンパク質試料を、緩衝液および／または塩類を含む溶液中において、固体支持体に固定された第２タンパク質を含む吸収剤に装填する。適切な緩衝液にはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液および／またはクエン酸緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。適切な塩類には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、カルシウム塩および／またはマグネシウム塩が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、この溶液はトリスを約５〜１００ｍＭの濃度で、塩化ナトリウムを約５０〜２５０ｍＭの濃度で含むことができる。しかし他の緩衝液および塩類も使用できる。装填後、吸収剤をさらに同溶液で洗浄してもよい。当該タンパク質は、抗体免疫グロブリン定常ドメインへの第２タンパク質の結合を妨害する溶液で溶離することができる。この溶液は、ｐＨを上昇もしくは低下させる物質であるカオトロピック剤、たとえばグアニジニウム、および／または塩類を含むことができる。この溶液は、酢酸、グリシンまたはクエン酸を含むことができる。溶離はｐＨの低下により実施できる。たとえば、特にクエン酸塩または酢酸塩を含む溶液を用いてｐＨを約４．５以下、特に典型的には約３．３〜約４．０に低下させることができる。あるいは、ｐＨを典型的には約８．５より高くしてもよい。そのような溶離を実施するのに適した溶液は、特にトリスまたは炭酸ナトリウムを含むことができる。他の溶離方法も採用できる。そのようなアフィニティークロマトグラフィーのプロトコルは当技術分野で周知である。たとえばＭｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｔｏｎｅ（１９７８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４（１−２）：１１１−１２５参照。結合および溶離の条件は当業者が容易に最適化できる。

本発明方法において、当該タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合しないが第２タンパク質および／または第２タンパク質と当該タンパク質の複合体（これらはアフィニティークロマトグラフィー後に存在する可能性がある）は結合する条件下で、当該タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理する。試料をヒドロキシアパタイトに装填し、緩衝液および／または塩類を含む約５．５より高いｐＨの溶液中でクロマトグラフィーを実施する。好ましくは、クロマトグラフィー媒体に当該タンパク質を装填する際の溶液と同一または類似する溶液中でクロマトグラフィーを実施する。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、当該タンパク質と第２タンパク質が互いに結合して複合体を形成する条件下で、または形成しない条件下で行うことができる。したがって、前者の場合、第２タンパク質からの当該タンパク質の分離には、第２タンパク質と当該タンパク質の複合体からの当該タンパク質の分離が必要となるであろう。後者の場合、第２タンパク質からの当該タンパク質の分離は、まさにそれを伴うであろう。クロマトグラフィーおよび装填は多様な緩衝液および／または塩類中で行うことができ、これにはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、および／またはトリス緩衝液が含まれる。そのような緩衝液および塩類の具体例は下記のものである：トリス、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムまたは酢酸アンモニウム。ｐＨ範囲は、クロマトグラフィー条件が最適となり、かつ当該タンパク質の目的特性が保持されるように選択される。大部分の当該タンパク質について、それは約６．０〜約８．６、好ましくは約６．５〜約７．５の間で変動しうる。しかし、あるタンパク質は極端なｐＨに耐えることが知られており、これより広い範囲も可能である。１態様において、装填／クロマトグラフィー溶液は約０．５〜約５０ｍＭ濃度、より好ましくは約１５〜３５ｍＭ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液を含む。所望により、この溶液は約２５ｍＭ濃度およびｐＨ約６．８のリン酸ナトリウム緩衝液を含む。他の態様において、装填溶液はｐＨ約６．０〜約９．０、好ましくは約６．５〜約８．０のトリスを含む。

精製されるタンパク質を含むフロースルー液を採集する。選択した濃度の選択した緩衝液および／または塩類により、第２タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合するが、精製されるタンパク質は結合しない。精製される特定のタンパク質に適切な緩衝液または塩類を決定する際には、当業者は当技術分野で既知の知識を指針とすることができる。たとえばＧｏｒｂｕｎｏｆｆ（１９９０），ヒドロキシアパタイトカラムによるタンパク質クロマトグラフィー，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３２９−３３９；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，ｐｐ．１７３−７５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９４参照（それらの全体を本明細書に援用する）。さらに、たとえば精製すべきタンパク質および第２タンパク質を含む試料を適用したヒドロキシアパタイトカラムに、濃度勾配をもつ選択した緩衝液または塩類を流すことにより、選択した緩衝液または塩類の最適使用濃度を当業者は容易に決定できるであろう。カラム溶出液画分を採集および分析して、当該タンパク質および第２タンパク質が溶出する緩衝液または塩類の濃度を判定できる。適切な分析法には、たとえば導電率計による導電率の測定（試料の塩類濃度を測定）とゲル電気泳動、またはＥＬＩＳＡアッセイ法（試料中のタンパク質の同一性を判定）が含まれる。所望により、タンパク質試料を装填したのと同じ溶液でヒドロキシアパタイトをさらに洗浄することができる。この洗液を採集してフロースルー液と混和してもよい。

精製されるタンパク質を含むフロースルー液および所望により洗液を採集した後、クロマトグラフィーに用いた緩衝液または塩類をより高い濃度で含む溶液を用いてクロマトグラフィー媒体をストリッピングすることにより、ヒドロキシアパタイトに結合したままの可能性があるタンパク質を放出させてもよい。次いで、大部分または全部のタンパク質をクロマトグラフィー媒体から放出させかつクロマトグラフィー媒体中に存在する可能性のある微生物の混入を減少または排除する効力をもつ溶液を用いて、カラムを再生することができる。１態様において、そのような溶液は水酸化ナトリウムを含むことができる。他の試薬も使用できる。次いでカラムをすすぎ、微生物増殖を阻止しうる溶液中に保存することができる。そのような溶液は水酸化ナトリウムを含むことができるが、他の試薬も適切であろう。

第２タンパク質、当該タンパク質と第２タンパク質の複合体、および／または精製されるタンパク質試料中に存在する可能性のある他のタンパク質を、いずれかの適切な手段でモニターできる。好ましくは、その手法は約２ｐｐｍ（精製されるタンパク質ミリグラム当たりのナノグラムとして計算）〜約５００ｐｐｍの混入物を検出するのに十分な感度をもつべきである。たとえば、当技術分野で周知の方法である酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて当該タンパク質への第２タンパク質の混入を検出できる。たとえばＲｅｅｎ（１９９４），酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ），Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：４６１−４６６参照；その全体を本明細書に援用する。１態様において、特にヒドロキシアパタイトに装填する物質が検出可能レベルに近いかまたはそれより低い第２タンパク質レベルをもつ場合、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは第２タンパク質による混入を検出可能なほど低下させなくてもよい。あるいは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは第２タンパク質による混入を少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１５倍、最も好ましくは少なくとも約２０倍、低下させることができる。好ましくは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の当該タンパク質への第２タンパク質の混入は約４００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約３６０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約３２０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２８０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２４０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１６０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１４０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１２０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約８０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約６０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約４０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約５ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１ｐｐｍを超えず、最も好ましくは約０．５ｐｐｍを超えない。そのような第２タンパク質による混入は、検出不可能レベルから約５ｐｐｍまで、または約５〜約４００ｐｐｍであってよい。薬理学的用途のためにタンパク質を精製しようとする場合、患者が週当たり特定量より多量のタンパク質混入物を摂取しないために、第２タンパク質の好ましいレベルは患者当たりの当該タンパク質の週間投与量に依存する可能性があることは当業者に自明であろう。したがって、当該タンパク質の必要な週間投与量が少なくなるほど、第２タンパク質による混入レベルは高くなってもよいであろう。

同様に、精製されるタンパク質試料中に存在する可能性のある他のタンパク質（宿主細胞タンパク質を含む）による混入物も、ＥＬＩＳＡアッセイを含めた適宜な手段でモニターできる。１態様において、そのような他のタンパク質による当該タンパク質への混入をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に、好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、最も好ましくは少なくとも約３０倍、より好ましくは少なくとも約４０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約６０倍、より好ましくは少なくとも約７０倍、より好ましくは少なくとも約８０倍、より好ましくは少なくとも約９０倍、最も好ましくは少なくとも約１００倍、低下させることができる。他の態様において、そのような他のタンパク質による当該タンパク質への混入は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に約１０，０００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２５００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約４００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約３６０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約３２０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２８０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２４０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１６０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１４０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１２０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１００ｐｐｍを超えず、より好ましくは約８０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約６０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約４０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約３０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約２０ｐｐｍを超えず、より好ましくは約１０ｐｐｍを超えず、最も好ましくは約５ｐｐｍを超えない。そのような混入は、検出不可能レベルから約１０ｐｐｍまで、または約１０〜約１０，０００ｐｐｍであってよい。薬理学的用途のためにタンパク質を精製しようとする場合、前記のように他のタンパク質混入物の許容できるレベルは患者当たりの当該タンパク質の週間投与量に依存することは当業者に自明であろう。

精製されるタンパク質試料中に存在する可能性のあるＤＮＡの量は、いずれか適切な手段で測定できる。たとえばポリメラーゼ連鎖反応を用いるアッセイ法を使用できる。所望により、その手法は１０ｐｇ／タンパク質ｍｇ以上のＤＮＡ混入を検出できる。ＤＮＡレベルを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより所望により約２倍、好ましくは約５倍、より好ましくは約１０倍、より好ましくは約１５倍、最も好ましくは約２０倍、低下させることができる。所望により、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後のＤＮＡレベルは２０ｐｇ／タンパク質ｍｇ未満、より好ましくは１５ｐｇ／タンパク質ｍｇ未満、より好ましくは１０ｐｇ／タンパク質ｍｇ未満、最も好ましくは５ｐｇ／タンパク質ｍｇ未満である。

以下の実施例は説明のために提示するものであって、限定のためのものではない。

実施例１
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた、ＴＮＦＲ：Ｆｃを含む試料中のプロテインＡレベルの低下
この実験は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを含み、特定量のプロテインＡ（ＴＮＦＲ：Ｆｃと複合体を形成している可能性がある）を含有するタンパク質試料の残留プロテインＡレベルを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより低下させうることを証明する。

高さ１８ｃｍ、内径１．６ｃｍのセラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩＩ、バイオラッド、８０μ）カラムを、２カラム容量の０．４Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で予備平衡化し、導電率２．８ミリシーメンス（ｍＳ）の２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）４カラム容量で平衡化した。２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）６６８ｍｌ中のタンパク質試料（５．１１ｍｇ／ｍｌ）［ＴＮＦＲ：ＦｃおよびプロテインＡ（２０９ｐｐｍ）を含有］を、カラムに装填した。試料中のプロテインＡの量はＥＬＩＳＡアッセイにより測定された。ＴＮＦＲ：Ｆｃを含有するフロースルー液を採集した。カラムを３カラム容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄し、洗液を採集し、フロースルーと合わせた。フロースルーと洗液中に採集されたタンパク質を濾過により滅菌し、次の精製工程を実施するまで２〜８℃に保存した。装填したＴＮＦＲ：Ｆｃの大部分（９７％）がフロースルー液と洗液中に回収された。フロースルー液と洗液中のプロテインＡの量は、１１ｐｐｍと測定された。次いでカラムを３カラム容量の０．４Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）でストリッピングし、２カラム容量の１Ｍ水酸化ナトリウムで再生し、３カラム容量の０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウムですすぎ、同溶液中に保存した。この状態で再使用可能である。

実施例２
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた、ＴＮＦＲ：Ｆｃを含む試料中の宿主細胞タンパク質レベルの低下
以下の実験は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを含む試料の宿主細胞タンパク質レベルを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより低下させうることを証明する。

高さ１０ｃｍ、内径１．１ｃｍのセラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩＩ、バイオラッド、８０μ）カラムを、２カラム容量の０．３Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で予備平衡化し、導電率２．８ｍＳの２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）３カラム容量で平衡化した。２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）３８２ｍｌ容量中約１．９ｇのタンパク質を、カラムに装填した。この試料は、試料の大部分を占めるＴＮＦＲ：Ｆｃ、および宿主細胞タンパク質（５４５ｐｐｍ）を含有していた。試料中の宿主細胞タンパク質の量はＥＬＩＳＡアッセイにより測定された。ＴＮＦＲ：Ｆｃを含有するフロースルー液を採集した。カラムを３カラム容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄し、洗液を採集し、フロースルーと合わせた。装填したＴＮＦＲ：Ｆｃの大部分（９２％）がフロースルー液と洗液中に回収された。採集したタンパク質を濾過により滅菌した。宿主細胞タンパク質の量は、ヒドロキシアパタイトカラムに装填した材料と比較して少なくとも約７０倍減少した（５４５ｐｐｍから７ｐｐｍに）。次いでカラムを３カラム容量の０．３Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）でストリッピングし、半カラム容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）ですすぎ、２カラム容量の１Ｍ水酸化ナトリウムで再生し、３カラム容量の０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウムですすぎ、同溶液中に保存した。この状態で再使用可能である。

図１は、このカラムの吸光度および導電率のプロフィールを示す。試料中の大部分のタンパク質は、５５〜５９カラム容量において０．３Ｍリン酸ナトリウム添加により起きる導電率増大（約２０ｍＳになる）の前に、カラムを流れ抜ける。その後の大きな導電率増大（約２００ｍＳになる）は、前記に説明したカラム再生のための１．０Ｍ水酸化ナトリウム添加に対応する。ＴＮＦＲ：Ｆｃはカラムに装填したタンパク質試料の大部分の種を構成するので、このプロフィールはＴＮＦＲ：Ｆｃが２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中においてヒドロキシアパタイトカラムを流れ抜けることを示す。

実施例３
セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる、ＴＮＦＲ：Ｆｃ試料中の残留プロテインＡおよび他のタンパク質の減少
以下の実験は、プロテインＡと他のタンパク質混入物のレベルを同時に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより低下させうることを証明する。

高さ１８ｃｍ、内径１．６ｃｍのセラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩＩ、バイオラッド、８０μ）カラムを、２カラム容量の０．４Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で予備平衡化し、３カラム容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で平衡化した。２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質約３．２ｇ［ＴＮＦＲ：Ｆｃ、この条件下でＴＮＦＲ：Ｆｃと複合体を形成しているプロテインＡ（約９７〜約１０６ｐｐｍ）、および他のプロセス関連不純物（ＰＲＩ；約５９〜約６７ｐｐｍ）を含む］を、カラムに装填した。試料中のプロテインＡおよびＰＲＩの量はＥＬＩＳＡアッセイにより測定された。ＴＮＦＲ：Ｆｃを含有するフロースルー液を採集した。カラムを３カラム容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄し、洗液を採集した。装填したＴＮＦＲ：Ｆｃのほぼすべて（９９〜１００％）がフロースルー液と洗液中に回収された。試料中のプロテインＡおよびＰＲＩの量は、ヒドロキシアパタイトカラムに装填した材料と比較して、それぞれ５．３〜５．４倍、および２．８〜３．７倍減少した。次いでカラムを５カラム容量の０．４Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）でストリッピングし、２カラム容量の１Ｍ水酸化ナトリウムで再生し、３カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１Ｍ水酸化ナトリウム中ですすぎ、同溶液中に保存した。この状態で再使用可能である。

本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。それらは単に本発明の各態様を説明するためのものであり、機能的に均等な方法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、以上の記載および添付の図面から、本明細書に記載したもののほか多様な本発明の改変が当業者に自明であろう。そのような改変も特許請求の範囲に含まれるものとする。

図１は、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中で操作し、大部分の種としてＴＮＦＲ：Ｆｃを含む試料を装填した、ヒドロキシアパタイトカラムの溶離プロフィールを示す（実施例２に記載）。

Claims (26)

1. あるタンパク質および少なくとも１種類のタンパク質混入物を含む試料から当該タンパク質を精製するための方法であって、試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含み、
   当該タンパク質を少なくとも１種類のタンパク質混入物から、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実行する溶液中でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離し、
   大部分の当該タンパク質分子がフロースルーおよび洗液中に回収され、
   当該タンパク質は、固体支持体に固定された吸収剤としてのプロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより予め精製されており、
   当該タンパク質は抗体免疫グロブリン定常ドメインを含み、そして
   当該タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃまたは抗体である
   前記方法。
2. プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬＧが検出可能な濃度で試料中に存在し、当該タンパク質をプロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬＧから溶液中でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離する、請求項１に記載の方法。
3. 当該タンパク質が培養動物細胞により培地中へ分泌されたものである、請求項１または２に記載の方法。
4. 動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 少なくとも１種類のタンパク質混入物が培養動物細胞により培地中へ分泌されたものである、請求項３または４に記載の方法。
6. 当該タンパク質が抗体のＦｃ部を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. 当該タンパク質がＴＮＦＲ：Ｆｃである、請求項６に記載の方法。
8. 当該タンパク質が抗体である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
9. アフィニティークロマトグラフィーの実行にプロテインＡが使用される、請求項１に記載の方法。
10. 溶液が５ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度のリン酸ナトリウム緩衝液を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
11. 溶液が６．０〜８．６の間のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
12. 当該タンパク質がＴＮＦＲ：Ｆｃであり；
    アフィニティークロマトグラフィーの実行にプロテインＡが使用され；そして、
    溶液が１５ｍＭ〜３５ｍＭの間の濃度のリン酸ナトリウム緩衝液を含み、６．５〜７．５の間のｐＨを有する、
    請求項１に記載の方法。
13. あるタンパク質および少なくとも１種類のタンパク質混入物を含む試料から当該タンパク質を精製する方法であって、
    試料を固体支持体に固定された吸収剤としてのプロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬＧを用いるアフィニティークロマトグラフィー処理し、そして、
    試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含み、
    当該タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃ、または抗体のＦｃ部を含む抗体であり、そして
    大部分の当該タンパク質分子がフロースルーおよび洗液中に回収される
    前記方法。
14. 当該タンパク質がＴＮＦＲ：Ｆｃである、請求項１３に記載の方法。
15. アフィニティークロマトグラフィーの実行にプロテインＡが使用される、請求項１３または１４に記載の方法。
16. ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーがリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中で実施される、請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
17. リン酸ナトリウム緩衝液が溶液中に５〜５０ｍＭの間の濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
18. ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが６．０〜８．６の間のｐＨで実施される、請求項１３ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 当該タンパク質が培養動物細胞により培地中へ分泌されたものである、請求項１３ないし１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１９に記載の方法。
21. 少なくとも１種類のタンパク質混入物が培養動物細胞により培地中へ分泌されたものである、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 当該タンパク質がＴＮＦＲ：Ｆｃであり；
    アフィニティークロマトグラフィーの実行にプロテインＡが使用され；そして
    １５ｍＭ〜３５ｍＭの間の濃度のリン酸ナトリウム緩衝液を含む、６．５〜７．５の間のｐＨ溶液中で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する、
    請求項１３に記載の方法。
23. ＴＮＦＲ：Ｆｃを精製する方法であって、大部分のＴＮＦＲ：Ｆｃ分子がフロースルーおよび洗液中に回収され、少なくとも１種類のタンパク質混入物がＴＮＦＲ：Ｆｃから分離される条件下で、ＴＮＦＲ：Ｆｃおよび少なくとも１種類のタンパク質混入物を含む試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含む方法。
24. あるタンパク質を宿主細胞タンパク質から分離する方法であって、当該タンパク質および少なくとも１種類の宿主細胞タンパク質を含む試料をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー処理することを含み、
    これにより当該タンパク質から少なくとも１種類の宿主細胞タンパク質を分離し、
    当該タンパク質は抗体免疫グロブリン定常ドメインを含み、
    当該タンパク質はＴＮＦＲ：Ｆｃまたは抗体であり、
    大部分の当該タンパク質分子がフロースルーおよび洗液中に回収され、
    当該タンパク質および宿主細胞タンパク質が両方とも、培養動物細胞により培地中へ分泌されたものである、
    前記方法。
25. フロースルーおよび洗液中の当該タンパク質に対する宿主細胞タンパク質の濃度が１００ｐｐｍ未満である、請求項２４に記載の方法。
26. 当該タンパク質がＴＮＦＲ：Ｆｃである、請求項２４または２５に記載の方法。

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