JP4367866B2 - 肺癌用のタンパク質マーカーおよびその使用 - Google Patents

Description

発明の背景
発明の属する分野
本発明は、肺癌用マーカーである、タンパク質に関するものである。
三種の主な型の肺腫瘍を識別するように発現する、多数のポリペプチドが同定されている。少数のこれらポリペプチドは、以前に食道腫瘍用のマーカーとして同定されているマーカーと重複する。しかしながら、大多数（約30個のポリペプチド）が、この分析にとって新規である。
関連技術の説明
肺癌は、年齢35を越える男性における癌死亡の主な原因となっており、またこの年齢群における女性の死亡の、主な原因となっている。幾つかのサブタイプの肺癌が存在する。偏平上皮癌、腺癌および小細胞癌が、主なサブタイプである。肺癌の、この全体としての高い発生率および死亡率のために、初期段階におけるこの種の癌のスクリーニングおよび検出法は、全く有益なものである。しかしながら、一般的に利用できるスクリーニング法の利点には、疑問があり、より効果的な方法に対する多大な需要がある。そのためには、腫瘍および腫瘍の特定のサブタイプに対して、高い特異性をもつ、生化学的なマーカーの同定が有利であろう。
現時点において、肺癌は、主として生検によって診断されている。不幸なことに、この癌が診断された時点までに、この癌は、しばしばかなり進行した状態にある。診断後の生存率は低い。
従って、初期段階における肺癌診断の必要性が存在する。疾病の進行に対応するマーカーを用いて、治療養生を監視することができる。
発明の概要
本発明の方法は、種々の肺癌サブタイプにおいて発現される、数百に及ぶ細胞タンパク質（タンパク）を分析して、該サブタイプに対して特異的なタンパクを同定する工程を含む。二次元的ゲル電気泳動法の手順を利用して、統計的に有意な方法で、該主要なサブタイプ間の識別を可能とすると思われる、タンパクのサブセットを検出した。これらのタンパクは、以下のような領域を含む多くの分野における有用性をもつ。
1. 正常な個体または肺癌の高い危険性のある個体のスクリーニング。
2. 診断時点における、特定の肺癌サブタイプの確立。
3. 特定の肺癌サブタイプに罹患していると診断された個体の指標の規定。
4. 種々の肺癌サブタイプにおける、これらタンパクの役割の理解に基づく、治療のための新規な方法の提供。
正常な肺および種々の型の肺腫瘍、例えば偏平上皮癌、小細胞癌および腺癌を由来とするタンパクを示す、2-Ｄゲルの比較により、一連のタンパクが、種々の起源組織において同定されている。これらのタンパクは、肺腫瘍の病因論に関する情報を与え、また治療養生を監視するためのマーカーとしての利用性をもつ。これらのタンパクはまた、精製し、診断試薬として使用できる抗体を生成するための免疫源として使用することができる。更に、該タンパクまたはこれらに対する抗体の幾つかは、治療上の用途をもつことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、偏平上皮細胞肺癌に罹患した患者由来のサンプルの、等電点（IEF）電気泳動ゲルを示す図である。
第２図は、古典的な小細胞肺癌に罹患した患者由来のサンプルの、IEF電気泳動ゲルを示す図である。
第３図は、肺の腺癌に罹患した患者由来のサンプルの、IEF電気泳動ゲルを示す図である。
発明の詳細な説明
本発明の一局面は、肺腫瘍に関する新規な診断法である。この診断法は、腫瘍に罹っていない肺組織に対して、肺癌において過度に発現され、かつ肺腫瘍サブタイプに対して特異的な、少なくとも一種のタンパクの検出に基づくものである。肺腫瘍の診断において使用すべき該タンパクを同定するために、60例の肺腫瘍において発現されたタンパクを、2-Ｄゲル電気泳動を利用して分析した。肺腫瘍および腫瘍に罹っていない肺組織に関する、該タンパクのゲル電気泳動プロフィールを比較することにより、肺腫瘍において過度に発現されたタンパクを捜し出した。以下で証明するように、過度に発現された該特定のタンパクの幾つかはまた、該肺腫瘍サブタイプとも相関がある。従って、種々の特定の肺腫瘍サブタイプにおいて過度に発現された、複数のタンパクマーカーに注目することによって、該肺腫瘍サブタイプの診断を行うことができる。例えば、それぞれ３種の主な肺腫瘍サブタイプ、即ち偏平上皮細胞癌、腺癌または小細胞癌の一つに対して特異的な、少なくとも３種のタンパクマーカーによって、該主な肺腫瘍サブタイプの診断を行うことができる。該タンパクマーカーは、抗体の不在下で、ゲル電気泳動を利用して、該タンパクマーカーに対して特異的な抗体が入手できる場合には、イムノアッセイによって、あるいは任意の他の該タンパクマーカーの検出法によって決定できることを強調すべきである。該タンパクマーカーに対して特異的である抗体は、該診断法のインビボまたはインビトロでの使用を可能とする。
本発明のもう一つの局面は、治療すべき該肺腫瘍サブタイプに対して特異的な少なくとも一つのタンパクマーカーの出現を追跡することによって、肺腫瘍の治療の進行具合を監視する方法である。本発明において同定された該タンパクマーカーの幾つかは、治療中の該肺腫瘍サブタイプに対して特異的なタンパクマーカーに注目することによって、肺腫瘍の治療中に追跡することができる。治療が進行するにつれて、少なくとも１種のこれら特異的なタンパクマーカーの存在を、別の方法で追跡して、該治療の有効性を判断することができる。
肺癌のキャリヤー両性電解質（CA）に基づく2-Ｄゲル
60例を越える肺腫瘍由来の組織を、2-Ｄ分析のために入手した。
該腫瘍の多くは、利用可能な銀染色されたゲルを含む一対の複製を有し、その第一次元のゲルは、等電点電気泳動用ゲルであった。更に、該腫瘍の大部分は、固定されたpH勾配を使用して分析された。これらの共通の腫瘍型は、十分に理解されている：肺の古典的小細胞（SC）癌、腺癌（Ad）および偏平上皮（Sq）腫瘍。レーラー（Rarer）腫瘍型は、少数のサンプルによって代表された。
これら３種の主な肺腫瘍型の分析には、３つの大きなゲルバッチの、肉眼による分析を利用した。該ゲルは、対象とする最大数の該腫瘍型（これら３種の型の各々を10以上）を含んでいた。その像は、一度に一つの小さな拡大部分を、最良の像のサブセットを与えると思われる像の間にスポットを合わせて、コンピュータでも研究した。このコンピュータによる研究のために、スポットをAb6148、即ちSCサンプル（標品）を撮影するように合わせ、これからここで使用した「肺」スポット番号系を導いた。このマスター（master）を、食道癌、結腸癌、膵臓癌、白血病、脳腫瘍および乳癌を包含する腫瘍研究で使用するマスター像にも調和させ、肺における対象とする各スポットが、他の系におけるスポット数と一致するようにした。対象とするスポットが同定された時点で、各スポットに関する、大抵の場合はどのサンプルが最大のまたは最小のスポットをもつかに関連する、論評を行った。
興味深いスポットの幾つかのセットを、群として扱うべきであると思われ、即ちこれらは単一の遺伝子の生成物であり、翻訳後の変更（修飾）においてのみ異なっていると思われる。この解釈は、該ゲル上のスポットの近接性、これらスポットの形成する配列の幾何形状（例えば、「チャージチェーン（charge chain）」、その銀染色に関する同一の色および異なるサンプルにおける量の相関に基づくものである。このような場合、単一のスポットのみが、典型的には、無関係と思われる他のスポットと最小の重なりを示す群またはスポットにおける最大のものが、定量のために選択される。定量のために選択された該群および代表は以下の通りである。

第１〜３図は、該候補スポットの位置を示す。これらは、該肺腫瘍適合に対して特異的なスポット番号で標識されている。
pH範囲約3.5-10.0をカバーする、キャリヤー両性電解質を主体とする2-Ｄゲルを、全ての検体について調製した。
組織を、（１ｌ当たり）8Mの尿素、20mlのノニデット（Nonidet）P-40界面活性剤、20mlの両性電解質（pH3.5-10）、20mlの2-メルカプトエタノール、および0.2mMの、蒸留脱イオン水に溶解したフェニルメチルスルホニルフルオライドを含有する溶解バッファーの添加によって溶解した。70μｇのタンパクを含有する約30μｌのアリコートを、各ゲル上に載せた。
等電点電気泳動は電荷の変更に敏感であるので、不適当なサンプルの調製に起因する可能性のある、タンパクの変更（例えば、タンパク分解、グルタミンおよびアスパラギンの脱アミノ化、シスチンのシスチックアシッドへの酸化、カルバミル化）を最小化することが重要である。一旦溶解したサンプルを、短期間（<1カ月）、重大なタンパク変性を起こさないように、-80℃にて凍結保存する。
2-ＤPAGEを、前に記載されたように（Strahler等，Journal of Clinical Investigation, 1990, 85:200-207）実施した。殆どの場合、アリコートを即座に等電点電気泳動ゲル上に適用した。一次元ゲルは、１ｌ当たり50mlの両性電解質を含んでいた（pH3.5-10）。等電点電気泳動は、1,200Vにて16時間および1,500Vにて２時間実施した。20個のゲルを同時に泳動させた。二次元分離のために、アクリルアミド勾配11.4-14.0g/dlを使用した。ゲル中のタンパクスポットを、メリル等の銀−染色技術（Merril等，Science, 1981, 211:1437-1438）を使用して、可視化した。
肺癌の固定化pH勾配（IPG）2-Ｄゲル
キャリヤー両性電解質を主成分とする2-Ｄパターンの生成に加えて、固定化pH勾配を使用した第二の組のパターンを、多数の該腫瘍に対して生成した。
サンプルは、上記の肺癌のCAを主成分とする2-Ｄゲルと同様にして調製した。一次元の分離に対して、固定化pH勾配は、pH範囲4-10に及んだ。この二次元は、該CAを主成分とする2-Ｄゲルと同様であった。
IPGゲルは、特定のpK値を有する、カルボキシルまたは三級アミノ基をもつアクリルアミド誘導体を使用して調製した。線形pH勾配は、濃厚な酸性溶液および希薄な塩基性溶液から、2-チャンバー微小勾配形成装置を使用して得る。このpH勾配を、グリセロールの同時線形勾配によって、該インモビリン（Immobiline）-アクリルアミド−ビスアクリルアミドマトリックスの重合中安定化させる。pHを制限するためにインモビリンを滴定することによる、緩衝性インモビリン混合物の処方、即ち狭い範囲のpH勾配（１pH単位）または広い範囲のpH勾配（>1pH単位、６pH単位まで）に対する溶液は公開されている（Gianazza等，Electrophoresis, 1985, 6:l13およびLKBアプリケーション（application）Note, 1984, 324）。
該二次元分離は、SDSゲル中で、分子量を基にしてタンパクを分離する。11.5〜14%T（2.6%の架橋度）のアクリルアミド勾配は、分子量15,000〜100,000のタンパクを効果的に分離する。この範囲外のタンパクは、それ程十分に解像されない。10,000Da未満の分子量をもつタンパクは、染料フロントと近接して泳動し、解像されない。
コンピュータを使用した2-Ｄゲルの解析
各ゲルを1024×1024画素フォーマットで走査させ、ここでは各画素は、種々の強度を表す256個の可能な値の一つをもつことができる。画像研究用のスポットリストを、マスター画像のスポットリストと一致させる。従って、その結果が調和したタンパクスポットの１階層（hierarchy）となる。この調和の目的は、該階層を通して同一のポリペプチドスポットをリンクさせ、Strahler等（1990）によって記載されたように、その存在、定量的な変動および特異性を評価する。ゲル間の個々のタンパクの量を比較するために、調節法を利用する。１mm²当たりの光学強度単位で測定された、検出されたポリペプチドの積分強度を、至るところに記載されている、基準ポリペプチドの強度に対して調節する。この調節は、タンパクの積層または染色に起因する、ゲル間の任意の変動を補償するために行う。
対象とする殆どのスポットを定量化し、その結果を表１−５に示した。対象とする、第1-3図に見られる幾つかのスポットは、該表には示されていない。スポット除外の要因は以下の通りである。
−これらは、上記のような大きなスポット群の一部である。
−定量的な結果を解析した後に、それらに対する興味が薄れた（例えば、肺32、44、46、99）。
−それらは既に研究されている。これは、肺スポット番号23-26（np65’s）、56（B23’s）、87-89（P18’s）、97（CRBP-1）、60（PCNA）、78（Hsp27）並びにNDPK-Aを包含する。これら顕著なスポットの幾つかを、各腫瘍サンプル（P18、P18a、CRBP-1、Hsp27、Hsp27a）の特徴付けを補助するために定量した。
他の組織におけるスポットの評価
肺腫瘍において興味あることが分かったスポットに関する、幾らかの見識を得るための試みにおいて、種々の正常な組織および腫瘍組織を研究した。以下のリストに含められたスポットは、定量化され、かつ極めて興味深いものと考えられるスポットの該当するサブセットである。幾つかの定量化されたスポットは、この時点では余り興味深くないと考えられた。というのは、肺腫瘍間の差異が、それ程統計的に有意ではなく、腫瘍型間の平均の差異がそれ程大きくはなく、あるいは該スポットが、コントロール肺サンプル内の腫瘍よりもそれ程大きく思えなかったからである。
極めて小さなP-値を与えなかったものの、幾つかのスポットが依然として含まれている。通常、これは、恐らく興味ある差があると思われるが、使用したかなり単純な統計的テストが、群（ゲルバッチ）の作用を無視しており、しかもサンプルが完全には一致していない（誇張された分散度）幾つかの場合によって影響されるからであると考えられる。また食道癌の研究を含む、以前の研究において興味あるものとされた場合に、好ましいスポットとされるものであった。
GELS：
脳：髄芽腫、神経膠芽腫、および正常なサンプル
乳癌
白血病：AML=ANLL、CALLおよび正常なPBL
肺癌：偏平上皮（Squ）癌、小細胞（SC）癌、腺癌（Adn）および正常な肺のサンプル（NM）
神経芽腫：種々の段階およびmyc複製数
食道癌：食道の偏平上皮癌（SC）、正常な食道（NE）、胃粘膜（GM）、パレット食道（BA）、食道腺癌（EA）および噴門の腫瘍（TC）
記載項目：
L=大きい、即ち食道腺癌または噴門の腫瘍よりも大きい
M=中程度、しかし対象とする腫瘍におけるよりも大きくない
S=小さい
A=存在しない
S?またはA?は、単に該領域に、腫瘍中に観測されるようなものが存在しないことから、幾つかの組織においてスポットを同定できなかったことを意味する。逆に、L?は、該当位置に大きなスポットが存在するが、同一のスポットであるか否かが確認されないことを意味する。A^*は以下に注記があることを意味する。
最初のスポット数は、肺腫瘍の調和において使用したものである（Ab6148）。第二のスポット数は、食道由来の該マスター像に基づくものである（Bb9779）。食道による“@”は、該スポットが該当する食道組織において興味あるとされたものであることを意味する。しばしば、他の報告における食道サンプル中のこれらスポットに関して、注記がある。一つの一般的な観測は、SC肺と神経芽腫との比較が最も容易であることである。
スポットの第一のブロックは、初めにSQまたはAd肺（通常Ad）においてより大きいと考えられており、一方スポットの第二のブロックは、SC肺サンプルにおいてより大きいと考えられていた。これらの定量的な結果は、種々の型のサンプルにおけるスポットサイズに関する、正確な状態を判定するのに使用すべきである。というのは、しばしばあるスポットは、該型の２つにおいてより大きく、あるいは一つの型において最大であり、もう一つが最小であり、第三の型の腫瘍において中程度であるような、パターンを有する。
肺腫瘍に関するスポットの定量
３回のIEFゲル電気泳動から得た、肺偏平上皮腫瘍（Sq）、腺癌腫（Ad）、および小細胞肺癌（SC）のデジタル像におけるスポットを定量した。全体で9Sq、8Adおよび9SCサンプルが存在した。該サンプルの起源は、原発腫瘍（PT）または転移性腫瘍（MT）であった。電気泳動実験によって形成されたこれらゲル群は、該表の第一の欄にＡ、ＢおよびＣとして示した。該腫瘍の「段階（Stage）」は“stg”で示した。
マスター肺癌パターンと一致した像をもつゲルは、殆ど「Ａ」と表示した群由来のものであった。幾つかのスポットは省略した。というのは、これらが定量困難であり、以下の表に示された１種のみのスポット群の一員であると思われ、またはこれらがすでに公知であるからである。サンプル型間で多少とも不変であると思われる10個の基準スポットをも、該スポットの積分強度データの調節で使用するために、定量した。これらのスポットは、検査された他の型の組織を示す、もう一つの表の順序で表示されている。４つの「顕著なスポット（famous spots）」（L2=ホスホリル化Hsp27、L4=ホスホリル化されていないHsp27、P18およびP18a=ホスホリル化P18）をも、該サンプルの特徴付けを補助する目的で、該表に含めた。
該10個の基準スポットを使用したゲル同士の補正は、通常の方法となっているものであった。基準は、本研究における該ゲル全体に渡る各スポットの平均サイズを計算することによって作成した。特定のゲルに関する補正値を計算するために、該基準に対する、該ゲル上の各スポットの比を計算し、（平均log比に対して、真数をとることによって）該比を平均した。もとのスポットの積分強度を、この補正因子で割って、以下の表に示した、補正された積分強度を得る。各ゲルに対して、該補正因子を、表の「ダーク（Dark）」の下方に与える。
各スポットに対して、各型のサンプルに関する平均および分散、並びに該３つの平均が同等であるか否かに関するF-テストのp-値を与える。恐らく肉眼で判定される、泳動効果および幾つかのスポットに関する個々の効果が見られ、電気泳動実験により形成された群に従って、ブロックとして該データを表に示した理由は、この泳動効果である。しばしば、群効果（group effects）を考慮したテストに関する有意性が大きくなり、あるいは大きな値をもつ単一の個体を省略することにより、分散を低下することが、該P-値を大幅に変更するのに十分であることが理解できる。
有力なマーカー
14．小細胞肺癌において大きなスポットとして現れるもの。これは正常な肺組織には見られず、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌では小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および大きな髄芽腫を除く癌においては、これは低強度スポットとして現れる。
15．スポット14と同様な強度および組織分布パターンをもつもの。分離されない関連ポリペプチドの一群を表すものと思われる。
16．小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れるもの。これは少量で正常な肺組織にも存在し、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および大きな髄芽腫を除く癌においては、これは存在しないか、あるいは低強度スポットとして現れる。
17．小細胞肺癌において大きな強度をもつスポットとして現れるもの。これは正常な肺組織中に少量で存在し、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および大きな髄芽腫を除く癌においては、これは存在しないか、あるいは低強度スポットとして現れる。
22．小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れるもの。これは少量で正常な肺組織にも存在し、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、あるいは低強度スポットとして現れる。
27．小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れるもの。これは正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、あるいは低強度スポットとして現れる。
31．これは、小細胞肺癌において中程度乃至高い強度をもつスポットである。これは正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、あるいは低強度スポットとして現れる。
33．小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れるもの。これは正常な肺組織、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌には存在しない。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、あるいは低強度スポットとして現れる。
50．小細胞肺癌において顕著なスポットとして現れ、正常な肺、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織なたびに大きな脳および幾つかの脳腫瘍を除く癌においては、これは中程度乃至低い強度のスポットとして現れる。
68．小細胞肺癌において中程度のサイズのスポットとして現れ、正常な肺、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織ならびに大きな脳および幾つかの脳腫瘍を除く癌においては、これは中程度乃至低い強度のスポットとして現れる。
47．小細胞肺癌において大きな強度をもつスポットとして現れるもの。これは正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは低強度スポットとして現れる。
57．小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れるもの。これは正常な肺組織、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌ではより小さい。殆どの他の組織および癌において、これは低強度スポットとして現れる。
58．小細胞肺癌において高い強度をもつスポットを生ずる。これは、正常な肺組織、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さい。殆どの他の組織および大きな脳のものを除く癌において、これは低強度乃至中程度の強度をもつスポットとして現れる。
59．小細胞肺癌および食道腺癌において高い強度をもつスポットを生ずる。これは、正常な肺組織、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さい。殆どの他の組織および大きな脳のものを除く癌において、これは低強度乃至中程度の強度をもつスポットとして現れる。
61．これは、小細胞肺癌においては、中程度乃至高い強度をもつスポットである。これは正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌において、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
66．これは、小細胞肺癌においては、中程度乃至高い強度をもつスポットである。これは正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌において、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
67．小細胞肺癌において大きなスポットとして現れる。これは正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および大きな関連する脳のものを除く癌において、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
73．小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れる。これは正常な肺組織には存在しないか小さいものであり、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および中程度の関連する脳のものを除く癌において、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
74．恐らく73と関連している。小細胞肺癌において中程度の強度をもつスポットとして現れる。これは正常な肺組織には存在しないか小さいものであり、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および中程度の関連する脳のものを除く癌において、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
81．これは、小細胞肺癌においては、高強度をもつスポットである。これは、正常な肺組織には存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
105．これは、小細胞肺癌においては、中程度乃至高い強度をもつスポットである。これは、正常な肺組織、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さい。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
86．これは、小細胞肺癌においては、高強度をもつスポットである。これは正常な肺組織、肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さい。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、または低強度のスポットとして現れる。
97．これは、小細胞肺癌においては、高強度をもつスポットである。これは正常な肺組織では存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においては小さい。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
98．これは、小細胞肺癌においては、中程度乃至高い強度をもつスポットである。これは、正常な肺組織では存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
106．これは、小細胞肺癌においては、中程度乃至高い強度をもつスポットである。これは、正常な肺組織では存在せず、かつ肺の腺癌および偏平上皮細胞肺癌においてはより小さなスポットとして現れる。殆どの他の組織および癌においては、これは存在しないか、低強度のスポットとして現れる。
109．偏平上皮細胞肺癌において、中程度の強度をもつスポットとして現れ、かつ正常な肺組織では存在せず、また大きな偏平上皮食道癌を除く他の癌においては、存在しないか、あるいは小径のスポットとして現れる。
101．偏平上皮細胞肺癌および肺の腺癌において、中程度の強度をもつスポットとして現れ、正常な肺組織においては小さい。これは、大きな偏平上皮食道癌を除く他の癌においては、存在しないか、小径のスポットとして現れる。
102．101と類似する発現パターンをもつもの。
107．偏平上皮細胞肺癌および腺癌において、高い強度をもつスポットとして現れ、正常な肺組織においては、存在しないか、小さい。これは、小細胞肺癌においては、小さなものであり、また多数の他の癌においては、中程度乃至大きなものである。
21．偏平上皮細胞肺癌および腺癌において、高い強度をもつスポットとして現れ、正常な肺組織においては中程度のものであり、また小細胞肺癌においては、小さなものである。また、これは食道の偏平上皮細胞癌および腺癌においても大きなものであり、かつ他の癌においては種々の変動するサイズのものとして現れる。
62．偏平上皮細胞肺癌および腺癌において、高い強度をもつスポットとして現れ、正常な肺においては中程度のものであり、また小細胞肺癌においては、小さなものである。他の癌においては種々の変動するサイズのものとして現れる。
79．偏平上皮細胞肺癌および腺癌において、高い強度をもつスポットとして現れ、正常な肺においては大きなものである。これは、小細胞肺癌においては、小さなものである。他の組織および癌においては種々の変動するサイズのものとして現れる。
80．偏平上皮細胞肺癌および腺癌において、高い強度をもつスポットとして現れ、また小細胞肺癌においては、小乃至中程度のものである。これは、殆どの他の組織において検出することは困難であるか、あるいは存在しない。
90．偏平上皮細胞肺癌および腺癌において、高い強度をもつスポットとして現れ、また小細胞肺癌においては、小乃至中程度のものであり、しかも正常な肺においては小さなものである。他の組織および癌においては種々の変動するサイズのものとして現れる。
95．偏平上皮細胞肺癌および腺癌においては、染料フロント近傍の大きなスポットとして現れ、また小細胞肺癌においては、小乃至中程度のものであり、しかも正常な肺組織においては小さなものである。他の組織および癌においては変動性のものであるか、検出不能である。
43．偏平上皮細胞肺癌および腺癌においては、高強度のスポットとして現れ、また小細胞肺癌においては、小乃至中程度のものである。多くの他の組織においては検出が困難であるか、あるいは存在しない。
29．偏平上皮細胞肺癌および腺癌においては、大きなスポットとして現れ、また小細胞肺癌および正常な肺組織においては、小乃至中程度のものである。他の殆どの組織おいては変動性のものである。
40．偏平上皮細胞肺癌および腺癌においては、大きなスポットとして現れ、また小細胞肺癌および正常な肺組織においては、小乃至中程度のものである。他の殆どの他の組織おいては変動性のものである。
42．これは、目立たないスポットであり、偏平上皮細胞肺癌および腺癌において最も顕著であり、殆どの他の組織おいてはより小さいか、存在しない。
53．肺腺癌において顕著な、一連のスポットの一部である。
83．このスポットは、偏平上皮細胞肺癌および腺癌において顕著であり、殆どの他の組織おいてはより小さいか、存在しない。
92．これは、目立たないスポットであり、偏平上皮細胞肺癌および腺癌において最も顕著であり、殆どの他の組織おいては極めて小さいか、存在しない。
94．このスポットは、偏平上皮細胞肺癌および腺癌において顕著であり、殆どの他の組織おいては検出が困難であるか、存在しない。
84．このスポットは、肺および食道腺癌および偏平上皮細胞癌において最も顕著であり、他の組織および癌においては、変動性のものである。
100．これは、目立たないスポットであり、偏平上皮細胞肺癌および腺癌において最も顕著であり、殆どの他の組織おいては極めて小さいか、存在しない。
96．偏平上皮細胞肺癌および腺癌においては、高い強度をもつスポットとして現れ、また小細胞肺癌および正常な肺組織においては、小乃至中程度のものである。他の殆どの他の組織おいては変動性のものである。
抗体の生産
該ゲルから溶出した該タンパク、またはそのペプチドフラグメントを、抗体生産用の免疫原として使用できる。これら抗体はポリクローナル抗体であり得、あるいはモノクローナル抗体であり得る。該抗体は、当業者には公知の方法によって製造される。極めて高いアフィニティーおよび特異性をもつ抗体は、癌のマーカー用の免疫学的なテストのために使用できる。
ポリクローナル抗体を製造するために、通常アジュバントと混合される該免疫原を、宿主動物、例えばマウス、モルモット、ラビット、ヤギまたはウマに注入する。該注入は、同一のサイトまたは異なるサイトに、規則的なまたは不規則的な間隔で繰り返される。該宿主動物から周期的に採血し、最適の力価が達成されたことが認められるまで、その抗体力価を評価する。該抗体は、採血によって該宿主動物から採取した抗血清から、あるいは当分野で公知の体細胞ハイブリダイゼーション技術により、得ることができる。
モノクローナル抗体は、当分野で公知の、例えばKohler & Milsten（Nature, 1975, vol.256, pp.495-497）によって製造することができる。一般に、脾細胞は、該免疫原またはそのフラグメントを注入した、宿主動物から得られる。該脾細胞は、該注入された宿主動物と同一または異なる種の、不死化細胞系（セルライン）、好ましくはミエローマ細胞系との細胞融合により不死化される。該融合細胞をクローニングし、得られるハイブリドーマを、該免疫原と特異的に結合するモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングする。
本出願において、用語「免疫学的アッセイ」とは、物質の定量のための免疫学的技術において公知の任意の方法を意味する。免疫学的アッセイの例は、ラジオイムノアッセイである。
インビボでの適用
製造した該抗体は、放射性標識と複合化して、患者に注入することができる。適当な撮像技術を利用して、該放射能により複合化した抗体を用いて、腫瘍の位置の特定を行うことができる。該抗体と結合した放射能の量がかなり増大した場合、または該抗体が、または毒素、抗−腫瘍薬物と複合化されている場合には、該複合体は、インビボで腫瘍細胞を殺すのに使用することができる。該抗体は、ターゲット機能を与え、該毒素、抗−腫瘍薬物または放射能は、該抗体により標的とされた細胞を殺す。該放射性標識は、α−粒子、β−粒子またはγ線を放出する任意の同位体であり得る。該毒素は、任意の物質、例えば細胞に対して有毒であることが知られているリシンであり得る。該抗−腫瘍薬物は、腫瘍を治療するのに有効な任意の薬物、例えばダウノルビシン、5-フルオロウラシル、もしくはその誘導体、またはメトトレキセートを包含する。放射能、毒素または腫瘍治療用薬物と組み合わせた抗体の使用は、当分野で公知であり、例えばRoitt, I.等，Immunology, 1996, pp. 20.8 & 20.9，モスビー、ロンドンを参照のこと。この文献を本発明に援用する。有効投与量は、体重１kg当たり0.005〜500mg抗体であり得る。この複合体は、静脈内、筋肉内または皮下注射によって投与できる。
該タンパクマーカーはまた、肺腫瘍の免疫療法で使用することもできる。例えば、患者の血液由来の免疫担当細胞を、インビトロにて、該患者が罹患している肺腫瘍のサブタイプに対して特異的な、１種以上のタンパクマーカーに繰り返し暴露することができる。これらの攻撃した免疫担当細胞を、該肺腫瘍の免疫療法のために、後に同一の患者に注入することができる。
遺伝子療法
本発明の方法によって同定された腫瘍特異的タンパクに対応する遺伝子を、単離し、かつ同定することができる。所定のタンパクに対応する該遺伝子を単離するための方法は、当業者には周知である。次いで、この遺伝子を、分子生物学的技術によって不活性化し、かつ遺伝子療法によってその身体内で置換することができる。あるいはまた、該腫瘍特異的マーカーの遺伝子に対する、アンチセンス分子を作成し、該アンチセンス分子を治療薬物として使用することができる。当業者にとっては公知の、上記方法の何れかを利用して、該腫瘍特異的遺伝子発現を減じる。
MRP8およびMRP14並びにその腫瘍生物学との関連性、および腫瘍マーカーとしての研究
種々の型の肺腫瘍（即ち、偏平上皮細胞癌、腺癌および小細胞癌）由来の2Dタンパクパターンを比較する研究において、あるタンパクスポットが、これらの腫瘍型において同定され、これは該患者の正常な肺組織中には存在しないことが分かった。このタンパクは、配列MLTELEKALNを与え、これはヒトMRP-8と100%の相同性をもつ。更に、大きなMRP-8スポットを有する肺腫瘍に対する該2Dタンパクパターンに関連して、付随的な低分子量のスポット対の存在が認められ、このことは、公開された数値との比較により明らかとなるように、MRP-14の二つの型と一致する（MRP14は、４コドン離れて位置する２つの翻訳開始サイトをもつ）。肺腫瘍において過度に発現された該スポットタンパクの中で、好ましいスポットタンパクは、MRP8およびMRP14である。
MRP8およびMRP14の腫瘍生物学との関連性
MRP8（10kDa）およびMRP14（14kDa）は、両者共にカルシウム結合タンパクであって、EF−ハンドタンパクのS100ファミリー（family）に属し、一ファミリーは少なくとも17の構成員からなる。タンパクのこのファミリーに対する遺伝子として興味深いのは、ヒト染色体Iq21に位置しており、該染色体の領域は、しばしば異なる腫瘍型で配列されている。これらタンパクは、分化、細胞サイクルの調節および細胞骨格／膜相互作用中に、ある役割を演じることが報告されている。これらタンパク両者は、いずれかの末端における疎水性領域の側面に位置し、かつ中央のヒンジ領域によって分離された、２つの別々のEF−ハンドで構成される。MRP8は、マクロファージにおける走化性活性を媒介することが明らかにされている。興味深いことに、該ヒンジ領域（該２つのEF−ハンド領域間）によってコードされるペプチドは、この効果を特異的に媒介することが示された。従って、これらタンパクは、癌を包含する、慢性的な炎症を生ずる疾患においてある役割を演じているものと思われる。
該N-末端およびカルボキシ−末端EF−ハンドの両者は、カルシウムを結合することができるが、該カルボキシ−末端EF−ハンドが、より高いアフィニティーをもつ。MRP8およびMRP14は、両者共に顆粒球および単球から分泌されることが示されている。これらタンパクは、古典的なシグナルペプチドをもたないので、該タンパクがどのようにして分泌されるかについては、現時点では不明である。一つの可能性は、カルシウムの結合が、該膜との相互作用を可能とする疎水性ドメインを露出させ、結果として該膜の分泌を生ずる可能性があることにある。MRP8およびMRP14の両者が、ホモダイマー化し、また相互にヘテロダイマー化して、種々の分子量をもつ複合体を生成することが明らかにされている。各ホモダイマーまたはヘテロダイマー型の正確な機能については、現時点では不明である。
嚢胞性繊維症抗原に対する抗体（MRP8およびMRP14のヘテロダイマー化により形成されるエピトープ）も、MRP14であることが示された14kDaの抗原に対して正の反応を生じるであろう。この抗体は市販品として入手可能である。この抗体は、同一の患者由来の腫瘍組織および対応する正常な組織部分に関する、免疫組織化学のために利用されている。これらの染色された組織部分は、該正常な肺組織において最小の染色性を示した。腫瘍組織において幾分高い反応性が見られたが、これは恐らく高濃度での浸潤性細胞の存在によるものと思われた。しかしながら、注目すべきことは、該腫瘍に極近接する正常を組織で構成される領域において、かなり多量の免疫反応性が存在し、従って浸潤性細胞（即ち、顆粒球、単球および／またはマクロファージ）が、該腫瘍に補給されていることを示唆している。更に、該抗体が、正常な個体の血清中に存在するものと思われる濃度よりも高い濃度で存在する、肺腫瘍に罹患した患者の血清中の特異的な14kDaのタンパクを識別するか否かを検査した。14例の肺腫瘍患者および14例の正常な個体の血清を、1D電気泳動によって分離し、得られるタンパクをPVDF膜に転写し、かつ市販品として入手できる抗体を使用して精査した。14kDaにおいて可視化したバンド内の、反応性の積分強度分析は、正常な個体（n=14;0.09なる平均強度）由来の血清における反応性と比較して、腫瘍患者（n=14;0.46なる平均強度）由来の血清中で、顕著に高い反応性を示した。
これらの発見は、該MRPが腫瘍組織中に検出された、癌の種々の型のスクリーニングにおける、MRPに対する抗体の役割を示している。
配列決定
幾つかの上記スポットタンパクのアミノ酸配列決定を実施した。該スポットを該ゲルから溶出し、配列決定分析にかける。幾つかの該スポットタンパクのアミノ酸配列を以下に報告する。該スポットタンパクと該配列番号（Seq. ID No.）との対応性を以下の表に示す。

スポットタンパク109は、２つの成分を含む。該主な成分および微量成分の配列を、それぞれ配列番号１０および１１（Seq. ID No. 10および11）に記載する。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ハナシュ、サム
（ii）発明の名称：肺癌用のタンパク質マーカー
（iii）配列の数：１１
（iv）通信先住所：
（Ａ）名あて人：ニカイドウ、マーメルステイン、ミューレイ アンド オラム エルエルピー
（Ｂ）ストリート：６５５ フィフティーンス ストリート、エヌ．ダブリュー．スート ３３０
（Ｃ）シティ：ワシントン
（Ｄ）ステート：デー．シー．
（Ｅ）カントリー：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：２０００５−５７０１
（ｖ）コンピュータが読める形式：
（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル
（Ｃ）動作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30
（vi）本件出願データ：
（Ａ）出願番号：アメリカ合衆国６０／０３８，８１９
（Ｂ）出願日：１９９７年２月１２日
（Ｃ）分類：
（viii）代理人情報：
（Ａ）名前：ウヲング、キング エル．
（Ｂ）登録番号：３７，５００
（Ｃ）整理／処理番号：８１４０−６００２
（ｉｘ）通信情報：
（Ａ）電話：（２０２）６３８−５０００
（Ｂ）テレファックス：（２０２）６３８−４８１０
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはLys又はHisである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはLys又はGIyである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGlu又はAsnである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはLeu又はArgである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGln又はProである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGIu又はLeuである。”
（xi）配列の記載：配列番号：１：

（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：２：

（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３：

（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：４：

（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはHis又はAsp又はSer又はGlnである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGlu又はGlnである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはArg又はIle又はLeuである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはLys又はAla又はArgである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGln又はArgである。”
（xi）配列の記載：配列番号：５：

（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：６：

（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはSer又はAsp又はGlyである。”
（xi）配列の記載：配列番号：７：

（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGly又はIle又はLys又はMetである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGlu又はArgである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはVal又はLeuである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはLys又はGln又はThr又はGluである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはVal又はGlnである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはAsp又はPhe又はLeuである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはArg又はIleである。”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他の情報：/生産物＝”他”
/注＝”XaaはGln又はLys又はPhe又はIleである。”
（xi）配列の記載：配列番号：８：

（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：９：

（２）配列番号１０についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１０：

（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデッドネス：
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１１：

Claims (6)

1. 組織切片における肺腫瘍を検出する方法であって、
   ａ）組織切片をMRP8およびMRP14のヘテロダイマー化により形成されるエピトープに特異的な抗体で処理し、
   ｂ）非結合抗体を洗い流し、そして
   ｃ）肺腫瘍組織の存在に関する指標として該組織切片における結合抗体の量を決定することを含む上記方法。
2. 動物またはヒトの肺癌を検出する方法であって、該動物またはヒト由来の血清サンプル中の肺腫瘍において過度に発現するMRP8およびMRP14からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を検出することからなる上記方法。
3. MRP8およびMRP14タンパク質のヘテロダイマー化により形成されるエピトープに対して特異的な抗体を用いた請求項２に記載の方法。
4. 請求項２に記載の方法であって、
   ａ）組織切片をMRP8およびMRP14タンパク質のヘテロダイマー化により形成されるエピトープに対して特異的な抗体を用いて処理し、
   ｂ）非結合抗体を洗い流し、そして
   ｃ）肺腫瘍の存在に対する指標として、該組織切片における結合抗体の量を決定する上記方法。
5. 請求項２に記載の方法であって、
   ａ）該動物またはヒト由来の血清サンプル中のタンパク質を分離し、
   ｂ）該タンパク質を膜に転写し、
   ｃ）該タンパク質を、MRP8およびMRP14タンパク質のヘテロダイマー化により形成されるエピトープに対して特異的な抗体で精査し、
   ｄ）結合抗体の量を決定し、
   ｅ）バンドにおける反応性の強度を積分し、
   ｆ）該積分強度の分析から、肺腫瘍の存在を決定することからなる上記方法。
6. 該バンドが14kDaであるタンパク質材料である請求項５に記載の方法。

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