JP4374236B2

JP4374236B2 - ゴムノキの培養系を利用した形質転換体及びその評価方法

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Publication number: JP4374236B2
Application number: JP2003373103A
Authority: JP
Inventors: 訓江渡辺
Original assignee: Bridgestone Corp
Current assignee: Bridgestone Corp
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2023-10-31
Also published as: JP2005130815A

Description

本件発明は、ゴムノキの遺伝子組み換え育種、及びその評価技術の分野に属する。

天然ゴムは、ゴムノキの分泌するラテックスという乳液から製造される。工業用ゴム原料を目的として栽培されているゴムノキとしては、トウダイグサ科のパラゴムノキHavea brasiliensisが特に重要であるが、ラテックスを産生するゴムノキとしては、他に、セアラゴムノキ（Manihot glaziovii）、桑科植物のインドゴムノキ（Ficus elastica）等がある。

ゴムノキの苗を植えてから、ラテックスを採取できる程度に成長するまでには、５〜７年かかり、採取期間は、およそ２０−３０年である。

また、パラゴムノキの産出するラテックス中にはおよそ３５％のゴム成分のほか、タンパク質、イノシトール、ケブラキトールなどの糖類、ビタミンEの一種であり天然の老化防止剤としても効果のあるトコトリエノールなど多くの有用物質が含まれている（非特許文献１）。

又、草本類については、遺伝子改変植物の作出の研究が進んでいるが、木本類については、細胞からの再分化が困難な上、植物体を得るまでに長期を要しすぎるために、現在までのところ、研究は極めて限られたものにすぎない。

ゴムノキについても、遺伝子組み換え育種を試みているものはあるが、胚様体への再生に３ヶ月、小植物に至るまでに更に６０日掛け、その後に、植物体で遺伝子が発現しているか確認されているため、育種に相当の期間を要している。（特許文献１）

特許第３２８９０２１号応用ゴム化学１２講金子秀夫著５２−５３頁大成社

ラテックスス、または他のゴムノキ由来の有用物質を増産するため、更にはゴムノキの環境適応性を改善するため等、ゴムノキの形質・特性を更に改良することが望まれている。

パラゴムなどのゴムノキを、遺伝子導入により形質を改良するには、葯、未熟種子又は形成層などから誘導したカルスに遺伝子を導入し、カルスを再分化させ、植物を再生させてから、遺伝子改変の効果を評価すことになる。カルスを再分化させ、植物を再生させるのは、非常に時間がかかるので、その評価が非常に遅れ、改良を繰り返し、育種するには、多大の時間が必要となる。

そこで、本願発明は、遺伝子組み換え植物の育種において、できるだけ早い段階で組み換え植物の評価をすることにより、目的の特性を有する遺伝子改変植物の育種を短期間で行うことを課題とする。

本件発明者らは、ゴムノキの葯、未熟種子又は形成層などから誘導したカルスに標的遺伝子を導入し、その後カルスから不定根を効率よく再生する条件を見出した。そして、遺伝子改変されたゴムノキの不定根を培養することにより、導入遺伝子の植物内での機能を不定根の段階で評価検定できることを見出して本件発明を完成させたものである。

本件発明により、遺伝子改変されたゴムノキの不定根を培養することにより、不定根の段階で遺伝子改変ゴムノキの評価検定が可能となるので、遺伝子改変技術によるゴムノキ植物の育種期間を大幅に削減でき、新たな、目的の特性を有する遺伝子改変ゴムノキを効率的に育種できるようになった。

特に、形質転換により、（１）ゴムの重合反応を制御させることにより、ラテックス中のゴムの分子量又は分子量分布の変更、（２）ゴムの生合成反応の促進することによりゴムのゴム重量の増加、又は（３）有用成分合成を促進することにより、当アルコール、トコトリエノール、有用タンパク質の増加を狙った場合に、その狙い通りの育種ができたか否かを、不定根の段階で、それぞれ、（１）分子量分析、（２）ゴム量の定量、（３）各成分の定量（液体クロマトグラフィー）などによりスクリーニングでき、育種効率の向上を図れるものである。

本願発明は、ゴムノキの葯、未熟種子又は形成層などから誘導したカルス又は未熟胚に遺伝子を導入し、その後カルス又は未熟胚から不定根に分化させ、遺伝子改変されたゴムノキの不定根を培養する、ゴムノキの遺伝子改変不定根を包含する。

更に本願発明は、ゴムノキの遺伝子改変された不定根を用いて、不定根の段階で導入された標的遺伝子による形質転換を評価検定する方法をも包含する。

組織培養の対象となるゴムノキとしては、特に好適には、パラゴムノキが挙げられるが、これ以外に、セアラゴムノキ、インドゴムノキ、パナマゴムノキ、グアユールゴムノキ、ゴムタンポポ、ラゴスゴムノキ、グッタペルガノキ、パラタゴムノキ、シス・チクルが挙げられる。

以下、パラゴムノキを例として説明するが、それ以外のゴムノキについても同様の方法で実施できる。

組織培養に用いる材料としては、パラゴムノキの根、茎、葉又は花等の種々の部分を適宜の大きさに切断して用いることができるが、好適には、つぼみ、未熟果実又は茎を利用し、つぼみから取り出した葯、又は未熟果実から取り出した未熟種子又は茎から取り出した形成層を材料とすることができる。

まず、パラゴムノキの材料の表面を洗浄する。材料として植物内部を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗っても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄することもできる。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗う。

次に、材料を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤・滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好適である。

パラゴムノキから取り出した材料からカルスを誘導し、カルスから不定根を誘導する、又は、パラゴムから採取した材料から直接無菌根を誘導することもできる。

Ｉ．カルスの誘導方法
材料として、好適には、葯、未熟種子又は形成層を用いる。カルスを誘導するには、培地にサイトカイニン系植物ホルモン及び／又はオーキシン系植物ホルモンを、低濃度で加える。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地（SchenkとHildebrandtの培地）、MS培地（MurashigeとSkoogの培地）、ＬＳ培地（LinsmaierとSkoogの培地）、Gamborg、Ｂ５、ＭＢ培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えた又はMS改変培地が好適である。

サイトカイニン系植物ホルモンとしては、BAP（ベンジルアミノプリン）、2iP（イソペンチニルアミノプリン）、カイネチン（６−フルフリルアミノプリン）、ゼアチン、を用いることができるが、好適には、BAP(ベンジルアミノプリン)又はKIN(カイネチン)を１〜３ppmで用いることができる。

オーキシン系植物ホルモンとしては、pCPA（クロロフェノキシ酢酸）、2,4-D(ジクロロフェノキシ酢酸)、IAA（インドール酢酸）、IBA（インドール酪酸）、NAA（ナフタレン酢酸）、NOA（ナフトキシ酢酸）を用いることができる。好適には、2,4-D(ジクロロフェノキシ酢酸)を０．３〜１．０ppm、及びIAA(インドール酢酸)を約１ppm若しくはNAA（ナフタレン酢酸）を約１ppmを組み合わせて用いることができる。

更に好適には、サイトカイニン系植物ホルモンとオーキシン系植物ホルモンとを組み合わせて用いることができ、例えば、BAP若しくはKIN、２，４−Ｄ、及びIAA若しくはNAAの３種類を組み合わせて用いることができる。

更に、カルス誘導を促進するために、スクロースを６〜７wt％の高濃度で添加し、ココナッツウォーターを加えても良い。好適には、PHを５．６〜５．８に調整し、培養温度は、２６〜２８℃、暗所にてカルス誘導する。カルスの支持体としてはゲルライトあるいは寒天を用いることができる。

誘導したカルスを、１〜２ヶ月間同じ組成の培地で暗所、培養温度は、２６〜２８℃で培養し、カルスを増殖させる。６−７週間で好適なカルスが得られる。

II.未熟胚の調製法
好ましくは、外果皮が硬化する前の段階の未熟な緑色の果実を利用する。未熟果実の表面を、周知の滅菌剤、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム好適には、エタノールで滅菌する。滅菌した後、果実の内部の種子をとりだす。未熟種子の胚に成長する部分を摘出する。

摘出した未熟胚は、培地で成長させる。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地、MS培地、ＬＳ培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えたMS改変培地が好適である。

III.遺伝子導入法
III-1 標的遺伝子組み換えベクターの調製
ゴムノキに導入する標的遺伝子としては、例えば、ゴムの生合成機構やポリイソプレン鎖延長反応に関与し、ラテックスの産生量や分子量に対して機能する遺伝子、並びに、ラテックス中に含まれる、タンパク質、イノシトール、ケブラキトールなどの糖類、ビタミンEの一種であり天然の老化防止剤としても効果のあるトコトリエノールの生合成に関与し、その生産量に対して影響を与える遺伝子、さらには、これらのタンパク質、糖類、トコトリエノールの変異体を生ずる遺伝子などを挙がることができるが、これらに限定されず、任意の遺伝子を導入することができる。上記標的遺伝子は、ゴムノキで機能するプロモーターに連結してベクターに載せられる。ゴムノキで機能するプロモーターとしては、ゴムノキ由来のプロモーターであっても、異種以来のものであっても、ゴムノキにおいて機能する限り使用することができる、異種プロモーターとしては、例えば、CaMV35、NOS promoter等を使用することができる。

標的遺伝子は、好適には、マーカー遺伝子、場合により、レポーター遺伝子とともにベクターに組み込まれる。

選抜用マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（nptII）、ヒエグロマイシン耐性遺伝子（hptI）、ブレオマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ、GUS（βグルクロニダーゼ）遺伝子などを挙げることができる。

III-2 標的遺伝子のカルス又は未熟胚への導入方法
標的遺伝子組み換えベクターは、周知の手段、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等により、カルス又は未熟胚に導入される。

III-2-1 パーティクルガン法を利用する場合は、次のように行う。まず、金粒子（好適には直径１−２μｍ）に調製された標的遺伝子組み換えベクターでコーティングし、マイクロキャリアーに接着させる。カルス又は未熟胚をプレートに並べ、パーティクルガン装置で、２回打ち込む。

III-2-2 アグロバクテリウム法では次のように行う。
上記III-1で調製した標的遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス中のTiプラスミドと相同組み換えされるか、又は標的遺伝子バイナリーベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンスに導入する。
形質転換されたアグロバクテリウムを、カルスに感染させることにより、標的遺伝子をカルスに導入することができる。

III-3 エレクトロポレーション法
III-1で調製したカルスより、プロトプラストを調製する。調製したプロトプラストをIII-1で調製した標的遺伝子組み換えベクターの共存下、溶液中で、高圧電場を掛け、標的遺伝子をプロトプラストに導入する。

IV.カルスから不定根を誘導する方法
遺伝子導入されたカルス又はプロトプラストは、培地中で増殖させる。
増殖させたカルスから、不定根を誘導する。不定根誘導には、好適には、MS基本培地にIBA（インドール酪酸）を３〜１０ppm添加した培地を用いる。更に好適には、スクロースを６〜７ｗｔ％添加する。IAA,NAA等のオーキシン類は添加しても、添加しなくても良い。

Ｖ．未熟胚からの無菌根の誘導
遺伝子導入された未熟胚は、培地で成長させる。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地、MS培地、ＬＳ培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えたMS改変培地が好適である。

約３０日程度培養し比較的成長した未熟胚から、ＭS基本培地をベースにスクロースを添加すれば、ホルモン種にあまり影響されることなしに根を誘導することができる。

VII．根の大量増殖
上記１．又は２．で誘導された不定根又は無菌根を、適宜の大きさ、好適には、２〜３cm角の小片に切り分ける。適宜の培地、例えば、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地、MS培地、ＬＳ培地又はMＢ培地を用いることができ、好適には、MS培地を用い、培地中にIBA３〜１０ppmを加えて、培養することにより、根の増殖を行うことができる。培地は固体でも液体でも良い。固体培地で行う場合は、適当な大きさに根が成長すると、根の一部を切断し、更に移植して、増殖する。好適には、液体培地を用いて、振トウ培養を、ジャーファーメンター等を用いて行う。液体培養することで、いっそう効率のよい増殖が可能で、移植操作も容易となる。

VIII．根から標的遺伝子の発現の確認
大量培養して、増殖させた根培養物から、標的遺伝子産物を抽出する。

さらに、微量の抽出物は熱分解GC/MS、FT-IR、又はNMＲなどの手法で分析することにより、成分を確認できる。

また、大量に増殖した根より、ラテックスを抽出し、さらにゴム成分を遠心分離などの手法によって分離後、標的遺伝子の産物である、たんぱく質、糖、トコトリエノールなどの有用物質を検出する。

[実施例１]カルスの誘導組織培養によるラテックスの産生方法
（１）葯・未熟種子・形成層からカルスを経由して不定根を得る方法
外植体として用いる雄花の葯は蕾の状態のものをパラゴムノキから採取し、希釈した次亜鉛素酸ソーダ溶液で消毒後、蕾を開いて取り出した。未熟種子は外皮が緑色の軟らかい果実から採取した。形成層は若い枝を採取し、表面をエタノールで洗浄後、サンプリングした。

カルス誘導にはMS基本培地に、1〜3ppmのBAP若しくはKINと、0.3〜1ppmの2,4-D、さらに1ppmのNAA若しくはIAAを添加、さらに6〜7％のスクロースおよび5％程度のココナッツウォータを加えた培地を調整した。pHは5.6〜5.8に調製し、支持体としては、ゲルライトあるいは寒天粉末を使用した。

27〜28℃の暗所で1〜2ヶ月培養することにより、カルスの増殖が確認された。
増殖されたカルスはホルモン組成のみ3〜10ppmに変えた、カルス誘導と同一組成の培地に移植した。IAA、NAAなどのオーキシンは加えても加えなくてもよい。IBAを加え、16時間光照射した27〜28℃の環境で1〜数ヶ月培養することにより不定根を誘導することができた。形成した発根を図１に示す。

（２）未熟胚から無菌根を誘導する方法
比較的成長した未熟胚を種子からサンプリングし、MS基本培地に6〜7％のスクロースを加えた培地で培養することにより、ホルモン種にはあまり影響されることなしに、無菌根を誘導することができた。

（３）根の大量増殖
上記（１）、（２）の培養で得た根を2〜3cm以上の小片に切り分け、IBA 3〜10ppmを加えた培地で根を増殖させた。培地は個体でも液体でも良い結果を得た。(図２参照。)

（４）＜培養根中のラテックスの確認＞
増殖が進んだ根の培養物においては、移植操作時の切断により、ラテックスの浸出が黙示で確認できた。さらにその組成を分析するために、培養根を有機溶媒(クロロホルムなど)でソクスレー抽出を行い、抽出部分を熱分解GC/MS,FT-IR,NMRなどの手法で分析した。
例えば、NMRでＣＤＣ１３を溶媒として測定したところ、１３５．２４ppm、１２５．０８ppm、３２．２５ppm、２６．４４ppm、及び２３．４４ppmの位置に高いピークが見られ、これ以外に、１２８．０ppm、１２０．４ppm、２９．７ppm、２２．７ppm及び14.1ppmの位置に低いピークが見られた。

その結果、天然ゴムの主成分である、シスポリイソプレンが多量に存在することが確認されたほか、糖類、アミノ酸、タンパク質、高級脂肪酸などの有用成分が同定された。(図３ NMRスペクトル参照)

[実施例2] カルスへの遺伝子導入
（１）カルスへ導入するプラスミドの調製
ここではβ-glucuronidase（通称：GUS）をレポータータンパク質として用いる。GUSは、D-グルクロン酸のβ型配糖体に作用してそのグルクロニド結合を加水分解する酵素であり、ゴムノキには存在しない。そこで、GUS遺伝子と、コローニー選抜用の抗生物質抵抗性遺伝子を有するプラスミドを次のように設計した。

GUS遺伝子と、ハイグロイマイシン抵抗性遺伝子（ｈｙｇｒ）をCaMV35Sのプロモータの下流になるようにpUC１９のマルチクローニングサイトに組み込んで、pU１９―GUSを調製する。

（２）プラスミドのカルスへの導入
遺伝子導入にはパーティクルガン（BIORAD PDS 1000/He）を用いる。ラプチャーディスクは1100psi(7.58Mpa)を用いる。マイクロキャリーからストッピングスクリーンまでの距離は、１．０ｃｍ、ストッピングスクリーンから打ち込み対象のカルス試料までの距離は9．5cmとする。撃ち込みには上記のpCU１９−GUSプラスミドをコーティングした1.6μmの金粒子を用いる。

（３）１次選抜
カルスは遺伝子導入2日後にハイグロマイシンを含む選抜培地に移し、培養し、生長してきたカルスを１次選抜する。

（４）根の誘導
遺伝子導入されたカルス又はプロトプラストは、培地中で増殖させる。
増殖させたカルスから、不定根を誘導する。不定根誘導には、好適には、MS基本培地にIBA（インドール酪酸）を３〜１０ppm添加した培地を用いる。更に好適には、スクロースを６〜７ｗｔ％添加する。

（５）根の大量培養
上記（４）で誘導された不定根を、約１cm角の小片に切り分ける。MS培地培地中にIBA３〜１０ppmを加えて、ジャーファーメンターを用いて、培養することにより、根の増殖を行うことができる。

（６）GUSの発現確認
大量増殖された根の組織（0.1g）を採取し、GUS抽出バッファー（50mM リン酸ナトリウムバッファー,10mM EDTA,0.1% Triton X-100,0.1%サルコシル,10mM 2-ME）を0.5ml加えてよくホモジナイズし、全量をエッペンドルフチューブに移し、５分間遠心する。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ここから、10μlを採取し、別のエッペンドフルチューブに移し、これをGUS含有サンプルとする。次に、上記GUS含有サンプルにGUS基質溶液（１ｍM 4-MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide、50mM リン酸ナトリウムバッファー,10mM EDTA,0.1% Triton X-100,0.1%サルコシル,10mM 2-ME）90μlを加え、37℃で1時間保温後、900μlの反応停止液（0.2% Na2CO3）を加え、反応を停止する。蛍光分光光度計（励起365nm、蛍光455nm）により蛍光強度を定量的に測定する。
これにより、遺伝子導入された、根をスクリーニングすることができる。

IBA含有培地でのカルスの発根伸長した培養根培養根からクロロホルム抽出した抽出物の13C-NMRスペクトル

Claims

ゴムノキの葯、未熟種子又は形成層から誘導したカルスに標的遺伝子を導入し、該カルスから、３〜１０ppmIBA（インドール酪酸）及び６〜７ｗｔ％スクロースを添加した培地を用いて、不定根又は無菌根を誘導させ、該根を切り分けた小片とし、IBAを含有する培地で培養することを含む、ゴムノキの形質転換された根の培養方法。
ゴムノキの未熟胚の組織培養物に標的遺伝子を導入し、該組織培養物から６〜７ｗｔ％スクロースを添加した培地を用いて不定根又は無菌根を誘導させ、該根を切り分け小片とし、IBAを含有する培地で培養することを含む、ゴムノキの形質転換された根の培養方法。
ゴムノキが、パラゴムノキである請求項１又は２記載のゴムノキの形質転換された根の培養方法。
標的遺伝子が、ゴムの生合成機構又はポリイソプレン鎖延長反応に関与する遺伝子、若しくは、ラテックス中に含まれる、タンパク質、イノシトール、ケブラキトール等の糖類、又はトコトリエノールの生合成に関与する遺伝子である請求項１〜３いずれか１項記載のゴムノキの形質転換された根の培養方法。