JP4380807B2

JP4380807B2 - Method for separating nucleic acids

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Publication number: JP4380807B2
Application number: JP03913597A
Authority: JP
Inventors: 可君范; 政明北島; 澄笠井; 滋玉造
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2017-02-24
Also published as: JPH101493A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸プローブを固定化された微粒子を用いて核酸とヌクレアーゼが共存する検体から核酸を分離する方法を用いて検体中の核酸を検出するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、血清、血漿中に浮遊しているウィルスまたは細菌を検出するには、次のような方法によっていた。まず全血液を低速遠心にかけ、血球成分を沈澱させ、上清の血清または血漿を回収する。次いで回収された血清または血漿に高濃度グアンチュームチオシアネート溶液（ＧＴＣ）と微量のＳＨ基酸化防止剤を加えると、ウィルス殻、細菌膜が破壊されると同時に、遊離されるウィルスまたは細菌の核酸の分解が抑えられる（Sambrook他著、“Molecular Cloning 2nd Ed.” Sec7., Cold Spring Harbor Press, New York, USA）。
血清中には大量の蛋白質、脂質、糖、および他の分子が含まれるので、前分離処理なしでは血清中の標的遺伝子を検出することはできない。そこで、通常、クロロホルム／フェノールまたはイソプロピルアルコール等の有機溶媒を使って、さらに、これらの溶媒中の蛋白質と核酸の溶解度の違いを利用して、血清中の核酸と蛋白質の分離を行ってから、標的遺伝子を核酸プローブ法またはポリメラーゼ増幅反応（ＰＣＲ法）により検出していた。
【０００３】
前記有機溶媒を使用する核酸と蛋白質の分離法は、血清中に存在する全ての核酸と全ての蛋白質を分離する方法であるので、分離された核酸中には検出の対象である標的核酸以外の核酸が大量に含まれている。もし所定量の検査対象の検体中に標的核酸が数分子ないし数十分子しか含まれない場合、標的遺伝子検出のバックグランドが大きくなり、このため標的核酸が検出できないことがある。バックグラウンドを小さくするために、一つの方法として検査対象の検体に使う血清または血漿の量を減らすこともできるが、この方法には結果的に検査感度を低下させてしまうという問題点がある。加えて、この溶媒を使用した分離方法の操作は煩雑であるために、大量の臨床検体の日常的な処理に対しては不向きであった。
【０００４】
上記の問題点を解決するために提案されたもう一つ方法は、核酸を蛋白質と分離するために、有機溶媒の代わりにイオン交換樹脂またはガラスビーズを使用し、さらに異なる核酸と蛋白質間の荷電度の違いを利用することから成る。この方法は、通常の水溶液中に混在する核酸と蛋白質の分離には有効であるが、血清または血漿中に核酸とヌクレアーゼが共存する場合、特に標的遺伝子が、例えばＨＩＶまたはＨＣＶ中のＲＮＡであるとき、検体中に大量に含まれるＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）の活性を妨げるために、少なくとも約２Ｍ／ｌのＧＴＣ溶液を検体の血清に添加する必要があるが、それには、検体中の電荷イオンが塩によって中和されてしまうという効果があるので、そのような場合において、この方法は効果がなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明によって提示される課題とは、生物学的液体から誘導された検体から、特に検体中に核酸とヌクレアーゼが共存する場合において、標的核酸を特異的に分離し、上記の問題点のない、上記のような検体中からウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
一つの局面によれば、本発明は血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）血液の血清および／または血漿からウィルスまたは細菌を含む液体画分を得る工程、
（ｂ）液体画分中に標的核酸を溶出するためにウィルスまたは細菌を溶解する工程、
（ｃ）細菌またはウィルスの標的核酸をハイブリッド形成によって捕獲するために、特定の配列のウィルスまたは細菌の標的核酸に対して実質上相補的である核酸プローブを比重１.１から２.５を有する粒子に化学的に結合することによって得られる、核酸プローブを有する粒子を（ｂ）の工程で得られた溶解物に添加する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において得られた系からウィルスまたは細菌の標的核酸を捕捉した粒子を回収する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で回収した、標的核酸を捕捉した粒子を、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、直接ポリメラーゼ増幅反応または逆転写ポリメラーゼ増幅反応に付し次いで増幅された核酸を検出する工程
よりなる方法であり、前記工程（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程の前、或いは途中で、蛋白質変性剤を添加することを特徴とする方法である。
【０００７】
本発明の方法は、長時間を必要とせず、容易に実行に移せて、よって臨床検査センターや病院における大量の検体の日常的な処理に十分適切である技術を使用して、生物学的液体検体または生物学的液体から誘導された検体からウィルスまたは細菌の標的核酸を特異的に、かつ効率的に分離することを可能とする。その分離方法を利用することにより、特にＨＩＶ−ＲＮＡおよびＨＣＶ−ＲＮＡの検体において、非常に高感度な標的核酸の検出が可能となる。
本発明の方法が適用され得る検体は、
【０００８】
血清および／または血漿（以下、これらを「血清等」という）である。
そのような血清等は、ヒトまたは動物の全血液から低速の遠心分離を利用して血球成分を分離することによって容易に調製することができる。通常の免疫検査によって調製される血清をそのまま用いることもできる。血清等には、もし適当であるならば、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、あるいはＥＤＴＡのような抗血液凝固剤が含まれていてもよい。
本発明において分離される核酸が宿主中に含まれる場合には、核酸を溶出するために、すなわち液体画分中に核酸を溶出するために、該宿主の外殻または膜を溶解または破壊することが必要である。かくして本発明の方法には、ウィルス殻または細菌膜を破砕する方法を要する。
【０００９】
ウィルス殻または細菌膜を破砕する方法としては、通常に用いられるいかなる適当な物理的、電気的または化学的な方法が使用できる。そのような破砕方法の例としては、超音波破砕法、電気ショック法、浸透圧差を利用する方法、界面活性剤を利用する方法等が挙げられる。
ウィルス殻または細菌膜を破砕するための特に適当なものとして、“PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications”（M.A. Innis et. Al., 1990, Academic Press, NY, USA）に記載の方法がある。
本発明の方法によって分離されるべきウィルスまたは細菌の標的核酸はＲＮＡおよび／またはＤＮＡでもよい。本発明の方法は、標的核酸がＨＩＶ−ＲＮＡあるいはＨＣＶ−ＲＮＡのようなＲＮＡである場合に特に好適である。
【００１０】
本発明において、ウィルスまたは細菌から遊離される核酸が検体中のヌクレアーゼにより分解されることを妨げるために、蛋白質変性剤によって検体のヌクレアーゼ活性が抑えられる。
ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の活性を抑える当該技術分野における様々な方法が知られている。好適な方法の一例としては、例えばMolecular Cloning（前期に引用）に記載されているグアニチュームチオシアネート（ＧＴＣ）のような蛋白質変性剤を用いる方法が挙げられる。グアニチュームチオシアネートは、通常ＳＨ基含有酸化防止剤を含有する。
【００１１】
本発明が適応される血清等のＧＴＣの濃度は、約０.１〜５モル／ｌ、好ましくは約０.２〜４.５モル／ｌである。もしこの濃度が約０.１モル／ｌより少ないと、濃度が低すぎて所定のＲＮａｓｅ活性を抑えることができない。一方、約５モル／ｌより多い場合には、ＧＴＣにおいて溶液が飽和状態となり、そのような飽和溶液の実際の使用は困難となる。
ＳＨ基含有酸化防止剤の例としては、ジチオトレイトール、メルカプト酢酸、メルカプトエタノールが挙げられる。血清等中のＳＨ基含有酸化防止剤の濃度は、好ましくは約０.１〜３００ミリモル／ｌ、より好ましくは約１〜１００ｍミリモル／ｌである。もしその濃度が約０.１ミリモル／ｌより少ないと、濃度が低すぎてＲＮａｓｅ活性を抑えることができない。
【００１２】
本発明において、蛋白質変性剤は、本発明の方法における（ａ）〜（ｄ）のどの工程の前、或いは途中で添加されてもよいが、通常、その変性剤はウィルスまたは細菌の標的核酸の液体画分中への溶出の直前あるいは直後に添加されるのが好ましい。
本発明において使用する核酸プローブを担持させる粒子としては、有機高分子粒子、無機粒子、またはこれらの複合体のいずれでもよい。
本発明において使用する核酸プローブを担持させる粒子の比重は、約１.１〜約２.５、好ましくは約１.２〜約２.０である。もしその比重が約１.１より小さくなると、粒子を遠心分離により沈澱させられなくなる。また、もしその比重が約２.５より大きくなると、標的核酸の捕捉反応の間の短い時間内にも粒子が沈澱してしまい、効率的に標的核酸を回収することができない。
【００１３】
粒子を形成するために使用可能な有機高分子の例としては、一つ以上のハロゲン原子を分子中に有するコモノマーを他のコモノマーと共重合することによって得られた重合体を挙げることができる。そのような一つ以上のハロゲン原子を分子中に有するモノマーとしては、例えばモノフルオロフェニル（メタ）アクリレート、トリクロロフェニル（メタ）アクリレート、モノブロモフェニル（メタ）アクリレート、トリブロモフェニル（メタ）アクリレート、モノイオドフェニル（メタ）アクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルアクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルメタクリレート、α−クロロフェニルアクリレートおよびα−クロロフェニルメタクリレートが挙げられる。
【００１４】
他のコモノマーの例としては、芳香族ビニル化合物、α,β−不飽和カルボン酸およびそのエステル類とアミド類、α,β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、スチレン、クロロスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、および臭化ビニルのような低級脂肪酸ビニルエステル化合物が挙げられる。
【００１５】
一つ以上のハロゲン原子を分子中に有するモノマーは、通常室温で水溶性の固体である。従って、これらは前記したコモノマーと一緒に水性媒体中に微分散させてエマルジョンを形成させ、次いで目的とする粒子を得るために、乳化重合、懸濁重合、シード重合、溶液沈澱重合、分散重合等に掛けることが好ましい。
【００１６】
本発明において使用するのに好適な粒子の平均粒子径は、そのような微粒子は遠心分離等の簡便な操作で回収できるので、好ましくは約０.０５μｍ以上、より好ましくは約０.１μｍ以上である。一方、各粒子の単位体積当りの表面積を大きくし、その粒子がハイブリダイゼーションの適当な条件下で効率よく標的核酸を捕捉できるためには、その平均粒子径は、好ましくは約５μｍ以下、より好ましくは約３μｍ以下である。さらに、本発明において使用する粒子は、水性媒体中で使用されるために、不水溶性でなければならない。
本発明において使用するのに好適な無機粒子としては、例えばガラスビーズ、金属または金属酸化物の粒子を挙げることができる。
好適な複合粒子としては、例えば有機高分子で表面被覆された無機コア粒子、あるいは有機高分子中に分散された複数個の無機粒子が挙げられる。
【００１７】
本発明において、少なくとも一つの常磁性体あるいは超常磁性体を含有する粒子（以下、「磁性粒子」という）を使用することもできる。次いで磁性粒子の分離は、遠心分離のほか、磁石の利用によっても、便利に、且つ迅速に実現できる。超常磁性体の例としては、鉄、酸化鉄（Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｆｅ₃Ｏ₄）、窒化鉄、ニッケル、酸化ニッケルの超微粒子、およびこれらの金属および化合物のいずれかを含有する粒子が挙げられる。
このような磁性粒子は、例えば特開昭６１−１９１０３号公報に記述されている方法によって調整できる。
このように調製された磁性粒子は有機高分子で表面被覆されることが望ましい。これは、例えば磁性粒子を揮発性の有機溶媒に溶解させたモノマーと開始剤からなる液に添加し、脱溶媒と共にモノマーを磁性粒子の内に含浸させた後に、界面活性剤の入った水溶液中に磁性粒子を分散させ、粒子中に含まれるモノマーを加熱重合することにより都合よく実現される。このように表面被覆された粒子を核酸プローブと結合させやすくするために、表面被覆に使用されたモノマーの一部またはすべては、好ましくはカルボキシル基を側鎖にもつモノマーである。
【００１８】
本発明に用いる粒子の表面におけるカルボキシル基量は、好ましくはドライ粒子の質量当り約０.０１〜０.８ｍｅｑ／ｇであり、より好ましくは約０.０２〜０.５ｍｅｑ／ｇである。カルボキシル基量が約０.０１ｍｅｑ／ｇ以下になると、核酸プローブの固定化における粒子の効率が著しく低下し、また、核酸プローブが固定された粒子の安定性も低下する。このような粒子は、一粒子あたり数分子ないし数十分子の標的核酸の捕捉を行うという本発明の目標にとっては好ましくない。しかしながら、その一方では、カルボキシル基量が約０.８ｍｅｑ／ｇ以上になると、実質的にこのような粒子を調製することは容易ではない。粒子表面のカルボキシル基量の範囲は、本発明の用途および粒子調製のコストとのバランスを考慮して選択される。
【００１９】
本発明に用いる粒子の表面にカルボキシル基を導入する手段としては、前述のように重合または表面被覆する工程において、適量のカルボキシル基を有するモノマーを添加することにより達成できる。
少なくとも本発明に用いる粒子の表面は、前述したように、有機高分子材料で被覆されることが望ましい。そのような有機高分子材料には、例えばスチレン、ジビニルベンゼン、（メタ）アクリル酸、ハロゲン化ビニル化合物、およびそれらの派生化合物が含まれる。また、このように表面被覆された粒子を核酸プローブと化学的に結合させやすくするために、粒子表面にカルボキシル基を導入することが望ましい。
【００２０】
本発明において使用する核酸プローブは、固定化部位とハイブリッド形成部位により構成される。
核酸プローブ中のハイブリッド形成部位の配列は、標的核酸の特定の配列と実質的に相補的である配列を含んでいる。本発明において特に好適である検体である血清等には、通常、大過剰な望ましくない核酸、蛋白質、脂質、糖、および他の分子が、例えば標的核酸の数千倍〜数百万倍の濃度で含まれているので、標的核酸を特異的に、迅速に、且つ効率的に抽出、分離および検出するために、核酸プローブ中のハイブリッド形成部位の配列は、少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでいることが望ましい。一方、ハイブリッド形成部位の配列中のヌクレオチド数の上限は特に制限されないが、通常１００個以下、好ましくは８０個以下である。この上限は、ヌクレオチドの合成における経済面および効率を考慮して選択される。
【００２１】
本発明において使用する核酸プローブの固定化部位の配列は、第１級アミノ基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含有する。その配列は、通常１〜２０個、好ましくは３〜１５個のヌクレオチドから構成される。
核酸プローブの固定化部位の配列中の第１級アミノ基を有するヌクレオチドとしては、例えばデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）が挙げられるが、担体粒子表面に存在するカルボキシル基との反応性が高いという点で、ｄＡおよびｄＣが好ましい。第１級アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、一種類のヌクレオチドで構成されていてもよいし、２種類以上のヌクレオチドで構成されていてもよいが、ハイブリッド形成の相手となる標的核酸中の特定の配列以外の配列と偶然に相補的な配列の発生を避けるために、１種類のヌクレオチド、特にｄＡまたはｄＣ、で構成されることが望ましい。本発明で使用される核酸プローブが標的核酸の検出工程における酵素反応に影響を与えないために、粒子と核酸プローブとの接合部位がプローブの配列の３’末端の塩基であることが好ましい。さらに、３’末端の塩基を化学修飾することによって、その意図する効果がさらに増大するかもしれない。この化学修飾には、例えばアルキル基、アミノ基、ニトロ基等の官能基を３’末端の塩基に導入する方法がある。
【００２２】
［核酸プローブ粒子の調製］
本発明において使用する核酸プローブを担体粒子へ固定する法として、例えば特開平７−７５５９９号公報および特開平６−３３５３８０号公報に記述されている方法が適用される。
簡潔に述べれば、核酸プローブ１当量分と核酸プローブのハイブリッド形成部位と相補的であるＤＮＡ１当量分とをアニーリング緩衝液中で混合し、８０℃で５分間加熱した後、徐々に室温に戻し、２本鎖のＤＮＡを形成する。この２本鎖のＤＮＡをヒドロキシアパタイトカラムに通して精製した後に、脱水縮合剤と共に担体粒子の分散に添加し、加熱することによって、核酸プローブの固定化部位の配列中の第１級アミノ基がアミド結合により粒子表面に存在するカルボキシル基に固定される。
【００２３】
ここで言う脱水縮合剤とは、例えば１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド類、そしてＮ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジヒドロキノリン等も含有する水溶性の脱水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、これらに加えて、油溶性の脱水縮合剤も使用することができる。
粒子の使用量は、通常核酸プローブ１ミリモル当り、約０.１〜５００ｇ、好ましくは約５〜５０ｇである。核酸プローブの粒子への固定化は、約ｐＨ３〜１１程度の水性媒体中、４〜７０℃において、５分から一夜の間で実行されればよい。
【００２４】
次に、この粒子に固定化された核酸プローブ中のハイブリッド形成部位に結合した相補的な配列を離脱させることによって、本発明において使用する核酸プローブを有する粒子が得られる。上記のこの際、前記の相補的な配列の離脱は、熱またはアルカリ変性により達成されることができ、その後このように離脱された相補的な配列は、遠心分離、濾過等の手段によって除去することができる。
標的核酸の捕捉を実現するために、核酸プローブを有する粒子が、前記に示す方法において処理された生物学的液体、特に血清等の検体に、核酸プローブと標的核酸の特定の配列との間においてハイブリッド形成を可能とする条件下において添加される。
【００２５】
本発明において、ハイブリッド形成の条件は、標的核酸の形態および特定の配列によって異なるが、一般的に塩濃度が０.２モル〜１０モル、温度が１０℃〜７０℃、時間が１０分〜１００分であるように選択される。
本発明により分離される標的核酸がウィルスまたは細菌のゲノムから誘導される場合、標的核酸を含むゲノムの高次三次元構造を破壊するために、核酸プローブを有する粒子を加える前または加えてから反応系全体を約５０℃〜約７５℃で一度加熱することが望ましい。ゲノムはウィルスまたは細菌のゲノムでもよいし、または検体が収集され、そして標的核酸が注入されるヒトまたは動物のゲノムであってもよい。
【００２６】
ハイブリッド形成反応中は、界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を、系の核酸プローブ粒子の安定性および分散性を維持するために、ハイブリッド形成反応系に加えられることが望ましい。例えば、ノニオン性界面活性剤の約０.１重量％〜２０重量％が系に加えられてもよい。適当なノニオン性界面活性剤の例には、TRITON(r) X シリーズ、TWEEN(r) シリーズ、BRIJ(r) シリーズ（全てシグマ社製）が含まれる。それらのノニオン性界面活性剤のいずれも上記の濃度において系に加えられてもよい。
また、それらの界面活性剤と同様な分子構造を有する反応性モノマーのいずれも重合時に粒子に加えられることによって、界面活性剤を粒子表面に予め含有させていてもよい。
【００２７】
本発明の方法による粒子によって捕捉された標的核酸は、もし必要であれば、熱やアルカリにより粒子から分離することができる。
【００２８】
本発明の方法により捕捉された標的核酸の検出は、
【００２９】
血清等の検体中に存在する標的核酸が極く微量であるので、例えばポリメラーゼ増幅反応（ＰＣＲ）または逆転写ポリメラーゼ増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ法）のような核酸増幅法を利用し、増幅された核酸を検出することで行われる。
そのような核酸増幅法において、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、標的核酸を捕捉した粒子を直接ポリメラーゼ増幅反応系に加えることが適切である。
検体中の他の成分と標的核酸との先立って行われた特定の分離処理のため、その核酸増幅反応は、検体中に存在し得るいかなる反応抑制剤からも影響を受けない。特に血清等に対して、ＰＣＲ法或いはＲＴ−ＰＣＲ法は血清成分由来の反応抑制剤の影響を受けず、通常の溶液系反応で検出される時のものと同等の感度において標的核酸の検出を可能とする。
【００３０】
増幅された核酸の検出は、当該技術分野において知られているいかなる検出方法、特に紫外線下においてビジュアル化する方法、或いはラベル化された核酸プローブとのハイブリッド形成反応を利用する方法のいずれによっても実施できる。特に簡単に利用できる方法は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色し、紫外線下において増幅産物を検出することから構成される。この方法において、核酸プローブ粒子を増幅反応産物と共にゲルに加えてもよい。また、もし必要であれば、予め増幅領域に対応するプローブが固定されたウェルを有するプレートを使用することも可能である。そのようなプレートを使用する場合、増幅産物のある領域がウェルに固定化されているプローブとハイブリッドを形成しやすく、増幅産物のその他の領域に対応するもう一つのラベル化されたプローブが使用されれば、前記同様の方法で増幅産物を検出できる。
【００３１】
さらなる局面によると、本発明は上記の核酸プローブを有する粒子からなる、生物学的液体検体中または生物学的液体から誘導された検体中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出するためのキットと標的核酸を検出する方法に関するものである。さらに、そのキットは適切に、標的核酸を増幅する方法、特にＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ法による増幅による方法を包括する。
本発明を以下の実施例に基づき具体的に説明する。
【００３２】
【実施例】
実施例１
ポリマー粒子の生成
１）高比重ポリマー粒子
スチレン５０ｇ、２,４,６−トリブロムフェニルメタクリレート４５ｇ、メタクリル酸５ｇ、過硫酸カリウム１ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム１ｇ、水１０００ｇを窒素雰囲気下に７０℃で１０時間乳化重合することで、粒子径約０.３μｍ、粒子比重約１.４を有するカルボキシル基変性された高比重ポリマー粒子を得た。
２）磁性ポリマー粒子
スチレン５０ｇ、メタクリル酸５ｇ、ジビニルベンゼン３ｇ、油性の磁性流体（松本油脂（株）ＭＡ２００）３０ｇ、ベンゾイルペルオキシド３ｇを均一に混合し、次いでこれをラウリル硫酸ナトリウム５ｇを含む水溶液１０００ｍｌ中に分散し、７０℃で１０時間の重合を行った。
重合後、そのポリマー混合物を市販磁石を用いた磁気沈澱精製と溶剤精製にかけることで、粒子径約０.８μｍ、磁性体含量約３０重量％、粒子比重約１.２５を有する磁性ポリマー粒子を得た。
【００３３】
実施例２
１）ＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子の調製
ＨＩＶ−ＲＮＡを標的核酸とする核酸プローブは、 Science Vol.227,484-495,1985にて記載されたＨＩＶタイプ−１の配列に基づき、下記のように調整された。
オリゴヌクレオチド A(+) は以下の配列を有する。
５'-GTT TAG CAT GGT GTT TAA ATC TTG TGG GGT GGC TCC TTC CCC CCC CCC -３'前記配列において、５’末端の３８塩基分はＨＩＶ−ＲＮＡに対応し、ハイブリッド形成領域を構成するもので、３’末端の１０塩基分はプローブ粒子表面の固定反応に使用される領域であり、固定化部位を構成する。
Ａ（＋）およびその相補鎖Ａ（−）は通常の化学固相合成法で調整された。Ａ（−）の配列はＡ（＋）のハイブリッド形成領域に対し相補的であるが、３’末端の１０C塩基分に欠ける。これらのＡ（＋）およびＡ（−）は下記の実験に先立って、ＯＰＣカラム（Oligonucleotide Purification Cartridge column; Perkin Elmer）で精製された。
合成ポリヌクレオチドＡ（＋）およびＡ（−）をそれぞれ６０ｎｍｏｌ取り、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、（６０ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ塩化ナトリウムよりなる、１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８を有する）１０倍アニーリング溶液を１０μｌ加え、減菌蒸留水で１００μｌに調製した。
【００３４】
これを８０℃のウオーターバスで１０分間加温し、その後室温になるまで静置した（所要時間５時間）。この反応によりＡ（＋）とＡ（−）が、２本鎖DNAを形成した（以下、２本鎖核酸Ａという）。
次に、ハイブリッド形成されていない１本鎖オリゴヌクレオチドを除去するため、上記で得られた反応生成物を１０ｍｌのヒドロキシアパタイト（Bio Rad社製ＡＧ５０１−Ｘ８＆ＭＳＺ５０１）を含有するカラムに通した。その後、０.１５ｍＭと０.５ｍＭのリン酸緩衝液で展開され、各画分の２６０ｎｍにおける吸光度が測定された。この方法によって、ハイブリッド形成されていない１本鎖核酸と反応生成物の２本鎖核酸が別々に分離され集められた。
２本鎖核酸の回収率は約９１％であり、回収された画分の２.５容量分のエタノールが反応生成物に加えられ、その後−７０℃で２０分間静置後、１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、沈澱物を回収、７０℃容量％エタノール溶液でリンスした後、（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる）ＴＥ緩衝液に溶かして、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量され、以下の固定化反応において使用された。
【００３５】
実施例１の１）で生成された高比重ポリマー粒子の１０（ｗ／ｖ）％を含む０.０００１Ｎ塩酸懸濁液を１０００μｌ、上記で調製された２本鎖核酸プローブＡを１０ｎｍｏｌ、１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０.５（ｗ／ｖ）％を含む０.０００１Ｎ塩酸溶液を５００μｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより、２本鎖核酸Ａをアミド結合の形成を利用して１本鎖の固定化領域を介して粒子に結合させた。次に、５,０００ｒｐｍ（ｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ）で２分間遠心分離にかけられ、粒子の沈澱が回収された。沈澱分は減菌蒸留水で再分散され、８０℃のウオーターバス中で加温されてから、直ちに、０℃の氷水に浸され、５分間放置後、−２０℃で５,０００ｒｐｍで３分間遠心分離され、分離した上清が除去された。この操作により核酸プローブＡ（＋）の相補鎖Ａ（−）が粒子から除去された。次に、（５００ｍＭ塩化ナトリウム、０.１（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸よりなる，１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８を有する）結合用緩衝液を粒子沈殿物に１ｍｌ添加することにより、ハイブリッド形成用担体粒子を緩衝液内に再分散させた後、５,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ハイブリッド形成用担体粒子を回収した。この操作を３回繰り返して、毎回ハイブリッド形成用担体粒子を洗浄し、最終的に担体は再度（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる）ＴＥ緩衝液１０００ｍｌに再分散された。
【００３６】
２）ＨＩＶ−ＲＮＡの分離および検出
ａ）イソプロピルアルコール抽出法による分離
ＨＩＶ−１タイプウィルスを含有するヒト血清の検体を、正常なヒト血清を用いて１０倍ずつの希釈列を調製した。これらの希釈された血清０.３ｍｌづつに、５Ｍのグアニジニウムチオシアネート（ＧＴＣ）および１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）０.１ｍｌを加えて、７０℃で５分間放置後、イソプロピルアルコール１ｍｌを加えて、室温で５分間静置後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去してから残ったペレットを１ｍｌの減菌蒸留水中に再分散し、続いてその中の５０ｍｌを鋳型として、以下に示すようにＲＴ−ＰＣＲ反応およびNestedＰＣＲ反応により増幅した。
ｂ）本発明の粒子法による分離
上記の希釈されたＨＩＶ−１ウィルス含有血清の０.３ｍｌづつに、５ＭＧＴＣおよび１０ｍＭＤＴＴを含む溶液０.５ｍｌを加えて、７０℃で５分間放置後、上記で調製したＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子分散液（５重量％）１０μｌと界面活性剤Triton X-100の２０％溶液１００μｌを加えて、室温で１０分間静置後、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して沈澱した粒子を回収した。その粒子を０.２Ｍの塩化ナトリウム水溶液１ｍｌに再分散し、遠心洗浄し、ペレットを５０μｌの減菌蒸留水に再分散した後、そのまま上記のイソプロピルアルコール分離法によって調整された検体と同様にＲＴ−ＰＣＲ増幅反応処理およびNestedＰＣＲ増幅反応処理にかけられた。
【００３７】
ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ反応およびNestedＰＣＲ反応による増幅
ＲＴ−ＰＣＲ増幅には、Gene Amp rTth RT PCRキット（パーキンエルマー社製）が使用された。使用された試薬組成および反応条件は、キットの製造者によって提供されたマニュアルに従った。また、ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記の配列を有するものが使用された。
プライマーＳＫ１４５Ａの配列（逆転写反応兼用）：
５’−ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ−３’
プライマーＳＫ４５１Ａの配列：
５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ−３’
１ｓｔＰＣＲの産物を５μｌを取り、２ｎｄＰＣＲ増幅（NestedＰＣＲ）を行った。
２ｎｄＰＣＲのプライマーは以下の通りである。
ＳＫ１４５：５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＣＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ−３’
ＳＫ４３１：５’−ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ−３’
【００３８】
なお、上記の増幅反応において、サーモーサイクラーGene Amp 9600（パーキンエルマー社製）が使用された。
ＲＴ−ＰＣＲ法およびNestedＰＣＲ法によって増幅された各反応産物を２％のアガロースゲル（Agarose 1600、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で電気泳動にかけて、エチジウムブロマイドで染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。４つの別個の検体を使用して得られた結果を表１に示した。
表１は、本発明の粒子法を用いてヒト血清とＨＩＶ−ＲＮＡとを分離する場合に、イソプロピルアルコール抽出法を用いて分離するよりも、少なくとも１００倍以上の希釈倍率においてＨＩＶ−ＲＮＡの検出が可能であることを示している。
【００３９】
【表１】

【００４０】
実施例３
ＨＣＶ−ＲＮＡの検出
１）ＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子の調製
実質的に実施例２の１）と同様な手順で、様々なＨＣＶ核酸プローブを調製した。その核酸プローブの配列は、岡本らの論文（Okamoto, H. et al., Japan. J. Exp. Med., Vol. 60, pp.167-177. 1990)に掲載されたＨＣ−１株の配列を参考にした。コンピューターシュミレーション（ソフト Geuetyx、ＳＯＣ社製）による二次構造、ＧＣ含有率、融点温度（Ｔｍ）および他のパラメーターを考慮し、以下のプローブを選定した。
【００４１】

【００４２】
なお、ＤＮＡ製造に使用されるカラムのうち、 PAおよびPBには３’ＤＮＰ−ＯＮ(TM) ＣＰＧ、PCおよびPDには３’−Ａｃｒｉｄｉｎｅ−ＯＮ(TM) ＣＰＧ、PE、PF、PGおよびPHには３’−ＤＭＴ−Ｃ₆Ａｍｉｎｏ−ＯＮ(TM) ＣＰＧ（いずれもクロンテック（株）製）を使用した。
それぞれが対応するプローブの３’末端の１０Ｃ塩基分を欠く、これらプローブの相補鎖も、上記に示される手順で調製した。
実施例２の１）に示されるように、各々の核酸プローブをその相補鎖と同当比で混ぜ合わせ、アニリングし、二本鎖核酸を形成し、精製後、使用に供した。
続いて、実施例１の２）で調製した磁性ポリマー粒子を用いて、上記のプローブPA 〜 PHの二本鎖核酸をそれぞれ磁性ポリマー粒子に化学結合させ、これらのプローブの一つを有する磁性ポリマー粒子の分散液を得るために、実施例２の１）に示されるように処理した。このように、プローブPA 〜 PHのそれぞれについて、それらのプローブが固定された磁性ポリマー粒子の分散液を得た。
【００４３】
２）相補的オリゴヌクレオチドを捕獲および分離するためのキャパシティーに関する、ＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子の評価
相補的オリゴヌクレオチドの32Ｐによる標識
プローブPA 〜 PHのそれぞれについて、（実施例２に示されるような）３’末端を欠く相補鎖オリゴヌクレオチドPA（−）〜 PH（−）を次のようにして32Ｐにより標識した。
２ｎｍｏｌのＡ（−）を含有する水溶液を１μｌ、８Ｕの酵素活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１μｌ、γ−32Ｐ−標識付きアデノシン三リン酸（１０μＣｉ／μｌ）を５μｌ、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液を５μｌおよび減菌水３９μｌを、２ｍｌエッペンドルフ遠心管に入れ、混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は、次の組成を有するものである。
【００４４】
組成：
０.５Ｍ／ｌトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７.６
０.１Ｍ／ｌ塩化マグネシウム
５０ｍＭ／ｌジチオスレイトール
１ｍＭ／ｌスペルミジン
１ｍＭ／ｌエチレンジアミン四酢酸
次に、反応混合物からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（see Sambrook at al.,“Molecular Cloning” reference cited above, P458）によって除去した後、反応混合物を（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる）ＴＥ緩衝液と均衡を保つセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）を有する１ｍｌのカラム通じてゲル濾過に供した。
ゲル濾過により溶出され分割された１００μｌずつの各画分を順に摂取し、各画分の放射線量をチェレンコフーカウント法によって測定して、カラムを通過した画分を判別し集めた。その結果、32Ｐによって標識された２つのオリゴヌクレオチドのそれぞれを有するＴＥ緩衝液２００μｌが得られた。これらは、各々が１μｌ当り４００,０００ｃｐｍのカウントの放射線量を有する溶液であった。
【００４５】
上記１）下において調整された核酸プローブPAを有する磁性ポリマー粒子の１０（ｗ／ｖ）％分散液（１００ｐｍｏｌｅプローブ核酸含有）の１００μｌを８本のエンペドルフチューブにそれぞれ入れた。標的核酸として、上記で調整された32Ｐによって標識された（約４００,０００ｃｐｍのチェレンコフカウントを有し、１０ｐｍｏｌに相当する）PA（−）を１μｌ、および上記１）下において調整された１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０ｐｍｏｌの未標識のＡ（−）をそれぞれ、８本のエペンドルフチューブのそれぞれに加えた。減菌蒸留水を加えて全体の容量を１８０μｌとし、各チューブのチェレンコフカウントを測って、それらの値をカウント１とした。
上記のように調製した８本のエペンドルフチューブすべてを８０℃のウォーターバスに入れ、１０分間加熱後、直ちに氷水に入れ、５分間静置後に、５Ｍ塩化ナトリウム２０μｌを各チューブに加えて、次いで４０℃のウォーターバスで５分間加熱し、ハイブリット形成体を調製した。次に、結合した核酸と遊離している核酸とを分離するために、各チューブに市販磁石を１分間あて、未反応の標的核酸を含む上清を除去し、沈澱物を結合用緩衝液で２回洗浄し、最終的に（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる）ＴＥ緩衝液に再分散し、全体の容量を１００μｌとし、チュレンコフカウントを測定した。それらの値をそれぞれのチューブのカウント２とした。
【００４６】
次に、各検体を磁気分離して、沈澱物を減菌蒸留水１００μｌ中に再分散し、全体の容量を１００μｌとし、６５℃のウォーターバス中で１０分間静置後、直ちに氷水により冷却した。５分後、１０,０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄し、上清を除去した後、沈澱物を減菌蒸留水に再分散し、全体の容量を１００μｌとし、チュレンコフカウントを測定した。それらの値をそれぞれのチューブのカウント３とした。
標的核酸の捕獲率（［捕獲核酸量］／［標的核酸量］×１００％）および捕獲した核酸の分離率（［分離核酸量］／［捕獲核酸量］×１００％）を以下の表２にまとめた。
他の核酸プローブPBからPHまでについても、同様な手順で処理および評価を行い、それらの結果も以下の表２にまとめた。
表２は、商用検定に適応する時間内および条件下において、相補的なオリゴヌクレオチドの９０％以上を捕獲する、および捕獲されたオリゴヌクレオチドの９０％以上を分離するためのＨＣＶ核酸プローブを有する考察される個々のポリマー粒子のキャパシティーを示している。それらの検定結果は、それらの粒子を用いた商用検定において、高いパーセンテージのＨＣＶ−ＲＮＡの捕獲および分離が見込めるということを証明している。
【００４７】
【表２】

【００４８】
３）ＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子によるＨＣＶ−ＲＮＡの抽出および検出
上記で調整されたＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡが分離された。抽出実験は、遠心分離操作の代わりに市販磁石を、粒子を含有する懸濁液に１分間当てることを除いて、実施例２の２）のｂ）に示される手順で実行される。簡潔に述べると、ＨＣＶ−ＲＮＡを含有するヒト血漿３００μｌに、Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（ＡｍｐｌｉｃｏｎTM ＨＣＶキット、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ社製、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＵＳＡ）６００μｌを加え、室温にて１０分間静置後、１０重量％のＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子を含む懸濁液１０μｌおよびハイブリ緩衝液（３０％ Triton X-100溶液）３００μｌを入れ、そのまま６０℃で１０分間、２５℃で１０分間静置し、磁気分離後、０.４Ｍの塩化ナトリウム溶液１ｍｌで分離された粒子を洗浄し、再分散後、再度磁気分離を行ってから、沈澱分に上記キットの検体希釈剤を加えて、希釈剤中に再分散させた。該分散液はそのままＰＣＲの鋳型として使用された。なお、ＲＴ−ＰＣＲの増幅は、上記キットの操作方法に示される手順で行われた。
【００４９】
核酸プローブPAからPHまでを有する磁性ポリマー粒子を用いて得られた実験結果を以下の表３にまとめた。該実験結果は、プローブPB、PE、およびPFを有する粒子は、少なくとも５つのＨＣＶウィルスを有するサンプルのすべてからＨＣＶウィルスの検出を可能にするということを証明している。該粒子は、本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡの分離および検出に特に有益である。
【００５０】
【表３】

【００５１】
実施例４
ＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子は、上記において使用されたポリマー粒子の代わりに、粒径が約０.５μｍで、表面積１ｎｍ²当り５個のカルボキシル基を有する、比重が約１.０５のポリスチレンラテックスが使用されたこと以外は、実施例２の１）において記述されるように調整された。簡潔に述べると、核酸プローブは２本鎖核酸に変換されるように、上記に示されるように処理された後に、粒子に化学的に固定化され、最終的に核酸プローブの相補鎖を熱処理により除去し、ＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子の分散液が得られた。
手順は実施例２の２）のｂ）の方法と同様であるが、上記において得られたポリマー粒子を使用した。しかしながら、ＨＩＶ−ＲＮＡの捕捉およびＰＣＲ反応による検出を行ったが、０.３ｍｌの血清検体と０.５Ｍ／ｌのＧＴＣおよび１０ｍＭ／ｌのＤＴＴを含有する溶液０.６ｍｌ加えた系において、５０００ｒｐｍ×３分間では粒子の回収ができず、該系をさらに過酷な条件下、１５０００ｒｐｍ×１５分において遠心分離したときでさえ、粒子は遠心管の下部に行かず、血清／ＧＴＣ／ＤＴＴ混合液の上部に集まり、粒子相と溶液相の２相に分かれたが、その境界面が不明瞭で、回収後、粒子相の容量は約０.３ｍｌとなった。これを、実施例２の２）のｃ）において示されるようなＲＴ−ＰＣＲ反応系およびＰＣＲ反応系で処理したが、ＨＩＶ−ＲＮＡに対応する増幅された核酸は検出できなかった。
上記の例は、ポリマー粒子の比重の重要性を特に示している。比重約1.05を有するポリマー粒子を用いても、低速遠心では粒子を沈殿させることはできない。
【００５２】
実施例５
実施例４で回収された遠心管上部にある粒子相０.３ｍｌに、減菌蒸留水を１５０Ｍｌずつ加えて、再度１５０００ｒｐｍ×１０分で遠心分離を行った。この操作を５回繰り返したところ、０.３ｍｌの粒子相溶液への０.７５ｍｌの減菌蒸留水の添加に対応して、系の遠心分離によって粒子をペレットとして回収することができた。このときの系はＧＴＣ／ＤＴＴ溶液を２.５倍希釈したものからなっていた。
回収された粒子のペレットを実施例２の２）のｃ）に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲ反応系およびＰＣＲ反応系で処理したが、以下の表４に示されるように、ＨＩＶ−ＲＮＡに対応する増幅された核酸は検出できなかった。
コントロールとして、ＧＴＣ／ＤＴＴの非希釈系、ＧＴＣ／ＤＴＴ系の０.５、１.０、１.５、２.０、２.５倍希釈した溶液が調整され、血清に添加された。これらは実施例２の１）のａ）に示されるようなイソプロピルアルコール抽出方法に従って処理および評価された。その結果も表４に示す。
【００５３】
表４は、０.５ｍＭ／ｌのＧＴＣを含有するＧＴＣ／ＤＴＴ溶液を少なくとも１.０倍以上希釈した場合、検体の一つに、増幅産物の減少が見られることを示している。この減少は、おそらく血清検体中に存在するリボヌクレアーゼによるＨＩＶ−ＲＮＡの分解によるものと思われる。
前述の部分において詳細に示される本発明によると、特定の核酸プローブを有する粒子を使用して、生物学的液体の検体から誘導される検体に含有されるウィルスまたは細菌の標的核酸を容易に分離できる。特異的に、本発明による粒子を用いる標的核酸の捕捉は、高感度で簡便に、且つ短時間で済む。加えて、本発明の方法によると、捕捉された標的核酸を粒子から解離することなく、単に標的核酸を捕捉した粒子をポリメラーゼ増幅反応系に加えることによって捕捉された標的核酸を容易に検出できる。このように、本発明の方法は臨床検査センターや病院の検査において有利に利用できる。
【００５４】
【表４】

【００５５】
以下、本発明並びにその好ましい実施態様についてまとめて説明する。
１.血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）血液の血清および／または血漿からウィルスまたは細菌を含む液体画分を得る工程、
（ｂ）液体画分中に標的核酸を溶出するためにウィルスまたは細菌を溶解する工程、
（ｃ）細菌またはウィルスの標的核酸をハイブリッド形成によって捕獲するために、特定の配列のウィルスまたは細菌の標的核酸に対して実質上相補的である核酸プローブを比重１.１から２.５を有する粒子に化学的に結合することによって得られる、核酸プローブを有する粒子を（ｂ）の工程で得られた溶解物に添加する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において得られた系からウィルスまたは細菌の標的核酸を捕捉した粒子を回収する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で回収した、標的核酸を捕捉した粒子を、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、直接ポリメラーゼ増幅反応または逆転写ポリメラーゼ増幅反応に付しついて増幅された核酸を検出する工程
よりなる方法であり、前記工程（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程の前、或いは途中で、蛋白質変性剤を添加することを特徴とする方法。
２.核酸プローブを有する粒子の担体粒子が、その表面上にカルボキシル基を有する水不溶性のポリマー粒子である、前記１の方法。
３.核酸プローブを有する粒子が磁性粒子である、前記１および２の方法。
４.核酸プローブを有する粒子の平均サイズが約０.０５〜５μｍ、好ましくは約０.１〜３μｍである、前記１〜３のいずれかの方法。
５.検体が血清等である、前記１〜４のいずれかの方法。
【００５６】
６.蛋白質変性剤が約０.１〜５モル／ｌ、好ましくは約０.２〜４.５Ｍモル／ｌの濃度で使用されるグアニチュームチオキシアネート（ＧＴＣ）である、前記５の方法。
７.標的核酸がＲＮＡである、前記１〜６のいずれかの方法。
８.標的核酸がＨＩＶ−ＲＮＡまたはＨＣＶ−ＲＮＡである、前記７の方法。
【００５７】
９.前記１〜４のいずれでも定義される粒子からなる、血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出するためのキット。
１０.さらに標的核酸を増幅するための方法を含む、前記９のキット。
１１．ＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法によって標的核酸が増幅する方法を含む、前記１０のキット。
１２．標的核酸がＨＩＶ−ＲＮＡまたはＨＣＶ−ＲＮＡである、前記９〜１１のいずれかのキット。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to a method for separating a nucleic acid from a sample in which a nucleic acid and a nuclease coexist using a microparticle with a nucleic acid probe immobilized thereonThe lawTo detect nucleic acids in specimensWhoIt is about the law.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, viruses and bacteria floating in serum and plasma have been detected by the following method. First, whole blood is subjected to low-speed centrifugation, blood cell components are precipitated, and supernatant serum or plasma is collected. Next, when a high-concentration guantium thiocyanate solution (GTC) and a trace amount of an SH group antioxidant are added to the collected serum or plasma, the virus shell or bacterial membrane is destroyed, and at the same time, the virus or bacterial nucleic acid released. Degradation is suppressed (Sambrook et al., “Molecular Cloning 2nd Ed.” Sec7., Cold Spring Harbor Press, New York, USA).
Since serum contains a large amount of proteins, lipids, sugars, and other molecules, a target gene in serum cannot be detected without pre-separation treatment. Therefore, usually, using an organic solvent such as chloroform / phenol or isopropyl alcohol and further utilizing the difference in solubility between the protein and nucleic acid in these solvents, the nucleic acid and protein in the serum are separated, The target gene was detected by the nucleic acid probe method or the polymerase amplification reaction (PCR method).
[0003]
The method for separating nucleic acid and protein using an organic solvent is a method for separating all nucleic acids and all proteins present in serum. Therefore, the separated nucleic acids include those other than the target nucleic acid to be detected. Contains a large amount of nucleic acid. If a predetermined amount of the target nucleic acid contained in the sample to be examined contains only a few molecules or tens of molecules, the background of target gene detection becomes large, and thus the target nucleic acid may not be detected. In order to reduce the background, as one method, the amount of serum or plasma used for the specimen to be examined can be reduced, but this method has a problem that the sensitivity of the examination is lowered as a result. In addition, since the operation of the separation method using this solvent is complicated, it is not suitable for daily processing of a large amount of clinical specimens.
[0004]
Another method proposed to solve the above problem is to use an ion exchange resin or glass beads instead of an organic solvent to separate the nucleic acid from the protein, and further charge between different nucleic acids and the protein. It consists of using the difference in degrees. This method is effective for separation of nucleic acids and proteins mixed in a normal aqueous solution. However, when nucleic acids and nucleases coexist in serum or plasma, the target gene is, for example, RNA in HIV or HCV. Sometimes it is necessary to add at least about 2 M / l GTC solution to the serum of the sample in order to prevent the activity of RNase contained in a large amount in the sample. In such a case, this method was ineffective.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
  The problem presented by the present invention is to specifically separate a target nucleic acid from a specimen derived from a biological fluid, particularly when the nucleic acid and nuclease coexist in the specimen.AndIt is an object of the present invention to provide a method for detecting a target nucleic acid of virus or bacteria from a specimen as described above, which does not have the above problems.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
  According to one aspect, the present invention providesBlood serum and / or plasmaA method for detecting a target nucleic acid of a virus or bacteria in
(A)Blood serum and / or plasmaObtaining a liquid fraction containing virus or bacteria from
(B) lysing a virus or bacteria to elute the target nucleic acid in the liquid fraction;
(C) a nucleic acid probe having a specific gravity of 1.1 to 2.5 that is substantially complementary to a specific sequence of viral or bacterial target nucleic acid to capture bacterial or viral target nucleic acid by hybridization. Adding a particle having a nucleic acid probe obtained by chemically binding to the particle to the lysate obtained in the step (b);
(D) recovering particles capturing the viral or bacterial target nucleic acid from the system obtained in step (c); and
(E) recovered in step (d)Without directly eluting the target nucleic acid from the particle directly,A step of subjecting to a polymerase amplification reaction or a reverse transcription polymerase amplification reaction and then detecting the amplified nucleic acid
A protein denaturant is added before or during any of the steps (a) to (d).
[0007]
  The method of the present invention does not require a long time and can be easily implemented, thus using a technique that is well suited for routine processing of large quantities of specimens in clinical laboratories and hospitals. It enables specific and efficient separation of viral or bacterial target nucleic acids from analytes or analytes derived from biological fluids. By utilizing this separation method, it becomes possible to detect a target nucleic acid with very high sensitivity, particularly in specimens of HIV-RNA and HCV-RNA.
  Sample to which the method of the present invention can be appliedIs
[0008]
  bloodClean and / or bloodSeedThese are called "serum")InThe
  Such serum or the like can be easily prepared by separating blood cell components from whole human or animal blood using low-speed centrifugation. Serum prepared by a normal immunoassay can be used as it is. Serum or the like may contain an anticoagulant such as heparin, sodium citrate, or EDTA, if appropriate.
  When the nucleic acid to be separated in the present invention is contained in the host, to dissolve or destroy the outer shell or membrane of the host in order to elute the nucleic acid, that is, to elute the nucleic acid in the liquid fraction is required. Thus, the method of the present invention requires a method of disrupting the virus shell or bacterial membrane.
[0009]
As a method for disrupting the virus shell or bacterial membrane, any appropriate physical, electrical or chemical method which is usually used can be used. Examples of such a crushing method include an ultrasonic crushing method, an electric shock method, a method using an osmotic pressure difference, a method using a surfactant, and the like.
Particularly suitable for disrupting virus shells or bacterial membranes is the method described in “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” (MA Innis et. Al., 1990, Academic Press, NY, USA). .
The viral or bacterial target nucleic acid to be isolated by the method of the invention may be RNA and / or DNA. The method of the present invention is particularly suitable when the target nucleic acid is RNA such as HIV-RNA or HCV-RNA.
[0010]
In the present invention, the nuclease activity of the specimen is suppressed by the protein denaturant in order to prevent the nucleic acid released from the virus or bacteria from being degraded by the nuclease in the specimen.
Various methods are known in the art for suppressing the activity of nucleases, especially ribonucleases (RNases). An example of a suitable method is a method using a protein denaturant such as guanitium thiocyanate (GTC) described in Molecular Cloning (cited in the previous term). Guanitum thiocyanate usually contains an SH group-containing antioxidant.
[0011]
The concentration of GTC such as serum to which the present invention is applied is about 0.1 to 5 mol / l, preferably about 0.2 to 4.5 mol / l. If this concentration is less than about 0.1 mol / l, the concentration is too low to suppress the predetermined RNase activity. On the other hand, if it is more than about 5 mol / l, the solution becomes saturated in GTC, and the actual use of such a saturated solution becomes difficult.
Examples of the SH group-containing antioxidant include dithiothreitol, mercaptoacetic acid, and mercaptoethanol. The concentration of the SH group-containing antioxidant in serum or the like is preferably about 0.1 to 300 mmol / l, more preferably about 1 to 100 mmol / l. If the concentration is less than about 0.1 mmol / l, the concentration is too low to suppress RNase activity.
[0012]
In the present invention, the protein denaturing agent may be added before or during any of the steps (a) to (d) in the method of the present invention, but the denaturing agent is usually a virus or bacterial target nucleic acid. It is preferably added immediately before or after elution into the liquid fraction.
The particles carrying the nucleic acid probe used in the present invention may be any of organic polymer particles, inorganic particles, or a complex thereof.
The specific gravity of the particles carrying the nucleic acid probe used in the present invention is about 1.1 to about 2.5, preferably about 1.2 to about 2.0. If the specific gravity is less than about 1.1, the particles cannot be precipitated by centrifugation. Further, if the specific gravity is larger than about 2.5, particles are precipitated even within a short time during the target nucleic acid capture reaction, and the target nucleic acid cannot be efficiently recovered.
[0013]
Examples of organic polymers that can be used to form particles include polymers obtained by copolymerizing a comonomer having one or more halogen atoms in the molecule with another comonomer. Examples of the monomer having one or more halogen atoms in the molecule include monofluorophenyl (meth) acrylate, trichlorophenyl (meth) acrylate, monobromophenyl (meth) acrylate, tribromophenyl (meth) acrylate, Monoiodophenyl (meth) acrylate, pentachlorophenyl acrylate, pentachlorophenyl methacrylate, 2,4,6-tribromophenyl acrylate, 2,4,6-tribromophenyl methacrylate, α-chlorophenyl acrylate and α-chlorophenyl methacrylate It is done.
[0014]
Examples of other comonomers include aromatic vinyl compounds, α, β-unsaturated carboxylic acids and esters and amides thereof, α, β-unsaturated nitrile compounds, vinyl halide compounds, conjugated diene compounds, styrene, chloro Styrene, α-methylstyrene, divinylbenzene, sodium styrenesulfonate, (meth) acrylic acid, methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, (meth) acrylic acid-2-hydroxyethyl, (meth) acrylic Glycidyl acid, ethylene glycol-di- (meth) acrylic acid ester, (meth) acrylonitrile, (meth) acrolein, (meth) acrylamide, N-methylol- (meth) acrylamide, methylenebis (meth) acrylamide, butadiene, isoprene, acetic acid Vinyl, vinyl pyridine, N-bi Rupiroridon, vinyl chloride, vinylidene chloride, and a lower fatty acid vinyl ester compounds such as vinyl bromide and the like.
[0015]
Monomers having one or more halogen atoms in the molecule are usually water-soluble solids at room temperature. Therefore, these are finely dispersed in an aqueous medium together with the above-mentioned comonomer to form an emulsion, and then emulsion polymerization, suspension polymerization, seed polymerization, solution precipitation polymerization, dispersion polymerization, etc. to obtain the desired particles. Is preferred.
[0016]
The average particle size of the particles suitable for use in the present invention is preferably about 0.05 μm or more, more preferably about 0.1 μm or more, since such fine particles can be collected by a simple operation such as centrifugation. is there. On the other hand, in order to increase the surface area per unit volume of each particle and to efficiently capture the target nucleic acid under appropriate conditions for hybridization, the average particle diameter is preferably about 5 μm or less, more preferably Is about 3 μm or less. Furthermore, the particles used in the present invention must be water insoluble in order to be used in an aqueous medium.
Examples of inorganic particles suitable for use in the present invention include glass beads, metal or metal oxide particles.
Suitable composite particles include, for example, inorganic core particles surface-coated with an organic polymer, or a plurality of inorganic particles dispersed in an organic polymer.
[0017]
In the present invention, particles containing at least one paramagnetic substance or superparamagnetic substance (hereinafter referred to as “magnetic particles”) can also be used. Next, separation of magnetic particles can be realized conveniently and quickly by using a magnet in addition to centrifugation. Examples of superparamagnetic materials include iron, iron oxide (Fe₂O_Three, Fe_ThreeO_Four), Iron nitride, nickel, ultrafine particles of nickel oxide, and particles containing any of these metals and compounds.
Such magnetic particles can be prepared by a method described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-19103.
The magnetic particles prepared in this way are preferably surface-coated with an organic polymer. This is because, for example, a magnetic particle is added to a liquid composed of a monomer and an initiator dissolved in a volatile organic solvent, and the monomer is impregnated into the magnetic particle together with desolvation, followed by an aqueous solution containing a surfactant. It is conveniently realized by dispersing magnetic particles in the mixture and heat-polymerizing the monomer contained in the particles. In order to facilitate binding of the surface-coated particles to the nucleic acid probe, some or all of the monomers used for the surface coating are preferably monomers having a carboxyl group in the side chain.
[0018]
The amount of carboxyl groups on the surface of the particles used in the present invention is preferably about 0.01 to 0.8 meq / g, more preferably about 0.02 to 0.5 meq / g, based on the dry particle mass. When the carboxyl group amount is about 0.01 meq / g or less, the efficiency of the particles in immobilizing the nucleic acid probe is remarkably lowered, and the stability of the particles to which the nucleic acid probe is immobilized is also lowered. Such particles are not preferred for the goal of the present invention to capture target molecules of several molecules to tens of molecules per particle. However, on the other hand, when the amount of carboxyl groups is about 0.8 meq / g or more, it is not easy to prepare such particles substantially. The range of the amount of carboxyl groups on the particle surface is selected in consideration of the balance between the use of the present invention and the cost of particle preparation.
[0019]
The means for introducing a carboxyl group into the surface of the particles used in the present invention can be achieved by adding an appropriate amount of a monomer having a carboxyl group in the polymerization or surface coating step as described above.
At least the surfaces of the particles used in the present invention are desirably coated with an organic polymer material as described above. Such organic polymer materials include, for example, styrene, divinylbenzene, (meth) acrylic acid, vinyl halide compounds, and derivatives thereof. Further, in order to facilitate the chemical bonding of the surface-coated particle to the nucleic acid probe, it is desirable to introduce a carboxyl group on the particle surface.
[0020]
The nucleic acid probe used in the present invention is composed of an immobilization site and a hybridization site.
The sequence of the hybridization site in the nucleic acid probe includes a sequence that is substantially complementary to the specific sequence of the target nucleic acid. In serum and the like, which are particularly suitable specimens in the present invention, a large excess of undesirable nucleic acids, proteins, lipids, sugars, and other molecules are usually in concentrations of, for example, several thousand to several million times that of the target nucleic acid. In order to specifically, rapidly and efficiently extract, separate and detect a target nucleic acid, the number of hybridization sites in the nucleic acid probe is at least 15, more preferably at least 20 It is desirable to include one nucleotide. On the other hand, the upper limit of the number of nucleotides in the sequence of the hybridization site is not particularly limited, but is usually 100 or less, preferably 80 or less. This upper limit is selected in view of economics and efficiency in the synthesis of nucleotides.
[0021]
The sequence of the immobilization site of the nucleic acid probe used in the present invention contains at least one nucleotide having a primary amino group. The sequence is usually composed of 1 to 20, preferably 3 to 15 nucleotides.
Examples of nucleotides having a primary amino group in the sequence of the nucleic acid probe immobilization site include deoxyadenylic acid (dA), deoxycytidylic acid (dC), and deoxyguanylic acid (dG). DA and dC are preferable in that they are highly reactive with the carboxyl group present on the surface. The oligonucleotide having a primary amino group may be composed of one kind of nucleotide or may be composed of two or more kinds of nucleotides. In order to avoid the occurrence of a sequence that is accidentally complementary to a sequence other than the sequence, it is desirable to be composed of one type of nucleotide, particularly dA or dC. In order that the nucleic acid probe used in the present invention does not affect the enzymatic reaction in the target nucleic acid detection step, it is preferable that the joining site between the particle and the nucleic acid probe is the 3 'terminal base of the probe sequence. Furthermore, chemically modifying the 3 'terminal base may further increase its intended effect. This chemical modification includes a method of introducing a functional group such as an alkyl group, an amino group, or a nitro group into a base at the 3 'end.
[0022]
[Preparation of nucleic acid probe particles]
As a method for fixing the nucleic acid probe used in the present invention to the carrier particles, for example, the methods described in JP-A-7-75599 and JP-A-6-335380 are applied.
Briefly, 1 equivalent of the nucleic acid probe and 1 equivalent of DNA complementary to the hybridization site of the nucleic acid probe are mixed in an annealing buffer, heated at 80 ° C. for 5 minutes, and then gradually returned to room temperature. Forms double-stranded DNA. The double-stranded DNA is purified through a hydroxyapatite column, then added to the dispersion of carrier particles together with a dehydrating condensing agent, and heated, whereby the primary amino group in the sequence of the nucleic acid probe immobilization site is changed. It is fixed to the carboxyl group present on the particle surface by an amide bond.
[0023]
Examples of the dehydrating condensing agent mentioned here include carbodiimides such as 1-ethyl-3- (N, N′-dimethylamino) propylcarbodiimide, and N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate. Water-soluble dehydration condensing agent containing N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline and the like is preferable, but in addition to these, an oil-soluble dehydrating condensing agent may be used. it can.
The amount of particles used is usually about 0.1 to 500 g, preferably about 5 to 50 g, per mmol of nucleic acid probe. The nucleic acid probe may be immobilized on the particles in an aqueous medium having a pH of about 3 to 11 at 4 to 70 ° C. for 5 minutes to overnight.
[0024]
Next, particles having the nucleic acid probe used in the present invention are obtained by releasing the complementary sequence bound to the hybridization site in the nucleic acid probe immobilized on the particle. In this case, the removal of the complementary sequence can be achieved by heat or alkali denaturation, and then the removed complementary sequence is removed by means of centrifugation, filtration or the like. be able to.
In order to realize the capture of the target nucleic acid, the particles having the nucleic acid probe are transferred to the biological fluid treated in the above-described method, particularly a specimen such as serum, between the nucleic acid probe and a specific sequence of the target nucleic acid. It is added under conditions that allow hybridization.
[0025]
In the present invention, hybridization conditions vary depending on the form of the target nucleic acid and the specific sequence, but generally the salt concentration is 0.2 mol to 10 mol, the temperature is 10 ° C to 70 ° C, and the time is 10 minutes to 100. Selected to be minutes.
When the target nucleic acid isolated according to the present invention is derived from a viral or bacterial genome, the reaction is performed before or after the addition of particles with nucleic acid probes to destroy the higher order three-dimensional structure of the genome containing the target nucleic acid. It is desirable to heat the entire system once at about 50 ° C to about 75 ° C. The genome may be a viral or bacterial genome, or it may be a human or animal genome from which specimens are collected and injected with a target nucleic acid.
[0026]
During the hybridization reaction, it is desirable to add a surfactant, preferably a nonionic surfactant, to the hybridization reaction system in order to maintain the stability and dispersibility of the nucleic acid probe particles of the system. For example, about 0.1% to 20% by weight of the nonionic surfactant may be added to the system. Examples of suitable nonionic surfactants include the TRITON (r) X series, the TWEEN (r) series, and the BRIJ (r) series (all manufactured by Sigma). Any of those nonionic surfactants may be added to the system at the above concentrations.
Further, any of the reactive monomers having the same molecular structure as those surfactants may be added to the particles at the time of polymerization, so that the surfactants may be included in advance on the particle surfaces.
[0027]
  The target nucleic acid captured by the particles according to the method of the present invention can be separated from the particles by heat or alkali, if necessary.The
[0028]
  Detection of target nucleic acid captured by the method of the present inventionIs
[0029]
  Serum, etc.Very small amount of target nucleic acid present in the sampleBecauseDetecting the amplified nucleic acid using a nucleic acid amplification method such as polymerase amplification reaction (PCR) or reverse transcription polymerase amplification reaction (RT-PCR method)Done in.
  In such a nucleic acid amplification method, it is appropriate to add the particles capturing the target nucleic acid directly to the polymerase amplification reaction system without eluting the target nucleic acid from the particles in advance.
  Due to the specific separation process performed prior to the other components in the sample and the target nucleic acid, the nucleic acid amplification reaction is not affected by any reaction inhibitor that may be present in the sample. Especially for serum, the PCR method or RT-PCR method is not affected by reaction inhibitors derived from serum components, and can detect target nucleic acids with the same sensitivity as that detected by ordinary solution-based reactions. Make it possible.
[0030]
Detection of the amplified nucleic acid is performed by any detection method known in the art, in particular by visualizing under UV light or by utilizing a hybridization reaction with a labeled nucleic acid probe. it can. A particularly easily available method consists of performing electrophoresis on an agarose gel or polyacrylamide gel, staining with ethidium bromide, and detecting the amplification product under ultraviolet light. In this method, nucleic acid probe particles may be added to the gel along with the amplification reaction product. If necessary, it is also possible to use a plate having a well in which a probe corresponding to the amplification region is fixed beforehand. When using such a plate, one region of the amplification product tends to hybridize with the probe immobilized in the well, and another labeled probe corresponding to the other region of the amplification product is used. Then, the amplification product can be detected by the same method as described above.
[0031]
According to a further aspect, the present invention provides a kit and target for detecting a viral or bacterial target nucleic acid in a biological fluid sample or in a sample derived from a biological fluid, comprising particles having the nucleic acid probe described above The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid. In addition, the kit suitably includes a method for amplifying the target nucleic acid, in particular by PCR or RT-PCR.
The present invention will be specifically described based on the following examples.
[0032]
【Example】
Example 1
Generation of polymer particles
1) High specific gravity polymer particles
By emulsion polymerization of 70 g of styrene, 45 g of 2,4,6-tribromophenyl methacrylate, 5 g of methacrylic acid, 1 g of potassium persulfate, 1 g of sodium lauryl sulfate and 1000 g of water at 70 ° C. for 10 hours in a nitrogen atmosphere, A carboxyl group-modified high specific gravity polymer particle having a size of 0.3 μm and a particle specific gravity of about 1.4 was obtained.
2) Magnetic polymer particles
50 g of styrene, 5 g of methacrylic acid, 3 g of divinylbenzene, 30 g of oily magnetic fluid (Matsumoto Yushi Co., Ltd. MA200), 3 g of benzoyl peroxide were mixed uniformly, and then dispersed in 1000 ml of an aqueous solution containing 5 g of sodium lauryl sulfate. Polymerization was carried out at 70 ° C. for 10 hours.
After polymerization, the polymer mixture is subjected to magnetic precipitation purification using a commercially available magnet and solvent purification to obtain magnetic polymer particles having a particle diameter of about 0.8 μm, a magnetic substance content of about 30% by weight, and a particle specific gravity of about 1.25. Obtained.
[0033]
Example 2
1) Preparation of polymer particles with HIV nucleic acid probe
A nucleic acid probe targeting HIV-RNA as a target nucleic acid was prepared as follows based on the HIV type-1 sequence described in Science Vol. 227,484-495,1985.
Oligonucleotide A (+) has the following sequence:
5'-GTT TAG CAT GGT GTT TAA ATC TTG TGG GGT GGC TCC TTC CCC CCC CCC -3 'In the above sequence, 38 bases at the 5' end correspond to HIV-RNA and constitute a hybridization region, The 10 base portion at the 3 ′ end is a region used for the fixation reaction on the probe particle surface and constitutes an immobilization site.
A (+) and its complementary strand A (−) were prepared by a conventional chemical solid phase synthesis method. The sequence of A (−) is complementary to the hybridization region of A (+) but lacks 10C bases at the 3 ′ end. These A (+) and A (−) were purified with an OPC column (Oligonucleotide Purification Cartridge column; Perkin Elmer) prior to the following experiment.
Synthetic polynucleotides A (+) and A (−) were each taken at 60 nmol and placed in a 2 ml Eppendorf tube, and a 100 mM Tris hydrochloride buffer solution, pH 8, consisting of (60 mM magnesium chloride, 60 mM β-mercaptoethanol, 500 mM sodium chloride) was added. 10 μl annealing solution was added and prepared to 100 μl with sterile distilled water.
[0034]
This was heated in an 80 ° C. water bath for 10 minutes, and then allowed to stand until it reached room temperature (required time 5 hours). By this reaction, A (+) and A (−) formed double-stranded DNA (hereinafter referred to as double-stranded nucleic acid A).
Next, in order to remove the non-hybridized single-stranded oligonucleotide, the reaction product obtained above was passed through a column containing 10 ml of hydroxyapatite (Bio501, AG501-X8 & MSZ501). Then, it was developed with 0.15 mM and 0.5 mM phosphate buffer, and the absorbance at 260 nm of each fraction was measured. By this method, non-hybridized single-stranded nucleic acid and reaction product double-stranded nucleic acid were separated and collected separately.
The recovery rate of double-stranded nucleic acid was about 91%, and 2.5 volumes of ethanol was added to the reaction product after that, and then allowed to stand at −70 ° C. for 20 minutes, and then at 10,000 rpm. Centrifuge for 10 minutes, collect the precipitate, rinse with 70% volume ethanol solution, dissolve in TE buffer (consisting of 10 mM Tris hydrochloride buffer and 1 mM EDTA, pH 8.0) and absorb at 260 nm And was used in the following immobilization reactions.
[0035]
1000 μl of a 0.0001N hydrochloric acid suspension containing 10 (w / v)% of the high specific gravity polymer particles produced in 1) of Example 1, 10 nmol of the double-stranded nucleic acid probe A prepared above, 1− 500 μl of 0.0001N hydrochloric acid solution containing 0.5% (w / v) of ethyl-3- (N, N′-dimethylamino) propylcarbodiimide was placed in an Eppendorf centrifuge tube in a thermostatic chamber set at 10 ° C. By mixing overnight, the double-stranded nucleic acid A was bound to the particles via a single-stranded immobilization region using the formation of an amide bond. Next, centrifugation was performed at 5,000 rpm (rotations per minute) for 2 minutes, and the precipitate of particles was collected. The precipitate was redispersed with sterilized distilled water, heated in an 80 ° C. water bath, immediately immersed in 0 ° C. ice water, allowed to stand for 5 minutes, and then at −20 ° C. and 5,000 rpm for 3 minutes. It was centrifuged and the separated supernatant was removed. By this operation, the complementary strand A (−) of the nucleic acid probe A (+) was removed from the particles. Next, 1 ml of binding buffer (having 10 mM Tris hydrochloride buffer, pH 8 consisting of 500 mM sodium chloride, 0.1 (w / v)% sodium dodecyl sulfate, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8) is added to the particle precipitate. By adding, the carrier particles for hybridization were redispersed in the buffer solution, and then centrifuged at 5,000 rpm for 3 minutes to recover the carrier particles for hybridization. This operation was repeated three times to wash the hybridization carrier particles each time, and the carrier was finally redispersed in 1000 ml of TE buffer (consisting of 10 mM Tris hydrochloride buffer and 1 mM EDTA, pH 8.0). .
[0036]
2) Separation and detection of HIV-RNA
a) Separation by isopropyl alcohol extraction method
Samples of human serum containing HIV-1 type virus were prepared in 10-fold dilution series using normal human serum. Add 0.1 ml of 5M guanidinium thiocyanate (GTC) and 10 mM dithiothreitol (DTT) to each 0.3 ml of these diluted sera, leave at 70 ° C. for 5 minutes, and then add 1 ml of isopropyl alcohol. After leaving at room temperature for 5 minutes, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed, and the remaining pellet was redispersed in 1 ml of sterile distilled water, and then 50 ml of the pellet was used as a template. Amplification was performed by RT-PCR reaction and Nested PCR reaction as shown below.
b) Separation by the particle method of the present invention
Add 0.5 ml of a solution containing 5 M GTC and 10 mM DTT to each 0.3 ml of the diluted HIV-1 virus-containing serum, and leave it at 70 ° C. for 5 minutes, and then have the HIV nucleic acid probe prepared above. 10 μl of a polymer particle dispersion (5% by weight) and 100 μl of a 20% solution of surfactant Triton X-100 were added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 2000 rpm for 3 minutes to recover precipitated particles. The particles were redispersed in 1 ml of a 0.2 M sodium chloride aqueous solution, washed by centrifugation, the pellet was redispersed in 50 μl of sterile distilled water, and then RT as in the specimen prepared by the isopropyl alcohol separation method. -It was subjected to PCR amplification reaction treatment and Nested PCR amplification reaction treatment.
[0037]
c) Amplification by RT-PCR reaction and Nested PCR reaction
A Gene Amp rTth RT PCR kit (manufactured by Perkin Elmer) was used for RT-PCR amplification. The reagent composition and reaction conditions used were according to the manual provided by the kit manufacturer. In addition, primers having the following sequences were used for RT-PCR.
Primer SK145A sequence (also used for reverse transcription):
5'-CCCACAAGATTTAAACACCA-3 '
Sequence of primer SK451A:
5'-TGAAGGGTACTAGTAGTTCC-3 '
5 μl of 1st PCR product was taken and 2nd PCR amplification (Nested PCR) was performed.
The primers for 2nd PCR are as follows.
SK145: 5'-AGTGGGGGGCATAAGAGCCCATGCAAAT-3 '
SK431: 5'-TGCTATGTCAGTTCCCTTGGTTCCT-3 '
[0038]
In the above amplification reaction, a thermocycler Gene Amp 9600 (manufactured by PerkinElmer) was used.
Each reaction product amplified by the RT-PCR method and the Nested PCR method was used in a TBE buffer solution (buffer solution composed of 50 mM boric acid, pH 8.2) using a 2% agarose gel (Agarose 1600, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Electrophoresis was performed using a Mupid type electrophoresis apparatus, and after staining with ethidium bromide, detection was performed under ultraviolet light (254 nm) irradiation. The results obtained using four separate specimens are shown in Table 1.
Table 1 shows that when separating human serum and HIV-RNA using the particle method of the present invention, detection of HIV-RNA at a dilution factor of at least 100 times that of separating using human isopropyl alcohol extraction method. Indicates that it is possible.
[0039]
[Table 1]

[0040]
Example 3
Detection of HCV-RNA
1) Preparation of magnetic polymer particles with HCV nucleic acid probe
Various HCV nucleic acid probes were prepared by substantially the same procedure as 1) of Example 2. The sequence of the nucleic acid probe is that of the HC-1 strain published in Okamoto et al. (Okamoto, H. et al., Japan. J. Exp. Med., Vol. 60, pp.167-177. 1990). Reference was made to the sequence. The following probes were selected in consideration of the secondary structure by computer simulation (Soft Geuetyx, manufactured by SOC), GC content, melting point temperature (Tm) and other parameters.
[0041]

[0042]
Of the columns used for DNA production, PA and PB have 3'DNP-ON (TM) CPG, and PC and PD have 3'-Acridine-ON (TM) CPG, PE, PF, PG and PH. 3'-DMT-C₆Amino-ON (TM) CPG (both manufactured by Clontech) was used.
The complementary strands of these probes, each lacking the 10C base at the 3 'end of the corresponding probe, were also prepared by the procedure shown above.
As shown in 1) of Example 2, each nucleic acid probe was mixed with its complementary strand at the same ratio, annealed to form a double-stranded nucleic acid, purified, and then used.
Subsequently, the magnetic polymer particles prepared in 2) of Example 1 are used to chemically bond the double-stranded nucleic acids of the probes PA to PH to the magnetic polymer particles, respectively, and the magnetic polymer having one of these probes. In order to obtain a dispersion of particles, the treatment was carried out as shown in 1) of Example 2. Thus, for each of the probes PA to PH, a dispersion of magnetic polymer particles on which the probes were fixed was obtained.
[0043]
2) Evaluation of magnetic polymer particles with HCV nucleic acid probes for capacity to capture and separate complementary oligonucleotides
Labeling of complementary oligonucleotides with 32P
For each of probes PA-PH, complementary strand oligonucleotides PA (-)-PH (-) lacking the 3 'end (as shown in Example 2) were labeled with 32P as follows.
1 μl of an aqueous solution containing 2 nmol of A (−), 1 μl of T4 polynucleotide kinase having an enzyme activity of 8 U (Boehringer Mannheim), 5 μl of γ-32P-labeled adenosine triphosphate (10 μCi / μl), 5 μl of 10 × 5′-phosphorylation buffer and 39 μl of sterile water were placed in a 2 ml Eppendorf centrifuge tube, mixed and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
The 10-fold concentration buffer for 5'-phosphorylation used above has the following composition.
[0044]
composition:
0.5 M / l Tris hydrochloride buffer, pH 7.6
0.1M / l Magnesium chloride
50 mM / l dithiothreitol
1 mM / l spermidine
1 mM / l ethylenediaminetetraacetic acid
Next, after removing T4 polynucleotide kinase from the reaction mixture by phenol extraction method (see Sambrook at al., “Molecular Cloning” reference cited above, P458), the reaction mixture is (10 mM Tris hydrochloride buffer and 1 mM EDTA, Gel filtration was performed through a 1 ml column with Sephadex G-50 (Pharmacia) balanced with TE buffer (consisting of pH 8.0).
Each fraction of 100 μl each eluted and separated by gel filtration was ingested in order, and the radiation dose of each fraction was measured by the Cherenkov counter method, and the fractions that passed through the column were discriminated and collected. As a result, 200 μl of TE buffer having each of the two oligonucleotides labeled with 32P was obtained. These were solutions each having a radiation dose of 400,000 cpm per μl.
[0045]
100 μl of a 10 (w / v)% dispersion (containing 100 pmol probe nucleic acid) of magnetic polymer particles having the nucleic acid probe PA prepared under 1) above was placed in 8 Empedorff tubes, respectively. 1 μl of PA (−) labeled with 32 P prepared above as a target nucleic acid (having a Cherenkov count of about 400,000 cpm and corresponding to 10 pmol), and 10, 30 prepared under 1) above , 50, 70, 90, 110, 130, 150 pmol of unlabeled A (-), respectively, was added to each of the 8 Ependorf tubes. Sterile distilled water was added to make the total volume 180 μl, the Cherenkov count of each tube was measured, and those values were counted 1.
Put all the 8 Eppendorf tubes prepared as above in a water bath at 80 ° C., heat for 10 minutes, immediately put in ice water, let stand for 5 minutes, add 20 μl of 5M sodium chloride to each tube, Subsequently, it heated for 5 minutes with a 40 degreeC water bath, and the hybrid formation body was prepared. Next, in order to separate the bound nucleic acid from the free nucleic acid, a commercially available magnet is applied to each tube for 1 minute to remove the supernatant containing unreacted target nucleic acid, and the precipitate is washed with a binding buffer. Washed twice, and finally redispersed in TE buffer (consisting of 10 mM Tris hydrochloride buffer and 1 mM EDTA, pH 8.0) to a total volume of 100 μl, and the Turenkov count was measured. These values were counted as 2 for each tube.
[0046]
Next, each specimen was magnetically separated, and the precipitate was redispersed in 100 μl of sterilized distilled water to a total volume of 100 μl, left in a 65 ° C. water bath for 10 minutes, and then immediately cooled with ice water. . After 5 minutes, centrifugation was performed at 10,000 rpm for 3 minutes and the supernatant was removed. Then, the precipitate was redispersed in sterilized distilled water to make the total volume 100 μl, and the Turenkov count was measured. These values were taken as 3 for each tube.
The capture rate of target nucleic acid ([capture nucleic acid amount] / [target nucleic acid amount] × 100%) and the separation rate of captured nucleic acid ([separated nucleic acid amount] / [capture nucleic acid amount] × 100%) are shown in Table 2 below. Summarized.
Other nucleic acid probes PB to PH were processed and evaluated in the same procedure, and the results are also summarized in Table 2 below.
Table 2 considers having HCV nucleic acid probes to capture more than 90% of complementary oligonucleotides and to isolate more than 90% of captured oligonucleotides within the time and conditions adapted to commercial assays Shows the capacity of the individual polymer particles. These assay results demonstrate that a high percentage of HCV-RNA can be captured and separated in commercial assays using these particles.
[0047]
[Table 2]

[0048]
3) Extraction and detection of HCV-RNA by magnetic polymer particles with HCV nucleic acid probe
HCV-RNA was separated using magnetic polymer particles having the HCV nucleic acid probe prepared as described above. The extraction experiment is performed according to the procedure shown in 2) b) of Example 2, except that a commercial magnet is applied to the suspension containing the particles for 1 minute instead of the centrifugation operation. Briefly, to 300 μl of human plasma containing HCV-RNA, 600 μl of Lysis buffer (Amplicon ™ HCV kit, manufactured by Roche Diagnostics Systems, Branchburg, USA) was added, and after standing at room temperature for 10 minutes, 10 wt% Add 10 μl of suspension containing magnetic polymer particles with HCV nucleic acid probe and 300 μl of hybrid buffer (30% Triton X-100 solution), leave it at 60 ° C. for 10 minutes and at 25 ° C. for 10 minutes, and after magnetic separation After washing the particles separated with 1 ml of 0.4 M sodium chloride solution, redispersion and magnetic separation again, add the sample diluent from the kit to the precipitate and redisperse in the diluent. It was. The dispersion was directly used as a PCR template. In addition, amplification of RT-PCR was performed in the procedure shown by the operation method of the said kit.
[0049]
The experimental results obtained using magnetic polymer particles having nucleic acid probes PA to PH are summarized in Table 3 below. The experimental results demonstrate that particles with probes PB, PE, and PF allow detection of HCV virus from all samples with at least five HCV viruses. The particles are particularly useful for the separation and detection of HCV-RNA according to the present invention.
[0050]
[Table 3]

[0051]
Example 4
Polymer particles having HIV nucleic acid probes have a particle size of about 0.5 μm and a surface area of 1 nm instead of the polymer particles used above.²The preparation was as described in 1) of Example 2, except that a polystyrene latex having a specific gravity of about 1.05 having 5 carboxyl groups per unit was used. Briefly, the nucleic acid probe is chemically immobilized to the particle after being treated as shown above so that it is converted to a double stranded nucleic acid, and finally the complementary strand of the nucleic acid probe is subjected to heat treatment. Removal of the polymer particle dispersion with the HIV nucleic acid probe was obtained.
The procedure was the same as in Example 2, 2) b), but the polymer particles obtained above were used. However, in the system in which HIV-RNA was captured and detected by PCR reaction, but 0.3 ml serum sample and 0.6 ml of a solution containing 0.5 M / l GTC and 10 mM / l DTT were added at 5000 rpm No particle recovery in 3 minutes, and even when the system is centrifuged under more severe conditions at 15000 rpm x 15 minutes, the particles do not go to the bottom of the centrifuge tube and the serum / GTC / DTT mixture It gathered at the top and separated into two phases, a particle phase and a solution phase, but the boundary surface was unclear, and the volume of the particle phase after recovery was about 0.3 ml. This was treated with an RT-PCR reaction system and a PCR reaction system as shown in 2) c) of Example 2, but no amplified nucleic acid corresponding to HIV-RNA could be detected.
The above examples particularly show the importance of the specific gravity of the polymer particles. Even with polymer particles having a specific gravity of about 1.05, the particles cannot be precipitated by low speed centrifugation.
[0052]
Example 5
150 ml of sterilized distilled water was added to 0.3 ml of the particle phase at the top of the centrifuge tube collected in Example 4 and centrifuged again at 15000 rpm × 10 minutes. When this operation was repeated 5 times, the particles could be recovered as pellets by centrifugation of the system corresponding to the addition of 0.75 ml of sterile distilled water to the 0.3 ml particle phase solution. The system at this time consisted of a 2.5-fold diluted GTC / DTT solution.
The recovered particle pellets were treated with RT-PCR reaction system and PCR reaction system as shown in Example 2 2) c). As shown in Table 4 below, The corresponding amplified nucleic acid could not be detected.
As a control, GTC / DTT undiluted system, GTC / DTT system 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, and 2.5-fold diluted solutions were prepared and added to serum. These were processed and evaluated according to the isopropyl alcohol extraction method as shown in Example 2 1) a). The results are also shown in Table 4.
[0053]
Table 4 shows that when a GTC / DTT solution containing 0.5 mM / l GTC is diluted at least 1.0 times or more, a decrease in the amplification product is observed in one of the specimens. This decrease is probably due to degradation of HIV-RNA by ribonucleases present in serum samples.
According to the present invention shown in detail in the foregoing part, particles with specific nucleic acid probes can be used to easily isolate viral or bacterial target nucleic acids contained in specimens derived from biological fluid specimens. it can. Specifically, the capture of the target nucleic acid using the particles according to the present invention is highly sensitive, simple and short. In addition, according to the method of the present invention, the captured target nucleic acid can be easily detected by simply adding the captured particle of the target nucleic acid to the polymerase amplification reaction system without dissociating the captured target nucleic acid from the particle. As described above, the method of the present invention can be advantageously used in clinical examination centers and hospital examinations.
[0054]
[Table 4]

[0055]
Hereinafter, the present invention and preferred embodiments thereof will be described together.
1.Blood serum and / or plasmaA method for detecting a target nucleic acid of a virus or bacteria in
(A)Blood serum and / or plasmaObtaining a liquid fraction containing virus or bacteria from
(B) lysing a virus or bacteria to elute the target nucleic acid in the liquid fraction;
(C) a nucleic acid probe having a specific gravity of 1.1 to 2.5 that is substantially complementary to a specific sequence of viral or bacterial target nucleic acid to capture bacterial or viral target nucleic acid by hybridization. Adding a particle having a nucleic acid probe obtained by chemically binding to the particle to the lysate obtained in the step (b);
(D) recovering particles capturing the viral or bacterial target nucleic acid from the system obtained in step (c); and
(E) recovered in step (d)Without directly eluting the target nucleic acid from the particle directly,A step of detecting nucleic acid amplified by polymerase amplification reaction or reverse transcription polymerase amplification reaction
A method comprising adding a protein denaturant before or during any of the steps (a) to (d).
2. The method according to 1 above, wherein the carrier particles of the particles having a nucleic acid probe are water-insoluble polymer particles having a carboxyl group on the surface thereof.
3. The method according to 1 or 2 above, wherein the particle having a nucleic acid probe is a magnetic particle.
4. The method according to any one of 1 to 3 above, wherein the average size of the particles having a nucleic acid probe is about 0.05 to 5 μm, preferably about 0.1 to 3 μm.
5. The method according to any one of 1 to 4 above, wherein the specimen is serum or the like.
[0056]
6. The protein denaturant is guanitium thiooxynate (GTC) used at a concentration of about 0.1-5 mol / l, preferably about 0.2-4.5 Mmol / l. Method.
7. The method according to any one of 1 to 6 above, wherein the target nucleic acid is RNA.
8. The above 7 wherein the target nucleic acid is HIV-RNA or HCV-RNALaw.
[0057]
9. Consists of particles defined in any of the above 1-4.Blood serum and / or plasmaA kit for detecting the target nucleic acid of a virus or bacteria therein.
10. The kit of 9, further comprising a method for amplifying the target nucleic acid.
11. 10. The kit according to 10 above, which comprises a method for amplifying a target nucleic acid by PCR method or RT-PCR method.
12 The kit according to any one of 9 to 11, wherein the target nucleic acid is HIV-RNA or HCV-RNA.

Claims

A method for detecting viral or bacterial target nucleic acids in blood serum and / or plasma comprising:
(A) obtaining a liquid fraction containing virus or bacteria from blood serum and / or plasma ;
(B) lysing a virus or bacteria to elute the target nucleic acid in the liquid fraction;
(C) a nucleic acid probe having a specific gravity of 1.1 to 2.5 that is substantially complementary to a specific sequence of viral or bacterial target nucleic acid to capture bacterial or viral target nucleic acid by hybridization. Adding a particle having a nucleic acid probe obtained by chemically binding to the particle to the lysate obtained in the step (b);
(D) a step of recovering particles capturing the target nucleic acid of virus or bacteria from the system obtained in step (c), and (e) a particle capturing the target nucleic acid recovered in step (d) Any of the above-mentioned steps (a) to (d), which comprises a step of directly subjecting to a polymerase amplification reaction or reverse transcription polymerase amplification reaction and then detecting the amplified nucleic acid without eluting the target nucleic acid from A method comprising adding a protein denaturant before or during the step.

The method according to claim 1, wherein the particles having a specific gravity of 1.1 to 2.5 have an average particle size of 0.1 µm to 3 µm.