JP4411280B2 - 骨及び／又は関節疾患関連遺伝子 - Google Patents

Description

本発明は、新規機能として軟骨分化制御作用をもつタンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子及びこれらの遺伝子の取得方法に関する。さらに、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬のスクリーニング方法、並びに治療薬に関する。

骨及び／又は関節疾患の１つである変形性関節症（ＯＡ）は、加齢又は力学的ストレスに伴い、軟骨変性及び骨棘形成を生じ、２次性の滑膜炎を伴う疾患である。リスクファクターとしては、加齡以外に、性別（女性）、肥満、外傷（靭帯や半月板損傷など）が挙げられているが、病因については、不明な点が多い。変形性関節症は、日本国内で年間約９０万人もの新たな発症者がいるとの報告もあり（非特許文献１：南江堂：別冊整形外科４２：２−６，（２００２））、今後高齡化が進むに従い、より患者数が増加するものと考えられる。変形性関節症の保存的治療としては、内服薬としては非ステロイド性抗炎症剤が一般的に用いられる。また、関節内注入療法としては、高分子のヒアルロン酸が使用されている。しかしながら、作用機序として、軟骨変性を明確に抑制し、軟骨再生を促進するような薬剤はいまだにない。変形性関節症の病因はいまだ解明されていない部分が多いので、そのような薬剤の開発には、まず、変形性関節症の病態進行に深く関与する遺伝子の同定が必要である。
従来、ヒト病態関連遺伝子を取得するためには、主病変部位におけるヒト病態組織とヒト正常組織において発現の差のある遺伝子を、サブトラクション法、ＤＮＡマイクロアレイ法、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ法、又はＥＳＴの比較などにより取得する方法が従来行われてきた。例えば、骨及び／又は関節疾患の一つである変形性関節症においては健常人の軟骨と変形性関節症患者の軟骨それぞれのｃＤＮＡライブラリーにおいて５０００のｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｔａｇｓ（ＥＳＴｓ）を比較し、その出現頻度を比較することにより、変形性関節症で発現上昇しているＥＳＴの同定を試みる実験がなされている（非特許文献２：Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２００１）９，６４１−６５３）。また、同じく骨及び／又は関節疾患の一つである慢性関節リウマチ患者の滑膜細胞及び軟骨細胞において、ＰＭＡ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα処理により変動する遺伝子の検出も行われている（非特許文献３：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４，２１５０−２１５５）。一方、動物病態モデルを用いて、同様に正常組織と病態組織の遺伝子発現を比較することによる病態関連遺伝子の取得も試みられている。例えば、コラーゲン惹起関節炎モデル（ＣＩＡ）における遺伝子変動についてＤＮＡマイクロアレイ法で解析し、８７３４個のｃＤＮＡのうち３３０個が２倍以上の誘導を、５５個が２倍以上の抑制を示したとの報告がある（非特許文献４：Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ（２００２）１０５，１５５−１６８）。しかしながら、病態組織においては、正常組織と比べて、非常に数多くの遺伝子発現が変動していることが考えられ、単に病態組織と正常組織を比較するだけでは、病態進行に重要な役割を果たす遺伝子を絞り込むのは、困難と思われる。
病態進行に重要な役割を果たす遺伝子を、より直接的に同定するために、炎症性サイトカインなどのような病態と深く関与する因子により誘導される遺伝子をＤＮＡマイクロアレイ法により、同定する試みがなされている。例えば、炎症性サイトカインの１つであるインターロイキン−１を軟骨細胞株に作用させ、その際に誘導されてくる遺伝子を同定する試みがなされている（非特許文献５：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ（２００１）３，３８１−３８８）しかしながら、炎症性サイトカインも同様に非常に多くの作用を持っているので、この方法だけは、炎症や病態に重要な役割を果たす遺伝子を同定するには、十分な方法とはいえない。
一方、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１はポリオーマエンハンサー結合タンパク質（ＰＥＢＰ２αＡ）とも呼ばれるものであり、ｒｕｎｔ領域を有する遺伝子ファミリーに属する転写因子の一つである（非特許文献６：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，６８５９−６８６３）。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１は共役転写因子であるＣｂｆＢ／ＰＥＢＰ２βとヘテロ２量体を形成し、それによりＤＮＡ結合活性が高められることがｉｎ ｖｉｔｒｏで示されている（非特許文献７：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９４，３１４−３３１，非特許文献８：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）１３，３３２４−３３３９）。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１のノックアウトマウスは出生直後に呼吸不全で死亡し、骨形成の完全な欠損が起こることが知られ、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１は骨分化において必須の転写因子であることが明らかとなっている（特許文献１：特開平１０−３０９１４８、非特許文献９：Ｃｅｌｌ（１９９７）８９，７５５−７６４）。さらに、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ノックアウトマウスでは、軟骨細胞の成熟も抑制されており、マウス軟骨細胞株（ＡＴＤＣ５）において、前肥大軟骨細胞から肥大軟骨細胞にかけてアイソフォームの１つであるＴｙｐｅＩＩ Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現が観察されることから、軟骨分化、特に増殖軟骨から肥大化軟骨の段階で重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１Ｏ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５，８６９５−８７０２）。
変形性関節症患者の軟骨においては、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチンのような成長軟骨で見られるような軟骨分化マーカーの発現が亢進することが示されており（非特許文献１１：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ（１９９２）３５，８０６−８１１、非特許文献１２：Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）１９，２４５−２５５）、実際に変形性関節症の軟骨において石灰化も観察されている（非特許文献１３：金原出版株式会社「骨と軟骨のバイオロジー」（２００２年））。Ａ．Ｒｏｂｉｎ Ｐｏｏｌｅは、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍの論説の中で、変形性関節症の軟骨破壊に伴い、軟骨分化が進み肥大軟骨細胞がみられ、その過程は成長板でみられる内軟骨性骨化と似たプロセスである、と述べている（非特許文献１４：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ（２００２）４６，２５４９−２５５２）。このような変形性関節症で見られる永久軟骨の成長軟骨化が変形性関節症の病態進行と深い関りがあることが示唆されている（非特許文献１５：岩本容泰「軟骨組織形成の制御機構」第１７回日本骨代謝学会学術賞受賞論文）。
一方Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１をＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いて軟骨特異的に発現させると、変形性関節症でみられるような永久軟骨の成長軟骨化が見られ（非特許文献１６：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００１）１５３，８７−９９）、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１が変形性関節症の病態進行に重要な役割を果たすことが示唆された。しかしながら、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１は軟骨分化だけでなく、骨分化に対しても大きな作用があり、また免疫系への作用も示唆されている。したがって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１そのものの作用を阻害することによる薬剤の開発は、副作用が懸念される。そこで、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御される遺伝子を探索し、より病態特異的な作用をもつ遺伝子の探索が考えられる。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御される遺伝子の１つであるコラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）は（非特許文献１７：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９９）１９，４４３１−４４４２）、知られている３つのコラゲナーゼの中で最も変形性関節症の軟骨破壊に重要な役割を果たすことが判明している（非特許文献１８：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）９７，７６１−７６８）。また、コラゲナーゼ−３の軟骨特異的発現トランスジェニックマウスは変形関節症様の病態を示し、肥大軟骨分化マーカーであるＸ型コラーゲンの発現も観察されることがわかっている（非特許文献１９：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００１）１０７，３５−４４）。これらの知見は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１で誘導又は抑制される遺伝子（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子）の中には、変形性関節症の病態に深く関る遺伝子が存在することを示唆している。しかしながら、これまでにＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子の網羅的な解析は試みられていない。
転写因子に注目し、その転写因子を細胞に強制発現させたときに誘導される遺伝子の解析がなされている。例えば、炎症反応に深く関わる転写因子であるＮＦ−ｋＢのサブユニットの１つであるｐ６５を強制発現させ、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行い、誘導又は抑制される遺伝子が同定されている（非特許文献２０：Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００２）２８３，Ｃ５８−Ｃ６５）。この方法は機能のよくわかっている転写因子の関連遺伝子を同定するには効率的な方法であるが、ホスト細胞には、もともと内在性のＮＦ−ｋＢがあり、それによりＮＦ−ｋＢによる恒常的な遺伝子誘導がある。そのため、ＮＦ−ｋＢで制御される遺伝子のうち、すべてを感度よく検出するのが困難な可能性がある。これを回避するための方法が必要と考えられるが、これまでにそのような方法は試みられていない。
本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一つであることが明らかとなったＷＩＳＰ−２は、ＣＣＮ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ６１／ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）ｆａｍｉｌｙに属するＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒである（非特許文献２１：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５，１４７１７−１４７２２）。ＷＩＳＰ−２はＷｎｔ−１によりその発現が増強されることが明らかとなっており、また、ヒト大腸癌において、その発現が２〜３０倍弱くなっていることが明らかとなっている（非特許文献２１：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５，１４７１７−１４７２２）。また、ＷＩＳＰ−２ヒト正常乳上皮細胞に比べ、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株において、発現が上昇しており、癌細胞の増殖に関与していることが示唆されている（非特許文献２２：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１）２８２，４２１−４２５）。さらにｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより、骨芽細胞及び軟骨細胞に強く発現しており、骨芽細胞の機能の制御因子であることが示唆されている（非特許文献２３：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４，１７１２３−１７１３１）。しかしながら、ＷＩＳＰ−２がＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御されているという報告はこれまでにない。
また、同様に本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一つであることが明らかとなったＮｏｐｐ１４０は、最初に核局在化シグナル結合タンパク（１４０ｋＤａ）として同定されたものである（非特許文献２４：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９０）１１１，２２３５−２２４５）。Ｎｏｐｐ１４０遺伝子のポリペプチドは、６９９アミノ酸から成り、分子量は１３０〜１４０ｋｄ（脱リン酸化で９５ｋｄ）である。Ｎｏｐｐ１４０タンパク質は、高度にリン酸化されるリン酸化タンパク質であり、転写因子の制御等の作用を発揮するにはリン酸化が必要である。また、このタンパク質はＧＴＰａｓｅ／ＡＴＰａｓｅドメインを有する。
Ｎｏｐｐ１４０は、当初、核からの輸送のためのジャペロンとして機能していると考えられていた（非特許文献２５：Ｃｅｌｌ（１９９２）７０，１２７−１３８）。しかし、その後の報告では、ａｌｐｈａ−１ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＰ／ＥＢＰ）と特異的に結合することにより、転写活性化因子として機能していることが明らかとなっている（非特許文献２６：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１７，２３０−２３９）。Ｎｏｐｐ１４０タンパク質の作用には、細胞周期の調節（非特許文献２７：Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（１９９５）Ｍａｙ；ｐ１０８）、細胞の生死の調節（非特許文献２８：Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（１９９５）Ｍａｙ；１０８（Ｐｔ ５）：ｐ１９１１−１９２０）、黄体形成・卵細胞成熟（非特許文献２９：Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２０００）Ｄｅｃ；２５（３）：２７５−２８６．）、核内の仁の形成（非特許文献３０：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０００）１１，５６７−５７７）、転写因子の制御（非特許文献３１：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）１６，ｐ４２５７−４２６３）、ｒＲＮＡ合成の制御（非特許文献３２：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）１９，ｐ８５３６−８５４６）、及びシャペロン活性、肝臓の炎症急性期反応でα１急性期タンパク質の誘導があり（非特許文献３３：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１７，ｐ２３０−２３９）、ニワトリ神経菅形成時に発現が上昇する（非特許文献３４：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２）１２９，ｐ５７３１−５７４１）。また、このＮｏｐｐ１４０タンパク質は、ＯＬＥＴＦ肥満ラットの内臓脂肪で発現が上昇する（非特許文献３５：Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２０００）４１：ｐ１６１５−１６２２）。Ｎｏｐｐ１４０遺伝子は、Ｔｒｅａｃｈｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ症候群（頭部顔面の形成不全）の原因遺伝子ＴＣＯＦ１に構造的に類似している（非特許文献３６：Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．（２０００）Ｓｅｐ；１１（９）：ｐ３０６１−３０７１．）。以上のような報告があるが、Ｎｏｐｐ１４０の軟骨分化での役割については、いまだに明らかになっておらず、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御されているという報告もない。また、Ｎｏｐｐ１４０と骨及び／又は関節疾患の関連については、現在までのところ知られていない。
また、同様に本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一つであることが明らかとなったＴｅｍ８は、該Ｔｅｍ８遺伝子によりコードされるポリペプチドが５６２アミノ酸からなる細胞膜貫通型タンパク質であり、腫瘍に侵入する血管内皮細胞でのマーカーとなる（非特許文献３７：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）Ｓｅｐ １５；６１（１８）：ｐ６６４９−６６５５）。
また、Ｔｅｍ８遺伝子によりコードされるポリペプチドはＣａｐｉｌｌａｒｙ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎと相同性が高い（非特許文献３８：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２００３）Ａｐｒ ２９；１００（９）：５１７０−５１７４．Ｅｐｕｂ ２００３ Ａｐｒ １６．）。
Ｔｅｍ８と骨及び／又は関節疾患の関連については、現在までのところ知られていない。Ｔｅｍ８タンパク質の作用は、炭素菌毒素の細胞レセプター（ＡＴＲ１）として知られており（非特許文献３９：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００３）Ｆｅｂ １；６５（３）：３０９−３１４）、またコラーゲンαＩＶのＣ５ドメインと結合することが知られている（非特許文献４０：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）Ｆｅｂ １；６４（３）：ｐ８１７−８２０．）。
また、同様に本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一つであることが明らかとなったＧＡＬＮＴ３は、該ＧＡＬＮＴ３遺伝子によりコードされるポリペプチドが６３３アミノ酸からなり、ＧａｌＮａｃ糖転移酵素ファミリー内の他の酵素と非常に相同性が高い（非特許文献４１：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９９）Ｓｅｐ ３；２７４（３６）：２５３６２−２５３７０）。
ＧＡＬＮＴ３と骨及び／又は関節疾患の関連については、現在までのところ知られていない。ＧＡＬＮＴ３タンパク質は、ゴルジ体上の膜型酵素であって、ＧａｌＮＡｃ−糖転移酵素である。膵臓や甲状腺など腺組織での発現が多い。ＧＡＬＮＴ３のある種の突然変異遺伝子は家族性腫状石灰症の原因となる（非特許文献４２：Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）３６，ｐ５７９−５８１）。また、胃癌・膵臓癌などでＧＡＬＮＴ３タンパク質が発現することが知られている（非特許文献４３：Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．（２００３）Ｊａｎ；９４（１）：ｐ３２−３６）。
また、同様に本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一つであることが明らかとなったＨＣＫは、該ＨＣＫ遺伝子によりコードされるポリペプチドが５２６アミノ酸からなり、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｋｉｎａｓｅであり、血球系細胞で発現することが知られている。また、ＨＣＫタンパク質は、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリーに属する（非特許文献４４：Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９５）Ｊｕｎ；２７（６）：ｐ５５１−６３．）。ＳＨ２／ＳＨ３ドメインを持ちリン酸化によって活性化される。また、塩化水銀でも活性化される（非特許文献４５：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）Ｄｅｃ；２６７（２４）：ｐ７２０１−８）。
ＨＣＫと骨及び／又は関節疾患の関連については、現在までのところ知られていない。ＨＣＫタンパク質は、細胞増殖や免疫反応での重要なジグナル伝達因子であって、ｇｐ１３０（ＩＬ−６ＲやＬＩＦＲのシグナル伝達コンポーネント）からのジグナルで活性化される（非特許文献４６：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００１）Ｄｅｃ；２１（２３）：ｐ８０６８−８１）。ＨＣＫタンパク質は、Ｒａｓ ＧＡＰやＳＴＡＴ５などをリン酸化し、免疫グロブリンレセプターのシグナル伝達にも関与する（非特許文献４７：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９５）Ｊｕｎ １６；２７０（２４）：１４７１８−２４．；非特許文献４８：ＥＭＢＯ Ｊ．（２００２）Ｎｏｖ １；２１（２１）：ｐ５７６６−７４）。ＨＣＫタンパク質は、ＬＡＭＡ８４細胞において、ｉｍａｔｉｎｉｂｍｅｓｙｌａｔｅで発現上昇及び／又は活性化される（非特許文献４９：Ｂｌｏｏｄ．（２００４）Ｊｕｌ １５；１０４（２）：ｐ５０９−１８．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｍａｒ ２３）。また、ＨＣＫタンパク質は、骨髄腫などを増殖させる（非特許文献５０：Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９７）Ｄｅｃ；２５（１３）：ｐ１３６７−７７）。

本発明が解決しようとする課題は、骨及び／又は関節疾患の一つである変形性関節症と深い関連性のある転写因子Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１に着目し、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨細胞又はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス由来軟骨細胞株にＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を導入することにより、発現が誘導される遺伝子を同定し、新規機能として軟骨分化制御作用を持つ遺伝子を見出し、これらの遺伝子を変形性関節症などの骨及び／又は関節疾患の診断・制御・治療を目的とする手段として使用することである。さらには、該遺伝子がコードするポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、該遺伝子のトランスジェニック動物、骨及び／又は関節疾患好ましくは変形性関節症のモデル動物を提供することである。また、他の本発明の課題は、上記のものを利用して、該ポリペプチドの作用若しくは発現を調節する化合物のスクリーニングを行うことであり、さらには、スクリーニングにより選別される化合物を提供することであり、また、これらを利用した疾病の診断手段、治療薬を提供するものである。
この出願は、前記の課題を解決する第１発明として、病態に関連した転写因子を該転写因子の欠失した細胞株又は初代培養細胞で発現させ、その際発現が誘導又は抑制される遺伝子を、例えばサブトラクション法又はＤＮＡチップ法等によりスクリーニングすることにより、病態関連遺伝子を取得する方法を提供する。好ましくは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１をＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損軟骨細胞株又はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨細胞で発現させ、その際に発現が誘導される遺伝子を、例えばサブトラクション法又はＤＮＡチップ法等によりスクリーニングすることにより、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１に関する病態の関連遺伝子を取得する方法を提供する。言い換えると、この出願は、病態に関連した転写因子を該転写因子の欠失した細胞に導入することにより、従来法よりバックグラウンドの低く検出感度の優れた病態関連遺伝子探索方法を提供する。例えば、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損軟骨細胞株又はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損初代培養細胞で発現させ、その際に発現が誘導又は抑制される遺伝子は、軟骨分化制御関連遺伝子としてスクリーニングすることをができる。
この出願は、第２発明として、前記第１発明に用いるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来の初代軟骨細胞又は培養軟骨細胞、及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス由来軟骨細胞株を提供する。言い換えると、これらの細胞を用いた前記第１発明の遺伝子取得方法は、転写因子Ｃｂｆａ１が欠失しているため、内在性Ｃｂｆａ１による恒常的な遺伝子誘導がなく、従来法よりバックグラウンドの低く、検出感度に優れた遺伝子誘導及び／又は抑制系を提供する。本発明で好ましく用いることのできるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス由来軟骨細胞株は、ＲＵ−１株及びＲＵ−２２株として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブタペスト条約の規定下で２００３年８月５日付（原寄託）で国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１３７（ＲＵ−１株）及び受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１３８（ＲＵ−２２株）が付与されている。
この出願は、第３発明として、前記第２発明の細胞又は細胞株を用いてＣｂｆａ１を強制発現させた際に、発現が誘導される遺伝子のポリヌクレオチドを提供する。これらの遺伝子はＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においてもＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導が再確認されており、さらに野生型マウス胎仔骨格と比してＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス胎仔骨格では、発現が抑制されている遺伝子である。具体的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、又は２５に示される塩基配列を有し、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現によって発現が誘導されるポリヌクレオチドを提供する。
好ましくは、ＩＩ型コラーゲンプロモーターによる軟骨特異的トランスジェニックマウスにおいて、軟骨分化促進作用を有するタンパク質をコードし、配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子のポリヌクレオチド、軟骨分化抑制作用を有するタンパク質をコードし、配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子のポリヌクレオチド、軟骨分化促進作用を有するタンパク質をコードし、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子のポリヌクレオチド、軟骨分化抑制作用を有するタンパク質をコードし、配列番号１５に示される塩基配列を有する遺伝子のポリヌクレオチド、及び、軟骨組織形成抑制作用を有するタンパク質をコードし、配列番号２５に示される塩基配列を有する遺伝子のポリヌクレオチドを提供する。さらに、配列が新規である、配列番号９に示される塩基配列を有する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを提供する。
前記のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子はマウス由来であるが、データベースをサーチすることにより容易に、相当するヒトホモログを同定することが可能であり、これらのヒトホモログが軟骨分化に対し、類似した作用を持つことは容易に類推できる。また、これらの遺伝子の情報からハイブリダイゼーション法により、類似した遺伝子を取得することは容易に可能であり、得られた遺伝子が軟骨に対して類似した機能を持つことは容易に類推できる。従って、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、又は５１に示される塩基配列を有する、上記のマウス由来ポリヌクレオチドに対するヒトホモログポリヌクレオチドもまた提供する。
さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、又は２５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドのコードするポリペプチドと６５％以上の相同性を有し、かつ軟骨分化を促進又は抑制する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。またさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、又は２５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、軟骨分化を促進又は抑制する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
また、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖を含む組換えＤＮＡベクター、該組換えＤＮＡベクターを用いて形質転換した形質転換体、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（具体的には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、又は５２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ軟骨分化を促進又は抑制する作用を有するポリペプチド；該アミノ酸配列と少なくとも６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ軟骨分化を促進又は抑制する作用を有するポリペプチド）、上記ポリヌクレオチドからなる遺伝子の発現を調節するアンチセンスポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドからなる遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ分子、並びに上記ポリペプチドに対する抗体を提供する。
また、この出願は第４の発明として、骨及び／又は関節疾患の治療薬及び／又は予防薬のスクリーニング方法を提供する。本発明が提供するスクリーニング方法は、上記ポリヌクレオチド（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子）又は該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を用いるものであり、該方法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現を制御する化合物、及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質の活性を制御する化合物を取得することができる。
前記方法により軟骨分化抑制を示すことの明らかになったＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は、該遺伝子のポリヌクレオチド、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子のポリヌクレオチドを含むベクター、遺伝子発現やタンパク質の作用を活性化する化合物などを用いることにより、骨及び／又は関節疾患（好ましくは変形性関節症）で見られる軟骨分化亢進に対し、抑制効果が期待でき、治療及び／又は予防効果が期待できる。一方、軟骨分化促進を示すことの明らかになったＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は、このタンパク質の作用を阻害する化合物、遺伝子発現を阻害する化合物、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンスポリヌクレオチドなどを取得することによって、骨及び／又は関節疾患（好ましくは変形性関節症）の軟骨分化亢進に対し抑制効果が期待でき、治療及び／又は予防効果が期待できる。
また、前記方法によりスクリーニングされた病態関連遺伝子、例えば軟骨分化の抑制又は促進を示すことの明らかになったＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺子について、該遺伝子のポリヌクレオチド、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子のポリヌクレオチドを含むベクター、遺伝子発現やタンパク質の作用を活性化する化合物などを用いることにより、疾患、好ましくは骨及び／又は関節疾患（例えば変形性関節症）の診断を行うことができる。
さらに、この出願は、第５の発明として、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に関連するトランスジェニック動物、すなわち、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現強度を増強又は低下させた骨及び／又は関節疾患のモデル用トランスジェニック動物を提供する。好ましくはＩＩ型コラーゲンプロモーターによりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を軟骨特異的に発現させたトランスジェニックマウスを提供する。軟骨分化促進作用を有するＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のトランスジェニックマウスは、変形性関節症に類似した表現型をもつ可能性があり、変形性関節症の有用な病態モデルを提供する。この病態モデルは、医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供し、さらに病態解明の有用なツールとなる。また、本発明は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のポリヌクレオチド又はその相補鎖を含むＤＮＡベクター、該ＤＮＡベクターで形質転換された形質転換体、該ポリヌクレオチドがコードするタンパクそのもの、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、抗体、又は上記スクリーニング方法により選択された化合物などを投与することによる、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症のモデル動物の製造方法を提供する。

図１は、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨培養細胞の形態を示す、光学位相差顕微鏡（１００倍）による写真である。ＲＵ−１及びＲＵ−２２は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株を示す。
図２Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株（ＲＵ−１及びＲＵ−２２）のＩＩ型コラーゲン（Ａ）及びＸ型コラーゲン（Ｂ）の、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法による発現解析結果である。それぞれの細胞株をコンフルエントになるまで培養し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。その後、ｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法による発現解析を行った。各サンプルはＧＡＰＤＨの発現を同時に測定し、発現量はＧＡＰＤＨの値を１０００としたときの相対値として表した。
図３Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株（ＲＵ−１）にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現した際のＣｂｆａ１及び軟骨分化関連マーカーの遺伝子発現解析結果（Ａ：Ｃｂｆａ１，ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ，ＴｙｐｅＸ Ｃｏｌｌａｇｅｎ；Ｂ：ＭＭＰ１３，ＡＬＰ，ＢＳＰ）である。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１強制発現後０日目〜１５日目までの、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下での遺伝子発現の経時変化を、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により測定した。
図４Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株（ＲＵ−１）にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現した際の軟骨分化関連マーカー及びＨＮＯＥＬ−ｉｓｏの遺伝子発現解析結果（Ａ：Ｉｈｈ，ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ，Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ；Ｂ：ＩＬ１１，Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）である。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１強制発現後０日目〜１５日目までの、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下での遺伝子発現の経時変化を、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により測定した。
図５Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株（ＲＵ−２２）にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現した際のＣｂｆａ１及び軟骨分化関連マーカーの遺伝子発現解析結果（Ａ：Ｃｂｆａ１，ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ，ＴｙｐｅＸ Ｃｏｌｌａｇｅｎ；Ｂ：ＭＭＰ１３，ＡＬＰ，ＢＳＰ）である。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１強制発現後０日目〜１５日目までの、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下での遺伝子発現の経時変化を、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により測定した。
図６Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株（ＲＵ−２２）にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現した際の軟骨分化関連マーカー及びＨＮＯＥＬ−ｉｓｏの遺伝子発現解析結果（Ａ：Ｉｈｈ，ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ；Ｂ：ＩＬ１１，Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，Ｏｓｔｅｏｐｏｔｉｎ）である。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１強制発現後０日目〜１５日目までの、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下での遺伝子発現の経時変化を、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により測定した。
図７Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨培養細胞にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現した際のＣｂｆａ１及び軟骨分化関連マーカーの遺伝子発現解析結果（Ａ：Ｃｂｆａ１，ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ，ＴｙｐｅＸ Ｃｏｌｌａｇｅｎ；Ｂ：ＭＭＰ１３，ＡＬＰ，ＢＳＰ）である。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１強制発現後０日目〜１５日目までの、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下での遺伝子発現の経時変化を、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により測定した。
図８Ａ及びＢは、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨培養細胞にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現した際の軟骨分化関連マーカー及びＨＮＯＥＬ−ｉｓｏの遺伝子発現解析結果（Ａ：Ｉｈｈ，ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ；Ｂ：ＩＬ１１，Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）である。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１強制発現後０日目〜１５日目までの、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下での遺伝子発現の経時変化を、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により測定した。
図９は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損細胞株（ＲＵ−１、ＲＵ−２２）、及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代培養細胞にそれぞれアデノウイルスによりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強制発現誘導し、１日目に誘導されてくる遺伝子をＤＮＡマイクロアレイにより解析した結果である。
図１０は、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが明らかとなった遺伝子について、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法によりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導を再確認した実験結果である。それぞれの遺伝子（Ｃｂｆａ１，Ｔｅｍ８，ＷＩＳＰ２）はＤＮＡマイクロアレイにより誘導の確認された細胞株（ＲＵ−１）を用いて、誘導の再確認を行った。
図１１は、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが明らかとなった遺伝子について、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法によりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導を再確認した実験結果である。それぞれの遺伝子（Ｃｂｆａ１，ｋＥＳＴ，ＭＹＢ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐ１６０）１ａ，Ｎｏｐｐ１４０）はＤＮＡマイクロアレイにより誘導の確認された細胞株（ＲＵ−２２）を用いて、誘導の再確認を行った。
図１２Ａ〜Ｃは、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが明らかとなった遺伝子について、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法によりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導を再確認した実験結果である。それぞれの遺伝子はＤＮＡマイクロアレイにより誘導の確認された初代培養細胞を用いて、誘導の再確認を行った。
図１３Ａ及びＢは、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが明らかとなった遺伝子について、野生型とＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生期骨格での発現解析を行った結果である。野生型マウス（ＷＴ）の胎生１３．５日目、１５．５日目、１８．５日目、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス（ＫＯ）の胎生１８．５日目の骨格よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。その後、それぞれの合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により、発現解析を行った。（軟骨細胞株）
図１４Ａ〜Ｃは、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが明らかとなった遺伝子について、野生型とＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生期骨格での発現解析を行った結果である。野生型マウス（ＷＴ）の胎生１３．５日目、１５．５日目、１８．５日目、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス（ＫＯ）の胎生１８．５日目の骨格よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。その後、それぞれの合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により、発現解析を行った。（初代軟骨培養細胞）
図１５は、Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウスの下半身骨格の切片のＨＥ染色像（ＨＥ）及びＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、ＰＴＨレセプター（Ｐｔｈｒ１）、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法による発現解析の結果の像を示す写真である。野生型マウス（Ｗｔ）に比較して、Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウス（Ｗｉｓｐ２ ｔｇ）では、軟骨の分化が遅延していることを示唆している。
図１６Ａ及びＢは、Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウスの下半身骨格のＨＥ染色像を示す写真である。野生型（ＷＴ；Ａ）に比較して、Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウス（ＷＩＳＰ２；Ｂ）では、軟骨の分化が遅延していることを示唆している。
図１７Ａ及びＢは、Ｎｏｐｐ１４０トランスジェニックマウスの外観（Ａ）及び脛骨のＨＥ染色像（Ｂ）を示す写真である。野生型（Ｗｔ）に比較して、Ｎｏｐｐ１４０トランスジェニックマウス（Ｎｏｐｐ１４０ ｔｇ）では、軟骨の分化がある特定の段階で促進し７ていることを示唆している。
図１８Ａ及びＢは、Ｔｅｍ８トランスジェニックマウスの頭部の外観（Ａ）及び骨格染色像（Ｂ）を示す写真である。野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）に比較して、Ｔｅｍ８ トランスジェニックマウス（Ｔｅｍ８）では、軟骨の分化が促進していることを示している。
図１９Ａは、ＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１４．５日目の外観（Ａ−▲２▼）、骨格染色像（Ａ−▲１▼）を示す写真である。
図１９Ｂ及びＣは、ＨＥ染色像（Ｂ−▲１▼、ＨＥ）及びＩ型コラーゲン（Ｂ−▲２▼：Ｃｏｌ１ａ１）、ＩＩ型コラーゲン（Ｂ−▲３▼：Ｃｏｌ２ａ１）、Ｘ型コラーゲン（Ｂ−▲４▼：Ｃｏｌ１０ａ１）、オステオポンチン（Ｂ−▲５▼：Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、インディアンヘッジホッグ（Ｂ−▲６▼：Ｉｈｈ）、ＰＴＨレセプター（Ｂ−▲７▼：Ｐｔｈｒ１）、Ｈｃｋ（Ｂ−▲８▼）、ＭＭＰ１３（Ｃ−▲１▼）、ＢＳＰ（Ｃ−▲２▼）、ＶＥＧＦ（Ｃ−▲３▼）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発現解析の像、並びにＴＲＡＰ染色による破骨細胞の解析像（Ｃ−▲４▼）を示す写真である。ＨＣＫトランスジェニックマウスは身体が小さく、四肢が太く短く、軟骨組織には分化異常が認められた。
図２０は、ＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１６．５日目のＨＥ染色（ＨＥ）、ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、ＰＴＨレセプター（ＰｔｈＲＰ）、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発現解析を示す写真である。ＨＣＫトランスジェニックマウスの脛骨では、組織化されていない異常な細胞増殖により、正常な成長軟骨板が形成されず、長軸方向への成長が異常であった。
図２１Ａ〜Ｃは、ＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観（Ａ）、骨格染色像（Ｂ）、ＨＥ染色（Ｃ）の結果を示す写真である。ＨＣＫトランスジェニックマウスは野生型と比較して、身体が小さく、腹部が突き出ており、四肢が太く短かった（図２１Ａ）。また、鼻と上顎の間が分裂しており、鼻と上顎の融合過程が阻害されていた。骨格染色ではアリザリンレッドで染色される石灰化組織が減少、アルシアンブルーで染色される細胞外マトリックスが増加していることが明らかになった（図２１Ｂ）。ＨＥ染色像においてはこのマウスの軟骨細胞は未熟であり、その周辺で間葉系細胞の侵入、増殖が認められた。内軟骨性骨で近位−遠位軸の方向性が失われており、異常な形状を示した。成長版は組織化されておらず、関節は癒合していた（図２１Ｃ）。
図２２Ａは、ＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観（Ａ−▲１▼）、骨格染色像（Ａ−▲２▼）を示す写真である。
図２２Ｂ及びＣは、ＨＥ−Ｋｏｓｓａ染色像（Ｂ−▲１▼：ＨＥ Ｋｏｓｓａ）及びＩ型コラーゲン（Ｂ−▲２▼：Ｃｏｌ１ａ１）、ＩＩ型コラーゲン（Ｂ−▲３▼：Ｃｏｌ２ａ１）、Ｘ型コラーゲン（Ｂ−▲４▼：Ｃｏｌ１０ａ１）、オステオポンチン（Ｂ−▲５▼：Ｏｓｔｅｏｐｏｍｔｉｎ）、オステオカルシン（Ｂ−▲６▼：Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、ＰＴＨレセプター（Ｂ−▲７▼：Ｐｔｈｒ１）、インディアンヘッジホッグ（Ｂ−▲８▼：Ｉｈｈ）、Ｈｃｋ（Ｃ−▲１▼）、ＭＭＰ１３（Ｃ−▲２▼）、ＢＳＰ（Ｃ−▲３▼）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発現解析像、並びにＴＲＡＰ染色による破骨細胞の解析像（Ｃ−▲４▼）とサフラニンＯ染色によるプロテオグリカンの解析像（Ｃ−▲５▼）を示す写真である。Ｃｏｌ２ａ１を発現する軟骨細胞は減少しており、骨は正常な過程を経ずに間葉系細胞の侵入と増殖を伴って形成されていた。
図２３Ａ及びＢは、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス作製のための遺伝子構築物の構造（Ａ）、及びＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観を示す写真（Ｂ）である。野生型マウス（ｗｔ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は身体が小さく、四肢が短く、胸部は小さく、腹部は突き出ていた。
図２４は、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の骨格染色像を示す写真である。野生型マウス（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は胸郭が小さく、内軟骨性骨化による石灰化した骨が顕著に減少していた。
図２５Ａ及びＢは、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１６．５日目の脛骨のＨＥ−Ｋｏｓｓａ染色像を示す写真である（図中ＢはＡの部分的な拡大像）。野生型（ｗｔ）では血管侵入が始まっているが、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ではそれが遅れており、関節腔の形成も不十分であった。
図２６は、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１６．５日目の脛骨のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によるＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）の発現解析結果を示す写真である。野生型マウス（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ではＩＩ型コラーゲンの発現は異常な分布を示した。
図２７は、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１６．５日目の脛骨のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によるＸ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）の発現解析結果を示す写真である。Ｘ型コラーゲンの発現は野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ともに肥大軟骨で認められた。
図２８は、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１６．５日目の脛骨のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によるオステオポンチンの発現解析結果を示す写真である。オステオポンチンの発現は野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ともに肥大軟骨で認められた。
図２９Ａ及びＢは、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の脛骨のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法（Ａ：ｍＲＮＡ）及び免疫染色法（Ｂ：ｐｒｏｔｅｉｎ）によるアグリカンの発現解析結果を示す写真である。アグリカンのｍＲＮＡの発現（Ａ）は野生型マウス（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では若干上昇していたが、タンパクレベル（Ｂ：ｐｒｏｔｅｉｎ）では減少していた。
図３０は、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１６．５日目の脛骨のサフラニン０染色の結果を示す写真である。野生型マウス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では染色性が顕著に低下しており、プロテオグリカン含量が顕著に減少していることが明らかとなった。
図３１Ａ及びＢは、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の距骨のＰＡＳ染色の結果を示す写真である（図中のＢはＡの部分的な拡大像である）。野生型マウス（ｗｔ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は染色性が増加しており、ムチン様の糖タンパク質が増加していることが明らかになった。
図３２は、ＧＡＬＮＴ３トラシスジェニックマウスの胎生１８．５日目の脛骨のフィブロネクチンの免疫染色像を示す写真である。野生型マウス（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では軟骨細胞間の距離が狭く、細胞外マトリックス量が低下していることが明らかになった。
図３３Ａは、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の脛骨をＢｒｄｕラベルにより軟骨細胞の増殖を解析した結果を示す写真である。野生型マウス（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では軟骨細胞の増殖が亢進していることが明らかになった。
図３３Ｂは、Ｂｒｄｕ陽性細胞を数を比較したグラフを示す。
図３４は、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の脛骨におけるアポトーシスをｔｕｎｎｅｌ染色により解析した結果を示す写真である。野生型マウス（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では軟骨のアポトーシスが亢進していることが明らかになった。
発明の実施をするための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１０月２０日に出願された日本国特許出願第２００３−３５９１７２号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
［骨及び／又は関節疾患の定義］
本発明において、骨及び／又は関節疾患とは、骨格を形成する骨及び軟骨の異常を症状の一つとする、全身性若しくは関節に主病変を生じる疾患の総称である。より具体的には、骨分化及び軟骨分化と病変の発症に結びつきが示されていることと定義することもできる。本発明における骨及び／又は関節疾患は、好ましくは軟骨分化関連疾患である。代表的な骨及び／又は関節疾患には、変形性関節症、慢性関節リウマチなどを示すことができる。また、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、Ｒｅｉｔｅｒ症候群、全身性エリテマトーデズ（ＳＬＥ）、進行性全身性硬化症、Ｃｈａｒｃｏｔ関節（神経障害性関節症）、ＣＰＰＤ結晶沈着症、ＢＣＰ結晶沈着症、痛風も、関節炎を病変の一つとして伴う場合があり、広義の骨及び／又は関節疾患に含まれる。また、骨分化と病変との関連という点から、骨粗鬆症も広義の骨及び／又は関節疾患に含まれる。
変形性関節症は、関節軟骨の変性、磨耗及び軟骨下骨の硬化、増殖性変化を特徴とする疾患であり、２次的な滑膜炎も観察される。変形性関節症は加齡を基盤とした多因子性疾患と考えられており、リスクファクターとしては、加齢以外に性別（女性）、肥満、外傷（靭帯・半月板損傷など）が考えられているが、その病因には不明な点が多い。変形性関節症の関節軟骨においては、正常永久軟骨では見られない肥大軟骨マーカーの発現亢進、石灰化が見られることが知られており、軟骨の肥大化（分化亢進）は変形性関節症の発症に関与していることが示唆されている。したがって、軟骨分化を制御することにより、変形性関節症の症状を改善できると思われる。
［Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の定義］
本発明において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１によりその発現が誘導される遺伝子をＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子という。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は特に断らない限り、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、又は２５に示される塩基配列を有する遺伝子及び配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、又は５１に示される塩基配列を有するヒトホモログ遺伝子（ヒトホモログポリヌクレオチド）及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導される遺伝子と同等の機能を有する遺伝子から選択されたいずれか１つ又は複数の任意の遺伝子を示す用語として用いられる（表１）。ここで言うＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導される遺伝子と同等の機能を有する遺伝子とは、具体的には、マウス・ヒト以外の動物種におけるカウンターパート遺伝子を例示することができる。これらの遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、又は５２に示す。これらの遺伝子は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１によりその発現が誘導されるため、軟骨分化制御作用を有し、また、軟骨分化制御に関連する疾患又は病態に関与する可能性がある。

［骨及び／又は関節疾患関連遺伝子］
本発明は、骨及び／又は関節疾患関連遺伝子のポリヌクレオチドに関する。好ましくは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導され、なおかつ、軟骨分化に対して促進又は抑制作用を示す遺伝子のポリヌクレオチドに関する。特に好ましくは、前記のことに加え、変形性関節炎に関連する遺伝子のポリヌクレオチドに関する。すなわち、前記の遺伝子はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の欠損したマウス由来初代軟骨細胞又はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損軟骨細胞株にＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を導入した際に、発現が誘導又は抑制される遺伝子を、例えばサブトラクション法、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いてスクリーニングすることにより同定することができる。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の欠損したマウス由来の初代軟骨細胞及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損軟骨細胞株の調製については、［細胞・細胞株］の項に記載されており、また、これらの細胞にＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を導入する方法は当業者に公知の遺伝子組換え手法（形質転換法）を用いることができる。より具体的な手順の例を実施例２に記載する。
前記により同定されたＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導される遺伝子のポリヌクレオチド（表１の左欄）はマウス由来であるが、公共のデータベースを調査することにより、容易にヒトホモログを特定することができる。公共のデータベース（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ）を調査することにより特定されたヒトホモログの塩基配列を配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、又は５１に示す（表１の右欄）。また、ヒトホモログは公共のデータベースを相同性検索することにより、特定することもできる。その場合は、上記遺伝子によりコードされるポリペプチドと少なくとも６０％以上、好ましくは少なくとも６５％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子の中から、最も相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子を選別することにより、特定することができる。タンパク質の相同性検索は当業者に公知であり、例えば公知のタンパク質相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｋａｒｌｉｎ Ｓ．， ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８）などを利用して容易に相同性を求めることができる。
さらに、実験的には、前記のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導される遺伝子をコードするポリヌクレオチド若しくはその相補鎖をプローブとして、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを得ることにより、例えばヒトにおいて、マウス由来の遺伝子と相同性が高く、機能的にも同等である遺伝子を特定することができる。このようにして得られたヒトホモログが、軟骨分化に対し、同等の機能を保持することは容易に類推できる。本発明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９））に記載の方法により得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察されることを表す。
以上のようにして得られるポリヌクレオチドが、実際に軟骨分化を促進又は抑制する作用を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば実施例８及び９に示す手法を用いて、当該ポリヌクレオチドを発現させた場合に軟骨分化を促進又は抑制するか否かを試験することにより確認することができる。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により発現が誘導され、かつＰＣＲ遺伝子増幅モニター法で再現性が確認され、さらに、野生型マウス胎仔骨格に比べてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス骨格において発現の抑制されている遺伝子をコードするポリヌクレオチドのうち、配列番号９に示される塩基配列を有する新規遺伝子をコードするポリヌクレオチドがある。この遺伝子は、解析に用いたＤＮＡマイクロアレイにおいて、グラス上にスポットされた配列の元となる配列は、公共のデータベース上に存在するが、遺伝子の一部分の配列のみが示されているにすぎない。本発明においては、その配列を元にＲＡＣＥ法により新規遺伝子の全長配列を同定したものである。解析に用いたＤＮＡマイクロアレイには、このような部分配列のみが知られた遺伝子が数多くスポットされており、これらはいずれもＲＡＣＥ法により全長配列を決めることができる。したがって、この方法を用いて、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により発現が誘導又は抑制されているＥＳＴが同定でき、さらにＲＡＣＥ法により全長遺伝子を解析することにより、新規遺伝子を同定することができる。このように同定された遺伝子も、他のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と同様に、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御され、好ましくは軟骨分化を制御する作用を持ち、さらに好ましくは骨及び／又は関節疾患、例えば変形性関節炎に関連する遺伝子である可能性がある。
また、配列番号３及び１５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは軟骨分化抑制作用を有し、一方、配列番号５及び１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは軟骨分化促進作用を有する。さらに配列番号２５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは軟骨組織の形成を抑制する作用を有する。
本発明の遺伝子のポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、又は５１で示されるものである。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、若しくは５１で示されるＤＮＡ配列又は公共のデータベースに記載の塩基配列において１ないし数個のＤＮＡの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するＤＮＡ配列であってもよい。ＤＮＡの欠失、置換、付加あるいは挿入の手段自体は公知であり、エキソヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製法、部位特異的突然変異誘発法などが挙げられる。また、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は、遺伝子によっては、異なるスプライシング部位による複数のアイソフォームが存在することがある。これらのアイソフォームは互いに機能的に類似することは容易に類推することができ、本発明におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に含まれるものである。
［一部の塩基配列からの全長の塩基配列のクローニング］
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一部の塩基配列が明らかであれば、当業者はこれらの部分塩基配列情報に基づいて、該遺伝子の全長配列を明らかにすることができる。全長塩基配列は、例えばｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングによって取得することができる。すなわち、公共データベースに集積されている膨大なＥＳＴ情報を対象として、該遺伝子の一部を構成するＥＳＴの塩基配列（クエリー配列）を照合する。照合の結果に基づいて、クエリー配列と一定の長さに渡って塩基配列が一致するほかのＥＳＴ情報を取得する。得られたほかのＥＳＴ情報を新たなクエリー配列として、さらに他のＥＳＴ情報の取得を繰り返す。この操作の繰り返しによって、部分的な塩基配列を共有する複数のＥＳＴのセットを得ることができる。ＥＳＴのセットはクラスターと呼ばれる。クラスターを構成するＥＳＴの塩基配列を重ね合わせて一つの塩基配列に統合することにより、目的とする遺伝子の塩基配列を明らかにすることができる。
さらに当業者は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングによって決定された塩基配列に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを使ったＲＴ−ＰＣＲによって、設計どおりの長さを有する遺伝子断片が増幅されることを確認すれば、決定された塩基配列からなる遺伝子が実際に存在することを裏付けることができる。
あるいは、ノーザンブロッティングによって、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングの結果を評価することもできる。決定された塩基配列情報に基づいてデザインされたプローブを使ってノーザンブロッティングを行う。その結果、上記塩基配列情報と一致するバンドが検出できれば、決定された塩基配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングの他、実験的に目的とする遺伝子を単離することもできる。まず、ＥＳＴとして登録されている塩基配列情報を与えたｃＤＮＡクローンを入手し、そのクローンが有するｃＤＮＡの塩基配列の全てを決定する。その結果、ｃＤＮＡの全長配列を明らかにできる可能性がある。少なくとも、より長い塩基配列を明らかにすることができる。当該クローンが有するｃＤＮＡの長さは、ベクターの構造が明らかであれば、あらかじめ実験的に確認することもできる。
また、ＥＳＴの塩基配列情報を与えたクローンが手元に無くとも、部分塩基配列に基づいて、当該遺伝子の塩基配列が未知の部分を取得する方法は公知である。たとえば、ＥＳＴをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、より長い塩基配列を明らかにできる場合がある。ｃＤＮＡライブラリーとしては、全長ｃＤＮＡを多く含むライブラリーを用いれば、容易に全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。例えば、オリゴキャップ法の原理に基づいて合成されたｃＤＮＡライブラリーは、全長ｃＤＮＡを多く含むとされている。
さらに、部分的な塩基配列情報に基づいて、遺伝子の塩基配列が未知の領域を合成するための手法が公知である。たとえばＲＡＣＥ法は、未知塩基配列を含む遺伝子の単離のための代表的な手法である。ＲＡＣＥ法においては、ｃＤＮＡの末端に人為的にオリゴヌクレオチドリンカーが連結される。このオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列は予め既知のものである。したがって、ＥＳＴとして既に塩基配列が明らかな領域と、オリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列情報に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。こうしてデザインされたプライマーを使ったＰＣＲによって、塩基配列が未知の領域が特異的に合成される。
ＲＡＣＥ法、ｃＤＮＡライブラリークローニング、公共のデータベースを用いたｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングなどにより、全長配列情報が取得できれば、当業者は全長配列情報に基づいて、合成ＤＮＡを作成し、さらにその合成ＤＮＡを結合することにより、全長配列を含むポリヌクレオチドの取得が可能である。合成ＤＮＡを用いた方法では、任意の場所に突然変異を導入することができ、軟骨分化に対する機能を保持したままで、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、付加を伴う改変体を作製することができる。また、このようにして得られたポリヌクレオチドは、他の手法で得られた同じ配列を含むポリヌクレオチドと同等の機能を有し、同様に用いることができる。
［遺伝子の多型について］
なお、一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。またスプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列が異なる遺伝子であっても、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と同様の活性を持つ遺伝子は、いずれも本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に含まれる。
［他種におけるホモログについて］
本発明において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は、マウス・ヒトホモログに限らず、他動物種におけるカウンターパートも含む。従って、マウス・ヒト以外の種におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子とは、特に断らないときには、その種に固有のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のホモログ、あるいはその個体に導入されている外来性のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を言う。
本発明においてマウスＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のホモログとは、マウス当該遺伝子伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつマウスＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と同等の機能を有する、マウス以外の種に由来する遺伝子を言う。「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼージョンのシグナルが観察されることを表す。ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼージョンや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼージョン溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。従って、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を実験又は経験的に設定することができる。ここで、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と同等の機能を有する遺伝子とは、マウス又は他の種のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子によってその発現が抑制又は促進され、マウスＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１遺伝子によりコードされるタンパク質と同一又は類似の活性又は機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
マウスＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のヒトホモログ遺伝子を、公共のデータベースで調べたところ、タンパク質のアミノ酸配列レベルの相同性が６５％以上の値を示すヒトホモログを特定することができた。したがって、マウスの配列から、ヒト以外の動物種のホモログを公共のデータベースから探す場合にも、アミノ酸配列レベルで６５％以上の相同性を有していれば、機能的に類似したカウンターパートである可能性がある。
［プライマー・プローブ］
プライマー又はプローブには、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の塩基配列の全部若しくは一部からなるポリヌクレオチド、又はその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより、決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を検出するためのプローブとして、又はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。
１）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
２）ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
３）クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
４）ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｚｉｎｎ Ｋ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８４）１２，７０３５−７０５６）
５）放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
尚、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち重合度が比較的低いものを意味し、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
［遺伝子探索手法］
本発明は、病態に関連のある転写因子を該転写因子の欠損した細胞へ導入し、該転写因子を発現させることによる病態関連遺伝子の探索手法に関する。さらに好ましくは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１をＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の欠損した初代軟骨細胞又は軟骨細胞株に導入し、該転写因子を発現させることによる遺伝子の探索手法に関する。この方法により内在性の遺伝子による恒常的な遺伝子発現がなく、バックグラウンドが非常に低く抑えられた、遺伝子探索手法が提供され、従来検出できなかった遺伝子を検出できる可能性がある。病態に関連のある転写因子とは、例えばＮＦ−ｋＢのような炎症反応に関与するものが挙げられる。病態に関連のある転写因子とは、病態において、誘導されるものでも抑制されるものでもよく、病態進行に従って、誘導されている転写因子でもよい。
転写因子の欠損した細胞は、既に確立されている細胞系を用いることもできるし、又は、該転写因子の遺伝子情報に基づいて遺伝子工学的手法により作製することも可能である。あるいは、種々の化学処理により、転写因子の欠損した細胞を得ることができる場合もある。
転写因子の細胞への導入は、当業者に公知の形質転換法を用いて行うことができる。転写因子を細胞へ導入し、その発現を確認した後、サブトラクション法、ＤＮＡチップなどを利用して、その発現が誘導又は抑制される遺伝子をスクリーニングする。
［細胞・細胞株］
本発明は、前記の遺伝子探索手法に用いることのできるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来の初代培養軟骨細胞又は培養軟骨細胞、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス由来軟骨細胞株に関する。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代培養軟骨細胞は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生１８．５日目の骨格をトリプシン処理及びコラゲナーゼ処理することにより、得られる初代軟骨細胞である。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス由来軟骨細胞株は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウスの胎生１８．５日目の骨格をトリプシン処理及びコラゲナーゼ処理し、さらにクローニングを３若しくは４回繰り返すことにより、樹立された細胞株である。前記の初代軟骨細胞及び軟骨細胞株の樹立の方法は、それ自体公知であり、自体公知の他の方法に従って採取してもよい。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス由来軟骨細胞株の好ましい例として、限定するものではないが、ＲＵ−１株及びＲＵ−２２株が挙げられる。これらのＲＵ−１株及びＲＵ−２２株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブタペスト条約の規定下で２００３年８月５日付（原寄託）で国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１３７（ＲＵ−１株）及び受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１３８（ＲＵ−２２株）が付与されている。
［ポリペプチド］
本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、又は５２に記載のものを含む。また、公共のデータベースで調べることにより、ポリペプチドの配列を調べることができる。公共のデータベースに登録のないものに関しては、Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ検索により、塩基配列から容易に類推できる。さらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、又は５２のポリペプチドか公共のデータベースに登録のポリペプチドであっても、新たにＯｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅが見つかった場合には、そのポリペプチドであってもよい。また、これらのポリペプチドは、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、そのアミノ基若しくはカルボキシル基などの修飾など、機能（すなわち軟骨分化を促進又は抑制する作用）の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。さらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、又は５２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、その機能（すなわち軟骨分化を促進又は抑制する作用）の著しい変更を伴わないものも本発明のポリペプチドに含まれる。
また、別の例として、本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＨＣＫなどのコードするポリペプチドについては、市販のタンパク質（ポリペプチド）として入手することも可能である（インビトロジェン社、Ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ２９０８等）。またさらに別の例としては本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＧＡＬＮＴ３などのコードするポリペプチドは、公知の方法によって精製を行うことで得ることも可能である（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｓｅｐ １９；２７２（３８）：２３５０３−１４．）。
本発明のポリペプチドは、それ自体で、それら自体の生体内での機能（例えば、軟骨の分化、変形性関節炎の発症）を調節するための医薬組成物に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、それらの機能を調節し得る化合物、例えば、阻害剤、拮抗剤、賦活剤などを得るためのスクリーニングや、それらに対する抗体の取得に用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドは、試薬としても使用可能である。
［組換えベクター］
本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子をコードするポリペプチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターを得ることができる。ベクターＤＮＡとしては、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡが一部欠落しているものでもよい。例えば、ＣｏｌＥ１から派生するベクター、ラムダファージから派生するベクターがある。前記ベクターＤＮＡに本発明のＤＮＡを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。
［形質転換体］
本発明からなるポリペプチド及びその由来物は、無細胞タンパク質発現系、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞などの公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明の新規ポリペプチド及びその由来物を提供可能である。形質転換は、公知の手段を応用することができ、例えば、レプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換を行う。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自律複製系を利用する。ベクターは、宿主の種類により選択され、発現目的遺伝子配列とその複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。構成要素は宿主の種類、すなわち原核細胞又は真核細胞に応じて選択し、プロモーター、リボソー厶結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組み合わせて使用する。
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養することにより、本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。培養は、発現産生される新規ポリペプチドの生理活性を指標に行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養又はバッチによって行う。
［抗体］
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質に対する抗体は、骨及び／又は関節疾患の診断・治療に用いることができる。例えば、診断においては、各Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。また治療においては、当該遺伝子のコードするタンパク質の活性を制御する抗体により行うことができる。
上記で用いる抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，５３７−５４０）であることができる。例えば、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に対するポリクローナル抗体は、下流遺伝子によりコードされるポリペプチド又はペプチドを抗原として用いて感作した哺乳動物から血清を採取することにより得ることができる。また、下流遺伝子によりコードされるポリペプチド又はペプチドを抗原として用いて感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させることによりハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングした後、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることも可能である。
また、このような抗体の具体的な例としては、たとえば本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＨＣＫやＴｅｍ８などのコードするタンパク質については、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．６１０２７７（抗ＨＣＫ抗体）やａｂｃａｍ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．２００Ｃ１３３９（抗Ｔｅｍ８抗体）などの市販の抗体を入手することも可能である。また抗Ｎｏｐｐ１４０等については公知の文献（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ｊａｎ；１７（１）：２３０−９．）に記載の抗体を用いることや、同様の方法で抗体を作製することが可能である。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質の検出には、これらの抗体を適宜標識してやればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えばＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いるタンパク質若しくはその部分ペプチドは、例えばＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子若しくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作製し、該形質転換体を培養して組換えタンパク質を発現させ、発現させた組換えタンパク質を培養体又は培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ハムスターなどが用いられる。
［アンチセンス］
遺伝子の全長配列情報が明らかであれば、当業者は遺伝子の機能を阻害するアンチセンスオリゴ（ポリヌクレオチド）の設計が可能である。また、遺伝子の部分配列のみの情報であっても、アンチセンスオリゴの設計は可能である。たとえば、本発明で軟骨分化に対して促進的に作用することが明らかになったマウスＮｏｐｐ１４０においては、その開始コドン付近の配列５’−ＣＧＧ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＡＴ ＡＣＣ ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＴＧ−３’（配列番号１１１）より、アンチセンスオリゴの候補配列である５’−ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＣＣ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＡＴ−３’（配列番号１１２）などのアンチセンスオリゴを設計することができる。アンチセンスオリゴは、細胞内での分解を避けるために様々な修飾や結合様式が知られており、当業者であれば、適切なアンチセンスオリゴの構造を選択することができる。その構造としては、天然型（Ｄ−オリゴ）、ホスホロチオエート型（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート型（Ｍ−オリゴ）、ホスホロアミデート型（Ａ−オリゴ）、２’−Ｏ−メチル型Ｄ−オリゴ、モルフォリデート型（Ｍｏ−オリゴ）、ポリアミド核酸、などが例示できる。また、長さは１０塩基から７０塩基、好ましくは１５塩基から３０塩基のものを用いる。このようにして作成されたアンチセンスオリゴは例えばＮｏｐｐ１４０であれば、その機能を抑制することが期待でき、さらに骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬として利用可能である。
［ＲＮＡｉ］
ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ、ＲＮＡ干渉）は、２１〜２３残基の二重鎖ＲＮＡ分子が同じ配列を含むターゲットのＲＮＡを分解することにより、その発現を強力に抑制する現象をいう。したがって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する２本鎖構造を含むＲＮＡ分子は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現抑制に利用することができる。ＲＮＡｉ効果を得るためには、少なくとも２０以上の連続する塩基配列を有する２本鎖構造のＲＮＡ分子を用いることが望ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていても良いし、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。本明細書中、このようなＲＮＡｉ現象を引き起こしうる二本鎖ＲＮＡをＲＮＡｉ分子という。
例えば、マウスＮｏｐｐ１４０においては、開始コドン付近の配列から５’−ＡＵＧ ＧＣＧ ＧＡＵ ＡＣＣ ＧＧＣ ＵＵＧ ＣＧＣ−３’（配列番号１１３）及びその相補鎖である５’−ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＣＣ ＧＧＵ ＡＵＣ ＣＧＣ ＣＡＵ−３’（配列番号１１４）の２つのＲＮＡ鎖を合成し、それぞれをアニーリングすることにより、二重鎖ＲＮＡ分子を作製することができ、これらはＲＮＡｉ分子として利用可能である。またそれぞれの鎖の３’側に２塩基のオーバーハングを持たせることにより、遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる（ＷＯ０１／７５１６４）。
また、このようなＲＮＡｉ分子の別の例としては、市販のＲＮＡｉ分子、例えばＨＣＫに対するＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）分子（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ−００３１００−ＴＫ−０２）なども用いることができる。
ＲＮＡｉ分子の設計に用いる配列及び長さや構造については、当業者であれば、様々な改変を試みて、最も遺伝子発現抑制作用の強いＲＮＡｉ分子を至適化することが可能である。またこのようにして得られたＲＮＡｉ分子は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子子の発現を抑制することにより、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬として利用可能である。
［活性の測定方法］
さらに本発明においては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質の生物学的な活性を指標にして化合物や抗体等のスクリーニングや、診断などを行うことができる。例えば、活性の増減、変化により、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１遺伝子の関連する病態を診断しうる。また、生物学的な活性を阻害又は活性化をする低分子化合物若しくは抗体などをスクリーニングすることにより、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質の活性制御化合物若しくは抗体を取得することができ、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節炎の治療に用いることができる。以下に各タンパク質の有する活性を測定するための一般的な方法を記載する。
（１）転写因子・転写調節因子
転写因子を、^３２Ｐなどで標識した転写因子の標的配列を含む２本鎖オリゴＤＮＡと共に室温でインキュベートして結合させる。インキュベート後のサンプルはＳＤＳを含まない未変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、標識したオリゴＤＮＡの移動度を^３２Ｐの放射活性などを指標にして評価する。転写因子にオリゴＤＮＡに対する結合活性があれば、標識したオリゴＤＮＡの移動度が遅くなり、高分子量側にシフトする。また、標的配列の下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーター遺伝子を連結した発現ベクターと転写因子遺伝子をヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の応答遺伝子プロモーターなどの下流に連結した発現ベクターをＨｅｌａやＨＥＫ２９３などの細胞株に共遺伝子導入し、４８時間後に細胞破砕液を調製してＣＡＴの発現量を調べることにより評価できる（Ｚｈａｏ ＦらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４０７５５−４０７６０（２００１））。
また具体的な例としては、本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＮＯＰＰ１４０のコードするポリペプチドは、ａｌｐｈａ−１ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＰ）遺伝子の発現を誘導する転写因子として知られており、ＡＧＰ ｐｒｏｍｏｔｏｒを利用したレポータージーンアッセイなど公知の方法を用いることも可能である（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ｊａｎ；１７（１）：２３０−９．；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｏｃｔ １８；２７７（４２）：３９１０２−１１．）。
（２）キナーゼ
キナーゼを、ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎを基質として含む緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，及び２５ｕＭ ＡＴＰ）に添加し、さらに［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを添加して３７℃で１０分保温する。１０分後にＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で反応を止め、反応液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルを乾燥させてリン酸化されたｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎの放射活性をＸ線フィルムにて検出する（Ｐａｒｋ ＳＹら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１９７６８−１９７７７（２０００））。
また具体的な例としては、本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＨＣＫのコードするポリペプチドはキナーゼとして機能することが知られており、公知の方法でその活性を測定することも可能である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｓｅｐ．１０ Ｖｏｌ．２７４（３７）ｐ２６５７９）。
（３）分泌性因子
活性を測定する分泌性因子の受容体が存在すると思われる細胞を、分泌性因子で刺激し、細胞に生じる変化を測定する。細胞に生じる変化を測定する方法としては、下記のようなものがある。
細胞をカルシウム感受性蛍光色素ｆｕｒａ−２を含むＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁し、分泌性因子による刺激を加える。刺激により引き起こされる細胞内カルシウム濃度の上昇をＬＳ５０Ｂ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などの蛍光検出器で測定する（Ｚｈｏｕ Ｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６，４２８２６−４２８３３）。
分泌性因子で細胞を刺激し、これにより引き起こされる細胞増殖をチミジンの取り込みで評価する。
分泌性因子の刺激を伝えると思われる転写因子の活性化をルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現により評価することもできる（Ｐｉｅｋ Ｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６，１９９４５−１９９５３）。
（４）受容体・膜タンパク
受容体若しくは膜タンパクを細胞に強制発現させ、リガンドが存在すると思われる試料（細胞の培養液、血清など）で刺激し、細胞に生じる変化を、［分泌性因子］の項に記載の方法に準じて測定する。
また受容体については、それに対して結合して作用を起こす物質（リガンド）との結合を測定することによっても活性を測定することができる。その具体的な例としては、本発明でＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＴｅｍ８のコードするポリペプチドであり、Ｔｅｍ８は炭素菌に結合する受容体としても知られており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３ Ｆｅｂ １４ Ｖｏｌ．２７８（７）ｐ５２２７）、またＶＩ型コラーゲンのα３サブユニットとの結合も知られている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４ Ｆｅｂ １ Ｖｏｌ．６４（３）ｐ８１７）。このことから、これらの物質とＴｅｍ８の結合を測定することによって活性の指標とすることも可能である。
（５）フォスファターゼ制御因子
制御を受けるフォスファターゼの活性を測定することにより、該タンパク質のフォスファターゼの制御活性を見る。フォスファターゼの活性は、下記の方法により活性を測定することができる。フォスファターゼをｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）を基質として含む緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ５．５，１．６ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，１０ｍＭ ｐＮＰＰ）に添加し、３７℃で３０分間保温する。３０分後に１Ｎ ＮａＯＨを添加して反応を停止し、ｐＮＰＰの加水分解の結果生じた４０５ｎｍの吸光度を測定する（Ａｏｙａｍａ Ｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６，２７５７５−２７５８３）。
（６）酵素類（キナーゼ・フォスファターゼ以外）
前述のキナーゼ・フォスファターゼ以外にも多種類の酵素が存在し、生体の機能や構造の維持・変化に関係している。酵素はその反応する物質（基質・反応産物）や反応のメカニズムに特異性を持つ（基質特異性・反応特異性）ため、その酵素に応じた活性を測定する種々の方法が考案されている。また酵素は構造や基質特異性・反応特異性が類似した一群の酵素群（酵素ファミリー）を形成することもあり、その酵素ファミリーの中では基質や阻害剤・活性化剤との反応性に共通性が見られることがあるため、同じ酵素ファミリーに属する酵素の活性測定方法を用いて新規の酵素活性評価系を構築することが可能となる場合もある。したがって、本発明の方法で得られたＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子が酵素である場合には、公知の方法や同じ酵素ファミリーに属する酵素の測定法を用いてその活性を測定する方法を構築することが可能である。
その具体的な例としては、本発明においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の下流遺伝子であることが示されたＧＡＬＮＴ３の場合を例示することができる。ＧＡＬＮＴ３（ｐｐＧａＮＴａｓｅ−Ｔ３）は、ｐｐＧａＮＴａｓｅ ｆａｍｉｌｙに属する糖転移酵素であり、その活性の測定はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを基質としてＭＵＣ２やＨＩＶ−Ｈ３などのペプチドにＧａｌＮＡｃを付加する反応を調べることで測定できる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｊｕｌｙ １９，Ｖｏｌ．２７１（２９）ｐ．１７００６）。また、ＧＡＬＮＴ３タンパク質は、既報の方法によって精製することができる（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｓｅｐ １９；２７２（３８）：２３５０３−１４．）。また、ｐｐＧａＮＴａｓｅ酵素ファミリーには現在２４種類の酵素の存在が報告されている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００３ Ｊａｎ；１３（１）：１Ｒ−１６Ｒ．）が、そのＧＡＬＮＴ３を含むｐｐＧａＮＴａｓｅ ｆａｍｉｌｙは低分子化合物での酵素活性を制御することが可能であると報告されていることから、そのような情報を用いて活性阻害剤・活性化剤などを取得できる可能性も考えられる。
［診断方法］
本発明の診断方法においては、通常、被験者から採取された生体試料を被験試料とする。生体試料としては、血液試料が望ましい。血液試料とは、全血、あるいは全血から得られた血漿や血清を用いることができる。また本発明における生体試料としては、血液のほか、関節液、バイオプシーにより採取された関節軟骨片、滑膜組織なども用いることができる。これらの生体試料の採取方法は公知である。
生体試料が関節軟骨片や滑膜組織などの細胞である場合には、ライセートを調製すれば、前記タンパク質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。あるいは、血液、関節液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈してタンパク質や遺伝子の測定のための試料とすることができる。
上記の生体試料からライセートを調製すれば、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいは、このライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセート又はｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。またＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質が血中や関節液に分泌されていれば、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とするタンパク質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の方法に使用することができる。
ｍＲＮＡを測定する場合には、本発明におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨなどを挙げることができる。
さらに本発明は、本発明の診断方法のための試薬（診断薬組成物）を提供する。すなわち本発明は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、その相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター、又は該ＤＮＡベクターで形質転換した形質転換体を含有する、骨及び／又は関節疾患の診断用試薬に関する。あるいは、本発明は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質（ポリペプチド）、該タンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、又はＲＮＡｉ分子を含有する、骨及び／又は関節疾患の診断用試薬に関する。
本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチド又は前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合わせて診断用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素（１）〜（６）を以下に示す。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
（１）試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
（２）陽性対照
（３）陰性対照
（４）標識を測定するための基質
（５）反応容器
（６）アッセイプロトコルを記載した指示書
本発明における骨及び／又は関節疾患の診断とは、例えば以下のような診断が含まれる。骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症が疑われる症状を示しながら、一般的な検査では、変形性関節症と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えば変形性関節症疾患の患者であるか否かを容易に判定することができる。より具体的には、変形性関節症疾患が疑われる症状を示す患者において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現の上昇若しくは低下は、その症状の原因が変形性関節症である可能性が高いことを示している。
あるいは、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。つまり、変形性関節症疾患に対する治療効果の判定に有用である。より具体的には、変形性関節症疾患が疑われる症状を示す患者において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現の上昇若しくは低下は、変形性関節症疾患がさらに進行若しくは改善している可能性が高いことを示している。
さらに、発現レベルの違いに基づいて、変形性関節症の重症度を判定することもできる。すなわち、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現の上昇の程度は、変形性関節症の重症度若しくは軽症度に相関する可能性がある。
［トランスジェニック動物、骨及び／又は関節疾患モデル動物］
本発明は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子若しくはＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、全身性、好ましくは軟骨特異的に発現強度を増強させたトランスジェニック非ヒト動物からなる骨及び／又は関節疾患モデル動物、好ましくは変形性関節症モデル動物に関する。本発明により、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は軟骨分化に対して促進作用又は抑制作用を示すことが明らかになった。したがって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化に対して促進作用を示す遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、変形性関節症の関節軟骨で見られる軟骨分化促進が観察され、変形性関節症のモデル動物として利用できる可能性がある。
また、本発明は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子若しくはＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、全身性、好ましくは軟骨特異的に発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト動物からなる骨及び／又は関節疾患モデル動物、好ましくは変形性関節症又は慢性関節リウマチのモデル動物に関する。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化に対して抑制作用を示す遺伝子の発現レベルを人為的に低下した動物は、変形性関節症の関節軟骨で見られる軟骨分化促進が観察され、変形性関節症のモデル動物として利用できる可能性がある。
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子によってコードされるタンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
さらに本発明は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコードするタンパク質そのもの、若しくは該タンパク質に対する抗体の投与による骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症のモデル動物の作製方法に関する。
まず、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子は、その発現レベルの上昇及び低下により、軟骨分化促進を誘導することができ、さらに好ましくは変形性関節症の病態を誘導することができる。遺伝子発現レベルと軟骨分化に対する作用の関係は、該遺伝子のコードするタンパク質が軟骨分化に対して促進作用を示すか、抑制作用を示すかにより判断できる。より具体的には、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子（例えば、配列番号５又は１）の発現レベルの上昇は、軟骨分化を促進し、変形性関節症の病態を誘導する可能性がある。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制作用を示す遺伝子（例えば、配列番号３、１５又は２５）の発現レベルの低下は、軟骨分化を促進し、変形性関節症の病態を誘導する可能性がある。
前記の遺伝子発現レベルの上昇は、トランスジェニック動物だけでなく、該遺伝子がコードするタンパク質そのものの投与によっても行うことができ、変形性関節症の病態を誘導し、モデル動物として利用できる可能性がある。該遺伝子がコードするタンパクは、同等の機能を持つのであれば、全長のタンパク質であっても、活性部位を含む部分配列のタンパク質であってもよい。
また、前記の遺伝子発現レベルの低下は、トランスジェニック動物だけでなく、該遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制するもの、若しくは該遺伝子の発現レベルを低下させるものの投与によっても行うことができ、変形性関節症の病態を誘導し、モデル動物として利用できる可能性がある。該遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制するものは、具体的には、抗体や化合物などの活性阻害物質であり、また、受容体であれば、リガンドと結合する領域のみで細胞内にシグナルを伝えることのできないデコイ部分ポリペプチド（細胞外ドメイン可溶化受容体）なども利用できる。また、該遺伝子の発現レベルを低下させるものには、アンチセンス核酸、リボザイムあるいはＲＮＡｉ分子を利用することができる。また、転写因子であれば、その転写因子の認識するプロモーターの特異的ＤＮＡ配列を基に、デコイ型の核酸を設計することができる。このように設計されたデコイは転写因子の活性化抑制作用をもつことが考えられ、変形性関節症病態モデルの作製、若しくは変形性関節症の医薬品として利用可能である。
本発明の変形性関節症モデル動物は、変形性関節症の生体内の変化を明らかにするために有用である。さらに、変形性関節症モデル動物を使用することにより、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のさらなる機能を解明すること、及び該遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また、本発明による変形性関節症モデル動物は、変形性関節症のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。例えば本発明による変形性関節症モデル動物が軟骨変性作用を示し、何らかの変形性関節症関連マーカーや軟骨分化マーカーの測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物をスクリーニングするシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは被験動物が本来備えているＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写とタンパク質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物であるタンパク質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。
本発明において、発現レベルの低下とは、被験動物が備えるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写とタンパク質への翻訳が阻害されている状態、あるいは翻訳産物であるタンパク質の分解が促進された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、例えばＤＮＡチップにおけるシグナル強度の差や、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により確認することができる。また、翻訳産物であるタンパク質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、指標遺伝子を導入し強制発現させた動物、又はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子をノックアウトした動物、他の遺伝子と置換（ノックイン）した動物等を示すことができる。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイムやＲＮＡｉ効果をもたらすポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、あるいはデコイ核酸として機能するＤＮＡなどを導入したトランスジェニック動物も、本発明におけるトランスジェニック動物として用いることができる。その他、たとえばＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強又は抑制したり、あるいは分解されにくい又は分解されやすいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異として、置換、欠失、挿入、又は付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着又はエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｌａｖｉｔｒａｎｏｅｔ Ｍら，Ｃｅｌｌ（１９８９）５７，７１７−７２３）。
発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルを調整することができる。例えば、限定されるものではないが、ＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いることができる。
本発明の変形性関節炎のモデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作製することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
［骨及び／又は関節疾患の治療薬又は予防薬候補化合物のスクリーニング方法（ｉｎ ｖｉｖｏ）］
本発明は、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子には、軟骨分化促進作用又は軟骨分化抑制作用を示すものがあることが示された。変形性関節症においては、その病態において永久関節軟骨の軟骨分化亢進が示されている。したがって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち、軟骨分化促進作用を示す遺伝子（例えば、配列番号５又は９に示される塩基配列を有する遺伝子）については、その発現レベルを低下させる化合物をスクレーニングすることにより、変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬を得ることができる。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち、軟骨分化抑制作用を示す遺伝子（例えば、配列番号３、１５又は２５に示される塩基配列を有する遺伝子）については、その発現レベルを上昇させる化合物をスクリーニングすることにより、変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬を得ることができる。
本発明において遺伝子の発現レベルを上昇若しくは低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、及びタンパク質の活性発現のいずれかのステップに対し、促進的若しくは抑制的に作用する化合物である。また本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、これらのステップのいずれかに対して阻害的な作用を持つ化合物である。
本発明の骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬候補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程
（２）前記被験動物の生体試料におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現強度を測定する工程
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子では該遺伝子発現レベルを低下させる化合物を、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制作用を示す遺伝子では該遺伝子発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子若しくはＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用することができる。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子によってコードされるタンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験物質が本来備えている、その動物種におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
本発明のスクリーニングにおける被験動物としては、［トランスジェニック動物、骨及び／又は関節疾患モデル動物］の項に記載した、本発明のトランスジェニック動物による骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症のモデル動物や、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子がコードするポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体などを投与することにより作製される骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症のモデル動物を利用することができる。それ以外にも公知の変形性関節症モデルを利用することが可能である。公知の変形性関節症モデルとしては、自然発症変形性関節症発症モデル（ＳＴＲ／ＯＲＴマウスなど）や、前十字靭帯切除モデル（マウス、ラット、ウサギ、イヌなど）などを例示することができる。
当業者は、本発明の開示に基づいて、マウス以外の種におけるホモログを特定することができる。例えばホモロジーサーチによって、ヒトホモログの塩基配列、あるいはアミノ酸配列と相同性の高い他種の遺伝子（あるいはタンパク質）を見出すことができる。あるいは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、他種におけるホモログを単離することもできる。なお、ヒト遺伝子を導入されたモデル動物を用いるスクリーニング方法では、当該動物のホモログのみならずヒト遺伝子がＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子として測定される場合もある。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物由来の生体試料におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験動物由来の生体試料におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の診断方法と同様の手法によってモニターすることができる。さらにこの評価の結果に基づいて、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子については、その発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制作用を示す遺伝子については、その発現レベルを上昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
このようなスクリーニングにより、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進を示す遺伝子：
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
（２）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写活性の抑制
（３）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写産物の安定化阻害若しくは分解の促進など。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制を示す遺伝子：
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化
（２）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写活性の促進
（３）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写産物の安定化若しくは分解の阻害など。
［骨及び／又は関節疾患の治療薬及び／又は予防薬候補化合物のスクリーニング法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）］
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニングにおいては、例えば、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子の場合は、発現レベルを低下させる化合物を、軟骨分化抑制作用を示す遺伝子の場合は、発現レベルを上昇させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルを測定する工程
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子では、該遺伝子発現レベルを低下させる化合物を、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制作用を示す遺伝子では、該遺伝子発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程。
本発明において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を発現する細胞は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、及び宿主細胞は、本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微小核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理学的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法においては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を発現する細胞として、マウス軟骨細胞株（ＡＴＤＣ５）などを用いることができる。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子を発現する宿主細胞としては、本発明で樹立したＣｂｆａ１−／−，ｐ５３−／−マウス由来軟骨細胞株を用いることができる。また、ラット、ウサギ、ニワトリ及びマウスの初代軟骨培養細胞を用いることも可能である。なお、関節軟骨及び成長板軟骨からの軟骨初代培養細胞は、公知の方法により採取することができる。
なお、本発明のスクリーニング方法において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルを比較するためには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに、本発明の開示に基づいて本発明のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の（１）〜（３）の工程を含む、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬のスクリーニング方法であって、該薬がＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子、若しくはＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と機能的に同等な遺伝子を標的とするものである方法に関する。
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子では、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、軟骨分化抑制作用を示す遺伝子では、前記レポーター遺伝子発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程。
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックスなどを例示することができる。
またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができる。
あるいは本発明における各Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示したｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子では、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、軟骨分化抑制作用を示す遺伝子では、前記レポーター遺伝子発現レベルを上昇させる化合物を選択することにより、本発明のスクリーニングを行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬のスクリーニング方法であって、該薬がＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子若しくはＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子と機能的に同等な遺伝子を標的とするものである方法に関する。
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子によってコードされるタンパク質と候補化合物を接触させる工程
（２）前記タンパク質の活性を測定する工程
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子では、前記活性を低下させる化合物を、軟骨分化抑制作用を示す遺伝子では、前記活性を上昇させる化合物を選択する工程。
本発明におけるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子がコードするタンパク質が有する活性を指標として、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進作用を示す遺伝子では、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、該遺伝子の働きを抑制する。その結果、変形性関節症で見られる軟骨分化促進を阻害することにより、変形性関節症の病態を制御することができる。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子がコードするタンパクの活性の測定は、前記の一般的な方法を用いて、測定することができる。また、当業者であれば、用いる試薬の組成や緩衝液の組成、基質などに変更を加えることにより、測定方法を最適化することができる。
また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制作用を示す遺伝子では、その活性を促進する活性を有する化合物のスクリーニングをすることができる。このようにして得ることができる化合物は、該遺伝子の働きを促進する。その結果、変形性関節症でみられる軟骨分化促進を抑制することができ、変形性関節症の病態を制御することができる。
これらのスクリーニングに用いる被験候補物質としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物若しくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、さらにはキットの使用方法を記載した指示書などをパッケージしておくこともできる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症に治療薬及び／又は予防薬として有用である。あるいは、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進を示す遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンス核酸、リボザイム、又はＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制することによって、変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬として有用である。
さらに、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化促進を示す遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体も、変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬として有用である。加えて、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のうち軟骨分化抑制を示す遺伝子によってコードされるタンパク質そのものも、変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬として有用である。
［医薬品］
本発明の骨及び／又は関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬は、スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦活剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明の変形性関節症の治療薬及び／又は予防薬は、変形性関節症の症状の改善を目的として、経口あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、関節腔注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき治療薬及び／又は予防薬の有効成分がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療及び／又は予防効果を達成することができる。治療及び／又は予防効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療及び／又は予防する手法は公知である。
あるいは、アンチセンス核酸、リボザイム、又はＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、適当なプロモーター配列の下流に組込み、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、あるいはＲＮＡｉ効果をもたらすＲＮＡの発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターを変形性関節症患者の関節軟骨若しくは滑膜細胞などに導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイ厶、又はＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によって変形性関節症に対し、治療及び／又は予防効果を達成することができる。
アンチセンスＲＮＡとは、遺伝子のセンス配列に相補的な塩基配列を有するＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡによって遺伝子発現を抑制するには、通常１５塩基以上たとえば２０塩基以上、あるいは３０塩基以上の連続した塩基配列を有するＲＮＡが用いられる。たとえば開始コドンを含む領域にハイブリダイズすることができるアンチセンス核酸は、当該遺伝子の発現抑制効果が大きいとされている。
リボザイムは、塩基配列特異的にＲＮＡを切断する触媒作用を備えたＲＮＡである。ハンマーヘッド型やヘアピン型のリボザイムが知られている。いずれのリボザイムも、切断すべき領域に相補的な塩基配列部分と触媒活性の発現に必要な構造を保持するための塩基配列部分とで構成されている。切断すべき領域に相補的な塩基配列は任意とすることができる。したがって、この領域の塩基配列を標的遺伝子に相補的な塩基配列とすることによって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現を制御するためのリボザイムをデザインすることができる。
次にＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果は、ｍＲＮＡと同じ塩基配列を含む２本鎖構造のＲＮＡ分子が、当該ｍＲＮＡの発現を強力に抑制する現象を言う。したがって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子のｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する２本鎖構造を含むＲＮＡｉ分子は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の発現抑制に利用することができる。ＲＮＡｉ効果を得るためには、少なくとも２０以上の連続する塩基配列を有する２本鎖構造のＲＮＡｉ分子を用いることが望ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていても良いし、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。
アンチセンス核酸、リボザイム、並びにＲＮＡｉ効果を得るためのポリヌクレオチド（ＲＮＡｉ分子）において、相補的、あるいは同一の塩基配列とは、完全に相補的、あるいは同一の塩基配列に限定されない。これらのＲＮＡの発現抑制作用は、高度に相補性あるいは同一性を維持して入れば、維持される。ある塩基配列又は、ある塩基配列と相補的な塩基配列に対して、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、たとえば９８％以上の同一性を有する場合、高度な同一性あるいは相補性を有すると言うことができる。
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療及び／又は予防効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、１回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。

以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
［実施例１］ Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス胎仔からの初代軟骨細胞の取得とＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウス胎仔骨格からの軟骨細胞株の樹立
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−マウス由来初代軟骨細胞の採取
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ノックアウトマウスは、小守らにより作製されたものを用いた（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４、特開平１０−３０９１４８号公報）。胎生期１８．５日目のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ホモ欠損マウスより骨格を採取し、０．１％ＥＤＴＡ／０．１％Ｔｒｉｐｓｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ７．４）で３７℃、６０分処理した。その後、１．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，ａｌｐｈａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ（αＭＥＭ）で３時間３０分処理し、細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液はコラーゲンコートｄｉｓｈにおいて、１０％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＣＯ ＢＲＬ）中で２〜３日増殖させて、その後の実験に用いた。初代軟骨細胞の形態を図１（下段）に示す。
（２）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１及びｐ５３欠損マウスの作製
未分化軟骨細胞の形質を維持し、かつ増殖能・生存率の維持された軟骨細胞株を樹立する目的で、軟骨細胞を取得するためのＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１とｐ５３遺伝子を両者とも欠損したマウスを作製した。ｐ５３欠損マウスはＧｏｎｄｏ Ｙらにより作製されたものを用いた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２０２，８３０−８３７）。またＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスを作製するにあたっては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ホモ欠損マウス（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−）は出生後すぐに死亡し交配に用いることは不可能であるため、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ヘテロ欠損マウス（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１＋／−）を用いた。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ヘテロ欠損マウス（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１＋／−）とｐ５３欠損マウス（ｐ５３−／−）を交配し、得られた仔マウスの尾の一部を採取してそのゲノム遺伝子を調べることによって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ヘテロ欠損−ｐ５３ホモ欠損マウス（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１＋／−，ｐ５３−／−）を得た。その後、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ヘテロ欠損−ｐ５３ホモ欠損マウス（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１＋／−，ｐ５３−／−）同士を交配し、それよって得られた胎仔の形状及び組織の一部より抽出したゲノム遺伝子を調べることでＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ホモ欠損−ｐ５３ホモ欠損マウス（Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−，ｐ５３−／−）を得た。
（３）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−，ｐ５３−／−マウス由来軟骨細胞株の作製
胎生期１８．５日目のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１ホモ欠損−ｐ５３ホモ欠損マウスより骨格を採取し、０．１％ＥＤＴＡ／０．１％Ｔｒｉｐｓｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ７．４）で３７℃、６０分処理した。その後、１．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，ａｌｐｈａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ（αＭＥＭ）で３時間３０分処理し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞は１０ｃｍ ｄｉｓｈあたり５０〜２００個の細胞を、１０％ウシ胎仔血清／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）中で培養することにより、コロニーを形成させ、得られたコロニーをステンレスリング中でＴｒｉｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理することによりピックアップした。さらに得られたコロニーは限界希釈法により２〜４回再クローニングを行い、増殖能や生存率が維持されている細胞を選択した。さらにそれらの細胞について、軟骨細胞に特徴的に発現しているＩＩ型コラーゲンの発現と、未分化軟骨細胞では発現の低いＸ型コラーゲンの発現（方法は（４）に記載）を確認して、未分化軟骨細胞の形質を維持している細胞株の候補を選択した。選択された候補細胞株は５代の継代を行い、継代による未分化軟骨細胞の形質の変化・増殖能や生存率の低下が認められないことを確認し、得られた細胞株が安定的に性状を保持できることを検証した。これらの過程を経て、最終的に２種類のＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−，ｐ５３−／−マウス由来軟骨細胞株（ＲＵ−１、ＲＵ−２２）を得た。得られた細胞株の形態を図１（上段）に示す。
（４）ＲＵ−１及びＲＵ−２２のＩＩ型コラーゲン及びＸ型コラーゲンの発現解析
得られた細胞株の分化段階及び性質を見るため、ＲＵ−２２及びＲＵ−１のＩＩ型コラーゲン及びＸ型コラーゲンの発現をＰＣＲ増幅モニター法により解析した。ＲＵ−２２及びＲＵ−１細胞株を１０％ウシ胎仔血清／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）で培養し、コンフルエントの状態の時にｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて精製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製方法は、ＩＳＯＧＥＮのマニュアル記載の方法に従った。さらにｔｏｔａｌ ＲＮＡは逆転写酵素及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。これらを鋳型として、ＩＩ型コラーゲン及びＸ型コラーゲンの発現をＰＣＲ増幅モニター法を用いて測定した。測定はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のマニュアルに従い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。用いたＰｒｉｍｅｒの配列は表２に示す。測定の結果得られたＣｔ値はグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現により補正し、ＧＡＰＤＨ＝１０００としたときの相対値で表した（図２）。

（５）結果
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨細胞は、細胞外マトリックスを蓄えた多角形の形態を示しており、典型的な軟骨細胞様の形態をしている（図１）。ＲＵ−１軟骨細胞株は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウス由来初代軟骨細胞の形態に類似している。一方、ＲＵ−２２軟骨細胞株は細胞外マトリックスの発現の少ない非常に扁平な形態が見られ、軟骨細胞様の形態ではない。しかしながら、ＲＵ−１軟骨細胞株及びＲＵ−２２軟骨細胞株のＩＩ型コラーゲンの発現は共に強く、またＸ型コラーゲンの発現は非常に弱いので（図２）、共に未分化な軟骨細胞の性質は保持していると考えられる。
［実施例２］ アデノウイルスを用いたＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の強制発現による軟骨分化誘導系の構築
（１）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１発現用アデノウイルスの構築
マウスＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡをｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、その後Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１，ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ），ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）を含むフラグメントをｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡシャトルベクター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，２８１２−２８１６）のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。構築したベクターは、アデノウイルスベクターｐＪＭ１７（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．（１９８８）１６３，６１４−６１７）と共に、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてヒト腎臓２９３細胞株にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。相同組換えにより生じたＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１フラグメントを持つアデノウイルスは、３〜４回２９３細胞を用いて継代することにより、ウイルスを増幅させ、増幅した粗精製ウイルスストック溶液は、塩化セシウム濃度勾配超遠心法により精製し、感染実験のためのウイルスストックとした。対照実験に用いるウイルスとして、ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのみをもつ組換えアデノウイルスも同様に作製した。
（２）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−，ｐ５３−／−軟骨細胞株（ＲＵ−１、ＲＵ−２２）、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−初代軟骨培養細胞による軟骨分化誘導系の構築
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−，ｐ５３−／−軟骨細胞株（ＲＵ−１、ＲＵ−２２）を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤ−ＭＥＭ培地にてコラーゲンコート２４ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに撒き、コンフルエントになるまで培養した。その後、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１発現用アデノウイルス及びコントロール用アデノウイルス（ＥＧＦＰのみ発現用）を１５時間感染させ、その後培地を交換し、３〜４日に一度培地を取り替えながら、ＢＭＰ−２の存在下又は非存在下で１５日目まで培養を継続した。感染日を０日目として、１日目、３日目、７日目、１１日目、１５日目にＲＮＡ調製のためのサンプリングを行った。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−初代軟骨培養細胞は、１０％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＣＯ ＢＲＬ）にてコラーゲンコート２４ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに撒き、コンフルエントになるまで培養した。その後、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１発現用アデノウイルス及びコントロール用アデノウイルス（ＥＧＦＰのみ発現用）を１５時間感染させ、その後培地を交換し、３〜４日に一度培地を取り替えながら、ＢＭＰ−２の存在下又は非存在下で１５日目まで培養を継続した。感染日を０日目として、１日目、３日目、７日目、１１日目、１５日目にＲＮＡ調製のためのサンプリングを行った。
サンプリングしたＲＮＡ調製用サンプルは、実施例１−（４）と同様の方法で、ｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅モニター法を用いて、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク（ＢＳＰ）、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ）、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチン（ＯＳＰ）、オステオカルシン（ＯＣ）の発現を測定した。用いたＰｒｉｍｅｒの配列を表２に示す。
（３）結果及び考察
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法の結果を図３〜図８に示す。どの細胞株及び初代培養細胞においても、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現は１日目をピークとして、３日目以降はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現はある程度の発現レベルを維持しつつ、徐々に弱まっていった。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現誘導に伴い、軟骨の肥大化のマーカーであるＸ型コラーゲンの発現誘導は観察されなかったが、肥大化の初期マーカーであるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲの発現誘導はどの細胞株・初代培養細胞においても観察され、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による軟骨の分化誘導が示された。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の既知の下流遺伝子であるＭＭＰ−１３、ＡＬＰ、ＢＳＰ、ＯＳＰ、ＯＣについては、ＯＳＰ以外はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による強い誘導が観察された。ＯＳＰは血清のみでも誘導されることが知られているので、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養系においては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導が観察されにくいことが考えられた。以上の結果より、本実験系は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の探索に非常に有用であることが明らかとなった。
サンプリングしたＲＮＡ調製用サンプルは、実施例１−（４）と同様の方法で、ｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅モニター法を用いて、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、Ｘ型コラーゲン（Ｔｙｐｅ Ｘ ｃｏｌｌａｇｅｎ）、骨シアロタンパク（ＢＳＰ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ、オステオカルシン（ＯＣ）、及びオステオポンチン（ＯＳＰ）の発現を測定した。用いたＰｒｉｍｅｒの配列を表２及び３に示す。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１は感染させたウィルス由来の遺伝子が発現していることを確認するために測定した。ＭＭＰ１３、ＡＬＰ、ＢＳＰ、Ｉｈｈ、ＩＬ１１、ＯＣ、及びＯＳＰはＲｕｎｘ２により発現が誘導されることが知られている既知の下流遺伝子である。これらの遺伝子の発現が誘導されていれば感染させたウィルス由来のＲｕｎｘ２が機能していること、及び軟骨の分化が促進していることが確認できる。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ及びＸ型コラーゲンは軟骨の分化に伴って発現が上昇することが知られている。従って、これらの遺伝子の発現が上昇すれば軟骨細胞が分化していることを示す。尚、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲは軟骨分化の比較的初期に、Ｘ型コラーゲンは軟骨分化の後期に発現することが知られている。ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏは我々が新たに見出したＲｕｎｘ２下流遺伝子のひとつとして測定した。
（３）結果及び考察
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法の結果を図３〜図８に示す。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１発現用アデノウイルスを感染させた場合をＫＳ−ＧＦＰ（黒丸）、コントロール用アデノウイルス（ＥＧＦＰのみ発現用）を感染させた場合をＧＦＰ（白丸）で表示した。ＢＭＰ２を共存させた場合は（＋ＢＭＰ２）と表示した。どの細胞株及び初代培養細胞においても、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現は１日目をピークとして、３日目以降はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現はある程度の発現レベルを維持しつつ、徐々に弱まっていった（図３Ａ、図５Ａ，図７Ａ：Ｃｂｆａ１）。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の発現誘導に伴い、軟骨の肥大化のマーカーであるＸ型コラーゲンの発現誘導は観察されなかったが（図３Ａ、図５Ａ、図７Ａ：Ｔｙｐｅ Ｘ Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、肥大化の初期マーカーであるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲの発現誘導はどの細胞株・初代培養細胞においても観察され（図３Ａ、図５Ａ、図７Ａ：ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰＲ）、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による軟骨の分化誘導が示された。また、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の既知の下流遺伝子であるＭＭＰ−１３、ＡＬＰ、ＢＳＰ（図３Ａ、図５Ａ、図７Ａ）、ＯＳＰ、ＯＣ（図４Ｂ、図６Ｂ、図８Ｂ）については、ＯＳＰ以外はＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による強い誘導が観察された。ＯＳＰは血清のみでも誘導されることが知られているので、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養系においては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導が観察されにくいことが考えられた。これらの遺伝子の発現誘導はＢＭＰ２存在下で増強された。生体内の軟骨組織ではＢＭＰ２を含む様々な成長因子が存在し、軟骨細胞の増殖と分化を制御している。Ｒｕｎｘ２による遺伝子の発現誘導がＢＭＰ２存在下で増強されたことは、本実験がｉｎ ｖｉｖｏにおける軟骨分化も反映した系であることを示している。以上の結果より、本実験系は、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の探索に非常に有用であることが明らかとなった。
［実施例３］ サブトラクション法によるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の取得
未分化間葉系細胞株（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）を用いて、サブトラクション法によるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の取得を行った。まず、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１を強く発現するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株を樹立した（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２−Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１）。次にＣ３Ｈ１０Ｔ１／２−Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１とＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いて、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２−Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１細胞株に強く発現する遺伝子をサブトラクション法により、スクリーニングした。サブトラクション法は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ^ＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ユーザーマニュアルに従って行った。その結果、配列番号１１で示される遺伝子（ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２８１０００２Ｅ２２ ｇｅｎｅ（ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ ｈｏｍｏｌｏｇ））がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２と比べ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２−Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１で発現が強い遺伝子であることが判明した。
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導される遺伝子であることを確認するため、ＲＵ−１、ＲＵ−２２、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−マウス由来初代軟骨培養細胞において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１によりＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子が誘導されているかどうかをＰＣＲ増幅モニター法を用いて測定した。ＰＣＲ増幅モニター法の測定に用いたＰｒｉｍｅｒを表３に示す。また、ＰＣＲ増幅モニター法による測定は、実施例１−（４）と同様の方法で行った。その結果を図４Ａ、図６Ａ及び図８Ａに示す。
その結果、ＲＵ−２２軟骨細胞株及び初代軟骨細胞において、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により強く誘導されることが明らかとなった（図４Ａ、図６Ａ、図８Ａ）。したがって、ＨＮＯＥＬ−ｉｓｏ ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子もＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の一つであることが明らかとなった。
［実施例４］ ＤＮＡマイクロアレイによる解析
（１）ＲＵ−１及びＲＵ−２２軟骨細胞株を用いたＤＮＡマイクロアレイ解析
ＲＵ−１細胞株及びＲＵ−２２細胞株をそれぞれコラーゲンコート１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１０ ｗｅｌｌ撒き、コンフルエントになったところで、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１発現用アデノウイルス及び対照ウイルス（ＧＦＰのみの発現用ウイルス）を感染させた。感染後１日目に、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮにより回収し、試薬のマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。その後、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、添付のマニュアルに従い、ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡを調製し、ＤＮＡマイクロアレイ解析用のサンプルとした。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、クラボウのＬｉｆｅＡｒｒａｙ（マウス遺伝子数：約９５００遺伝子）により解析した。
（２）Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−由来初代軟骨培養細胞を用いたＤＮＡマイクロアレイ解析
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１−／−由来初代軟骨培養細胞をコラーゲンコート１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１０ ｗｅｌｌ撒き、コンフルエントになったところで、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１発現用アデノウイルス及び対照ウイルス（ＧＦＰのみの発現用ウイルス）を感染させた。感染後１日目に、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮにより回収し、試薬のマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＤＮＡマイクロアレイ解析用のサンプルとした。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、クラボウのＣｏｄｅＬｉｎｋ ＤＮＡ ｍｉｒｏＡｒｒａｙ（マウス遺伝子数：約１００００遺伝子）により解析した。
（３）結果
ＤＮＡマイクロアレイ解析によりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１の強制発現に伴い誘導される遺伝子の一部を、図９に示す。各細胞株及び初代培養細胞において、Ｌｉｆｅ Ａｒｒａｙにおいては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御されることが明らかとなっているアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の誘導が見られ、実験系が機能していることが示された。また、ＣｏｄｅＬｉｎｋ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにおいては、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが明らかとなっているアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）及びコラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）の誘導が見られ、実験系が機能していることが示された。
［実施例５］ ｋＥＳＴ遺伝子のｃＤＮＡ配列の決定
１５日目のマウス胎児の骨格組織由来ＲＮＡから、クローンテック社製ＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて製品説明書に従いｃＤＮＡを合成した。プライマーはマウスｋＥＳＴの部分塩基配列（ＡＡ３９７２８０）より合成し、製品説明書に従ってＲＡＣＥ法によるｃＤＮＡの増幅を行った。得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド入りの１％アガロースゲルで電気泳動を行い、このゲルを紫外線下で観察することによりＤＮＡバンドを調べた。増幅されたフラグメントをゲルから切り取り、製品説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製フラグメントの塩基配列は製品説明書に従い、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて決定した。
マウスｋＥＳＴ ｃＤＮＡの核酸塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号９に示す。
［実施例６］ ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法によるＲｕｎｘ２／ｃｂｆａ１による誘導の確認
細胞株及び初代培養細胞を用いたＤＮＡマイクロアレイ解析により、軟骨細胞においてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導される遺伝子が明らかになった。次の段階として、これらの遺伝子がＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により再現性を持って誘導されるかどうかを実施例２−（２）のサンプル（０日目、１日目、３日目）を鋳型としたＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により、確認した。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導の確認は、ＤＮＡマイクロアレイ解析によりそれぞれの遺伝子の誘導が確認された細胞株若しくは初代培養細胞を用いて行った。ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法は実施例１−（４）と同様の方法で行った。発現解析に用いたＰｒｉｍｅｒを表３に示す。

その結果、どの遺伝子についてもＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による発現誘導が確認され、ＤＮＡマイクロアレイ解析と同様の結果が、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においても確認された（図１０〜図１２）。
［実施例７］ Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子の野生型及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生期骨格における発現解析
ＤＮＡマイクロアレイ解析によりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により誘導されることが確認された遺伝子について、野生型及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生期骨格における発現解析を行った。まず野生型マウスの胎生１３．５日目、１５．５日目、１８．５日目、及びＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生１８．５日目のそれぞれの骨格よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ化を行った。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、実施例１−（４）に記載の方法と同様に行った。次に、ＤＮＡマイクロアレイ解析によりＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１による誘導が確認された１２遺伝子について、ＰＣＲ増幅モニター法により胎生期骨格における発現解析を行った。ＰＣＲ増幅モニター法は、実施例１−（４）と同様の方法で行った。
その結果、１３遺伝子すべてについて、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生１８．５日目の発現は、野生型マウスの胎生１３．５日目及び胎生１５．５日目と比べて、抑制されていた（図１３Ａ及びＢ〜図１４Ａ、Ｂ及びＣ）。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスは、骨格の分化が著しく遅延しており、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの胎生１８．５日目の骨格は、野生型マウスの胎生１３．５日目若しくは１５．５日目に相当することから、これら１３遺伝子はすべてＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損マウスの骨格においては発現が抑制されており、したがって、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１により制御されていることが示唆された。
［実施例８］ ＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いたＷｉｓｐ２遺伝子トランスジェニックマウスの作製と軟骨における機能の検証
配列番号３に示されるマウスＷｉｓｐ２遺伝子ついて、ＩＩ型コラーゲンのプロモーターによる軟骨特異的発現トランスジェニックマウス（Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウス）を作製し、軟骨における機能に対する検証を行った。
（１）トランスジェニックマウス用コンストラクトの作製
マウスＷｉｓｐ２遺伝子は、下記のＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）及びＲｅｖｅｒｅ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）を用いて野生型マウス胎生１３．５日骨格のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅した。
＜Ｗｉｓｐ２＞

トランスジェニックマウス用のベクターは、上田らにより報告されたＣｏｌ２ａ１−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒを用いた（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）１５３，８７−９９）。このベクターは、マウスのＩＩ型コラーゲンプロモーター及びエンハンサーを含んでおり、軟骨特異的に発現することが確認されている。得られたＰＣＲフラグメントは、Ｃｏｌ２ａ１−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒのＮｏｔＩ部位に組込み、トランスジェニックマウス作製用のコンストラクトとした。
（２）トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウス作製用コンストラクトをＮａｒＩ処理することにより、ＩＩ型コラーゲンプロモーター、発現遺伝子（Ｗｉｓｐ２）、エンハンサーを含むフラグメントを切り出した。フラグメントはアガロースゲルで精製後、Ｆ１ ｈｙｂｒｉｄマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）から採取した受精卵の核にインジェクションした。インジェクション後の受精卵は仮親の子宮に入れ、帝王切開により胎仔を取り出し、肝臓よりゲノムを抽出し、ＰＣＲ法によりゲノムへの組込みの確認を行った。また、上半身骨格よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により、発現強度の測定を行った。
（３）骨格の切片の作製、染色及びＩｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
下半身の骨格は、切片を作成することにより、光学顕微鏡下での観察を行った。胎仔の下半身骨格は４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸緩衝液により、固定した。その後７μｍの切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、ＰＴＨレセプター１（Ｐｔｈｒ１）、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）、オステオポンチンのｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは、既報のプローブを使用して定法に従って実施した（Ｄｅｖ Ｄｙｎ．１９９９ Ａｐｒ；２１４（４）：２７９−９０）。
（４）結果及び考察
Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウスの外観は野生型と比較してわずかに小さかった。胎生期１６．５日目のＣｏｌ２ａ１、Ｐｔｈｒ１、Ｃｏｌ１０ａ１、及びオステオポンチンの発現をｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により解析した結果を図１５に示す。野生型（Ｗｔ）とＷｉｓｐ２トランスジェニックマウス（Ｗｉｓｐ２ ｔｇ）でこれらの遺伝子の発現に顕著な差は認められなかった。野生型とＷｉｓｐ２トランスジェニックマウスの胎生期１６．５日目の骨格切片のＨＥ染色像を図１６Ａ及びＢに示す。野生型（ＷＴ；Ａ）では、既に軟骨に血管が侵入しているのに対し、Ｗｉｓｐ２トランスジェニックマウス（ＷＩＳＰ２；Ｂ）においては、ボーンカラー（ｂｏｎｅ ｃｏｌｌａｒ）は形成されているものの、肥大化層が野生型と比べて短く、血管浸潤も見られず、軟骨分化及び内軟骨骨化の遅延が観察された。したがって、Ｗｉｓｐ２遺伝子は、軟骨分化に対して抑制的に作用することが考えられた。
［実施例９］ ＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いたＮｏｐｐ１４０、Ｔｅｍ８、ＨＣＫ及びＧＡＬＮＴ３遺伝子遺伝子トランスジェニックマウスの作製と軟骨における機能の解析
配列番号５に示されるマウスＮｏｐｐ１４０遺伝子、配列番号１に示されるマウスＴｅｍ８遺伝子、配列番号１５に示されるＨＣＫ遺伝子及び配列番号２５に示されるＧＡＬＮＴ３については、ＩＩ型コラーゲンのプロモーターによる軟骨特異的発現トランスジェニックマウスを作製し、軟骨における機能について、更なる解析を行った。
（１）トランスジェニックマウス用コンストラクトの作製
マウスＮｏｐｐ１４０遺伝子、マウスＴｅｍ８遺伝子、マウスＨＣＫ遺伝子及びマウスＧＡＬＮＴ３遺伝子は下記のＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）及びＲｅｖｅｒｅ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。鋳型としてはマウスＮｏｐｐ１４０遺伝子については野生型マウス胎生１３．５日骨格のｃＤＮＡを、マウスＴｅｍ８遺伝子については野生型マウス胎生１３．５日骨格のｃＤＮＡを、マウスＨＣＫ遺伝子については野生型マウス胎生１５．５日骨格ｃＤＮＡを、マウスＧＡＬＮＴ３遺伝子については野生型マウス胎生１５．５日骨格ｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＨＣＫは、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ（４９９Ｔｙｒ→Ｐｈｅ）を既報の文献に従って作製した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００２）Ｖｏｌ．１９６，Ｎｏ．５；５８９−６０４）。
＜Ｎｏｐｐ１４０＞

＜Ｔｅｍ８＞

＜ＨＣＫ＞

＜ＧＡＬＮＴ３＞

各遺伝子のトランスジェニックマウス用のベクターは実施例８に記載のＣｏｌ２ａ１−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒを用いて、実施例８と同様の方法で作製した。
（２）トランスジェニックマウスの作製
Ｎｏｐｐ１４０、ＨＣＫ及びＧＡＬＮＴ３遺伝子に関しては、トランスジェニックマウス作製用コンストラクトをＮａｒＩで、Ｔｅｍ８遺伝子の場合はＰｖｕ−ＩＩで処理することにより、ＩＩ型コラーゲンプロモーター、発現遺伝子、エンハンサーを含むフラグメントを切り出した。フラグメントはアガロースゲルで精製後、Ｆ１ ｈｙｂｒｉｄマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）から採取した受精卵の核にインジェクションした。インジェクション後の受精卵は仮親の子宮に入れ、帝王切開により胎仔を取り出し、肝臓よりゲノムを抽出し、ＰＣＲによりゲノムへの組込みの確認を行った。また、上半身骨格よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法により、発現強度の測定を行った。胎児骨格は、アリザリンレッド及びアルシアンブルーで染色した（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４）。
（３）骨格の切片の作製
下半身の骨格は、切片を作成することにより、光学顕微鏡下での観察を行った。胎仔の下半身骨格は４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸緩衝液により固定した。その後７μｍの切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）により骨格の解析を行った（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４）。ヘマトキシリン−エオジン−コッサ染色（ＨＥ−Ｋｏｓｓａ染色）を実施し、石灰化部位を黒色で染色することにより、骨格と石灰化の解析を実施した（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４）。軟骨のマトリックスは、サフラニンＯ染色、ＰＡＳ染色により解析した（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４）。アポトーシスの解析はｔｕｎｎｅｌ染色により実施した（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４）。細胞増殖の解析は、Ｂｒｄｕ染色により実施した（Ｃｅｌｌ（１９９７），８９，７５５−７６４）。ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは、既報のプローブを使用して定法に従って実施した（Ｄｅｖ Ｄｙｎ．１９９９ Ａｐｒ；２１４（４）：２７９−９０）。
（４）結果及び考察
Ｎｏｐｐ１４０トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観を図１７Ａに、脛骨と大腿骨の関節部位の切片のＨＥ染色像を図１７Ｂに示す。野生型マウス（Ｗｔ）と比較してＮｏｐｐ１４０トランスジェニックマウス（Ｎｏｐｐ１４０ｔｇ）は、非常に手足が短く、顎が小さい外観が示された（図１７Ａ、下）。また、ＨＥ染色によると、Ｎｏｐｐ１４０トランスジェニックマウス（Ｎｏｐｐ１４０ｔｇ）においては、本来の増殖軟骨細胞層での細胞層の乱れが観察され、この部分での分化促進が示唆された（図１７Ｂ、下）。したがって、Ｎｏｐｐ１４０遺伝子は、軟骨分化に対して促進的に作用することが考えられた。
Ｔｅｍ８トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の頭の外観を図１８Ａに、骨格染色像を図１８Ｂに示す。正常マウス（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較してＴｅｍ８トランスジェニックマウス（Ｔｅｍ８）は顎の形成が不十分であり（図１８Ａ、右）、四肢が短い（図１８Ｂ、右）という外観上の特徴を示した。ＨＥ染色した切片の観察によると、本来の骨化が進行するのとは別の部位（異所性）での石灰化が認められ、このマウスにおいては軟骨の異常な分化が起こっていることが示された。また、Ｔｅｍ８トランスジェニックマウスでは野生型と比較して、ｔｕｎｎｅｌ染色陽性のアポトーシスを起こしている軟骨細胞が増加していた。このアポトーシス陽性細胞はオステオポンチンを発現しており、軟骨の異常な分化を伴ったアポトーシスが誘導されていると考えられた。これらの結果から、Ｔｅｍ８遺伝子は、軟骨分化に対して促進的に作用することが考えられた。
ＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１４．５日目の外観を図１９Ａ−▲２▼に、骨格染色像を図１９Ａ−▲１▼に示す。また、図１９ＡとＢにおいては、ＨＥ染色像（図１９Ｂ−▲１▼）及びＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１：図１９Ｂ−▲２▼）、ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１：図１９Ｂ−▲３▼）、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１：図１９Ｂ−▲４▼）、オステオポンチン（図１９Ｂ−▲５▼）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ：図１９Ｂ−▲６▼）、ＰＴＨレセプター（Ｐｔｈｒ１：図１９Ｂ−▲７▼）、Ｈｃｋ（図１９Ｂ−▲８▼）、ＭＭＰ１３（図１９Ｃ−▲１▼）、ＢＳＰ（図１９Ｃ−▲２▼）、ＶＥＧＦ（図１９Ｃ−▲３▼）の各プローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発現解析、並びにＴＲＡＰ染色による破骨細胞の解析（図１９Ｃ−▲４▼）を示す。ＨＣＫトランスジェニックマウス（Ｔｇ）は野生型（Ｗｔ）と比較して、身体が小さく、腹部が突き出ており、四肢が太く短かった（図１９Ａ−▲２▼）。ＨＣＫトランスジェニックマウスの脛骨では、組織化されていない異常な細胞増殖により、正常な成長軟骨板が形成されず、長軸方向への成長が異常であった（図１９Ａの▲１▼）。また、Ｉｈｈ及びＣｏｌ１０ａ１を発現する分化の進んだ軟骨細胞の数は少なかった図１９−▲６▼及び▲４▼）。Ｃｏｌ２ａ１とＰｔｈｒ１の発現は拡張した組織の中に認められた（図１９−▲３▼及び▲７▼）。最終分化した肥大軟骨及び骨芽細胞のマーカーであるオステオポンチンは、軟骨組織で発現が上昇していた（図１９Ｂ−▲５▼）。通常は軟骨には発現が認められないＣｏｌ１ａ１が軟骨組織に発現していた（図１９Ｂ−▲２▼）。通常は骨芽細胞に発現するＢＳＰの発現は低下していた（図１９Ｃ−▲２▼）。軟骨への血管侵入を誘導することが知られているＭＭＰ１３とＶＥＧＦの発現は上昇していた（図１９Ｃ−▲１▼及び▲３▼）。また、通常は最終分化した軟骨細胞に侵入するＴＲＡＰ陽性の破骨細胞が、未分化な軟骨に侵入していた（図１９Ｃ−▲４▼）。Ｂｒｄｕ染色では組織中の細胞増殖が亢進していることが明らかになった。
ＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１６．５日目のＨＥ染色（ＨＥ）及びＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）、ＰｔｈＲＰ、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発現解析を図２０に示す。ＨＣＫトランスジェニックマウスの脛骨では、組織化されていない異常な細胞増殖により、正常な成長軟骨板が形成されず、長軸方向への成長が異常であった（図２０−ＨＥ、下段）。Ｃｏｌ２ａ１の発現は拡張した組織の中に認められた（図２０−Ｃｏｌａ１、下段）。通常、分化の進んだ軟骨細胞に発現するＰｔｈＲＰとＣｏｌ１０ａ１の発現は低下していた（図２０−ＰｔｈＲＰ及びＣｏｌ１０ａ１、各下段）。
図２１Ａ〜ＣにＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観（図２１Ａ）、骨格染色像（図２１Ｂ）、ＨＥ染色（図２１Ｃ）の結果を示す。図２２ＡはＨＣＫトランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観（図２２Ａ−▲１▼）、骨格染色像（図２２Ａ−▲２▼）の結果を示す。また、図２２Ｂ及びＣにはＨＥ−Ｋｏｓｓａ染色（図２２Ｂ−▲１▼）及びＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１：図２２Ｂ−▲２▼）、ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１：図２２Ｂ−▲３▼）、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１図２２Ｂ−▲４▼）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：図２２Ｂ−▲５▼）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ：図２２Ｂ−▲６▼）、ＰＴＨレセプター（Ｐｔｈｒ１：図２２Ｂ−▲７▼）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ：図２２Ｂ−▲８▼）、Ｈｃｋ（図２２Ｃ−▲１▼）、ＭＭＰ１３（図２２Ｃ−▲２▼）、ＢＳＰ（図２２Ｃ−▲３▼）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発現解析結果、並びにＴＲＡＰ染色による破骨細胞の解析（図２２Ｃ−▲４▼）とサフラニン０染色によるプロテオグリカンの解析（図２２Ｃ−▲５▼）を示す。ＨＣＫトランスジェニックマウス（Ｔｇ）は野生型（Ｗｔ）と比較して、身体が小さく、腹部が突き出ており、四肢が太く短かった（図２２Ａ−▲１▼）。また、鼻と上顎の間が分裂しており、鼻と上顎の融合過程が阻害されていた。軟骨性頭蓋及び鼻軟骨では、膜性骨が拡張された軟骨性の領域で覆われていた。内軟骨性骨で近位−遠位軸の方向性が失われており、異常な形状を示した。成長版は組織化されておらず、関節は癒合していた。骨格染色ではアリザリンレッドで染色される石灰化組織が減少、アルシアンブルーで染色される細胞外マトリックスが増加していることが明らかになった（図２２Ａ−▲２▼）。またＨＥ染色像においてはこのＨＣＫトランスジェニックマウスの軟骨細胞は未熟であり、その周辺で間葉系細胞の侵入、増殖が認められた（図２２Ｂ−▲１▼）。Ｃｏｌ２ａ１を発現する軟骨細胞は減少しており、骨は正常な過程を経ずに間葉系細胞の侵入と増殖を伴って形成されていた（図２２Ｂ−▲２▼）。Ｉｈｈ、Ｐｔｈｒ１及びＣｏｌ１０ａ１の発現も低下していた（図２２Ｂ−▲８▼及び▲７▼並びに▲４▼）。Ｃｏｌ１ａ１は骨組織に発現しており、オステオポンチンは広範囲に分布していた（図２２Ｂ−▲２▼及び▲５▼）。一方、成熟した骨芽細胞のマーカーであるオステオカルシンはほとんど発現しておらず、骨組織を形成する細胞が未成熟であると考えられた（図２２Ｂ−▲６▼）。ボーンカラー（ｂｏｎｅ ｃｏｌｌａｒ）は組織化されておらず、多数の血管と間葉系細胞の侵入により連続性が失われていた。また、この血管と間葉系細胞の侵入はＴＲＡＰ陽性の破骨細胞の増加によってサポートされていると考えられた（図２２Ｃ−▲４▼）。サフラニンＯ染色の結果から、軟骨組織のプロテオグリカンは正常であると考えられた（図２２Ｃ−▲５▼）。これらの結果よりＨＣＫ遺伝子は軟骨細胞に対しては増殖を亢進し分化を抑制すると考えられた。
ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスの胎生１８．５日目の外観を図２３Ｂに示す。正常マウス（Ｗｔ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は身体が小さく、四肢が短く、胸部は小さく、腹部は突き出ていた。図２４は骨格染色の結果を示しており、正常マウス（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は胸郭が小さく、内軟骨性骨化による石灰化した骨が題著に減少していた。図２５Ａ及びＢは胎生１６．５日目の脛骨のＨＥ−Ｋｏｓｓａ染色での所見を示すが（図２５Ｂは同図Ａの拡大像）、野生型（Ｗｔ）では血管侵入が始まっているが、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ではそれが遅れており、関節腔の形成も不十分であった（図２５、右）。図２６はＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）のｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析結果を示すが、正常マウス（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ではＩＩ型コラーゲンの発現は異常な分布を示した。図２７はＸ型コラーゲンのｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析結果を、図２８はオステオポンチンｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析結果を示すが、Ｘ型コラーゲン及びオステオポンチンの発現は野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）ともに肥大軟骨で認められた。アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）のｍＲＮＡの発現を示すｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析結果を図２９Ａ（ｍＲＮＡ）に、タンパク質レベルでの発現を示す免疫組織染色像を図２９Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ）に示す。アグリカンは野生型マウス（ｗｔ）と比較して、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）で若干上昇していたが（図２９Ａ）、タンパクレベルでは減少していた（図２９Ｂ）。胎生１６．５日目の脛骨のサフラニンＯ染色の結果を図３０に示すが、この結果から野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は染色性が顕著に低下しており、プロテオグリカン含量が顕著に減少していることが明らかとなった。
胎生１８．５日目の距骨のＰＡＳ染色像を図３１Ａ及びＢに示す（図中のＢはＡの拡大像）。この結果から野生型（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）は染色性が増加しており、ムチン様の糖タンパク質が増加していることが明らかになった。胎生１８．５日目の脛骨のフィブロネクチンの免疫染色を図３２に示すが、この結果から野生型と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスでは軟骨細胞間の距離が狭く、細胞外マトリックス量が低下していることが明らかになった。Ｂｒｄｕラベルにより軟骨細胞増殖を検討した結果の像を図３３Ａに、ＢｒｄＵの取り込み量をグラフしたものを図３３Ｂに示す。これらの結果から野生型（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では軟骨細胞の増殖が亢進していることが明らかになった。またＴｕｎｎｅｌ染色の結果の像を図３４に示すが、この結果からは野生型（ｗｔ）と比較してＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウス（Ｇａｌｎｔ３ ｔｇ）では軟骨のアポトーシスが亢進していることが明らかになった。これらのことから、ＧＡＬＮＴ３遺伝子は軟骨組織自体の形成を抑制する作用を持つことが考えられた。関節軟骨は８０％の水分、２０％のマトリックスとわずかな軟骨細胞により構成されている。マトリックスはコラーゲン（乾燥重量の６０％）とプロテオグリカン（乾燥重量の１０％）から構成される。プロテオグリカンは９５％のグルコサミノグリカンと呼ばれる多糖類（ＧＡＧ）と５％のタンパク質からできており、大量の水を保持してゲル状物質となる。このプロテオグリカンの水分保持能力によって実に軟骨の８０％は水分を含み、関節軟骨に弾性と硬さを与えることができる。プロテオグリカン含量の減少により水分保持能が低下すると軟骨の弾性が失われ組織破壊につながると考えられる。したがって、ＧＡＬＮＴ３トランスジェニックマウスで認められた軟骨組織形成抑制及びプロテオグリカン含量の低下は、変形性関節症に関連した変化である可能性が考えられた。
これらの所見から、Ｎｏｐｐ１４０遺伝子及びＴｅｍ８遺伝子は軟骨分化を亢進することによって変形性関節症の病態形成を進行させる可能性が示された。また逆にＨＣＫ遺伝子は軟骨分化を抑制することことから変形性関節炎の病態を抑制する可能性を持つ。ＧＡＬＮＴ３遺伝子については軟骨組織自体の形成を抑制することから、二次的には軟骨分化を抑制するものの、変形性関節症においては病態の進行に関与する可能性が示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

病態に関連した転写因子を該転写因子の欠失した細胞株又は初代培養細胞で発現させることにより、病態に関連した遺伝子を取得する方法、好ましくはＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１をＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１欠損軟骨細胞株又は初代軟骨培養細胞で発現させることにより骨及び／又は関節疾患関連遺伝子、好ましくは変形性関節症関連遺伝子を取得する方法を提供するものである。この方法で取得したＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１下流遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドは、軟骨分化を制御する機能を持ち、骨及び／又は関節疾患（好ましくは変形性関節症）の医薬品となりうる。さらに、骨及び／又は関節疾患（好ましくは変形性関節症）の医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供し、骨及び／又は関節疾患（好ましくは変形性関節症）のモデル動物を提供するものである。本発明により提供されるものは、骨及び／又は関節疾患（好ましくは変形性関節症）の臨床・基礎の医薬品・医療品の領域において、大きな有用性を提供する。

配列番号５３〜１１４：合成オリゴヌクレオチド

Claims (3)

1. Runx2/Cbfa1を、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM BP-10137の受託番号で寄託されているRU-1株、又はFERM BP-10138の受託番号で寄託されているRU-22株で発現させ、その際に発現が誘導又は抑制される遺伝子をスクリーニングすることを特徴とする軟骨分化制御関連遺伝子の取得方法。
2. スクリーニング法が、サブトラクション法又はDNAチップ法である請求項１記載の方法。
3. 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM BP-10137の受託番号で寄託されているRU-1株、又はFERM BP-10138の受託番号で寄託されているRU-22株である、Runx2/Cbfa1及びp53欠損マウス由来軟骨細胞株。

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