JP4414229B2 - 難聴を治療する方法 - Google Patents

Description

本発明は、難聴を治療し予防するための方法及び組成物に関する。

発明の背景

後天性難聴の主原因は、大きな騒音である。職場では、有害なレベルの騒音に曝されることが多い。国立労働安全衛生研究所の推計によれば、米国内の約３，０００万人の労働者が有害なレベルの騒音に接している（Franks et a.(1996)Preventing Occupational Hearing Loss-A Practical Guide，ＤＨＨＡ（NIOSH) Publication No.96-110,p.1）。このようなレベルの騒音は、例えば、建築業、鉱業、農業、工業や公共事業、運輸、並びに軍隊で見られる。仕事での騒音への曝露を規制するとともに、耳当てや耳栓等の聴覚保護具の使用を改善するように努めてきたにもかかわらず、騒音による難聴の発生は、増加の一途を辿っている。

その他、難聴の原因としては、シスプラチンやアミノグリコシド系抗生物質等の耳毒性薬物への曝露がある。このため、難聴を予防又は治療するための方法や組成物に対する需要が存在する。

発明の要約

１つの側面において、本発明は、難聴を改善する方法であって、難聴を改善するのに有効なある量の耳保護組成物を対象に投与する工程を備えた方法を提供する。前記耳保護組成物は、本明細書に開示されている耳保護剤を少なくとも１種含む。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、薬学的に有効な量のグルタチンペルオキシダーゼ模倣物質を少なくとも１種含む（例えば、エブセレンを含む組成物）。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、薬学的に有効な量の（ａ）少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質と、（ｂ）少なくとも１種のキサンチンオキシダーゼ阻害剤とを含む（例えば、エブセレンとアロプリノールを含む組成物）。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、薬学的に有効な量の（ａ）少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質と、（ｂ）少なくとも１種のグルタチオン又はグルタチオン前駆体とを含む（例えば、エブセレンとＮ−アセチル−システインを含む組成物）。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、薬学的に有効な量の（ａ）少なくとも１種のキサンチンオキシダーゼ阻害剤と、（ｂ）少なくとも１種のグルタチオン又はグルタチオン前駆体を含む（例えば、アロプリノールとＮ−アセチル−システインとを含む組成物）。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、薬学的に有効な量の（ａ）少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質と、（ｂ）少なくとも１種のキサンチンオキシダーゼ阻害剤と、（ｃ）少なくとも１種のグルタチオン又はグルタチオン前駆体とを含む（例えば、エブセレン、アロプリノール、及びＮ−アセチル−システインを含む組成物）。

本発明の別の側面では、難聴を改善するために使用される耳保護組成物を提供する。前記耳保護組成物は、本明細書に開示されている耳保護剤を少なくとも１種含む。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質を含む。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質と少なくとも１種のキサンチンオキシダーゼ阻害剤とを含む。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質と少なくとも１種のグルタチオン又はグルタチオン前駆体とを含む。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、少なくとも１種のキサンチンオキシダーゼ阻害剤と少なくとも１種のグルタチオン又はグルタチオン前駆体とを含む。幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、少なくとも１種のグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質と、少なくとも１種のキサンチンオキシダーゼ阻害剤と、少なくとも１種のグルタチオン又はグルタチオン前駆体とを含む。

前述した本発明の側面と付随する多数の利点は、添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明を参照することによって、容易に明らかとなるとともに、理解が深まるであろう。

好ましい実施形態の詳細な説明

本明細書で使用される「耳保護剤（otoprotectant）」という用語は、難聴を改善させ得る化学物質を意味する。

本明細書で使用される「難聴を改善する(ameliorating hearing loss)」という用語には、（ａ）難聴の規模及び／又は期間を減少させること、及び／又は（ｂ）難聴の進行を遅らせること、及び／又は（ｃ）本発明の耳保護組成物を投与しなければ発生していた難聴の発現を抑制することが含まれる。

本明細書で使用する「耳毒性因子」という用語は、聴覚に関与する耳の何れかの要素の機能を損なう可能性があり、そのため、一時的又は永続的な難聴を誘発する可能性がある因子を意味する。耳毒性因子の例は、耳毒性薬物と耳毒性騒音である。

本明細書で使用する「耳毒性因子への曝露」という用語には、本分野において、一時的又は永続的な難聴を引き起こす可能性があるものと認識されている耳毒性因子に、単回又は複数回曝露することが含まれる。例えば、米国労働安全衛生局（ＯＳＨＡ）は、８５デシベル（ｄＢ）以上の騒音への曝露が聴覚に対して有害であると考えている。このため、騒音軽減措置（すなわち、耳当て）が用いられていないのであれば、時間加重平均に基づき、連続して８時間以上、８５ｄＢ以上の騒音に労働者を曝露させてはならないことを、ＯＳＨＡは義務付けている。

本明細書で使用する「耳保護組成物」という用語は、少なくとも１種の耳保護剤を含み、２以上の耳保護剤を含むことがある組成物を意味する。耳保護組成物は、１以上の耳保護剤に加えて、哺乳類の対象への耳保護組成物の投与を促進する薬学的に許容される担体を含んでもよい。

１つの側面において、本発明は、難聴を改善するための方法であって、難聴を改善するのに有効な一定量の耳保護組成物を対象に投与する工程を備えた方法を提供する。本発明の方法は、ヒトの患者等のあらゆる哺乳類の対象に適用できる。前記耳保護組成物は、耳毒性因子への曝露前、曝露中、又は曝露後に投与することができる。

前記耳保護組成物は、１又は複数の耳保護剤を含むことができる。特に別段の記載がなければ、本発明では、本明細書に開示したあらゆる耳保護剤の異性体又は互変異性体を何れも使用することができる。本発明の耳保護組成物中に加えることができる耳保護剤としては、グルタチオンやグルタチオン前駆体を挙げることができる。このグループに属する耳保護剤の代表例は、メチオニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、グルタチオンエチルエステル、グルタチオンジエチルエステル、グルタチオントリエチルエステル、システアミン、シスタチオン、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン（ＤｉＮＡＣ）、２（Ｒ，Ｓ）−Ｄ−リボ−（１’，２’，３’，４’−テトラヒドロキシブチル）−チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボン酸（ＲｉｂＣｙｓ）、２−アルキルチアゾリジン２（Ｒ，Ｓ）−Ｄ−リボ−（１’，２’，３’，４’−テトラヒドロキシブチル）チアゾリジン（ＲｉｂＣｙｓｔ）、及び２−オキソ−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸（ＯＴＣＡ）である。

キサンチンオキシダーゼ阻害剤（例えば、アロプリノール（Ｃ_５Ｈ_４Ｎ_４Ｏ））とその互変異性体は、本発明を実施する場合の耳保護剤として有用である。以下の代表的なアロプリノール誘導体：１−メチルアロプリノール、２−メチルアロプリノール、５−メチルアロプリノール、７−メチルアロプリノール、１，５−ジメチルアロプリノール、２，５−ジメチルアロプリノール、１，７−ジメチルアロプリノール、２，７−ジメチルアロプリノール、５，７−ジメチルアロプリノール、２，５，７−トリメチルアロプリノール、１−エトキシカルボニルアロプリノール、１−エトキシカルボニル−５−メチルアロプリノールは、本発明を実施する場合の耳保護剤として有用である。

グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質は、本発明を実施する場合の耳保護剤として有用である。グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の代表例には、２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン（エブセレン）、６Ａ，６Ｂ−ジセレニン酸−６Ａ’，６Ｂ’−セレニウム架橋β−シクロデキストリン（６−ｄｉＳｅＣＤ）、２，２’−ジセレノ−ビス−β−シクロデキストリン（２−ｄｉＳｅＣＤ）が含まれる。

表１には、本明細書に記載されている幾つかの耳保護剤について代表的な有効投与範囲が記されている。表１に記されている耳保護剤は、経口又は静脈内投与することが好ましい。表１に記されている耳保護剤は、耳毒性騒音等の耳毒性因子への曝露前、曝露中、又は曝露後に、哺乳類の対象に投与することができる。典型的には、哺乳類の対象は、耳毒性因子への曝露前と曝露後にそれぞれ少なくとも１種の耳保護剤を少なくとも１回投与される。幾つかの実施形態では、哺乳類の対象は、耳毒性因子への曝露前に少なくとも１種の耳保護剤を１回投与され、耳毒性因子への曝露後に少なくとも１種の耳保護剤を少なくとも１回投与される。幾つかの実施形態では、哺乳類の対象は、耳毒性因子への単回曝露（約１時間乃至約６時間にわたる耳毒性騒音への持続的曝露等）に対して、少なくとも１種の耳保護剤を１日に少なくとも２回投与される。幾つかの実施形態では、哺乳類の対象は、耳毒性因子への反復曝露又は耳毒性因子への長期曝露（約６時間を超える耳毒性騒音への持続的曝露等）に対して、少なくとも１種の耳保護剤を１日に少なくとも３回投与される。

本発明の幾つかの実施形態では、哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露される１８時間前から哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露された１８時間後までの期間中に、１以上の耳保護剤を含む耳保護組成物を哺乳類の対象に１回以上投与する。本発明の幾つかの実施形態では、哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露される１時間前から哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露された１時間後までの期間中に、１以上の耳保護剤を含む耳保護組成物を哺乳類の対象に１回以上投与する。本発明の幾つかの実施形態では、哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露される３０分前から哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露された３０分後までの期間中に、１以上の耳保護剤を含む耳保護組成物を哺乳類の対象に１回以上投与する。本発明の幾つかの実施形態では、哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露される１０分前から哺乳類の対象が耳毒性因子に曝露された１０分後までの期間中に、１以上の耳保護剤を含む耳保護組成物を哺乳類の対象に１回以上投与する。本発明の幾つかの実施形態では、耳毒性騒音等の耳毒性因子への哺乳類の対象の曝露と同時並行的に、１以上の耳保護剤を含む耳保護組成物を哺乳類の対象に投与する。

「ｍｇ」という略号は、ミリグラムを意味する。

表１ 耳保護剤の投与域

前記耳保護組成物には、１又は複数の耳保護剤を加えることができる。このように、本発明の耳保護組成物には、本明細書に記載されている各耳保護剤を任意の組み合わせで加えることができる。２以上の耳保護剤を含む耳保護組成物の実施形態では、表１に記されている各耳保護剤成分が有効量となるように、耳保護組成物を調合する場合がある。幾つかの実施形態では、実施例２に記載されているように、耳保護剤の組み合わせが相乗的に作用することがある。

別の側面では、本発明は、本明細書に開示されている各耳保護剤をそれぞれが少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）含む耳保護組成物を提供する。例えば、ある種の耳保護組成物は、グループＡから選択される少なくとも１種の耳保護剤と、グループＢから選択される少なくとも１種の耳保護剤と、グループＣから選択される少なくとも１種の耳保護剤とを含み、グループＡ、Ｂ、及びＣは、以下の耳保護剤を含む。

グループＡ（グルタチオン又はグルタチオン前駆体）：メチオニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、グルタチオンエチルエステル、グルタチオンジエチルエステル、グルタチオントリエチルエステル、ＤｉＮＡＣ、ＲｉｂＣｙｓ、ホモシステイン、シスタチオン、システアミン、ＯＴＣＡ、ＲｉｂＣｙｓｔ。

グループＢ（キサンチンオキシダーゼ阻害剤）：アロプリノール、１−メチルアロプリノール、２−メチルアロプリノール、５−メチルアロプリノール、７−メチルアロプリノール、１，５−ジメチルアロプリノール、２，５−ジメチルアロプリノール、１，７−ジメチルアロプリノール、２，７−ジメチルアロプリノール、５，７−ジメチルアロプリノール、２，５，７−トリメチルアロプリノール、１−エトキシカルボニルアロプリノール、１−エトキシカルボニル−５−メチルアロプリノール。

グループＣ（グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質）：エブセレン、２−ｄｉＳｅＣＤ、６−ｄｉＳｅＣＤ。

本発明の耳保護組成物は、例えば、耳毒性因子への曝露によって誘発された難聴を改善するために有用である。本発明の耳保護組成物は、耳毒性因子によって誘発された難聴（例えば、耳毒性騒音への曝露によって誘発された難聴）を改善するための本発明の方法において使用することができる。

本発明の耳保護組成物は、耳毒性因子に曝露された対象の難聴を改善させるのに有効な投薬量を与えるように調合することができる。例えば、幾つかの実施形態では、前記耳保護組成物は、表１に記されている各耳保護剤が有効投薬量となるように調合される。

本発明の耳保護組成物の投与は、実施例１〜３に記載されているように、任意の有効な経路（例えば、経口又は非経口）によって行われる。非経口送達の方法には、局所、動脈内、皮下、脊髄内、静脈内、又は鼻内投与が含まれる。１以上の耳保護剤に加えて、前記耳保護組成物は、哺乳類の対象への耳保護組成物の投与を促進する賦形剤その他の化合物を含む適切な薬学的に許容される担体を含んでもよい。調合と投与のための技術に関する詳細は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」(Maack Publishing Co,Easton PA)の最新版に記載されている。

経口投与用の耳保護組成物は、実施例１〜３に記載されているように、経口投与に適した投薬量で、本分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて調合することができる。このような担体によって、耳保護組成物を対象の摂取に適した錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調合することが可能となる。

経口用の耳保護組成物は、例えば、１以上の耳保護剤を固形賦形剤と組み合わせ、生じた混合物を必要に応じてすりつぶし、所望であれば、適切な化合物をさらに追加した後に、顆粒の混合物を加工して錠剤又は糖衣錠のコアを得ることによって取得することができる。適切な賦形剤には、炭水化物又はタンパク質の増量剤が含まれる。これらには、ラクトース、スクロース、マニトール、又はソルビトール、トウモロコシ、麦、米、芋、若しくは他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロースを含む糖類、アラビアゴムとトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。所望であれば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はその塩（アルギン酸ナトリウム等）のような崩壊剤又は可溶化剤を加えてもよい。

糖衣錠のコアは、濃縮糖溶液等の適切なコーティングによって与えられ、前記濃縮糖溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、適切な有機溶媒又は溶媒混合物が含有されてもよい。製品の識別のために、又は活性な化合物の量（すなわち、投薬量）を特定するために、染料又は色素を前記錠剤又は糖衣錠コーティングに加えてもよい。

経口で使用することができる耳保護組成物は、例えば、ゼラチンとグリセロール又はソルビトール等のコーティングとから作られた密封軟カプセルの他、ゼラチン製の押し込み式カプセル（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ ｃａｐｓｕｌｅ）として、調合することができる。押し込み式カプセルは、ラクトース又はデンプン等の増量剤又は結合剤と、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤と、必要に応じて安定化剤とを混合した耳保護剤を含有することができる。軟カプセルでは、安定化剤を加えて又は加えずに、脂肪油、液状パラフィン、又は液状ポリエチレングリコール等の適切な液体中に、耳保護剤を溶解又は懸濁させることができる。

非経口投与用の耳保護組成物は、実施例１〜３に記載されているように、１以上の耳保護剤の水溶液を含んでいる。注入の場合、本発明の前記耳保護組成物は、水溶液中に、好ましくはＨａｎｋ’ｓ溶液、リンゲル溶液、又は生理的緩衝食塩水等の生理的に適合的な緩衝液中に調合することができる。水性注入懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増大させる物質を含有させてもよい。加えて、耳保護剤の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。必要に応じて、前記懸濁液は、化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能とする適切な安定化剤又は因子を含有してもよい。

局所又は経鼻投与の場合には、障壁を通過するのに適した浸透剤を調剤中に使用するのが通例である。このような浸透剤は、本分野において一般的に知られている。

本発明の耳保護組成物は、本分野で公知の様式と同様の様式で（例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠の製造、粉末化、乳化、カプセル封入、封入、または凍結乾燥等の慣用工程によって）製造することができる。前記耳保護組成物は、慣用手段（例えば、コーティング）によって、適切な放出特性（例えば、持続的放出又は標的誘導放出）が得られるように改変してもよい。

前記耳保護組成物は、塩として与えてもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む（これらに限定されない）多くの酸とともに形成させることができる。塩は、対応する遊離塩基型に比べて、水その他のプロトン性溶媒中に溶けやすい傾向がある。

許容される担体中に調合されたこのような耳保護組成物を調製した後には、これを適切な容器に入れて、使用のためにラベルを貼付してもよい。

実際に投与される量は、治療を受ける個体に応じて変動し、顕著な副作用を生じることなく所望の効果が達成される最適化された量であることが好ましいであろう。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。もちろん、当業者であれば、分割及び部分投与も本発明の範囲に属することが明らかであろう。

いずれの耳保護組成物についても、実施例１〜３に記載されているように、細胞培養アッセイ又は何れかの適切な動物モデル（例えば、霊長類、ラット、モルモット、その他の実験用小動物）で、まず有効量を推測することが可能である。通例、動物モデルは、望ましい濃度域と投与経路を達成するためにも使用される。次いで、このような情報を用いて、ヒトその他の哺乳類で使用する用量と投与経路を決定することができる。

耳保護組成物の治療効果と生じ得る毒性は、細胞培養又は実験動物中で、標準的な薬学的操作によって決定することができる（例えば、ＥＤ_５０、集団の５０％に治療効果を示す用量、ＬＤ_５０、集団の５０％を死亡させる用量）。治療効果と毒性効果との用量比が治療係数であり、比率ＥＤ_５０／ＬＤ_５０として表すことができる。治療係数が大きな耳保護組成物が好ましい。細胞培養アッセイや動物実験から得られたデータは、ヒト又はその他の哺乳類に使用する投与域を策定するのに用いられる。このような化合物の投薬量は、毒性を殆ど又は全く示さずに、ＥＤ_５０を包含する循環濃度域内に入っていることが好ましい。投薬量は、使用する剤形、対象の感度、投与経路に応じて、この範囲内を変動するのが通例である。

本実施例では、騒音に曝露されたラットの聴力閾値の変動と蝸牛有毛細胞の喪失がエブセレン投与により抑制されることを示す。

１．方法
騒音への曝露法：８週齢のメスＦｉｓｈｅｒ−３４４ラットを、４〜１６ｋＨｚで１１０−１１５ｄＢの騒音に４時間曝露した。

生理学的解析：騒音に曝露する前後に、Intelligent Hearings Systemの装置を用い、聴性誘発脳幹反応（ＡＢＲ）を使用して各動物の各耳の聴力を評価した。クリック刺激（広域刺激、４〜１６ｋＨｚ）により生じたＡＢＲを、５ｄＢ間隔で測定した。騒音曝露から１日、１週間、２週間、および３週間後に動物の聴力を再評価した。騒音曝露から１日後に測定したＡＢＲ変化は、一時的な聴力閾値変動（ＴＴＳ）であると考えられるが、騒音曝露から３週間後に測定したＡＢＲ変化は、永久的な閾値変動（ＰＴＳ）と考えられる。

形態的解析：騒音曝露およびＡＢＲを用いた生理学的評価の後、試験を行った動物から慎重に蝸牛を切り出して内耳感覚上皮を得、蝸牛の有毛細胞数を測定した。フルオレセイン標識されたファロイジン（アクチン繊維に特異的で、有毛細胞中に豊富に存在する）および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、細胞核内のＤＮＡを特異的に染色）を用いて、前記組織を染色した。次に、試料を顕微鏡スライドに置き、エピ蛍光で可視化して有毛細胞の喪失と保持の程度を調べた。生理学的データ（ＡＢＲ）と形態学的データ（有毛細胞数）との相関関係から、本発明の耳保護剤が保護効果を有することが確認される。

耳保護剤の投与用量：エブセレンを４ｍｇ／ｍＬになるように１０％のＤＭＳＯ中に溶解し、１６ｍｇ／ｋｇになるようにラットに投与した。Ｎ−アセチル−システインを１００ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩水中に溶解し、３２５ｍｇ／ｋｇになるようにラットに投与した。約０．５ｍｌのエブセレン溶液またはＮ−アセチル−システイン溶液を、騒音への曝露前日、当日、および翌日に、１日２回、腹腔内投与または経口投与した。対照動物には、同様のスケジュールでビヒクル（１０％ ＤＭＳＯ）のみを投与した。

統計解析：全ての実験は、各試験群当り４匹のラットを用いて行い、各耳に対して、独立して、騒音曝露前後に測定を行った。データは、盲検法により収集した。試験群間の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計解析を行った。

２．結果
図１で示されるように、５ｄＢ間隔で測定され、４〜１６ｋＨｚのクリック刺激で得られたＡＢＲデータは、対照群と比べて、騒音曝露から１日後にエブセレンを投与された動物でＴＴＳが極めて有意に減少しており、騒音曝露から３週間後にＰＴＳが有意に減少していることを示している。エブセレン投与動物におけるＴＴＳおよびＰＴＳは、少なくとも対照動物の２分の１に減少した。同様に、ＡＢＲデータから、騒音曝露後の全時点で、Ｎ−アセチル−システイン投与動物においてＴＴＳが有意に減少することが分かる。

耳保護剤で処理した動物由来の蝸牛中に存在する有毛細胞の喪失は対照群と比べて少なく、生理学的データは、同じ試験動物由来の形態学的データとの相関性を有する。例えば、ＰＴＳが０ｄＢで且つＴＴＳが有意に低下したエブセレン処理動物では、外有毛細胞は殆ど保持されていることが観察されたが、１５ｄＢのＰＴＳを示す対照動物では外有毛細胞がほぼ完全に欠損していた。Ｎ−アセチル−システイン処理ラットでは、同様に外有毛細胞が保持されていることが観察された。従って、エブセレンまたはＮ−アセチル−システインを投与することにより、騒音によって誘発される難聴と有毛細胞の欠損が生理的に保護される。

同様に、アロプリノールを投与すると、騒音により誘導される難聴と有毛細胞の欠損から保護されることが明らかとなった（実施例２参照）。

本実施例では、エブセレンとアロプリノールの併用投与によって、各化合物の単独投与よりも、難聴と有毛細胞の喪失が効果的に保護されることを示す。

１．方法
騒音への曝露方法：８〜１０週齢のメスＦｉｓｈｅｒ−３４４ラットを、４〜１６ｋＨｚで１１０〜１１５ｄＢの騒音に４時間曝露した。

生理学的解析：クリック刺激（広域刺激、４〜１６ｋＨｚ）と４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１２ｋＨｚ、および１６ｋＨｚの周波数のトーン刺激によって生じたＡＢＲを５ｄＢ間隔で、実施例１に記載したようにして測定した。騒音曝露前および騒音曝露３週後に、これらの動物に対して試験を行い、ＰＴＳを評価した。

化合物の用量：４ｍｇ／ｍｌになるように１０％のＤＭＳＯ中にエブセレンを溶解し、アロプリノールを水で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。エブセレンとアロプリノールの各化合物溶液を１６ｍｇ／ｋｇでラットに単独投与するか、各８ｍｇ／ｋｇずつ混合して投与した。約０．５ｍｌのエブセレン溶液、アロプリノール溶液、またはエブセレン／アロプリノール溶液を、騒音曝露前日、騒音曝露当日、および騒音曝露翌日に、１日２回、腹腔内注入するか、または経口投与した。対照動物には、同様のスケジュールでビヒクルのみを投与した。

統計解析：全ての実験は、試験群当り４匹のラットを用いて行い、騒音曝露前後に、各耳を独立して測定した。データは、盲検法により収集した。統計解析は、試験群間のＡＮＯＶＡによって行った。

２．結果
ＡＢＲにより測定した生理学的データから、エブセレンとアロプリノールの単独または混合投与により、騒音に曝露されたラットにおいて、一時的および永久的な閾値変動から有意に保護されることが示唆される。図２により、対照群と比較して、それぞれ１６ｍｇ／ｋｇのエブセレンとアロプリノールを別々に腹腔内投与した場合、騒音曝露から３週後の時点でＰＴＳが有意に低下することが示される。各化合物の用量を半分にして（つまり、各８ｍｇ／ｋｇ）、エブセレンとアロプリノールを混合して投与した場合、加算したレベルより保護のレベルが大きくなる（相乗効果）。

本実施例では、エブセレンの投与によって、騒音に反復曝露されたラットにおける閾値変動と蝸牛有毛細胞の喪失が抑制されることを示す。

１．方法
騒音曝露方法：８週齢のメスＦｉｓｈｅｒ−３４４ラットを、３週間の間隔をあけて２回、４〜１６ｋＨｚで１１０ｄＢの騒音に４時間曝露した。

生理学的解析：４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１２ｋＨｚ、および１６ｋＨｚの周波数のトーン刺激により生じたＡＢＲを５ｄＢ間隔で、実施例１に記載したように測定した。騒音への反復曝露前および３週間後に、これらの動物を試験に供して、永続的閾値変動（ＰＴＳ）を評価した。

形態的解析：実施例1に記載したように、騒音曝露およびＡＢＲを用いた生理学的評価の後、試験動物から得た蝸牛中の有毛細胞数を数えた。

エブセレンの投与：４ｍｇ／ｍＬになるように１０％のＤＭＳＯ中にエブセレンを溶解し、ラットに１６ｍｇ／ｋｇになるように投与した。約０．５ｍｌのエブセレン溶液を、騒音曝露各回の前日、当日、および翌日に、１日２回、腹腔内投与または経口投与した。対照動物には、同様のスケジュールでビヒクルのみを投与した。

統計解析：全ての実験は、試験群当り４匹のラットを用いて行い、騒音曝露前後に、各耳を独立して測定した。データは、盲検法により収集した。試験群間でＡＮＯＶＡによりデータを解析した。

２．結果
ＡＢＲを測定した生理学的データから、騒音への反復曝露によって誘導される一時的および永続的閾値変動が、エブセレンにより何れも有意に抑制されることが示唆される。エブセレンの投与により、対照群と比較して、騒音への反復曝露から1日後にＴＴＳが有意に抑制される。さらに、図３に示されているように、対照群と比較して、これらのラットでは、騒音への反復曝露から３週間後のＰＴＳが有意に抑制された。図４に示されているように、生理学的データは同一試験動物から得られた形態学的データと相関性を有しており、エブセレン処理動物由来の蝸牛では、対照群よりも有毛細胞の喪失が少ないことを示している。

本発明の好ましい実施態様を例示し、説明を加えてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行えることが明らかであろう。

図１は、対照ラット（Ａ）、Ｎ−アセチル−システイン処理ラット（Ｂ）、エブセレン処理ラット（Ｃ）を１１５ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間曝露させてから１日後、１週後、２週後、及び３週後に、４〜１６ｋＨｚのクリック刺激を用いて調べた聴性誘発脳幹反応（ＡＢＲ）の閾値変動を比較したグラフを示している。対照ラットとエブセレン処理ラット間の閾値変動の差は、騒音への曝露から１日後、１週後、２週後には、著しく有意であり（ｐ＜０．０１）、騒音への曝露から３週後でも有意であった（ｐ＜０．０５）。対照ラットとＮ−アセチルシステイン処理ラット間の閾値変動の差は、騒音への曝露後の全ての時点において有意であった（ｐ＜０．０５）。ベースラインからの閾値変動は、５ｄＢの間隔で測定した。 図２は、対照ラット（Ａ）、１６ｍｇ／ｋｇ エブセレン処理ラット（Ｂ）、１６ｍｇ／ｋｇ アロプリノール処理ラット（Ｃ）、８ｍｇ／ｋｇ エブセレン／アロプリノール処理ラット（Ｄ）を１１５ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間曝露させてから３週後に、４〜１６ｋＨｚのクリック刺激と４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１２ｋＨＺ、１６ｋＨｚの周波数の刺激とを用いて調べたＡＢＲの閾値変動を比較したグラフを示している。対照（Ａ）とエブセレン処理ラット（Ｂ）の閾値変動の差は、クリック刺激と４ｋＨｚ刺激について著しく有意であった（ｐ＜０．０１）。対照（Ａ）とアロプリノール処理ラット（Ｃ）間の閾値変動間の差は、クリック、４ｋＨｚ、１６ｋＨｚ刺激について著しく有意であった（ｐ＜０．０１）。対照（Ａ）とエブセレン／アロプリノール処理ラット（Ｃ）間の閾値変動の差は、クリック、４ｋＨｚ、１６ｋＨｚ刺激について著しく有意であり（ｐ＜０．０１）、１２ｋＨｚ刺激について有意であった（ｐ＜０．０５）。ベースラインからの閾値変動は、５ｄＢの間隔で測定した。 図３は、対照ラット（Ａ）とエブセレン処理ラット（Ｂ）を１１０ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間、３週の間隔を置いて２回曝露させてから３週後に、４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１２ｋＨｚ、１６ｋＨｚの周波数の刺激を用いて調べたＡＢＲの閾値変動を比較したグラフを示している。対照ラットとエブセレン処理ラットの閾値変動の差は、８ｋＨｚの刺激について著しく有意であり（ｐ＜０．０１）、１６ｋＨｚの刺激について有意であった（ｐ＜０．０５）。ベースラインからの閾値変動は、５ｄＢ間隔で測定した。 図４Ａ〜Ｄは、対照ラット（ＡとＣ）及び１６ｍｇ／ｋｇエブセレン処理ラット（ＢとＤ）を、１１０ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間、３週の間隔を置いて２回曝露させた後に、蝸牛頂からの距離の関数として、外有毛細胞の喪失のパーセントを比較したグラフを示している。ラットＡとＣで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、４０１と２４６であり、ラットＢとＤで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、９０と５６であった。 図４Ａ〜Ｄは、対照ラット（ＡとＣ）及び１６ｍｇ／ｋｇエブセレン処理ラット（ＢとＤ）を、１１０ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間、３週の間隔を置いて２回曝露させた後に、蝸牛頂からの距離の関数として、外有毛細胞の喪失のパーセントを比較したグラフを示している。ラットＡとＣで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、４０１と２４６であり、ラットＢとＤで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、９０と５６であった。 図４Ａ〜Ｄは、対照ラット（ＡとＣ）及び１６ｍｇ／ｋｇエブセレン処理ラット（ＢとＤ）を、１１０ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間、３週の間隔を置いて２回曝露させた後に、蝸牛頂からの距離の関数として、外有毛細胞の喪失のパーセントを比較したグラフを示している。ラットＡとＣで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、４０１と２４６であり、ラットＢとＤで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、９０と５６であった。 図４Ａ〜Ｄは、対照ラット（ＡとＣ）及び１６ｍｇ／ｋｇエブセレン処理ラット（ＢとＤ）を、１１０ｄＢ、４〜１６ｋＨｚの騒音に４時間、３週の間隔を置いて２回曝露させた後に、蝸牛頂からの距離の関数として、外有毛細胞の喪失のパーセントを比較したグラフを示している。ラットＡとＣで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、４０１と２４６であり、ラットＢとＤで失われた外有毛細胞の数は、それぞれ、９０と５６であった。

Claims (14)

1. 哺乳類の対象の騒音関連の難聴を改善するための耳保護組成物であって、組成物は、騒音関連の難聴を改善するのに有効な量で哺乳類の対象に投与され、前記耳保護組成物が、２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン（エブセレン）、６Ａ，６Ｂ−ジセレニン酸−６Ａ’，６Ｂ’−セレニウム架橋β−シクロデキストリン（６−ｄｉＳｅＣＤ）、及び２，２’−ジセレノ−ビス−β−シクロデキストリン（２−ｄｉＳｅＣＤ）からなる群から選択される耳保護剤を少なくとも１種含有することを特徴とする、耳保護組成物。
2. 前記組成物がエブセレンを含む、請求項１に記載の耳保護組成物。
3. 前記哺乳類の対象がヒトである、請求項１に記載の耳保護組成物。
4. 哺乳類の対象の難聴を改善するための耳保護組成物であって、組成物は、難聴を改善するのに有効な量で哺乳類の対象に投与され、前記耳保護組成物が、
   （ａ）２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン（エブセレン）、６Ａ，６Ｂ−ジセレニン酸−６Ａ’，６Ｂ’−セレニウム架橋β−シクロデキストリン（６−ｄｉＳｅＣＤ）、及び２，２’−ジセレノ−ビス−β−シクロデキストリン（２−ｄｉＳｅＣＤ）からなる群から選択される少なくとも１種の薬学的に有効な量の耳保護剤と、
   （ｂ）アロプリノール、１−メチルアロプリノール、２−メチルアロプリノール、５−メチルアロプリノール、７−メチルアロプリノール、１，５−ジメチルアロプリノール、２，５−ジメチルアロプリノール、１，７−ジメチルアロプリノール、２，７−ジメチルアロプリノール、５，７−ジメチルアロプリノール、２，５，７−トリメチルアロプリノール、１−エトキシカルボニルアロプリノール、１−エトキシカルボニル−５−メチルアロプリノールからなる群から選択される少なくとも１種の薬学的に有効な量の耳保護剤を含有することを特徴とする、耳保護組成物。
5. 前記耳保護組成物がエブセレンとアロプリノールを含有する、請求項４に記載の組成物。
6. 前記哺乳類の対象がヒトである、請求項４に記載の組成物。
7. 哺乳類の対象の難聴を改善するための耳保護組成物であって、組成物は、難聴を改善するのに有効な量で哺乳類の対象に投与され、前記耳保護組成物が、
   （ａ）２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン（エブセレン）、６Ａ，６Ｂ−ジセレニン酸−６Ａ’，６Ｂ’−セレニウム架橋β−シクロデキストリン（６−ｄｉＳｅＣＤ）及び２，２’−ジセレノ−ビス−β−シクロデキストリン（２−ｄｉＳｅＣＤ）からなる群から選択される少なくとも１種の薬学的に有効な量の耳保護剤と、
   （ｂ）アロプリノール、１−メチルアロプリノール、２−メチルアロプリノール、５−メチルアロプリノール、７−メチルアロプリノール、１，５−ジメチルアロプリノール、２，５−ジメチルアロプリノール、１，７−ジメチルアロプリノール、２，７−ジメチルアロプリノール、５，７−ジメチルアロプリノール、２，５，７−トリメチルアロプリノール、１−エトキシカルボニルアロプリノール、１−エトキシカルボニル−５−メチルアロプリノールからなる群から選択される少なくとも１種の薬学的に有効な量の耳保護剤と、
   （ｃ）メチオニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、システイン、ホモシステイン、システアミン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、グルタチオンエチルエステル、グルタチオンジエチルエステル、グルタチオントリエチルエステル、システアミン、シスタチオン、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン（ＤｉＮＡＣ）、２（Ｒ，Ｓ）−Ｄ−リボ−（１’，２’，３’，４’−テトラヒドロキシブチル）−チアゾリジン−４（Ｒ）カルボン酸（ＲｉｂＣｙｓ）、２−アルキルチアゾリジン２（Ｒ，Ｓ）−Ｄ−リボ−（１’，２’，３’，４’−テトラヒドロキシブチル）チアゾリジン（ＲｉｂＣｙｓｔ）、及び２−オキソ−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸（ＯＴＣＡ）からなる群から選択される少なくとも１種の薬学的に有効な量の耳保護剤とを含有する耳保護組成物。
8. エブセレンと、アロプリノールと、Ｎ−アセチルシステインとを包含する、請求項７に記載の組成物。
9. 前記哺乳類の対象がヒトである、請求項７に記載の組成物。
10. 前記少なくとも１種の耳保護剤組成物が、５〜５０００ｍｇの量で存在する、請求項１に記載の耳保護組成物。
11. 群（ａ）の各耳保護剤が、５〜５０００ｍｇの量で存在し、群（ｂ）の各耳保護剤が、１０〜２４００ｍｇの量で存在する、請求項４から７に記載の耳保護組成物。
12. 前記アロプリノールが、１０〜２４００ｍｇ/日の量で投与され、前記２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンが、５〜５０００ｍｇ/日の量で投与可能である、請求項５から８に記載の耳保護組成物。
13. 前記アロプリノールが、５０〜１２００ｍｇ/日の量で投与され、前記２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンが、５０〜２０００ｍｇ/日の量で投与可能である、請求項５から８に記載の耳保護組成物。
14. 前記アロプリノールが、１００〜８００ｍｇ/日の量で投与され、前記２−フェニル−１，２−ベンゾイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンが、５０〜２０００ｍｇ/日の量で投与可能である、請求項５から８に記載の耳保護組成物。

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