JP4420360B2

JP4420360B2 - Process for producing 5'-O-trityl nucleosides

Info

Publication number: JP4420360B2
Application number: JP02574799A
Authority: JP
Inventors: 芳宏早川; 正典片岡
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2010-02-24
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: JP2000264897A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、無保護のヌクレオシドの５’位を選択的にトリチル化する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在のＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドの化学合成においては、固相法、液相法いずれにおいてもホスホロアミダイト法と呼ばれる手法が最も汎用されている。このホスホロアミダイト法は、ヌクレオシドのアミダイトブロックを順次縮合することで目的とする配列のオリゴヌクレオチドを合成する方法であるが、合成時の副反応を抑制するためにアミダイトブロックの核酸塩基部のアミノ基は保護基で保護されたものが通常使用されていた。
【０００３】
しかし、このような保護基の使用は、保護基の導入と脱保護の余分な２工程を必要とし、目的とするオリゴヌクレオチドの収率低下の１つの原因となっていることから、必ずしも好ましい方法とはいえない。最近、このような問題を克服する方法として、アミダイトブロックの核酸塩基部のアミノ基を保護基で保護しない無保護のアミダイトブロックを用いてオリゴヌクレオチドを化学合成する研究が盛んに行われており、大きな成果をあげつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような無保護のアミダイトブロックを用いたオリゴヌクレオチドの化学合成法をより現実のものとするためには、対応するヌクレオシドのアミダイトブロックおよびアミダイトブロック調製のためのジメトキシトリチル（ＤＭＴ）体などのヌクレオシドのトリチル体を簡便な手法で効率的に合成する必要がある。上述したオリゴヌクレオチドと同様に、たとえば無保護のヌクレオシドの５’位を選択的にトリチル化する方法が開発されれば、無保護のアミダイトブロックも効率的に合成でき、もってオリゴヌクレオチドを収率よく調製できることが大いに期待される。
【０００５】
従来、無保護のヌクレオシドの５’位を選択的にトリチル化する方法はいくつか報告されているものの（J. Am. Chem. Soc., 104, 1316-1319(1982)、J. Am. Chem. Soc., 85, 3821-3827(1963)、特開平１−３０８２９４など参照）、いずれの方法も合成手法が複雑であったり、合成収率が低かったり、特定のヌクレオシドにしか適用できなかったり等の問題を有し、すべてのヌクレオシドに応用可能で、しかも効率的な方法は報告されていない。特に、グアノシンは無保護の状態で５’位を選択的にトリチル化するのが難しいヌクレオシドであり、一旦２位アミノ基を保護し、５’位をトリチル化した後、アミノ基の保護基を脱保護する方法が現時点で最も実用的で効率的な方法とされている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題を克服するため鋭意研究を重ねた結果、イミダゾリウムメタンスルホネートおよびトリアルキルアミンなどの反応促進剤を使用することで、無保護のヌクレオシドの５’位を選択的にトリチル化することができ、この方法が特定のヌクレオシドに限定されず、すべてのヌクレオシドに応用可能であることを見いだし、本発明を完成させた。したがって、本発明は、無保護のヌクレオシドとトリチル化剤を反応させて５’−Ｏ−トリチルヌクレオシド類を製造法する方法であって、反応促進剤にアゾールの塩としてイミダゾールのスルホン酸塩を、アミン類としてトリアルキルアミンを使用する方法に関するものである。その中でも、好ましい方法として、アゾールの塩類としてイミダゾリウムメタンスルホネートおよびアミン類としてジイソプロピルエチルアミンを使用する方法に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で対象とするヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの合成に使用されているものであればすべて使用することができ、たとえばグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンなどのリボヌクレオシド、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、チミジンなどの２’−デオキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウルジン、２’−Ｏ−メトキシエチルグアノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルシチジン、２’−Ｏ−メトキシエチルウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウルジンなどの２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドなどを例示することができるが、これに限定されるものではない。
【０００８】
トリチル化剤としては、トリチルのハロゲン化物を使用すればよく、具体的には、ジメトキシトリチルクロライド、ジメトキシトリチルブロマイド、モノメトキシトリチルクロライド、モノメトキシトリチルブロマイド、トリチルクロライド、トリチルブロマイドなどを例示することができる。
【０００９】
本発明は、反応促進剤としてはアゾールの塩類を１種または数種使用することを特徴としている。そのようなアゾールの塩類としては、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾールまたはその誘導体あるいは同族体の塩酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩もしくはスルホン酸塩を例示することができる。具体的には、イミダゾール、ベンズイミダゾール、１−メチルイミダゾール、トリアゾールまたはテトラゾールの塩酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩もしくはスルホン酸塩が例示される。
【００１０】
このようなアゾールの塩類の中でも、イミダゾールまたはその誘導体のスルホン酸塩が好ましく、具体的には、イミダゾリウムメタンスルホネート、ベンズイミダゾリウムメタンスルホネート、１−メチルイミダゾリウムメタンスルホネート、イミダゾリウムトルエンスルホネート、ベンズイミダゾリウムトルエンスルホネート、１−メチルイミダゾリウムトルエンスルホネート、イミダゾリウムトリフルオロメタンスルホネート、ベンズイミダゾリウムトリフルオロメタンスルホネート、１−メチルイミダゾリウムトリフルオロメタンスルホネート、イミダゾリウムベンゼンスルホネート、ベンズイミダゾリウムベンゼンスルホネート、１−メチルイミダゾリウムベンゼンスルホネート等が挙げられる。この中でも、メタンスルホン酸塩、特にイミダゾリウムメタンスルホネートが好適である。
【００１１】
また、アミン類は反応に必須ではないが、多くの場合、反応が加速され、合成収率が向上することがあるので、アミン類を１種または数種併用することが望ましい。併用するアミン類としては、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、グアニジン、イミダゾール、１，８−ジアザビシクロ〔５，４，０〕ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ〔４，３，０〕ノナ−５−エン（ＤＢＮ）、１，４−ジアザビシクロ〔２，２，２〕オクタン（ＤＡＢＣＯ）などを例示することができ、特にトリアルキルアミン類、さらに好ましくはジイソプロピルエチルアミンを挙げることができる。
【００１２】
無保護のヌクレオシドの５’位を選択的にトリチル化する反応は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ジメチルアミン、アセトニトリル、ジメチルカーボネート、ピリジンなどの単独または混合溶媒中、無保護のヌクレオシド１モルに対し、トリチル化剤１〜２モル、反応促進剤０．５〜５モル、好ましくは１〜３モル、必要によりアミン類０．５〜５モル、好ましくは１〜３モルを用い、反応温度１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で１〜５０時間程度反応させることにより目的とする５’−Ｏ−トリチルヌクレオシド類を得ることができる。なお、上記反応は非水条件下で行うことが好ましく、使用する反応溶媒などは乾燥させたものを使用するのが望ましい。
このようにして得られた５’−Ｏ−トリチルヌクレオシド類はヌクレオシドの通常の方法にて単離精製すればよく、具体的にはシリカゲルなどの吸着クロマトグラフィーで精製すればよい。
【００１３】
【発明の効果】
本発明方法は、特定のヌクレオシドに特異的な方法ではなく、すべてのヌクレオシドに適用可能であり、しかも後述の実施例に示すように、１段階で７５％以上の収率でヌクレオシドの５’−位を選択的にトリチル化することができ、きわめて実用的で汎用性の高い方法である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は何等限定されるものではない。
実施例１
（１）イミダゾリウムメタンスルホネートの調製
イミダゾール（３４．０ｇ，０．４９９ｍｏｌ）を塩化メチレン（５００ｍｌ）に溶解し、この溶液に０℃にてメタンスルホン酸（４８．０ｇ，３２．４ｍｌ，０．４９９ｍｏｌ）を滴下した。析出した結晶をろ取し、塩化メチレン（１００ｍｌ）で洗浄し、イミダゾリウムメタンスルホネート（ＩＭＳ）を無色結晶として得た（８１．１ｇ，０．４９４ｍｏｌ，収率９９％）。
【００１５】
融点：１８４〜１８６℃
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ^-1）：３１４０，１５８９，１４６０，１４３７，１３３９，１１９４
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：２．４９（ｓ，３Ｈ），７．６２（ｓ，２Ｈ），９．０３（ｓ，１Ｈ）
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：４０．１，１１９．７，１３４．８
【００１６】
（２）５’−位の選択的なジメトキシトリチル化法
デオキシリボヌクレオシド（４０．０ｍｍｏｌ）、ＩＭＳ（１３．１ｇ，８０．０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１０．３ｇ，１３．９ｍｌ，８０．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ドライ）（１００ｍｌ）に懸濁し、更に、ｐ，ｐ’−ジメトキトリチルクロライド（１３．６ｇ，４０．０ｍｍｏｌ）を数回に分けて加え、２時間室温にて撹拌した。得られた均一な反応溶液を水（３．００リットル）にあけ、沈澱をろ取した。この沈澱をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、５’−Ｏ−（ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシリボヌクレオシドを得た。得られた化合物の収率、スペクトルデータは以下のとおりである。
【００１７】
５’−Ｏ−（ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７９％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．２２（ｂｒｓ，１Ｈ），２．５３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４，４．０，６．３Ｈｚ），２．７８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４，６．０，６．３Ｈｚ，Ｈ−２”），３．４０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．６，４．４Ｈｚ），３．７６（ｓ，６Ｈ），４．１６（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，４．４Ｈｚ），４．６７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，４．０，３．９Ｈｚ），５．９８（ｂｒｓ，２Ｈ），６．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），６．７８（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．１６−７．３９（ｍ，９Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）
【００１８】
５’−Ｏ−（ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン
性状：無色粉体
収率：７６％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．０１−２．１０（ｍ，１Ｈ），２．３９−２．４８（ｍ，１Ｈ），３．２２−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．６３（ｓ，６Ｈ），３．８６−３．９１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．３８（ｍ，１Ｈ），５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．６４−６．６９（ｍ，５Ｈ），７．０５−７．２４（ｍ，１１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
【００１９】
５’−Ｏ−（ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン
性状：無色針状
収率：７８％
融点：１９０−１９１℃
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：２．２２−２．３１（ｍ，１Ｈ），２．５７−２．６７（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．１５（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．８７−３．９１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．３５（ｍ，１Ｈ），５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），６．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．３，６．８Ｈｚ），６．４２（ｂｒｓ，２Ｈ），６．８１（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝６．８，８．８Ｈｚ），７．１７−７．３４（ｍ，９Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），１０．５８（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００２０】
５’−Ｏ−（ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン
性状：無色アモルファス状固体
収率：８２％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．１２−２．１９（ｍ，１Ｈ），２．２４−２．２９（ｍ，１Ｈ），２．５７（ｂｒｓ，１Ｈ），３．２０−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．６３（ｓ，６Ｈ），３．９０−３．９９（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．３８（ｍ，１Ｈ），６．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．６８（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．０８−７．２６（ｍ，１０Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），８．７９−８．９８（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００２１】
（３）５’−位の選択的なモノメトキシトリチル化法
前記（２）のジメトキシトリチル化法において、ｐ，ｐ’−ジメトキトリチルクロライドの代わりにｐ−メトキシトリチルクロライド（４０．０ｍｍｏｌ）を用いて、同様に反応させて５’−Ｏ−（ｐ−メトキシトリチル）−２’−デオキシリボヌクレオシドを得た。得られた化合物の収率、スペクトルデータは以下のとおりである。
【００２２】
５’−Ｏ−（ｐ−メトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７６％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．２１（ｂｒｓ，１Ｈ），２．４８−２．５４（ｍ，１Ｈ），２．６３−２．８１（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５，４．４Ｈｚ），３．７７（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，４．５Ｈｚ），４．５５−４．７８（ｍ，１Ｈ），５．９１（ｂｒｓ，２Ｈ），６．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），６．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．１６−７．３９（ｍ，１２Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）
【００２３】
５’−Ｏ−（ｐ−メトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７５％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．０５−２．１３（ｍ，１Ｈ），２．３３−２．４９（ｍ，１Ｈ），３．２１−３．３６（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．８５−３．９０（ｍ，１Ｈ），４．３８−４．４５（ｍ，１Ｈ），５．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．６４−６．６９（ｍ，３Ｈ），７．０５−７．２４（ｍ，１４Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）
【００２４】
５’−Ｏ−（ｐ−メトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７６％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：２．２０−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．５４−２．６３（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．８９−４．０１（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．４２（ｍ，１Ｈ），５．２４−５．３５（ｍ，１Ｈ），６．０６−６．１８（ｍ，１Ｈ），６．４２（ｂｒｓ，２Ｈ），６．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．１７−７．３４（ｍ，１２Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），１０．７３（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００２５】
５’−Ｏ−（ｐ−メトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン
性状：無色アモルファス状固体
収率：８１％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：２．１３−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．２１−２．２８（ｍ，１Ｈ），２．５６（ｂｒｓ，１Ｈ），３．１５−３．３１（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．８５−３．９８（ｍ，１Ｈ），４．３５−４．４４（ｍ，１Ｈ），６．２５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．０８−７．２６（ｍ，１３Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），８．６９−８．９１（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００２６】
（４）５’−位の選択的なトリチル化法
前記（２）のジメトキシトリチル化法において、ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルクロライドの代わりにトリチルクロライド（４０．０ｍｍｏｌ）を用いて、同様に反応させて５’−Ｏ−トリチル−２’−デオキシリボヌクレオシドを得た。得られた化合物の収率、スペクトルデータは以下のとおりである。
【００２７】
５’−Ｏ−トリチル−２’−デオキシアデノシン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７８％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．２３（ｂｒｓ，１Ｈ），２．３１−２．４８（ｍ，１Ｈ），２．６１−２．８０（ｍ，１Ｈ），３．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５，４．４Ｈｚ），４．１４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８，４．４Ｈｚ），４．５１−４．７６（ｍ，１Ｈ），５．９０（ｂｒｓ，２Ｈ），６．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），６．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．１４−７．２８（ｍ，１５Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ）
【００２８】
５’−Ｏ−トリチル−２’−デオキシシチジン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７９％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、ｐｐｍ）：２．０８−２．１４（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．４５（ｍ，１Ｈ），３．２４−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．９３（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．４１（ｍ，１Ｈ），５．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），６．５９−６．６７（ｍ，１Ｈ），７．０４−７．１８（ｍ，１６Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
【００２９】
５’−Ｏ−トリチル−２’−デオキシグアノシン
性状：無色アモルファス状固体
収率：７６％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：２．１８−２．２８（ｍ，１Ｈ），２．５５−２．６４（ｍ，１Ｈ），３．１１−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．９８（ｍ，１Ｈ），４．３５−４．４２（ｍ，１Ｈ），５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），６．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），６．５５（ｂｒｓ，２Ｈ），７．１２−７．２６（ｍ，１５Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），１０．３１（ｂｒｓ，１Ｈ）
元素分析：Ｃ₂₉Ｈ₂₇Ｎ₅Ｏ₄として
計算値：Ｃ６８．３６，Ｈ５．３４，Ｎ１３．７４
実測値：Ｃ６８．５０，Ｈ５．２８，Ｎ１３．７７
【００３０】
５’−Ｏ−トリチル−２’−デオキシチミジン
性状：無色アモルファス状固体
収率：８０％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、ｐｐｍ）：２．１１−２．１９（ｍ，１Ｈ），２．２６−２．３２（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｂｒｓ，１Ｈ），３．２１−３．３７（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．９３（ｍ，１Ｈ），４．３５−４．４３（ｍ，１Ｈ），６．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．０８−７．２３（ｍ，１６Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），８．７５−８．９２（ｂｒｓ，１Ｈ）[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for selectively tritylating the 5 ′ position of an unprotected nucleoside.
[0002]
[Prior art]
In the current chemical synthesis of oligonucleotides such as DNA, a technique called phosphoramidite method is most widely used in both solid phase and liquid phase methods. This phosphoramidite method is a method of synthesizing an oligonucleotide having a target sequence by sequentially condensing amidite blocks of nucleosides. In order to suppress side reactions during synthesis, the amino acid at the nucleobase portion of the amidite block is used. As the group, a group protected with a protecting group was usually used.
[0003]
However, the use of such a protecting group requires two extra steps of introduction and deprotection of the protecting group, which is one cause of a decrease in the yield of the target oligonucleotide. That's not true. Recently, as a method for overcoming such problems, there has been extensive research on chemically synthesizing oligonucleotides using an unprotected amidite block that does not protect the amino group of the nucleobase portion of the amidite block with a protecting group. It is producing great results.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In order to make the chemical synthesis of oligonucleotides using such unprotected amidite blocks more realistic, nucleosides such as amidite blocks of the corresponding nucleosides and dimethoxytrityl (DMT) isomers for the preparation of amidite blocks Therefore, it is necessary to efficiently synthesize the trityl isomer of this product by a simple method. Similar to the oligonucleotides described above, for example, if a method for selectively tritylating the 5 ′ position of an unprotected nucleoside is developed, an unprotected amidite block can be efficiently synthesized, and the oligonucleotide can be produced in high yield. It is highly expected that it can be prepared.
[0005]
Although several methods for selectively tritylating the 5 ′ position of an unprotected nucleoside have been reported (J. Am. Chem. Soc., 104, 1316-1319 (1982), J. Am. Chem Soc., 85, 3821-3827 (1963), Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-308294, etc.), either method has a complicated synthesis method, the synthesis yield is low, or it can be applied only to specific nucleosides. However, no efficient method has been reported that can be applied to all nucleosides. In particular, guanosine is a nucleoside that is difficult to selectively tritylize at the 5 ′ position in an unprotected state. Once the 2-position amino group is protected and the 5′-position is tritylated, the amino group protecting group is removed. The method of deprotection is the most practical and efficient method at present.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to overcome the above problems, the present inventors have selectively used trityl at the 5 ′ position of an unprotected nucleoside by using a reaction accelerator such as imidazolium methanesulfonate and trialkylamine. The present invention has been completed by finding that this method is not limited to a specific nucleoside but can be applied to all nucleosides. Therefore, the present invention is a method for producing a 5′-O-trityl nucleoside by reacting an unprotected nucleoside with a tritylating agent, and the reaction accelerator includes an imidazole sulfonate as an azole salt, The present invention relates to a method using trialkylamine as amines. Among them, a preferred method relates to a method using imidazolium methanesulfonate as an azole salt and diisopropylethylamine as an amine.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Any nucleoside targeted in the present invention can be used as long as it is used for the synthesis of oligonucleotides. For example, ribonucleosides such as guanosine, adenosine, cytidine, uridine, 2′-deoxyguanosine, 2 ′ 2'-deoxyribonucleosides such as deoxyadenosine, 2'-deoxycytidine, thymidine, 2'-O-methylguanosine, 2'-O-methyladenosine, 2'-O-methylcytidine, 2'-O-methyluridine 2′-O-methyl-5-methyluridine, 2′-O-methoxyethylguanosine, 2′-O-methoxyethyladenosine, 2′-O-methoxyethylcytidine, 2′-O-methoxyethyluridine, 2 ′ Examples of 2'-O-alkylribonucleosides such as -O-methoxyethyl-5-methylurudine It can be, but is not limited thereto.
[0008]
As the tritylating agent, a trityl halide may be used, and specific examples include dimethoxytrityl chloride, dimethoxytrityl bromide, monomethoxytrityl chloride, monomethoxytrityl bromide, trityl chloride, trityl bromide and the like. it can.
[0009]
The present invention is characterized in that one or several azole salts are used as the reaction accelerator. Examples of such azole salts include imidazole, triazole, tetrazole or derivatives or homologous hydrochlorides, nitrates, perchlorates or sulfonates. Specific examples include imidazole, benzimidazole, 1-methylimidazole, triazole or tetrazole hydrochloride, nitrate, perchlorate or sulfonate.
[0010]
Among such azole salts, sulfonates of imidazole or its derivatives are preferable, and specifically, imidazolium methanesulfonate, benzimidazolium methanesulfonate, 1-methylimidazolium methanesulfonate, imidazolium toluenesulfonate, benzine. Imidazolium toluenesulfonate, 1-methylimidazolium toluenesulfonate, imidazolium trifluoromethanesulfonate, benzimidazolium trifluoromethanesulfonate, 1-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate, imidazolium benzenesulfonate, benzimidazolium benzenesulfonate, 1-methylimidazole Examples include lithium benzene sulfonate. Of these, methanesulfonate, particularly imidazolium methanesulfonate, is preferred.
[0011]
In addition, amines are not essential for the reaction, but in many cases, the reaction is accelerated and the synthesis yield may be improved, so it is desirable to use one or several amines in combination. Examples of amines used in combination include trialkylamines such as diisopropylethylamine and triethylamine, guanidine, imidazole, 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene (DBU), 1,5-diazabicyclo [4]. , 3,0] non-5-ene (DBN), 1,4-diazabicyclo [2,2,2] octane (DABCO) and the like, particularly trialkylamines, more preferably diisopropylethylamine. Can be mentioned.
[0012]
The reaction for selectively tritylating the 5 ′ position of an unprotected nucleoside is carried out by using 1 mol of an unprotected nucleoside in a single or mixed solvent such as dimethylformamide (DMF), formamide, dimethylamine, acetonitrile, dimethyl carbonate, pyridine and the like. On the other hand, 1 to 2 mol of a tritylating agent, 0.5 to 5 mol, preferably 1 to 3 mol of a reaction accelerator, 0.5 to 5 mol, preferably 1 to 3 mol of an amine is used if necessary, and a reaction temperature of 10 The target 5′-O-trityl nucleoside can be obtained by reacting at ˜50 ° C., preferably 20˜40 ° C. for about 1-50 hours. In addition, it is preferable to perform the said reaction on non-aqueous conditions, and it is desirable to use the dried reaction solvent etc.
The 5′-O-trityl nucleosides thus obtained may be isolated and purified by the usual method of nucleosides, and specifically, may be purified by adsorption chromatography such as silica gel.
[0013]
【The invention's effect】
The method of the present invention is not a method specific to a specific nucleoside, but can be applied to all nucleosides. Furthermore, as shown in the examples below, the nucleoside 5′- It is a highly practical and versatile method that can selectively tritylate the position.
[0014]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited at all by this.
Example 1
(1) Preparation of imidazolium methanesulfonate Imidazole (34.0 g, 0.499 mol) was dissolved in methylene chloride (500 ml), and methanesulfonic acid (48.0 g, 32.4 ml,. 499 mol) was added dropwise. The precipitated crystals were collected by filtration and washed with methylene chloride (100 ml) to obtain imidazolium methanesulfonate (IMS) as colorless crystals (81.1 g, 0.494 mol, yield 99%).
[0015]
Melting point: 184-186 ° C
IR (KBr, cm ⁻¹ ): 3140, 1589, 1460, 1437, 1339, 1194
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 2.49 (s, 3H), 7.62 (s, 2H), 9.03 (s, 1H)
¹³ C-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 40.1, 119.7, 134.8
[0016]
(2) 5′-position selective dimethoxytritylation method Deoxyribonucleoside (40.0 mmol), IMS (13.1 g, 80.0 mmol), diisopropylethylamine (10.3 g, 13.9 ml, 80.0 mmol) The suspension was suspended in DMF (dry) (100 ml), and p, p′-dimethoxytrityl chloride (13.6 g, 40.0 mmol) was added in several portions, followed by stirring at room temperature for 2 hours. The obtained uniform reaction solution was poured into water (3.00 liter), and the precipitate was collected by filtration. This precipitate was purified by silica gel column chromatography to obtain 5'-O- (p, p'-dimethoxytrityl) -2'-deoxyribonucleoside. The yield and spectrum data of the obtained compound are as follows.
[0017]
5'-O- (p, p'-dimethoxytrityl) -2'-deoxyadenosine Property: colorless amorphous solid Yield: 79%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.22 (brs, 1H), 2.53 (ddd, 1H, J = 13.4, 4.0, 6.3 Hz), 2.78 (ddd, 1H) , J = 13.4, 6.0, 6.3 Hz, H-2 "), 3.40 (dd, 2H, J = 1.6, 4.4 Hz), 3.76 (s, 6H), 4 .16 (dt, 1H, J = 3.9, 4.4 Hz), 4.67 (ddd, 1H, J = 6.0, 4.0, 3.9 Hz), 5.98 (brs, 2H), 6.44 (t, 1H, J = 6.3 Hz), 6.78 (d, 4H, J = 9.3 Hz), 7.16-7.39 (m, 9H), 7.96 (s, 1H) ), 8.26 (s, 1H)
[0018]
5′-O- (p, p′-dimethoxytrityl) -2′-deoxycytidine Properties: colorless powder Yield: 76%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.01-2.10 (m, 1H), 2.39-2.48 (m, 1H), 3.22-3.34 (m, 2H), 3.63 (s, 6H), 3.86-3.91 (m, 1H), 4.32-4.38 (m, 1H), 5.41 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.10 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 6.64-6.69 (m, 5H), 7.05-7.24 (m, 11H), 7.75 (d, 1H, J = 7.3Hz)
[0019]
5'-O- (p, p'-dimethoxytrityl) -2'-deoxyguanosine Property: colorless needle yield: 78%
Melting point: 190-191 ° C
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 2.22-2.31 (m, 1H), 2.57-2.67 (m, 1H), 3.09-3.15 (m, 2H) ), 3.71 (s, 6H), 3.87-3.91 (m, 1H), 4.32-4.35 (m, 1H), 5.28 (d, 1H, J = 4.4 Hz) ), 6.12 (dd, 1H, J = 6.3, 6.8 Hz), 6.42 (brs, 2H), 6.81 (dd, 4H, J = 6.8, 8.8 Hz), 7 .17-7.34 (m, 9H), 7.76 (s, 1H), 10.58 (brs, 1H)
[0020]
5′-O- (p, p′-dimethoxytrityl) -2′-deoxythymidine Property: colorless amorphous solid yield: 82%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.12-2.19 (m, 1H), 2.24-2.29 (m, 1H), 2.57 (brs, 1H), 3.20- 3.33 (m, 2H), 3.63 (s, 6H), 3.90-3.99 (m, 1H), 4.32-4.38 (m, 1H), 6.27 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 6.68 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 7.08-7.26 (m, 10H), 7.43 (s, 1H), 8.79- 8.98 (brs, 1H)
[0021]
(3) Selective monomethoxytritylation method at 5′-position In the dimethoxytritylation method of (2), p-methoxytrityl chloride (40.0 mmol) was used instead of p, p′-dimethoxytrityl chloride. And reacted in the same manner to obtain 5′-O- (p-methoxytrityl) -2′-deoxyribonucleoside. The yield and spectrum data of the obtained compound are as follows.
[0022]
5′-O- (p-methoxytrityl) -2′-deoxyadenosine Property: colorless amorphous solid Yield: 76%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.21 (brs, 1H), 2.48-2.54 (m, 1H), 2.63-2.81 (m, 1H), 3.40 ( dd, 2H, J = 1.5, 4.4 Hz), 3.77 (s, 3H), 4.14 (dt, 1H, J = 3.9, 4.5 Hz), 4.55-4.78 (M, 1H), 5.91 (brs, 2H), 6.46 (t, 1H, J = 6.3 Hz), 6.78 (d, 2H, J = 9.1 Hz), 7.16-7 .39 (m, 12H), 7.96 (s, 1H), 8.26 (s, 1H)
[0023]
5′-O- (p-methoxytrityl) -2′-deoxycytidine Properties: colorless amorphous solid Yield: 75%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.05-2.13 (m, 1H), 2.33-2.49 (m, 1H), 3.21-3.36 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.85-3.90 (m, 1H), 4.38-4.45 (m, 1H), 5.44 (d, 1H, J = 6.7 Hz), 6.10 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 6.64-6.69 (m, 3H), 7.05-7.24 (m, 14H), 7.75 (d, 1H, J = 6.7Hz)
[0024]
5′-O- (p-methoxytrityl) -2′-deoxyguanosine Property: colorless amorphous solid Yield: 76%
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 2.20-2.30 (m, 1H), 2.54-2.63 (m, 1H), 3.12-3.18 (m, 2H) ), 3.75 (s, 3H), 3.89-4.01 (m, 1H), 4.33-4.42 (m, 1H), 5.24-5.35 (m, 1H), 6.06-6.18 (m, 1H), 6.42 (brs, 2H), 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.17-7.34 (m, 12H), 7.78 (s, 1H), 10.73 (brs, 1H)
[0025]
5′-O- (p-methoxytrityl) -2′-deoxythymidine Property: colorless amorphous solid Yield: 81%
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 2.13-2.20 (m, 1H), 2.21-2.28 (m, 1H), 2.56 (brs, 1H), 3. 15-3.31 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.85-3.98 (m, 1H), 4.35-4.44 (m, 1H), 6.25 ( t, 1H, J = 7.2 Hz), 6.65 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.08-7.26 (m, 13H), 7.46 (s, 1H), 8. 69-8.91 (brs, 1H)
[0026]
(4) 5'-position selective tritylation method In the dimethoxytritylation method of (2) above, trityl chloride (40.0 mmol) was used instead of p, p'-dimethoxytrityl chloride, and the reaction was carried out in the same manner. To give 5′-O-trityl-2′-deoxyribonucleoside. The yield and spectrum data of the obtained compound are as follows.
[0027]
5'-O-trityl-2'-deoxyadenosine Property: colorless amorphous solid Yield: 78%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.23 (brs, 1H), 2.31-2.48 (m, 1H), 2.61-2.80 (m, 1H), 3.44 ( dd, 2H, J = 1.5, 4.4 Hz), 4.14 (dt, 1H, J = 3.8, 4.4 Hz), 4.51-4.76 (m, 1H), 5.90 (Brs, 2H), 6.46 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 6.78 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.14-7.28 (m, 15H), 7 .91 (s, 1H), 8.24 (s, 1H)
[0028]
5′-O-trityl-2′-deoxycytidine Property: colorless amorphous solid Yield: 79%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , ppm): 2.08-2.14 (m, 1H), 2.37-2.45 (m, 1H), 3.24-3.33 (m, 2H), 3.87-3.93 (m, 1H), 4.33-4.41 (m, 1H), 5.44 (d, 1H, J = 6.7 Hz), 6.10 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 6.59-6.67 (m, 1 H), 7.04-7.18 (m, 16 H), 7.74 (d, 1 H, J = 7.3 Hz)
[0029]
5′-O-trityl-2′-deoxyguanosine Property: colorless amorphous solid Yield: 76%
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 2.18-2.28 (m, 1H), 2.55-2.64 (m, 1H), 3.11-3.18 (m, 2H) ), 3.88-3.98 (m, 1H), 4.35-4.42 (m, 1H), 5.23 (d, 1H, J = 4.5 Hz), 6.12 (t, 1H) , J = 6.4 Hz), 6.55 (brs, 2H), 7.12-7.26 (m, 15H), 7.81 (s, 1H), 10.31 (brs, 1H)
Elemental _{_{_{analysis: C 29 H 27 N 5 O}}} 4 Calculated: C68.36, H5.34, N13.74
Actual value: C68.50, H5.28, N13.77
[0030]
5′-O-trityl-2′-deoxythymidine Property: colorless amorphous solid Yield: 80%
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , ppm): 2.11-2.19 (m, 1H), 2.26-2.32 (m, 1H), 2.55 (brs, 1H), 3. 21-3.37 (m, 2H), 3.87-3.93 (m, 1H), 4.35-4.43 (m, 1H), 6.34 (t, 1H, J = 6.7 Hz) ), 7.08-7.23 (m, 16H), 7.42 (s, 1H), 8.75-8.92 (brs, 1H)

Claims

In the method for producing a 5′-O-trityl nucleoside by reacting an unprotected nucleoside with a tritylating agent, the reaction accelerator is selected from at least one of imidazole, benzimidazole or 1-methylimidazole as an azole salt. A method of using a trialkylamine as an amine for a sulfonic acid salt of azole.

The azole salts are imidazolium methanesulfonate, benzimidazolium methanesulfonate, 1-methylimidazolium methanesulfonate, imidazolium toluenesulfonate, benzimidazolium toluenesulfonate, 1-methylimidazolium toluenesulfonate, imidazolium trifluoromethanesulfonate, The method of claim 1, wherein the method is selected from at least one of nesimidazolium trifluoromethanesulfonate, 1-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate, imidazolium benzenesulfonate, benzimidazolium benzenesulfonate, or 1-methylimidazolium benzenesulfonate. .

The method of claim 1 wherein the azole salt is imidazolium methanesulfonate.

The process of claim 1 wherein the trialkylamine is diisopropylethylamine.

2. The method of claim 1, wherein the nucleoside is a ribonucleoside, deoxyribonucleoside or 2'-O-alkyl ribonucleoside.

The process of claim 1 wherein the tritylating agent is a trityl halide.