JP4438211B2

JP4438211B2 - Electrophoresis device

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Publication number: JP4438211B2
Application number: JP2000325104A
Authority: JP
Inventors: 伸中村
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2010-03-24
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを高速かつ高分解能に分析する電気泳動に用いる電気泳動装置に関し、さらに詳しくは板状部材の内部に形成された流路で電気泳動を行なうチップデバイスを用いる電気泳動装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動装置が用いられており、その代表的なものとしてキャピラリー電気泳動装置がある。キャピラリー電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下のガラスキャピラリー内に泳動媒体を充填し、一端側にサンプルを導入した後、両端間に高電圧を印加して分析対象物をキャピラリー内で展開させるものである。キャピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高いことから、高電圧の印加が可能となり、ＤＮＡなどの極微量サンプルを高速かつ高分解能にて分析することができる。
【０００３】
キャピラリーはその外径が１００〜５００μｍ程度と細く破損しやすいため、ユーザーが行なうべきキャピラリー交換時の取扱いが容易でないという問題を有する。そこで、取扱いが煩雑なキャピラリーに代わって、分析の高速化、装置の小型化が期待できる形態として、D. J. Harrison et al./ Anal. Chem. 1993, 283, 361-366に示されているように、２枚の基板を接合して形成された電気泳動チップ（マイクロチップという）が提案されている。そのマイクロチップの例を図７に示す。
【０００４】
マイクロチップ１は、一対の透明板状の無機材料（例えばガラス、石英、シリコンなど）又はプラスチックからなる基板１ａ，１ｂからなり、半導体フォトリソグラフィー技術又はマイクロマシニング技術により、一方の基板１ｂの表面に互いに交差する泳動用キャピラリー溝３，５を形成し、他方の基板１ａにはその溝３，５の端に対応する位置に貫通穴をアノードリザーバ７ａ、カソードリザーバ７ｃ、サンプルリザーバ７ｓ、ウエイストリザーバ７ｗとして設けたものである。マイクロチップ１は、両基板１ａ，１ｂを（Ｃ）に示すように重ねて接合した状態で使用される。このようなマイクロチップは２本の溝（channel）が交差して形成されていることから、Cross-channel Micro-chipとも呼ばれる。
【０００５】
このマイクロチップ１を用いて電気泳動を行なう場合には、分析に先立って、例えばシリンジを使った圧送により、いずれかのリザーバ、例えばアノードリザーバ７ａから溝３，５内及びリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗ内に泳動媒体を充填する。次いで、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗ内に充填された泳動媒体を除去し、短い方の溝（サンプル注入用流路）３の一方の端に対応するサンプルリザーバ７ｓにサンプルを注入し、他のリザーバ７ａ、７ｃ，７ｗにバッファ液を注入する。
【０００６】
泳動媒体、サンプル及びバッファ液を注入したマイクロチップ１を電気泳動装置に装着する。各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに所定の電圧を印加し、サンプルを溝３中に泳動させて両溝３，５の交差部９に導く。各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに印加する電圧を切り換えて、長い方の溝（分離用流路）５の両端のリザーバ７ａ，７ｃ間の電圧により、交差部分９に存在するサンプルを溝５内に注入する。溝５内にサンプルを注入した後、リザーバ７ｓ内に収容されているサンプルをバッファ液で置換する。その後、各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに電気泳動用の電圧を印加して、溝５内に注入したサンプルを溝５内で分離させる。溝５の適当な位置に検出器を配置しておくことにより、電気泳動により分離されたサンプルを検出する。検出は、吸光光度法や蛍光光度法、電気化学的又は電気伝導度法などの手段により行なわれる。
【０００７】
また、マイクロチップの流路デザインや泳動媒体の組成などの分析条件は、用途やサンプルに応じて異なる。他の流路デザインのマイクロチップとしては、例えば、Yining Shi et al./ Anal. Chem. 1999, 71, 5354-5361に示されているように、放射状に多数の分離用流路を備えた電気泳動用マイクロプレートがある。近年はマイクロチップよりもサイズの大きいものや、複数のチャンネルを備えたもの、さらにはチャンネルの交差部をもたないストレートチャンネルを備えたものも使用されている。本発明におけるチップデバイスはこれらを全て包含したものである。
【０００８】
マイクロチップを用いる電気泳動装置においては、サンプルリザーバに注入されたサンプルをサンプル導入用流路と分離用流路との交差部に導くために電圧を印加する際にサンプル導入用流路全体でサンプル分布が均一になる、すなわちサンプル導入用流路と分離用流路との交差部に十分な量のサンプルが導かれるインジェクション条件、例えば流路の両端に印加する電圧の大きさやその電圧印加時間、温度などを流路デザインやサンプルごとに検討しなければならない。従来、インジェクション条件の検討は、電気泳動装置とは別のモニター装置を用いて行なっていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、電気泳動装置にマイクロチップを設置し、上記モニター装置を用いて得られたインジェクション条件によりマイクロチップのサンプル導入用流路と分離用流路との交差部へサンプルを導くための電圧を印加するとき、何らかの不具合によりサンプルがサンプル導入用流路全体で均一にならないことがある。サンプル導入用流路でのサンプル分布が均一でない状態でサンプルを分離用流路に注入して分離した測定結果は信用性に欠けるが、サンプルを分離用流路に注入するときのサンプル導入用流路でのサンプル分布を確認することはできなかった。
そこで本発明は、電気泳動装置の測定結果の信頼性を向上させることを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の電気泳動装置は、板状部材の内部に流路が形成され、その板状部材の一表面の流路に対応する位置に流路に達する穴がリザーバとして形成されたチップデバイスを用い、流路の両端側に電圧を印加するための電圧供給機構と、流路内で分離されたサンプルを検出するための検出機構とを備えた電気泳動装置であって、少なくともサンプルが流路に注入される部位のサンプルを検出するサンプル注入モニター機構をさらに備えるものである。
【００１１】
電圧供給機構によりサンプルを流路へ導くための電圧を供給した後、サンプル注入モニター機構により、少なくともサンプルが流路に注入される部位のサンプルを検出する。例えば、流路として互いに交差するサンプル注入用流路と分離用流路が形成されているチップデバイスを用いた場合、サンプルが流路に注入される部位のサンプルを検出することにより、サンプル注入用流路と分離用流路との交差部に分離に十分な量のサンプルが導かれているか否かを知ることができる。さらに、サンプル注入用流路でのサンプル分布を監視することにより、インジェクション条件の検討を行なうこともできる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
サンプル注入モニター機構及び検出機構はそれぞれ蛍光検出光学系を備えたものであり、それらの蛍光検出光学系は共通の励起光源を有するものであることが好ましい。その結果、それぞれ励起光源を備えた場合に比べて、装置の大きさを小さくすることができ、さらに装置の価格及びランニングコストを低減することができる。
【００１３】
サンプル注入モニター機構はＬＥＤ（Light Emitting Device、発光ダイオード）を光源とする検出光学系を備えたものであることが好ましい。その結果、光源自体が安価になるのでサンプル注入モニター機構を安価に構築することができる。さらに、サンプルが流路に注入される部位のレイアウトに合わせてＬＥＤアレイを配置するようにすれば、複雑な照射用の光学系を設ける必要がないので、サンプル注入モニター機構をさらに安価に構築することができる。
【００１４】
用いるチップデバイスは流路として互いに交差するサンプル注入用流路と分離用流路とを備えているものであり、電圧供給機構によりサンプルをサンプル注入用流路と分離用流路との交差部へ導くための電圧を供給した後、サンプル注入モニター機構により検出したサンプル注入用流路の所定範囲でのサンプル分布が所定時間を経過しても均一にならないときに装置を一旦停止させる制御部をさらに備えることが好ましい。
【００１５】
用いるチップデバイスは流路として互いに交差するサンプル注入用流路と分離用流路とを備えているものであり、電圧供給機構によりサンプル分離用の泳動電圧を印加したときにサンプル注入モニター機構により検出したサンプル注入用流路と分離用流路との交差部に存在するサンプルが分離用流路内へ泳動しないときに装置を一旦停止させる制御部をさらに備えることが好ましい。
これらの制御部を備えることにより、サンプルの泳動の良否を自動で判定して泳動の管理を行なうことができる。
【００１６】
【実施例】
図１は本発明にかかる電気泳動装置の一実施例を示す概略構成図である。図１に示すマイクロチップ１は図７のものと同じである。
マイクロチップ１はリザーバが形成された表面を上方にしてチップ保持台（図示は省略）に保持されている。チップ保持台にはチップ１の温度を調節する温調機構が備えられている。
【００１７】
後述する分離ピーク検出光学系とサンプルインジェクションモニター光学系で共通の励起光源レーザ装置１１が設けられている。レーザ装置１１としては、例えばアルゴン（Ａｒ）レーザやクリプトン（Ｋｒ）レーザ、ヘリウムネオン（Ｈｅ-Ｎｅ）レーザ、ネオジム（Ｎｄ）-ＹＡＧ（Ｙ₃Ａｌ₅Ｏ₁₂）などのＮｄイオン固体レーザ、半導体レーザ（Laser Diode：ＬＤ）、光第２高調波発生（ＳＨＧ）現象を利用した固体レーザなど、種々のレーザ装置を用いることができる。
【００１８】
レーザ装置１１からの励起光の光路にはその励起光を平行光にするビームエキスパンダ１３が設けられている。ビームエキスパンダ１３からの励起光の光路には、その光路上に位置する実線位置とその光路から外れた破線位置の間で移動される可動反射ミラー１５が設けられている。
可動反射ミラー１５に反射された励起光の光路にはその励起光を広げるレンズ１７が設けられている。レンズ１７からの励起光の光路には、チップ１の底面側（リザーバが形成された表面とは反対側）に配置され、レンズ１７からの励起光をチップ１の底面側へ反射するダイクロイックミラー１９が設けられている。ダイクロイックミラー１９は励起光を反射し、チップ１側からの蛍光を透過するような波長特性のものを用いる。
【００１９】
ダイクロイックミラー１９のチップ１とは反対側に、分光フィルター２１が設けられている。分光フィルター２１はダイクロイックミラー１９を透過したチップ１からの蛍光のうち、所定の蛍光波長の光のみを透過するものである。ダイクロイックミラー１９及び分光フィルター２１の仕様は、サンプルの標識に使用する蛍光物質とレーザ装置１１が発振する励起光の波長により決定される。
【００２０】
分光フィルター２１を透過した蛍光の光路にはその蛍光をＣＣＤ（Charge Coupled Device）２５の受光面に結像するためのレンズ２３が設けられている。
ＣＣＤ２５には、ＣＣＤ２５の動作を制御し、ＣＣＤ２５の検出信号を処理するためのＣＰＵ（中央演算処理装置）２７が電気的に接続されている。
可動反射ミラー１５、ダイクロイックミラー１９、分光フィルター２１、レンズ２３及びＣＣＤ２５はサンプルインジェクションモニター光学系２９を構成する。モニター光学系２９は、チップ１のサンプル導入用流路３及び分離用流路５における蛍光標識を検出して流路３，５でのサンプル分布を検出する。
【００２１】
モニター光学系２９において、少なくともサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部周辺に励起光を照射できるのであれば、ビームエキスパンダ１３の出力光の径とチップ１の流路デザインによっては、レンズ１７はなくてもよい。本発明を構成するサンプル注入モニター機構は、レーザ装置１１、ビームエキスパンダ１３、ＣＰＵ２７及びモニター光学系２９により構成される。
【００２２】
可動反射ミラー１５が破線位置に位置するときのビームエキスパンダ１３からの励起光の光路には反射ミラー３１が設けられている。反射ミラー３１に反射された励起光の光路には、チップ１の表面側（リザーバが形成された側）に配置され、反射ミラー３１からの励起光をチップ１の表面側へ反射するダイクロイックミラー３３が設けられている。ダイクロイックミラー３３は励起光を反射し、チップ１側からの蛍光を透過するような波長特性のものを用いる。
【００２３】
ダイクロイックミラー３３に反射された励起光の光路には、その励起光をチップ１の分離用流路５の検出位置に集光する対物レンズ３５が設けられている。
ダイクロイックミラー３３の対物レンズ３５とは反対側に分光器３７が設けられている。分光器３７は対物レンズ３５及びダイクロイックミラー３３を通過したチップ１からの蛍光を分光する。分光器３７としては例えば分光フィルターパネルとウェッジプリズムを組み合わせたものや、通過型グレーティングなどを用いることができる。
【００２４】
分光器３７を透過した蛍光の光路にはその蛍光をＣＣＤ４１の受光面に結像するためのレンズ３９が設けられている。
ＣＣＤ４１には、ＣＣＤ４１の動作を制御し、ＣＣＤ４１の検出信号を処理するためのＣＰＵ４３が電気的に接続されている。
反射ミラー３１、ダイクロイックミラー３３、対物レンズ３５、分光器３７、レンズ３９及びＣＣＤ４１は分離ピーク検出光学系４５を構成する。検出光学系４５は、チップ１の分離用流路５の検出位置における蛍光標識を検出して分離したサンプルを検出するものである。分光器３７により検出位置からの光を分光することにより、複数種類の蛍光波長を検出することができる。
本発明を構成する検出機構は、レーザ装置１１、ビームエキスパンダ１３、ＣＰＵ４３及び検出光学系４５により構成される。
【００２５】
チップ１の表面側に、チップ１のリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに収容された液に電圧を印加するための電極４７がリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗごとに設けられている。各電極４７は電極４７に電圧を供給するための高電圧供給部４９に電気的に接続されている。高電圧供給部４９は、図示は省略されているがＣＰＵ２７に電気的に接続されており、高電圧供給部４９の動作はＣＰＵ２７により制御される。
本発明を構成する電圧供給機構は電極４７及び高電圧供給部４９により構成され、本発明を構成する制御部はＣＰＵ２７により実現される。
【００２６】
図２はこの実施例の動作を示すフローチャートである。図３はチップ１の平面図及びサンプル導入時のサンプル注入用流路と分離用流路との交差部内を示す拡大図である。図１から図３を参照してこの実施例の動作を説明する。
サンプル注入用流路３及び分離用流路５内に泳動媒体を充填し、リザーバ７ａ，７ｃ，７ｗにバッファ液を注入し、リザーバ７ｓにサンプルを注入したチップ１をチップ保持台に設置する（ステップＳ１）。
電極４７をリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗ内に進入させ、予め検討されたインジェクション条件よって高電圧供給部４９により電極４７を介して各リザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗにサンプル導入用の電圧を印加する（ステップＳ２）。リザーバ７ｓに注入されたサンプルはサンプル導入用流路３内に広がり始める。
【００２７】
モニター光学系２９を使用してサンプル導入用流路３内のサンプル分布を監視する（ステップＳ３）。
その動作を説明すると、まず可動反射ミラー１５を実線位置に移動させ、レーザ装置１１から励起光を発振させる。レーザ装置１１からの励起光をビームエキスパンダ１３により平行光にする。平行光にされた励起光を可動反射ミラー１５により反射し、モニター光学系２９内へ入射する。可動反射ミラー１５からの励起光をレンズ１７により広げ、さらにダイクロイックミラー１９により反射してチップ１の裏面側に照射する。これにより、励起光はサンプル導入用流路３全体及び分離用流路５全体に照射される。
分光フィルター２１により、ダイクロイックミラー１９を介して分光フィルター２１に照射されたチップ１からの蛍光のうち所定波長の蛍光のみをレンズ２３側へ透過させ、透過した蛍光をレンズ２３によりＣＣＤ２５に結像させる。ＣＰＵ２７によりＣＣＤ２５の検出信号をイメージファイルにデータ変換し、サンプル分布を監視する。
【００２８】
ＣＰＵ２７によりサンプル導入用流路３内でサンプル分布が均一になったか否かを判定する（ステップＳ４）。これにより、交差部９に分離及び検出に十分な量のサンプルが導かれたか否かを判定する。
ステップＳ４でサンプル分布が均一になっていないと判定したとき（Ｎｏ）は、サンプル導入用の電圧の印加から所定時間が経過したか否かを判断する（ステップＳ５）。所定時間が経過していないとき（Ｎｏ）はステップＳ４に戻る。所定時間が経過したとき（Ｙｅｓ）は、ＣＰＵ２７により高電圧供給部４９を制御して電圧の印加を停止させ、リカバールーチン又は次の実行モードへ移行する。
【００２９】
図３中で交差部９の拡大図に示すように、サンプル分布がサンプル導入用流路３内で均一になり、ステップＳ４でサンプル分布が均一になったと判定したとき（Ｙｅｓ）、高電圧供給部４９によりリザーバ７ａ，７ｃ，７ｓ，７ｗに印加する電圧を切り換えて、サンプル分離用の泳動電圧を印加してサンプルの分離泳動を開始する（ステップＳ６）。
このとき、ＣＰＵ２７はモニター光学系２９を使用したサンプル導入用流路３内のサンプル分布の監視を継続しており、交差部９に存在するサンプルが分離用流路５内に注入されたか否かを判定する（ステップＳ７）。
ステップＳ７で分離用流路５にサンプルが注入されないと判定したとき（Ｎｏ）は、ＣＰＵ２７により高電圧供給部４９を制御して電圧の印加を停止させ、リカバールーチン又は次の実行モードへ移行する。
ステップＳ８で分離用流路５にサンプルが注入されたと判定したとき（Ｙｅｓ）は、そのまま泳動電圧の印加を継続し、サンプルの分離泳動を行なう。
【００３０】
検出光学系４５を使用して、検出位置に到達したサンプルの検出を行なう（ステップＳ８）。
その動作を説明すると、ステップＳ８で分離用流路５へのサンプルの注入を確認した後、可動ミラー１５を破線位置へ移動させて、ビームエキスパンダ１３からの励起光を反射ミラー３１に照射する。ビームエキスパンダ１３からの励起光を反射ミラー３１により反射し、検出光学系４５内へ入射する。可動反射ミラー１５からの励起光をダイクロイックミラー３３によりチップ１の表面側へ反射し、対物レンズ３５により集光してチップ１の表面側から分離用流路５の検出位置に照射する。
【００３１】
分離用流路５の検出位置からの蛍光は対物レンズ３５及びダイクロイックミラー３３を介して分光器３７に照射される。分光器３７により分離用流路５の検出位置からの蛍光を分光し、その分光された蛍光をレンズ３９によりＣＣＤ４１に結像させる。ＣＰＵ４３によりＣＣＤ４１の検出信号をイメージファイルにデータ変換して波形処理を行ない、分離したサンプルの検出を行なう。
サンプルの分離終了後、高電圧供給機構４９による電圧の供給を停止する。
【００３２】
このように、モニター光学系２９を備え、モニター光学系２９を使用してサンプル導入用流路３内、特にサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部９周辺のサンプル分布を監視することにより、図２のステップＳ４で、サンプルを交差部９に導くための電圧をリザーバ間に印加しているときに交差部９に十分な量のサンプルが導かれたか否かを判定することができるので、交差部９に十分な量のサンプルが導かれない場合は測定を中止することにより、測定結果の信頼性を向上させることができる。さらに、図２のステップＳ８で、交差部９に存在するサンプルが分離用流路５内に導入され、泳動しているか否かを判定することができるので、サンプルが泳動市内場合は測定を中止することにより、測定結果の信頼性を向上させることができる。
【００３３】
この実施例はサンプルのインジェクション条件の検討を行なうこともできる。チップ１の温度、電圧供給機構４９による各リザーバへの供給電圧、各リザーバへの電圧印加時間を変更し、モニター光学系２９を使用して各条件におけるサンプル導入用流路３内のサンプル分布を監視する。これにより、最適なインジェクション条件を検討することができる。
【００３４】
この実施例では励起光源としてのレーザ装置１１を１つのみ備えているが、本発明はこれに限定されるものではなく、モニター光学系２９用の励起光源と検出光学系４５用の励起光源をそれぞれ設けてもよい。その場合、可動反射ミラー１５及び反射ミラー３１は不要である。
また、この実施例ではモニター光学系２９用のＣＰＵ２７と検出光学系４５用のＣＰＵ４３をそれぞれ設けているが、１つのＣＰＵによりＣＰＵ２７，４３の機能を実現するようにしてもよい。
【００３５】
また、この実施例では、サンプル注入モニター機構を構成するモニター光学系２９はサンプル導入用流路３全体及び分離用流路５全体を検出範囲としているが、本発明はこれに限定されるものではなく、サンプル注入モニター機構はサンプル導入用流路と分離用流路との交差部を含むサンプル導入用流路の一部分又は全体を検出範囲とするものであればよい。
【００３６】
図１に示す実施例では１本の分離用流路５が形成されたマイクロチップ１を用いているが、本発明はこれに限定されるものではなく、多数の分離用流路が形成されたチップデバイスを用いた電気泳動に適用することもできる。
図４は、多数の分離用流路が形成されたマイクロチップを示す上面図である。マイクロチップ５１は、一対の透明板状の無機材料（例えばガラス、石英、シリコンなど）又はプラスチックからなる基板５１ａ，５１ｂにより構成される。
【００３７】
一方の基板５１ｂの表面には、半導体フォトリソグラフィー技術又はマイクロマシニング技術により、互いに交差するサンプル導入用流路５３及び分離用流路５５の組が８組形成されている。８組の流路５３，５５は、他の組の流路と交差しないように、サンプル導入用流路５３と交差する側とは反対側の分離用流路５５の一端側を要として扇型に配置されている。サンプル導入用流路５３はチップ５１の面積縮小のために鉤型に形成されている。
【００３８】
他方の基板５１ａには流路５３，５５の端に対応する位置にアノードリザーバ５７ａ、カソードリザーバ５７ｃ、サンプルリザーバ５７ｓ、ウエイストリザーバ５７ｗとしての貫通穴が形成されている。リザーバ５７ｃ，５７ｓ，５７ｗは流路５３，５５の組ごとに設けられている。アノードリザーバ５７ａは扇型配置の要側の各組の分離用流路５５の一端側で共通である。
【００３９】
チップ５１は、両基板５１ａ，５１ｂを重ねて接合した状態で使用される。チップ５１での分離サンプルの検出位置は、扇型配置の要側の各組の分離用流路５５の一端側付近である。
このようなマイクロチップは、多数の分離用流路が形成されていることから、Multi-channel Micro-chipとも呼ばれる。
【００４０】
図１に示す電気泳動装置にチップ５１を設置して測定を行なう場合、装置の電極４７はリザーバ５７ａ，５７ｃ，５７ｓ，５７ｗの配置に対応して設ける必要がある。さらに、検出光学系４５に関し、例えば反射ミラー３１とダイクロイックミラー３３の間の光路にガルバノミラーやＡＯＤ（Acousto-Optics Device）などのビームスキャニング素子を設けて帯状の検出位置で励起光を走査できるようにし、分光器３７、レンズ３９及びＣＣＤ４１を８本の分離用流路５５を区別して検出できるものに変更する必要がある。
そのように変更してチップ５１に対応した図１に示す電気泳動装置を用いて電気泳動を行なうようにすれば、モニター光学系２９を使用して、サンプル導入用流路５３内のサンプル分布の様子や分離用流路５５へのサンプルの泳動を監視することができる。
【００４１】
図５は、サンプルを蛍光波長の異なる４種類の蛍光物質で標識し、チップ５１を用いて分離検出したときの検出信号を示す図である。横軸（ｘ軸）は分離用流路５５の番号（チャンネル番号）、縦軸（ｙ軸）は４種類の分光スペクトルを示す。図５では４本の分離用流路５５の検出信号を示している。
図５中の丸印は検出位置でかつ分光された蛍光の強度を示す。
【００４２】
チップ５１の各サンプルリザーバ５７ｓに異なるサンプルをそれぞれ注入し、各リザーバに電圧を印加してサンプルを各組のサンプル導入用流路５３と分離用流路５５との交差部に導いた後、各リザーバに泳動電圧を印加して交差部に存在するサンプルを分離用流路５５へ注入する。各分離用流路５５では、サンプルが分離されつつアノードリザーバ５７ａ側へ泳動される。分離され、検出位置に到達したサンプル成分を４種類の蛍光物質で識別する。
【００４３】
図６は本発明にかかる電気泳動装置の他の実施例を示す概略構成図である。図６に示すマイクロチップ１は図７のものと同じである。図１と同じ部分には同じ符号を付し、その部分の説明は省略する。
チップ１はチップ保持台（図示は省略）に保持されている。励起光源レーザ装置１１、ビームエキスパンダ１３、ＣＰＵ４３、分離ピーク検出光学系４５を構成する反射ミラー３１、ダイクロイックミラー３３、対物レンズ３５、分光器３７及びＣＣＤ４１、並びに電極４７及び高電圧供給部４９は図１の実施例と同じである。ただし、サンプルリザーバ及びウエイストリザーバに対応する電極４７の図示は省略されている。また、反射ミラー３１を省略して、ビームエキスパンダ１３からの励起光をダイクロイックミラー３３に直接入射するようにしてもよい。
【００４４】
チップ１の表面側のサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部９に対応する位置に励起光源としてのＬＥＤ５９が配置されている。ＬＥＤ８としては、例えば発振周波数４８０ｎｍの青色ＬＥＤを用いることができる。ただし、本発明で用いるＬＥＤは青色ＬＥＤに限定されるものではなく、用いる蛍光物質に応じて他の色、すなわち他の波長の光を発光するＬＥＤを用いることができる。
【００４５】
チップ１の裏面側のサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部９に対応する位置に分光フィルター６１が配置されている。分光フィルター６１はチップ１の交差部９周辺からの蛍光のうち、所定の蛍光波長の光のみを透過するものである。分光フィルター６１の仕様は、サンプルの標識に使用する蛍光物質とＬＥＤ５９が発光する励起光の波長により決定される。
【００４６】
分光フィルター６１を透過した蛍光の光路にはその蛍光をＣＣＤ６５の受光面に結像するためのレンズ６３が設けられている。
ＣＣＤ６５には、ＣＣＤ６５の動作を制御し、ＣＣＤ６５の検出信号を処理するためのＣＰＵ６７が電気的に接続されている。
ＬＥＤ５９、分光フィルター６１、レンズ６３及びＣＣＤ６５はサンプルインジェクションモニター光学系２９ａを構成する。モニター光学系２９ａは、チップ１のサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部９周辺における蛍光標識を検出して交差部９付近の流路３，５でのサンプル分布を検出する。
【００４７】
モニター光学系２９において、少なくともサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部周辺に励起光を照射できるのであれば、ビームエキスパンダ１３の出力光の径とチップ１の流路デザインによっては、レンズ１７はなくてもよい。
本発明を構成するサンプル注入モニター機構は、レーザ装置１１、ビームエキスパンダ１３、ＣＰＵ２７及びモニター光学系２９により構成される。
【００４８】
この実施例では、サンプルリザーバに注入されたサンプルを交差部９に導くための電圧をリザーバ間に印加しているときに、ＬＥＤ５９を点灯させ、モニター光学系２９ａを使用してサンプル導入用流路３内、特にサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部９周辺のサンプル分布を監視する。これにより、図１の実施例と同様に、交差部９に十分な量のサンプルが導かれたか否かを判定することができるので、測定結果の信頼性を向上させることができる。
また、この実施例をサンプルのインジェクション条件の検討に使用することもできる。
【００４９】
この実施例ではモニター光学系２９ａ用のＣＰＵ６７と検出光学系４５用のＣＰＵ４３をそれぞれ設けているが、１つのＣＰＵによりＣＰＵ４３，６７の機能を実現するようにしてもよい。
また、この実施例では、シングルチャンネルのチップ１を用いているが、マルチチャンネルのチップデバイスにも適用できる。例えば図４に示すチップ５１を用いる場合、サンプル導入用流路５３と分離用流路５５との交差部の位置に対応して８個のＬＥＤを並べて配置することにより、各交差部にそれぞれ励起光を照射し、に各交差部におけるサンプル分布を監視することができる。
【００５０】
また、この実施例では、チップ１のサンプル導入用流路３と分離用流路５との交差部９の位置に対応してＬＥＤ５９を配置し、ＬＥＤ５９からの励起光を交差部９に直接照射しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、ＬＥＤ５９とチップ１との間に集光レンズを配置し、その集光レンズを介して交差部９にＬＥＤ５９からの励起光を照射したり、図１に示す構成において可動反射ミラー１５をなくし、レンズ１７のダイクロイックミラー１９とは反対側にＬＥＤを配置し、レンズ１７及びダイクロイックミラー１９を介してＬＥＤからの励起光を照射したりするなど、ＬＥＤからの励起光を光学系を介してチップ１に照射するようにしてもよい。
【００５１】
本発明による電気泳動装置で使用できるマイクロチップは、図４及び図７に示すものに限定されるものではなく、例えば、交差する流路が存在しない分離用流路が形成されたものや、分離用流路に複数の流路が交差して形成されているもの、大型のものなど、種々の流路デザインのマイクロチップを用いることができる。但し、チップデバイスの流路デザインに対応して、電圧供給機構、検出機構及びサンプル注入モニター機構の構成の変更が必要である。
上記実施例では、サンプル注入モニター機構及び検出機構として蛍光検出光学系を備えたものを用いているが、本発明はこれに限定されるものではなく、サンプル注入モニター機構及び検出機構は、吸光光度法や電気伝導度法など、他の手段により検出を行なう機構を用いてもよい。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の電気泳動装置では、少なくともサンプル注入用流路と分離用流路との交差部を含むサンプル注入用流路におけるサンプル分布を検出するサンプル注入モニター機構をさらに備えているので、電圧供給機構によりサンプルを交差部へ導くための電圧を供給した後、サンプル注入用流路と分離用流路との交差部に分離に十分な量のサンプルが導かれているか否かを知ることができ、測定結果の信頼性が向上する。さらに、インジェクション条件の検討を行なうこともできるようになる。
【００５３】
サンプル注入モニター機構及び検出機構はそれぞれ蛍光検出光学系を備えたものであり、それらの蛍光検出光学系は共通の励起光源を有するようにすれば、それぞれ励起光源を備えた場合に比べて、装置の大きさを小さくすることができ、さらに装置の価格及びランニングコストを低減することができる。
【００５４】
サンプル注入モニター機構としてＬＥＤを光源とする検出光学系を備えたものを用いるようにすれば、光源自体が安価になるのでサンプル注入モニター機構を安価に構築することができ、さらに、サンプルが流路に注入される部位のレイアウトに合わせてＬＥＤアレイを配置するようにすれば、複雑な照射用の光学系を設ける必要がないので、サンプル注入モニター機構をさらに安価に構築することができる。
【００５５】
用いるチップデバイスは流路として互いに交差するサンプル注入用流路と分離用流路とを備えているものであり、電圧供給機構によりサンプルをサンプル注入用流路と分離用流路との交差部へ導くための電圧を供給した後、サンプル注入モニター機構により検出したサンプル注入用流路の所定範囲でのサンプル分布が所定時間を経過してもサンプル注入用流路の所定範囲で均一にならないときに装置を一旦停止させる制御部をさらに備えるようにすれば、サンプルの泳動の良否を自動で判定して泳動の管理を行なうことができる。
【００５６】
用いるチップデバイスは流路として互いに交差するサンプル注入用流路と分離用流路とを備えているものであり、電圧供給機構によりサンプル分離用の泳動電圧を印加したときにサンプル注入モニター機構により検出したサンプル注入用流路と分離用流路との交差部に存在するサンプルが分離用流路内へ泳動しないときに装置を一旦停止させる制御部をさらに備えるようにすれば、サンプルの泳動の良否を自動で判定して泳動の管理を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一実施例を示す概略構成図である。
【図２】同実施例の動作を示すフローチャートである。
【図３】マイクロチップの平面図、及びサンプル導入時のサンプル注入用流路と分離用流路との交差部内を示す拡大図である。
【図４】多数の分離用流路が形成されたマイクロチップを表す図であり、（Ａ）は一方の基板の上面図、（Ｂ）は他方の基板の上面図、（Ｃ）は両基板を重ね合わせた状態での上面図である。
【図５】サンプルを蛍光波長の異なる４種類の蛍光物質で標識し、図４のマイクロチップを用いて分離検出したときの検出信号を示す図である。
【図６】他の実施例を示す概略構成図である。
【図７】マイクロチップの一例を表す図であり、（Ａ）は一方の基板の上面図、（Ｂ）は他方の基板の上面図、（Ｃ）は両基板を重ね合わせた状態での側面図である。
【符号の説明】
１マイクロチップ
３サンプル注入用流路
５分離用流路
７ａアノードリザーバ
７ｃカソードリザーバ
７ｓサンプルリザーバ
７ｗウエイストリザーバ
１１励起光源レーザ装置
１３ビームエキスパンダ
１５可動反射ミラー
１７，２３，３９，６９レンズ
１９，３３ダイクロイックミラー
２１，６１分光フィルター
２５，４１，６５ＣＣＤ
２７，４３，６７ＣＰＵ
２９サンプルインジェクションモニター光学系
３７分光器
４５分離ピーク検出光学系
４７電極
４９高電圧供給部
５９ＬＥＤ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an electrophoresis apparatus for use in electrophoresis for analyzing extremely small amounts of proteins, nucleic acids, drugs, etc. at high speed and with high resolution, and more specifically, a chip for performing electrophoresis in a flow path formed inside a plate-like member. The present invention relates to an electrophoresis apparatus using a device.
[0002]
[Prior art]
In the case of analyzing a very small amount of protein or nucleic acid, an electrophoresis apparatus has been conventionally used, and a typical example is a capillary electrophoresis apparatus. A capillary electrophoresis apparatus is a device in which an electrophoresis medium is filled in a glass capillary having an inner diameter of 100 μm or less, a sample is introduced into one end side, and then a high voltage is applied between both ends to develop an analyte in the capillary. is there. Since the capillary has a large surface area relative to the volume, that is, the cooling efficiency is high, it is possible to apply a high voltage, and it is possible to analyze a trace amount sample such as DNA with high speed and high resolution.
[0003]
Since the capillary has a thin outer diameter of about 100 to 500 μm and easily breaks, it has a problem that it is not easy to handle at the time of replacement of the capillary to be performed by the user. Therefore, as shown in DJ Harrison et al./ Anal. Chem. 1993, 283, 361-366, a form that can be expected to speed up analysis and reduce the size of the apparatus instead of capillaries that are complicated to handle. An electrophoresis chip (referred to as a microchip) formed by joining two substrates has been proposed. An example of the microchip is shown in FIG.
[0004]
The microchip 1 includes a pair of transparent plate-like inorganic materials (for example, glass, quartz, silicon, etc.) or substrates 1a and 1b made of plastic, and is applied to the surface of one substrate 1b by a semiconductor photolithography technique or a micromachining technique. The capillary grooves for electrophoresis 3 and 5 intersecting each other are formed, and through holes are formed in the other substrate 1a at positions corresponding to the ends of the grooves 3 and 5, anode reservoir 7a, cathode reservoir 7c, sample reservoir 7s, waste reservoir 7w. Is provided. The microchip 1 is used in a state where both the substrates 1a and 1b are overlapped and bonded as shown in FIG. Such a microchip is also called a cross-channel micro-chip because two channels are formed intersecting each other.
[0005]
When electrophoresis is performed using this microchip 1, prior to analysis, for example, by pressure feeding using a syringe, any one of the reservoirs, for example, the anode reservoir 7a to the grooves 3, 5 and the reservoirs 7a, 7c, 7s 7w is filled with the electrophoresis medium. Next, the electrophoresis medium filled in the reservoirs 7a, 7c, 7s and 7w is removed, and the sample is injected into the sample reservoir 7s corresponding to one end of the shorter groove (sample injection channel) 3, and the other The buffer solution is injected into the reservoirs 7a, 7c and 7w.
[0006]
The microchip 1 into which the electrophoresis medium, the sample, and the buffer solution are injected is attached to the electrophoresis apparatus. A predetermined voltage is applied to each of the reservoirs 7 a, 7 c, 7 s, 7 w, the sample is migrated into the groove 3, and is guided to the intersection 9 between the grooves 3, 5. The voltage applied to each of the reservoirs 7a, 7c, 7s, 7w is switched, and the sample present at the intersection 9 is changed to the groove 5 by the voltage between the reservoirs 7a, 7c at both ends of the longer groove (separation channel) 5. Inject into. After injecting the sample into the groove 5, the sample accommodated in the reservoir 7s is replaced with a buffer solution. Thereafter, a voltage for electrophoresis is applied to each of the reservoirs 7 a, 7 c, 7 s, 7 w, and the sample injected into the groove 5 is separated in the groove 5. By disposing a detector at an appropriate position in the groove 5, the sample separated by electrophoresis is detected. Detection is carried out by means such as absorptiometry, fluorometry, electrochemical or electrical conductivity.
[0007]
The analysis conditions such as the flow path design of the microchip and the composition of the electrophoresis medium vary depending on the application and sample. For example, Yining Shi et al./ Anal. Chem. 1999, 71, 5354-5361 is an example of a microchip having another flow path design. There is a microplate for electrophoresis. In recent years, those having a size larger than that of a microchip, those having a plurality of channels, and those having a straight channel having no channel intersection have been used. The chip device in the present invention includes all of them.
[0008]
In an electrophoresis apparatus using a microchip, when a voltage is applied to guide the sample injected into the sample reservoir to the intersection between the sample introduction channel and the separation channel, the sample is introduced in the entire sample introduction channel. An injection condition in which the distribution is uniform, that is, a sufficient amount of sample is guided to the intersection of the sample introduction channel and the separation channel, for example, the magnitude of the voltage applied to both ends of the channel and the voltage application time, The temperature must be considered for each channel design and sample. Conventionally, injection conditions have been examined using a monitor device different from the electrophoresis device.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, a microchip is installed in the electrophoresis device, and a voltage is applied to guide the sample to the intersection of the microchip sample introduction channel and the separation channel according to the injection conditions obtained using the monitor device. When doing so, the sample may not be uniform over the entire sample introduction channel due to some problem. Although the measurement result obtained by injecting and separating the sample into the separation channel in a state where the sample distribution in the sample introduction channel is not uniform is not reliable, the sample introduction flow when the sample is injected into the separation channel The sample distribution on the road could not be confirmed.
In view of the above, an object of the present invention is to improve the reliability of the measurement result of the electrophoresis apparatus.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The electrophoresis apparatus of the present invention uses a chip device in which a channel is formed inside a plate-shaped member, and a hole reaching the channel is formed as a reservoir at a position corresponding to the channel on one surface of the plate-shaped member. An electrophoretic apparatus comprising a voltage supply mechanism for applying a voltage to both ends of a flow path and a detection mechanism for detecting a sample separated in the flow path, wherein at least the sample is in the flow path A sample injection monitoring mechanism for detecting a sample at a site to be injected is further provided.
[0011]
After supplying a voltage for guiding the sample to the flow path by the voltage supply mechanism, at least a sample at a site where the sample is injected into the flow path is detected by the sample injection monitoring mechanism. For example, when using a chip device in which a flow path for sample injection and a flow path for separation that intersect each other are used as flow paths, the sample is injected by detecting the sample at the site where the sample is injected into the flow path. It can be determined whether or not a sufficient amount of sample is guided to the intersection of the flow path and the separation flow path. Furthermore, the injection conditions can be examined by monitoring the sample distribution in the sample injection channel.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The sample injection monitoring mechanism and the detection mechanism are each provided with a fluorescence detection optical system, and it is preferable that these fluorescence detection optical systems have a common excitation light source. As a result, the size of the apparatus can be reduced as compared with the case where each has an excitation light source, and the price and running cost of the apparatus can be further reduced.
[0013]
The sample injection monitoring mechanism preferably includes a detection optical system using an LED (Light Emitting Device) as a light source. As a result, since the light source itself is inexpensive, the sample injection monitoring mechanism can be constructed at a low cost. Furthermore, if the LED array is arranged in accordance with the layout of the site where the sample is injected into the flow path, there is no need to provide a complicated illumination optical system, so the sample injection monitoring mechanism is constructed at a lower cost. be able to.
[0014]
The chip device used includes a sample injection channel and a separation channel that intersect each other as a channel, and the sample is transferred to the intersection between the sample injection channel and the separation channel by a voltage supply mechanism. A control unit for temporarily stopping the apparatus when the sample distribution in the predetermined range of the sample injection flow path detected by the sample injection monitoring mechanism does not become uniform even after a predetermined time has passed after supplying the voltage for guiding; It is preferable to provide.
[0015]
The chip device used is equipped with a sample injection channel and a separation channel that intersect each other as a channel, and is detected by the sample injection monitor mechanism when an electrophoresis voltage for sample separation is applied by the voltage supply mechanism. It is preferable to further include a controller that temporarily stops the apparatus when the sample existing at the intersection of the sample injection channel and the separation channel does not migrate into the separation channel.
By providing these control units, it is possible to automatically determine the quality of sample migration and manage migration.
[0016]
【Example】
FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an embodiment of an electrophoresis apparatus according to the present invention. The microchip 1 shown in FIG. 1 is the same as that shown in FIG.
The microchip 1 is held on a chip holder (not shown) with the surface on which the reservoir is formed facing upward. The chip holder is provided with a temperature control mechanism for adjusting the temperature of the chip 1.
[0017]
A common excitation light source laser device 11 is provided for a separation peak detection optical system and a sample injection monitor optical system which will be described later. Examples of the laser device 11 include an argon (Ar) laser, a krypton (Kr) laser, a helium neon (He—Ne) laser, and a neodymium (Nd) —YAG (Y _Three Al _Five O ₁₂ Various laser devices such as Nd ion solid state lasers, semiconductor lasers (Laser Diodes: LD), and solid state lasers utilizing the optical second harmonic generation (SHG) phenomenon can be used.
[0018]
A beam expander 13 is provided in the optical path of the excitation light from the laser device 11 to make the excitation light parallel light. The optical path of the excitation light from the beam expander 13 is provided with a movable reflecting mirror 15 that is moved between a solid line position on the optical path and a broken line position that is off the optical path.
A lens 17 that spreads the excitation light is provided in the optical path of the excitation light reflected by the movable reflecting mirror 15. A dichroic mirror 19 is disposed in the optical path of the excitation light from the lens 17 on the bottom surface side of the chip 1 (the side opposite to the surface on which the reservoir is formed) and reflects the excitation light from the lens 17 toward the bottom surface side of the chip 1. Is provided. The dichroic mirror 19 has a wavelength characteristic that reflects excitation light and transmits fluorescence from the chip 1 side.
[0019]
A spectral filter 21 is provided on the opposite side of the dichroic mirror 19 from the chip 1. The spectral filter 21 transmits only light of a predetermined fluorescence wavelength among the fluorescence from the chip 1 that has passed through the dichroic mirror 19. The specifications of the dichroic mirror 19 and the spectral filter 21 are determined by the fluorescent material used for labeling the sample and the wavelength of the excitation light oscillated by the laser device 11.
[0020]
In the optical path of the fluorescence transmitted through the spectral filter 21, a lens 23 for imaging the fluorescence on a light receiving surface of a CCD (Charge Coupled Device) 25 is provided.
A CPU (Central Processing Unit) 27 for controlling the operation of the CCD 25 and processing the detection signal of the CCD 25 is electrically connected to the CCD 25.
The movable reflecting mirror 15, the dichroic mirror 19, the spectral filter 21, the lens 23, and the CCD 25 constitute a sample injection monitor optical system 29. The monitor optical system 29 detects the fluorescent label in the sample introduction flow path 3 and the separation flow path 5 of the chip 1 to detect the sample distribution in the flow paths 3 and 5.
[0021]
In the monitor optical system 29, the diameter of the output light from the beam expander 13 and the channel design of the chip 1 can be used as long as at least the excitation light can be irradiated around the intersection between the sample introduction channel 3 and the separation channel 5. Depending on the case, the lens 17 may be omitted. The sample injection monitoring mechanism constituting the present invention includes a laser device 11, a beam expander 13, a CPU 27, and a monitor optical system 29.
[0022]
A reflection mirror 31 is provided in the optical path of the excitation light from the beam expander 13 when the movable reflection mirror 15 is located at the position of the broken line. A dichroic mirror 33 is disposed on the surface side of the chip 1 (the side where the reservoir is formed) in the optical path of the excitation light reflected by the reflection mirror 31 and reflects the excitation light from the reflection mirror 31 toward the surface side of the chip 1. Is provided. The dichroic mirror 33 has a wavelength characteristic that reflects excitation light and transmits fluorescence from the chip 1 side.
[0023]
In the optical path of the excitation light reflected by the dichroic mirror 33, an objective lens 35 for condensing the excitation light at the detection position of the separation channel 5 of the chip 1 is provided.
A spectroscope 37 is provided on the opposite side of the dichroic mirror 33 from the objective lens 35. The spectroscope 37 separates the fluorescence from the chip 1 that has passed through the objective lens 35 and the dichroic mirror 33. As the spectroscope 37, for example, a combination of a spectroscopic filter panel and a wedge prism, a pass grating, or the like can be used.
[0024]
A lens 39 for forming an image of the fluorescence on the light receiving surface of the CCD 41 is provided in the optical path of the fluorescence transmitted through the spectroscope 37.
A CPU 43 for controlling the operation of the CCD 41 and processing a detection signal of the CCD 41 is electrically connected to the CCD 41.
The reflection mirror 31, the dichroic mirror 33, the objective lens 35, the spectroscope 37, the lens 39, and the CCD 41 constitute a separation peak detection optical system 45. The detection optical system 45 detects the separated sample by detecting the fluorescent label at the detection position of the separation channel 5 of the chip 1. A plurality of types of fluorescence wavelengths can be detected by separating light from the detection position with the spectroscope 37.
The detection mechanism constituting the present invention includes the laser device 11, the beam expander 13, the CPU 43, and the detection optical system 45.
[0025]
On the surface side of the chip 1, electrodes 47 for applying a voltage to the liquid stored in the reservoirs 7a, 7c, 7s, 7w of the chip 1 are provided for each of the reservoirs 7a, 7c, 7s, 7w. Each electrode 47 is electrically connected to a high voltage supply unit 49 for supplying a voltage to the electrode 47. Although not shown, the high voltage supply unit 49 is electrically connected to the CPU 27, and the operation of the high voltage supply unit 49 is controlled by the CPU 27.
The voltage supply mechanism constituting the present invention is configured by the electrode 47 and the high voltage supply unit 49, and the control unit configuring the present invention is realized by the CPU 27.
[0026]
FIG. 2 is a flowchart showing the operation of this embodiment. FIG. 3 is a plan view of the chip 1 and an enlarged view showing the inside of the intersection between the sample injection channel and the separation channel when the sample is introduced. The operation of this embodiment will be described with reference to FIGS.
The electrophoresis medium is filled in the sample injection channel 3 and the separation channel 5, the buffer solution is injected into the reservoirs 7a, 7c, and 7w, and the chip 1 into which the sample is injected into the reservoir 7s is placed on the chip holder ( Step S1).
The electrode 47 is allowed to enter the reservoirs 7a, 7c, 7s, and 7w, and a high voltage supply unit 49 applies a voltage for introducing a sample to each of the reservoirs 7a, 7c, 7s, and 7w via the electrode 47 according to the injection conditions that have been examined in advance. Apply (step S2). The sample injected into the reservoir 7s starts to spread into the sample introduction channel 3.
[0027]
The monitor optical system 29 is used to monitor the sample distribution in the sample introduction flow path 3 (step S3).
The operation will be described. First, the movable reflecting mirror 15 is moved to the solid line position, and the excitation light is oscillated from the laser device 11. The excitation light from the laser device 11 is converted into parallel light by the beam expander 13. The excitation light converted into parallel light is reflected by the movable reflecting mirror 15 and enters the monitor optical system 29. Excitation light from the movable reflecting mirror 15 is spread by the lens 17, further reflected by the dichroic mirror 19, and irradiated on the back surface side of the chip 1. Thereby, the excitation light is irradiated to the entire sample introduction channel 3 and the entire separation channel 5.
The spectral filter 21 transmits only the fluorescence having a predetermined wavelength out of the fluorescence from the chip 1 irradiated to the spectral filter 21 through the dichroic mirror 19 to the lens 23 side, and the transmitted fluorescence is imaged on the CCD 25 by the lens 23. . The CPU 27 converts the detection signal of the CCD 25 into an image file and monitors the sample distribution.
[0028]
The CPU 27 determines whether or not the sample distribution is uniform in the sample introduction flow path 3 (step S4). Thereby, it is determined whether or not a sufficient amount of samples for separation and detection is led to the intersection 9.
When it is determined in step S4 that the sample distribution is not uniform (No), it is determined whether or not a predetermined time has elapsed since the application of the sample introduction voltage (step S5). When the predetermined time has not elapsed (No), the process returns to step S4. When the predetermined time has elapsed (Yes), the CPU 27 controls the high voltage supply unit 49 to stop the application of the voltage, and shifts to the recovery routine or the next execution mode.
[0029]
As shown in the enlarged view of the intersection 9 in FIG. 3, when it is determined that the sample distribution is uniform in the sample introduction flow path 3 and the sample distribution is uniform in step S4 (Yes), a high voltage is supplied. The voltage applied to the reservoirs 7a, 7c, 7s, and 7w is switched by the unit 49, and the sample separation electrophoresis is started by applying the electrophoresis voltage for sample separation (step S6).
At this time, the CPU 27 continues to monitor the sample distribution in the sample introduction flow path 3 using the monitor optical system 29, and whether or not the sample present at the intersection 9 has been injected into the separation flow path 5. Is determined (step S7).
When it is determined in step S7 that the sample is not injected into the separation channel 5 (No), the CPU 27 controls the high voltage supply unit 49 to stop the voltage application, and the process proceeds to the recovery routine or the next execution mode. .
When it is determined in step S8 that the sample has been injected into the separation channel 5 (Yes), the application of the electrophoresis voltage is continued as it is, and the sample is separated and migrated.
[0030]
The detection optical system 45 is used to detect the sample that has reached the detection position (step S8).
Explaining the operation, after confirming the injection of the sample into the separation channel 5 in step S8, the movable mirror 15 is moved to the position of the broken line, and the reflection mirror 31 is irradiated with the excitation light from the beam expander 13. . The excitation light from the beam expander 13 is reflected by the reflection mirror 31 and enters the detection optical system 45. Excitation light from the movable reflecting mirror 15 is reflected to the surface side of the chip 1 by the dichroic mirror 33, condensed by the objective lens 35, and irradiated from the surface side of the chip 1 to the detection position of the separation channel 5.
[0031]
The fluorescence from the detection position of the separation channel 5 is irradiated to the spectroscope 37 through the objective lens 35 and the dichroic mirror 33. The spectroscope 37 separates the fluorescence from the detection position of the separation channel 5, and the dispersed fluorescence is imaged on the CCD 41 by the lens 39. The CPU 43 converts the detection signal of the CCD 41 into an image file and performs waveform processing to detect the separated sample.
After the separation of the sample, the supply of voltage by the high voltage supply mechanism 49 is stopped.
[0032]
In this way, the monitor optical system 29 is provided, and the sample optical distribution in the sample introduction flow path 3, particularly around the intersection 9 between the sample introduction flow path 3 and the separation flow path 5, is obtained using the monitor optical system 29. By monitoring, in step S4 in FIG. 2, it is determined whether or not a sufficient amount of sample has been introduced to the intersection 9 when a voltage for introducing the sample to the intersection 9 is applied between the reservoirs. Therefore, if a sufficient amount of sample is not led to the intersection 9, the measurement can be stopped to improve the reliability of the measurement result. Further, in step S8 of FIG. 2, it is possible to determine whether or not the sample existing at the intersection 9 is introduced into the separation channel 5 and migrates. By stopping, the reliability of the measurement result can be improved.
[0033]
In this embodiment, the injection conditions of the sample can be examined. The temperature of the chip 1, the supply voltage to each reservoir by the voltage supply mechanism 49, and the voltage application time to each reservoir are changed, and the sample distribution in the sample introduction flow path 3 under each condition is changed using the monitor optical system 29. Monitor. Thereby, the optimal injection conditions can be examined.
[0034]
In this embodiment, only one laser device 11 as an excitation light source is provided, but the present invention is not limited to this, and an excitation light source for the monitor optical system 29 and an excitation light source for the detection optical system 45 are provided. Each may be provided. In that case, the movable reflecting mirror 15 and the reflecting mirror 31 are unnecessary.
In this embodiment, the CPU 27 for the monitor optical system 29 and the CPU 43 for the detection optical system 45 are provided. However, the functions of the CPUs 27 and 43 may be realized by one CPU.
[0035]
In this embodiment, the monitor optical system 29 constituting the sample injection monitoring mechanism uses the entire sample introduction channel 3 and the entire separation channel 5 as a detection range, but the present invention is not limited to this. Instead, the sample injection monitoring mechanism may be any one that has a detection range in part or the entirety of the sample introduction channel including the intersection of the sample introduction channel and the separation channel.
[0036]
In the embodiment shown in FIG. 1, the microchip 1 in which one separation channel 5 is formed is used. However, the present invention is not limited to this, and a large number of separation channels are formed. It can also be applied to electrophoresis using a chip device.
FIG. 4 is a top view showing a microchip on which a large number of separation channels are formed. The microchip 51 includes a pair of transparent plate-like inorganic materials (for example, glass, quartz, silicon, etc.) or substrates 51a and 51b made of plastic.
[0037]
On the surface of one substrate 51b, eight sets of the sample introduction flow path 53 and the separation flow path 55 intersecting each other are formed by a semiconductor photolithography technique or a micromachining technique. The eight sets of flow paths 53 and 55 are fan-shaped with the one end side of the separation flow path 55 opposite to the side crossing the sample introduction flow path 53 as a key so as not to cross the other sets of flow paths. Is arranged. The sample introduction channel 53 is formed in a bowl shape to reduce the area of the chip 51.
[0038]
In the other substrate 51a, through holes are formed as anode reservoirs 57a, cathode reservoirs 57c, sample reservoirs 57s, and waste reservoirs 57w at positions corresponding to the ends of the flow paths 53 and 55. The reservoirs 57c, 57s, 57w are provided for each set of the flow paths 53, 55. The anode reservoir 57a is common on one end side of each pair of separation flow paths 55 on the main side of the fan-shaped arrangement.
[0039]
The chip 51 is used in a state where both the substrates 51a and 51b are overlapped and joined. The detection position of the separation sample on the chip 51 is near one end side of each separation flow channel 55 of each set on the main side of the fan-shaped arrangement.
Such a microchip is also called a multi-channel micro-chip because a large number of separation channels are formed.
[0040]
When the chip 51 is installed in the electrophoresis apparatus shown in FIG. 1 and measurement is performed, the electrode 47 of the apparatus needs to be provided corresponding to the arrangement of the reservoirs 57a, 57c, 57s, and 57w. Further, with respect to the detection optical system 45, for example, a beam scanning element such as a galvano mirror or an AOD (Acousto-Optics Device) is provided in the optical path between the reflection mirror 31 and the dichroic mirror 33 so that the excitation light can be scanned at the belt-like detection position. Therefore, it is necessary to change the spectroscope 37, the lens 39, and the CCD 41 so that the eight separation channels 55 can be distinguished and detected.
If the electrophoresis is performed using the electrophoresis apparatus shown in FIG. 1 corresponding to the chip 51 so changed, the distribution of the sample in the sample introduction channel 53 can be measured using the monitor optical system 29. The state and migration of the sample to the separation channel 55 can be monitored.
[0041]
FIG. 5 is a diagram showing detection signals when a sample is labeled with four types of fluorescent substances having different fluorescence wavelengths and separated and detected using the chip 51. The horizontal axis (x axis) represents the number of the separation channel 55 (channel number), and the vertical axis (y axis) represents four types of spectral spectra. FIG. 5 shows detection signals of four separation channels 55.
The circles in FIG. 5 indicate the intensity of fluorescence separated at the detection position.
[0042]
A different sample is injected into each sample reservoir 57s of the chip 51, a voltage is applied to each reservoir, and the sample is guided to the intersection of each set of the sample introduction flow channel 53 and the separation flow channel 55. An electrophoresis voltage is applied to the reservoir to inject the sample present at the intersection into the separation channel 55. In each separation channel 55, the sample is migrated to the anode reservoir 57a side while being separated. The sample components that have been separated and have reached the detection position are identified by four types of fluorescent substances.
[0043]
FIG. 6 is a schematic configuration diagram showing another embodiment of the electrophoresis apparatus according to the present invention. The microchip 1 shown in FIG. 6 is the same as that shown in FIG. The same parts as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and description thereof will be omitted.
The chip 1 is held on a chip holder (not shown). The excitation light source laser device 11, the beam expander 13, the CPU 43, the reflection mirror 31, the dichroic mirror 33, the objective lens 35, the spectroscope 37, the CCD 41, the electrode 47, and the high voltage supply unit 49 that constitute the separation peak detection optical system 45 This is the same as the embodiment of FIG. However, illustration of the electrode 47 corresponding to a sample reservoir and a waste reservoir is abbreviate | omitted. Further, the reflection mirror 31 may be omitted, and the excitation light from the beam expander 13 may be directly incident on the dichroic mirror 33.
[0044]
An LED 59 as an excitation light source is arranged at a position corresponding to the intersection 9 between the sample introduction flow path 3 and the separation flow path 5 on the surface side of the chip 1. As the LED 8, for example, a blue LED having an oscillation frequency of 480 nm can be used. However, the LED used in the present invention is not limited to the blue LED, and an LED that emits light of another color, that is, another wavelength, can be used depending on the fluorescent material to be used.
[0045]
A spectral filter 61 is arranged at a position corresponding to the intersection 9 between the sample introduction flow path 3 and the separation flow path 5 on the back side of the chip 1. The spectral filter 61 transmits only light having a predetermined fluorescence wavelength out of the fluorescence from the vicinity of the intersection 9 of the chip 1. The spec of the spectral filter 61 is determined by the fluorescent material used for labeling the sample and the wavelength of the excitation light emitted by the LED 59.
[0046]
A lens 63 for forming an image of the fluorescence on the light receiving surface of the CCD 65 is provided in the optical path of the fluorescence transmitted through the spectral filter 61.
A CPU 67 for controlling the operation of the CCD 65 and processing a detection signal of the CCD 65 is electrically connected to the CCD 65.
The LED 59, the spectral filter 61, the lens 63 and the CCD 65 constitute a sample injection monitor optical system 29a. The monitor optical system 29a detects the fluorescent label in the vicinity of the intersection 9 between the sample introduction channel 3 and the separation channel 5 of the chip 1 and detects the sample distribution in the channels 3 and 5 near the intersection 9. To do.
[0047]
In the monitor optical system 29, the diameter of the output light from the beam expander 13 and the channel design of the chip 1 can be used as long as at least the excitation light can be irradiated around the intersection between the sample introduction channel 3 and the separation channel 5. Depending on the case, the lens 17 may be omitted.
The sample injection monitoring mechanism constituting the present invention includes a laser device 11, a beam expander 13, a CPU 27, and a monitor optical system 29.
[0048]
In this embodiment, when a voltage for guiding the sample injected into the sample reservoir to the crossing portion 9 is applied between the reservoirs, the LED 59 is turned on and the monitor optical system 29a is used to flow the sample introduction channel. 3, in particular, the sample distribution around the intersection 9 between the sample introduction channel 3 and the separation channel 5 is monitored. As a result, as in the embodiment of FIG. 1, it can be determined whether or not a sufficient amount of samples have been led to the intersection 9, so that the reliability of the measurement result can be improved.
This embodiment can also be used for examining sample injection conditions.
[0049]
In this embodiment, the CPU 67 for the monitor optical system 29a and the CPU 43 for the detection optical system 45 are provided, but the functions of the CPUs 43 and 67 may be realized by one CPU.
In this embodiment, the single-channel chip 1 is used, but the present invention can also be applied to a multi-channel chip device. For example, when the chip 51 shown in FIG. 4 is used, each LED is excited at each intersection by arranging eight LEDs side by side corresponding to the position of the intersection between the sample introduction channel 53 and the separation channel 55. The sample distribution at each intersection can be monitored by irradiating light.
[0050]
Further, in this embodiment, the LED 59 is arranged corresponding to the position of the intersection 9 between the sample introduction channel 3 and the separation channel 5 of the chip 1, and the excitation light from the LED 59 is directly irradiated to the intersection 9. However, the present invention is not limited to this. For example, a condensing lens is disposed between the LED 59 and the chip 1, and excitation light from the LED 59 is passed through the condensing lens to the intersection 9. 1, the movable reflecting mirror 15 is eliminated in the configuration shown in FIG. 1, an LED is disposed on the opposite side of the lens 17 from the dichroic mirror 19, and excitation light from the LED is irradiated via the lens 17 and the dichroic mirror 19. For example, the chip 1 may be irradiated with excitation light from the LED via an optical system.
[0051]
The microchip that can be used in the electrophoresis apparatus according to the present invention is not limited to those shown in FIG. 4 and FIG. 7. For example, a microchip in which a separation channel without an intersecting channel is formed, or a separation chip is used. It is possible to use microchips having various flow path designs such as those in which a plurality of flow paths intersect each other and large sizes. However, it is necessary to change the configuration of the voltage supply mechanism, the detection mechanism, and the sample injection monitoring mechanism in accordance with the flow channel design of the chip device.
In the above embodiment, a sample injection monitoring mechanism and a detection mechanism having a fluorescence detection optical system are used. However, the present invention is not limited to this, and the sample injection monitoring mechanism and the detection mechanism have an absorptiometry. You may use the mechanism which detects by other means, such as a method and an electrical conductivity method.
[0052]
【The invention's effect】
The electrophoresis apparatus of the present invention further includes a sample injection monitor mechanism for detecting a sample distribution in the sample injection channel including at least the intersection of the sample injection channel and the separation channel. After supplying a voltage for guiding the sample to the intersection by means of, it is possible to know whether or not a sufficient amount of sample is guided to the intersection of the sample injection channel and the separation channel, Reliability of measurement results is improved. Furthermore, the injection conditions can be examined.
[0053]
The sample injection monitoring mechanism and the detection mechanism are each equipped with a fluorescence detection optical system. If these fluorescence detection optical systems have a common excitation light source, the apparatus is compared with a case where each has an excitation light source. Can be reduced, and the price and running cost of the apparatus can be reduced.
[0054]
If a sample injection monitor mechanism equipped with a detection optical system using an LED as a light source is used, the light source itself can be made inexpensive, so that the sample injection monitor mechanism can be constructed at a low cost, and the sample can flow through the channel. If the LED array is arranged in accordance with the layout of the portion to be injected into the sample, it is not necessary to provide a complicated irradiation optical system, so that the sample injection monitoring mechanism can be constructed at a lower cost.
[0055]
The chip device used includes a sample injection channel and a separation channel that intersect each other as a channel, and the sample is transferred to the intersection between the sample injection channel and the separation channel by a voltage supply mechanism. When the sample distribution in the predetermined range of the sample injection flow path detected by the sample injection monitoring mechanism does not become uniform in the predetermined range of the sample injection flow path after a predetermined time has elapsed after supplying the voltage for guiding If a control unit for temporarily stopping the apparatus is further provided, it is possible to manage the migration by automatically determining the quality of the sample migration.
[0056]
The chip device used is equipped with a sample injection channel and a separation channel that intersect each other as a channel, and is detected by the sample injection monitor mechanism when an electrophoresis voltage for sample separation is applied by the voltage supply mechanism. If the sample that exists at the intersection between the sample injection channel and the separation channel does not migrate into the separation channel, a control unit that temporarily stops the device can be used to improve the sample migration. The migration can be managed by automatically determining the above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an embodiment.
FIG. 2 is a flowchart showing the operation of the embodiment.
FIG. 3 is a plan view of a microchip and an enlarged view showing the inside of an intersection between a sample injection channel and a separation channel when a sample is introduced.
4A and 4B are diagrams showing a microchip in which a large number of separation channels are formed, in which FIG. 4A is a top view of one substrate, FIG. 4B is a top view of the other substrate, and FIG. FIG.
FIG. 5 is a diagram showing detection signals when a sample is labeled with four types of fluorescent substances having different fluorescence wavelengths and separated and detected using the microchip of FIG.
FIG. 6 is a schematic configuration diagram showing another embodiment.
7A and 7B are diagrams illustrating an example of a microchip, in which FIG. 7A is a top view of one substrate, FIG. 7B is a top view of the other substrate, and FIG. FIG.
[Explanation of symbols]
1 Microchip
3 Sample injection channel
5 Separation flow path
7a Anode reservoir
7c Cathode reservoir
7s sample reservoir
7w waste reservoir
11 Excitation light source laser device
13 Beam expander
15 Movable reflection mirror
17, 23, 39, 69 Lens
19, 33 Dichroic mirror
21,61 Spectral filter
25, 41, 65 CCD
27, 43, 67 CPU
29 Sample injection monitor optical system
37 Spectrometer
45 Separation peak detection optical system
47 electrodes
49 High voltage supply
59 LED

Claims

Using a chip device in which a channel is formed inside the plate-like member, and a hole reaching the channel is formed as a reservoir at a position corresponding to the channel on one surface of the plate-like member, on both ends of the channel In an electrophoresis apparatus including a voltage supply mechanism for applying a voltage and a detection mechanism for detecting a sample separated in the flow path,
The chip device includes a sample injection channel and a separation channel that intersect each other as the channel,
A sample injection monitoring mechanism for detecting a sample at a site where at least the sample is injected into the flow path ;
A predetermined range of the sample injection channel detected by the sample injection monitor mechanism after supplying a voltage for guiding the sample to the intersection of the sample injection channel and the separation channel by the voltage supply mechanism And a control unit that temporarily stops the apparatus when the sample distribution in the apparatus does not become uniform even after a predetermined time has elapsed .

Using a chip device in which a channel is formed inside the plate-like member, and a hole reaching the channel is formed as a reservoir at a position corresponding to the channel on one surface of the plate-like member, on both ends of the channel In an electrophoresis apparatus including a voltage supply mechanism for applying a voltage and a detection mechanism for detecting a sample separated in the flow path,
The chip device includes a sample injection channel and a separation channel that intersect each other as the channel,
A sample injection monitoring mechanism for detecting a sample at a site where at least the sample is injected into the flow path;
The sample present at the intersection of the sample injection channel and the separation channel detected by the sample injection monitor mechanism when a sample separation electrophoresis voltage is applied by the voltage supply mechanism is the separation channel. An electrophoretic apparatus, further comprising: a control unit that temporarily stops the apparatus when not moving into the apparatus.

The electrophoresis apparatus according to claim 1 or 2 , wherein each of the sample injection monitoring mechanism and the detection mechanism includes a fluorescence detection optical system, and the fluorescence detection optical systems have a common excitation light source.

The sample injection monitoring mechanism electrophoretic device according to claim 1 or 2 in which with a detection optical system for an LED as a light source.