JP4446057B2

JP4446057B2 - Protein expression method using frame shift of mRNA in the presence of biological stimuli

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Publication number: JP4446057B2
Application number: JP2002248946A
Authority: JP
Inventors: 正幸三浦; 隆夫岩脇
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2002-08-28
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2022-08-28
Also published as: JP2004081143A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体刺激存在下でのｍＲＮＡのフレームシフトを利用した蛋白質の発現方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞において、小胞体ストレス状態（小胞体内の折り畳み異常蛋白質（ｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）の蓄積を含む）はいくつかの適応応答を誘導する。これらの内の一つは折り畳み異常蛋白質応答（ＵＰＲ）であり、それは蛋白質折り畳み活性を増加させるため、および、小胞体内の折り畳み異常蛋白質の凝集を防ぐため、小胞体−局在シャペロンおよび折り畳み触媒をコード化している遺伝子の転写活性化を導いている¹。ＵＰＲシグナリング経路は酵母でよく調べられている。
【０００３】
ＩＲＥ１およびＨＡＣ１は出芽酵母におけるＵＰＲのための必須分子である。ＩＲＥ１は小胞体に位置しているＩ型膜貫通蛋白質であり、セリン／スレオニン蛋白質キナーゼおよびＲＮａｓｅＬの相同域をカルボキシル末端に持っている。ＩＲＥ１のアミノ末端領域は小胞体内腔中の折り畳み異常蛋白質の蓄積を感知し、ＩＲＥ１のオリゴマー化およびトランス−自己リン酸化を導いている。最終的に、この分子はＨＡＣ１ｍＲＮＡの非通常スプライシングを誘導する。スプライスされたＨＡＣ１ｍＲＮＡは効率よく翻訳され、ＨＡＣ１蛋白質（転写因子）はＵＰＲの種々の標的遺伝子プロモーターを活性化する²。
【０００４】
哺乳動物ゲノムにおいては、酵母ＩＲＥ１の２つのホモログ、ＩＲＥ１α³およびＩＲＥ１β⁴が存在するが、ＨＡＣ１ホモログはいまだ同定されていない。しかしながら、哺乳動物ＩＲＥ１のリボヌクレアーゼドメインの切断標的としていくつかのＲＮＡ分子が同定されている。小胞体ストレス時に、各々のＩＲＥ１ｍＲＮＡはそれ自身のＩＲＥ１により切断され、および２８ＳｒＲＮＡはＩＲＥ１βにより切断される^5,6。最近、Ｙｏｓｈｉｄａらは、小胞体ストレス条件下で、ＸＢＰ１前駆体ｍＲＮＡがＩＲＥ１による非通常スプライシングの標的になることを報告している。ヒト細胞においては、ＸＢＰ１ｍＲＮＡ領域５３１から５５６（２６ヌクレオチドのイントロン）が小胞体ストレス時にスプライスされ、ＸＢＰ１ｍＲＮＡの“フレームシフト”を導いている。スプライスされたＸＢＰ１ｍＲＮＡは成熟ＸＢＰ１蛋白質へ翻訳され、シス配列ＥＲＳＥ（小胞体ストレス応答エレメント）及びＵＰＲＥ（折り畳み異常蛋白質応答エレメント）を介して標的遺伝子の転写を誘導する。ＥＲＳＥ又はＵＰＲＥを介した転写は、ＢｉＰ、ＰＤＩ、ＧＲＰ９４等の小胞体シャペロン遺伝子群などの誘導に帰結する。
【０００５】
過度な小胞体ストレスは細胞死を誘導することが知られている。もし、小胞体ストレスに対する適応応答が十分でないならば、アポトーシス応答が開始され、哺乳動物細胞においてはＪＮＫおよびカスパーゼ７および１２の活性化を導く^8-10。神経変性疾患の研究において、小胞体ストレスおよびＵＰＲはアルツハイマー病およびパーキンソン病により起こる神経細胞死と密接に関係していることが報告されている^11,12。小胞体ストレス応答のシグナリング分子は発生に必要であることも示されている¹³。よって、小胞体ストレスおよび小胞体ストレス応答についての研究から、病理学および発生生物学ならびに細胞生物学に有用な情報が得られると期待される。ｉｎｖｉｖｏでの小胞体ストレスを研究する第一段階として、小胞体ストレスを受けている細胞を可視化する方法を開発が重要である。
【０００６】
従来、小胞体ストレスの検出は、ある種の小胞体分子シャペロンの発現量を測定することによって行われている。具体的には、ＢｉＰやカルレティキュリンのｍＲＮＡの発現レベルをノザンブロット解析により放射活性で測定すること、あるいは、これらの分子をコードする遺伝子のプロモーター活性をルシフェラーゼ等のレポーター分子を測定することによって、小胞体ストレスの検出が行われている。しかしながら、これらの手法では細胞を溶解する工程を伴うため、固体レベルで小胞体ストレスを受けている組織学的領域を正確に特定できない。また、生細胞での小胞体ストレスの検出は不可能である。よって、これらの方法はｉｎｖｉｖｏで、リアルタイムでの小胞体ストレスの空間的および時間的変化についての十分な情報を提供しない。
【０００７】
また、ＢｉＰやカルレティキュリン遺伝子のプロモーター制御下に蛍光蛋白質のコード遺伝子をつなげた遺伝子発現コンストラクトを使用する方法も考えられる。この方法は培養細胞レベルで生細胞のまま小胞体ストレルを検出できるという利点を有するが、低感度であるため有用性が低いと考えられている。
【０００８】
一般に、小胞体ストレス以外の生体刺激についても、細胞を破壊することなく高感度に検出できる方法が希求される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に導入することを含み、ここにおいて、前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている。
【００１０】
本発明の方法は、好ましくは、例えば、前記標的蛋白質として蛍光蛋白質を適用することにより、前記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体において蛍光を測定して、生体刺激の存在を検出するために使用可能である。生体内刺激としては、例えば小胞体ストレスが含まれる。
【００１１】
本発明はまた、前記蛋白質の発現方法に使用するための、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子発現ベクターを提供することを目的とする。
【００１２】
本発明はさらに、前記ベクターを適当なアジュバントとともに含む、前記方法に使用するための試薬を提供することを目的とする。
本発明はさらにまた、前記ベクターを、が導入された細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記問題の解決を目的として、本発明者らは鋭意研究に努めた結果、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子を利用して、生体刺激存在下のみ蛋白質を発現させる方法を構築し、本発明を想到した。
【００１４】
生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法
よって、本発明は、生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法を提供する。本発明の方法は、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子発現ベクターを、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に導入することを含み、ここにおいて、前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている、ことを特徴とする。
【００１５】
本発明の原理としては、以下の通りである。ベクターは、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子を含んでいる。刺激応答遺伝子のｍＲＮＡは、生体刺激の存在に応じたリボヌクレアーゼのスプライシングの標的である。スプライシングによって当該ｍＲＮＡにフレームシフトが生じると、標的蛋白質をコードする遺伝子との読み枠が一致し、刺激応答遺伝子のコードする蛋白質（刺激応答蛋白質）と、標的蛋白質との融合蛋白質が発現される。所期の生体刺激が存在しない場合にはフレームシフトが生ぜず、標的蛋白質との融合蛋白質は、刺激応答遺伝子との読み枠が一致しないため発現しない。よって、本願発明は、生体刺激の存在に応じて刺激応答遺伝子のｍＲＮＡのフレームシフトが生じることを利用して、刺激の存在下でのみ標的蛋白質を発現させることを特徴とする。
【００１６】
本明細書において、「生体刺激」とは特に限定されない。当該刺激に応じて、１ないしまたは複数のリボヌクレアーゼが発現し又は活性化し、特定のｍＲＮＡのスプライシングによって当該ｍＲＮＡにフレームシフトを生じさせるようなものが好ましい。限定されるわけではないが、小胞体ストレス等が挙げられる。特定の癌細胞では、ある遺伝子のｍＲＮＡにフレームシフトが生ずるが、正常組織では生じない、という場合には、このような癌の状態も本明細書における「生体刺激」に含まれる。
【００１７】
「生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子」とは、生体刺激の存在下と非存在下でスプライシングの態様が異なり、結果、フレームシフトが生ずる遺伝子を言う。即ち、生体刺激の存在下と非存在下で、ｍＲＮＡの長さが異なり、塩基配列の長さの差が３の倍数でないため、読み枠がずれるような遺伝子である。本明細書において、簡略のため場合により「刺激応答遺伝子」と呼称する。生体刺激存在下又は非存在下のいずれか片方の条件下でのみスプライシングが生じてもよいし、あるいは、生体刺激存在下及び非存在下の双方でスプライシングが起こるがその態様が異なる、選択的スプライシングが生じても良い。
【００１８】
刺激応答遺伝子の例としては、小胞体ストレスに応じて２６ヌクレオチドのイントロンがスプライシングされる、ＸＢＰ１遺伝子が含まれる。ＸＢＰ１遺伝子は、例えば、ヒト、ウシ、マウス、アフリカツメガエル、ゼブラダニオ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）において知られており、そのｃＤＮＡ配列がＥＳＴデータベース上に、各々ＢＥ１７０１１９、ＡＶ６０４６６７、ＢＦ１４３０１９、ＡＦ３５８１３３、ＡＦ３９９９１８として登録されている。本明細書の後述の配列表において、ヒトＸＢＰ１のｃＤＮＡ配列を配列番号１として記載した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７６３８３）。
【００１９】
標的蛋白質は、生体刺激の存在下においてのみ発現させることを目的とする蛋白質であり、特に限定されない。前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている。よって、生体刺激が存在する場合にのみ、標的蛋白質が発現する。
【００２０】
前記標的蛋白質として、蛍光蛋白質を用いた場合、ベクターを導入した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体において蛍光を測定して生体刺激の有無を検出することが可能である。蛍光蛋白質の例としては、好ましくは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）若しくはその変異体である。ＧＦＰは発光クラゲ類の有する緑色蛍光蛋白質の総称である。オワンクラゲのＧＦＰは、約５００ｎｍの紫外線により励起され緑色蛍光を発する。この蛍光には酸素以外に特別の因子を必要としない。外来遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を導入すると、蛍光を有する培養細胞、植物、線虫、ハエ、魚、マウスなどが得られるため、生きてる細胞中で、発現を直接観察できる。さらに、ＧＦＰの変異体でより強い蛍光を発するＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅｆｌｕｏｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄｆｌｕｏｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）等が開発されており、市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より入手可能）。本発明の方法では、導入される発現ベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、刺激応答遺伝子と蛍光蛋白質遺伝子の読み枠が一致し、両者の融合蛋白質が発現する。蛍光の測定により、生体刺激の、細胞内局在、組織局在、又は時間的局在に関する情報を得ることが可能である。
【００２１】
あるいは、生体刺激として、特定の癌細胞では、ある遺伝子のｍＲＮＡにフレームシフトが生ずるが、正常組織では生じない、という場合には、本発明の方法を利用することにより、標的蛋白質を癌細胞でのみ発現させることができる。標的蛋白質として毒性蛋白質、例えば、カスパーゼ、ｐ５３等を発現させることにより、癌細胞を特異的に攻撃することが可能である。
【００２２】
その他、本発明の方法において発現させうる標的蛋白質の例としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシラーゼが含まれる。
本発明のベクター、細胞等、及びベクターの導入方法
本発明の方法において、刺激応答遺伝子及び標的蛋白質を含むベクター、ベクターが導入される細胞等、並びにベクターの導入方法等は特に限定されず、公知のベクター等を利用可能である。
【００２３】
本発明に使用可能なモデル系としての細胞等は、特に限定されず、細菌（例えば、大腸菌、乳酸菌）、酵母（例えば、発芽酵母、分裂酵母）等の単細胞であってもよい。または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞で使用可能である。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
【００２４】
限定されるわけではないが、プラスミドなどの組換え発現ベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、上述した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体等に導入される。
【００２５】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００２６】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望の蛋白質を過剰発現しうる機能を有するものであれば特に限定されない
哺乳動物細胞内に核酸を導入するための確立された方法が、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，ＬａｒｇｅＳｃａｌｅＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９に記載されている。商業的に入手可能な試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７，１９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版．Ｖｏｌ．１−３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）におけるもののような、慣用法を用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることが可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用いて、行うことが可能である。
【００２７】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムより切り出すことが可能である。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、又はヒト・サイトメガロウイルス由来である。好ましくは、ヒト・サイトメガロウイルス由来のエンハンサーを使用可能である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供することが可能である。２種類以上の種由来の細胞中での発現を可能にするために、プロモーターとエンハンサーが各々異なる種に由来するものであってもよい。
【００２８】
あるいは、酵母などのより低次の真核生物において、または細菌などの原核生物に、ベクターを導入することも可能である。潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ等、異種性ポリペプチドを発現することが可能ないかなる酵母株も含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等、異種性ポリペプチドを発現することが可能ないかなる細菌株も含まれる。昆虫発現系も利用可能である。
【００２９】
本発明はまた、前記ベクターを適当なアジュバントとともに含む、本発明の蛋白質を発現する方法に使用するための試薬を提供する。本発明の試薬に含まれる適当なアジュバントは、ベクターが導入される細胞等の種類、導入方法等に応じて適宜当事者が選択可能である。
【００３０】
【好ましい発明の実施の形態】
病理学的および発生研究において、ｉｎｖｉｖｏで小胞体ストレスをモニターできる方法が希求されている。本発明の方法は、生きている細胞中の小胞体ストレスを非破壊的におよび連続的に可視化するために利用可能である。本発明者らは、「ＥＲＡＩ」（小胞体ストレス活性化指標）と名付けた、生きている細胞における小胞体ストレスのための指標を開発した。
【００３１】
本態様の原理を図３に模式図として示した。本態様は、小胞体ストレス条件下に起こる、ＩＲＥ１によるＸＢＰ１ｍＲＮＡスプライシングに基づいている。小胞体ストレス指標遺伝子は、ＸＢＰ１および蛍光蛋白質、例えば、ＧＦＰ変異体、ｖｅｎｕｓを融合することにより構築される。融合ｍＲＮＡはＩＲＥ１αによる非通常スプライシングの標的であり、小胞体ストレス時に２６ヌクレオチドのイントロン（ヒトでは、配列番号１の塩基５０２−５２７に相当）がスプライスされ、指標ｍＲＮＡのフレームシフトが導かれる。ＸＢＰ１は小胞体ストレス条件下でスプライスされるが、このスプライシングは正常条件下ではほとんど観察されない⁷。最終的に、スプライスされたｍＲＮＡの翻訳は蛍光蛋白質の終結コドンで終結する。結果として、小胞体ストレス条件下ではＸＢＰ１のｍＲＮＡのスプライシングにより、配列番号１中の塩基９−５０１及び５２８−１１６５がコード領域となり、３７６アミノ酸残基（配列番号２）からなるＸＢＰ１蛋白質に翻訳される。スプライシングされたＸＢＰ１のｍＲＮＡに対し、蛍光蛋白質をコードする遺伝子がインフレームに結合しているため、この場合、ＸＢＰ１および蛍光蛋白質の融合蛋白質が産生される。一方、正常条件下、即ち、非スプライシング時には、配列番号中の塩基９−７９４がコード領域となり（配列番号３）、２６１アミノ酸残基（配列番号４）からなるＸＢＰ１蛋白質（短縮型）に翻訳される。
【００３２】
このように、小胞体ストレス下では、ＸＢＰ１および蛍光蛋白質の融合蛋白質が産生され、蛍光蛋白質の蛍光活性により小胞体ストレスへ暴露された細胞を検出できる。一方、小胞体ストレスの非存在下ではスプライシングによるフレームシフトは生ぜず、翻訳はＸＢＰ１および蛍光蛋白質の遺伝子間の連結部位近くの終結コドンで終了する。よって、標的蛋白質である蛍光蛋白質の翻訳は誘導されない。
【００３３】
本態様において小胞体ストレスは、天然に生じた生体刺激でも人為的に生じさせた生体刺激でもよい。後述の実施例３において、ある条件を人為的に細胞に与えると小胞体ストレスが生じ、細胞中でＵＰＲを誘導することが確認された。具体的には、ツニカマイシン、タプシガーギンおよびＤＴＴは強力な小胞体侵襲因子と考えられ、熱（４２℃）およびＭＧ１３２は弱い小胞体侵襲因子と考えられる。よって、本発明の方法を利用して、上記のような処理を人為的に施すことによって、標的蛋白質（蛍光蛋白質を含む）を発現させることも可能である。または、ＵＰＲの必須分子であるＩＲＥ１αを細胞内で過剰発現させることによっても、標的蛋白質の発現が可能である（実施例５、図８）。
【００３４】
蛍光蛋白質は、蛍光蛋白質の種類に応じた蛍光極大波長において、公知の方法によって蛍光を観察することにより、検出可能である。限定されるわけではないが、ＧＦＰは、約５００ｎｍの紫外線により励起され緑色蛍光を発する。ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰは各々、４８８ｎｍ、５１３ｎｍ、３８０ｎｍ及び５５８ｎｍの波長により励起され、５０７ｎｍ、５２７ｎｍ、４４０ｎｍ及び５８３ｎｍの波長を観察する。
【００３５】
なお、図３に記載のベクターｐＣＡＸは、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを有する。ゆえにこのベクターは、ヒト及びニワトリのいずれの細胞中でも下流遺伝子の発現が可能である。
【００３６】
さらに、図３に記載のベクターは、発現させた融合蛋白質の同定を容易にするためにＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓをコードする塩基配列を含んでいる。該ペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換え蛋白質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。または、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、例えばＳｉｇｍａ社、ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ社等より入手可能である。
【００３７】
本発明の方法は、折り畳み異常蛋白質応答（ＵＰＲ）の標的遺伝子のプロモーターにより調節されるレポーターよりも（参考例１）、広い測定範囲において特異的および高感度の小胞体ストレス指標として機能する。さらに、本指標の基礎レベルは非常に低い。よって、本発明の方法は生きている細胞で小胞体ストレスを可視化するために応用可能である。後述の実施例ではヒトの培養細胞を使用した例を記載したが、本発明の方法は、ヒトのみならずマウス培養細胞においてもうまく機能した（データは示されていない）。よって、ＥＲＡＩを発現しているトランスジェニック動物（トランスジェニックマウスを含む）の特異的組織および器官の非破壊的および連続的モニタリングを実施することが可能である。これらのトランスジェニック動物は発生過程に起こる生理学的小胞体ストレスおよび小胞体ストレスといくつかの疾病との間の関係についての情報を提供する。加えて、細胞選別システムの使用により、これらのトランスジェニック動物から、ｉｎｖｉｖｏで小胞体ストレスに暴露された細胞を単離することも可能である。
【００３８】
ＥＲＡＩは、低い基礎活性および広い測定範囲という二つの都合のよい特性を持っている。従って、この指標は、小胞体ストレスを誘導するまたは減少させる物質のハイスループットスクリーニングにより有用である。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。以下の実施例及び参考例においては、特に言及しない限り、以下の方法に従って行った。
【００４０】
細胞培養、トランスフェクションおよび処理
ヒーラー細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞由来）を、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を補給したαＭＥＭ中、５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃にて培養した。ＭＥＭ培地の組成は下記の表１の通りである。
【００４１】
【表１】

各プラスミドをリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法により細胞内へトランスフェクトした。トランスフェクション後、小胞体ストレスを起こすグルコース飢餓を避けるため、６時間毎に培地を交換した。各々の薬剤に対する細胞応答を試験するため、細胞は種々の時間、５μｇ／ｍｌのツニカマイシン、５μｇ／ｍｌのタプシガーギン、１ｍＭのジチオスレイトール、１０μＭのＭＧ１３２、１００μＭのエトポシド、または１００μｇ／ｍｌのテオニルトリフルオロアセトンで処理された。
【００４２】
蛍光強度の測定
細胞はジギトニン緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＡおよび１０μＭジギトニン）中、３７℃で３０分間溶解し、次に溶解物を１６，５００ｇでの遠心分離により清澄化した。上清の蛍光（４８５ｎｍで励起した５２０ｎｍでの発光）は分光蛍光計（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ９６０，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で測定した。各々の試料の蛍光強度はβ−ガラクトシダーゼ活性に対して規格化した。値は３回の実験から得られたデータの平均±ＳＥＭとして示されている。
【００４３】
ウェスタンブロット分析
細胞はＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、５０ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、および１μｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中で溶解し、次に溶解物を９８℃で１０分間煮沸した。溶解物中の蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）により分離した。電気泳動後、蛋白質はポリビニリデンフルオリド微小孔性メンブラン上へ電気的に移行させ、標準法を使用して抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）により免疫検出を実施した。
【００４４】
ノーザンブロット分析
全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ試薬（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を使用して調製した。全ＲＮＡの２０マイクログラムを１％変性アガロースゲルの各々のレーンへ加え、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上へ移した。ハイブリダイゼーションは標準溶液中、４２℃で実施した。メンブランを２ｘＳＳＣ中、６５℃で洗浄した。
【００４５】
ＢｉＰおよびＧＡＰＤＨの検出に、以下のプローブを使用した：ＢｉＰ、コード領域の＋１から＋１９５９；ＧＡＰＤＨ、＋７５から＋１０１９。なお、ＢｉＰ及びＧＡＰＤＨの塩基配列は、各々、ＧｅｎＢａｎｋのＡＦ２１６２９２（配列番号６）及びＢＣ００４１０９（配列番号７）に開示されている。
【００４６】
参考例１ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出
小胞体ストレス条件下、ＢｉＰおよびカルレティキュリンのようなＵＰＲ標的遺伝子の転写が、プロモーター上のシスエレメントである折り畳み異常蛋白質エレメント（ＵＰＲＥ）および小胞体ストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）を経て活性化される^14,15。これらのエレメントはＵＰＲ誘導に必須および十分であることが知られており、そのためＵＰＲＥおよびＥＲＳＥ由来レポーター遺伝子はしばしば小胞体ストレスをモニターするために使用されてきた。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびその変異体は生きている細胞中の指標またはマーカーとして、広く利用されてきた。
【００４７】
生きている哺乳動物細胞における小胞体ストレスをモニターするため、ＧＦＰ変異体“ｖｅｎｕｓ”のｃＤＮＡがヒトＢｉＰまたはマウスカルレティキュリンのプロモーターにより調節されている二つの発現ベクターを設計した（図１）。
【００４８】
具体的には、ｐＢｉＰ（−３０４）／ｖｅｎｕｓは、ヒトＢｉＰプロモーター（−３０４）^14,15およびＳＶ４０イントロン／ポリＡ配列間のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位にｖｅｎｕｓｃＤＮＡを挿入することにより作製した。ｐＣＲＴ（−２．３ｋ）／ｖｅｎｕｓは、マウスカルレティキュリンプロモーター（−２．３ｋ）¹⁸およびＳＶ４０イントロン／ポリＡ配列間のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位にｖｅｎｕｓｃＤＮＡを挿入することにより作製した。
【００４９】
ｖｅｎｕｓは、ＧＦＰの変異体であるＥＹＦＰを修飾したものである。ＥＹＦＰは公知の蛍光蛋白質であり、そのアミノ酸配列は登録番号ＡＡＦ６５４５５としてＮＣＢＩに寄託されており、本明細書の配列表に配列番号５として記載されている。ｖｅｎｕｓは、ＥＹＦＰの配列において以下の５箇所のアミノ酸残基が修飾されており、非常に強い蛍光活性を示す：Ｆ４７Ｌ／Ｆ６５Ｌ／Ｍ１５４Ｔ／Ｖ１６４Ａ／Ｓ１７６Ｇ。マーカーとしてｖｅｎｕｓを選んだのは、それが高い折り畳み活性を示し、およびアシドーシスおよびＣｌ^-への暴露に対する耐性を示したからである¹⁶。これらの特色はストレス誘導条件下で細胞を研究するために都合がよい。
【００５０】
図１及び２は、ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出の結果を示す。各々の指標プラスミドはｐＣＡＧ−βｇａｌとヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした。図１では、ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞の相対的蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取し、溶解した。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は細胞採取６時間前に開始された。図２は、細胞採取直前にトランスフェクトされた細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡写真である。これらの蛍光像は位相差像と重ね合わされた。
【００５１】
各々のｖｅｎｕｓ発現ベクターが一時的にヒーラー細胞内へトランスフェクトされた場合、ｖｅｎｕｓの蛍光強度はツニカマイシン（小胞体ストレス剤）で処理した細胞中で増加した。しかしながら、小胞体ストレス条件下での蛍光レベルは正常条件下より２．５から３倍高いのみであった（図１）。このことは、正常条件下で細胞中の基礎蛍光強度がかなり高かったためである（図２）。正常条件下、細胞中でＢｉＰおよびマウスカルレティキュリンはある程度のレベルで発現しているため、このレポーターの高い基礎活性は予想されなかった訳ではない。
【００５２】
実施例１ベクターの構築
本実施例では、小胞体ストレス特異的イントロン（２６ヌクレオチド）を含んでいるヒトＸＢＰ１の部分配列の下流にｖｅｎｕｓコード領域を融合したベクターを作成した。
【００５３】
二つのＤＮＡ断片（Ｆ−ＸＢＰ１およびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ）はＰＣＲにより作製した；前者はコザック配列、Ｆｌａｇタグ配列およびヒトＸＢＰ１ｃＤＮＡの一部（配列番号１の１２−６０４ヌクレオチド）を含んでおり、および後者はコザック配列、Ｆｌａｇタグ配列およびヒトＸＢＰ１ｃＤＮＡのより小さな一部（配列番号１の３８１−６０４ヌクレオチド）を含んでおり、それはＤＮＡ結合ドメインが欠けている。Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓはＦ−ＸＢＰ１およびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ各々の下流のＢｇｌＩＩ部位にｖｅｎｕｓｃＤＮＡを結合させることにより作製した。
【００５４】
Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓは哺乳動物発現ベクター、ｐＣＡＸ（サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターにより下流の遺伝子の発現を活性化する）のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位内へ挿入した。プラスミドｐＣＡＸは、例えば、理化学研究所脳科学総合研究センター修復機構研究グループの三浦研究室より分与可能である。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓはヒトおよびマウス培養細胞の両方で指標プラスミドとして働く。サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターに連結されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐＣＡＧ−βｇａｌ）はトランスフェクション効率の内部標準として使用した。
【００５５】
小胞体ストレス活性化指標（ＥＲＡＩ）のスキームを図３に示す。。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓまたはｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓからの転写産物は正常条件下ではスプライスされない。スプライスされていないｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つ端切断ＸＢＰ１へ翻訳される。小胞体ストレス条件下、これらの転写体はスプライスされ、フレームシフトを導く。スプライスされたｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質へ翻訳される。それ故、小胞体ストレスへ暴露されている細胞のみで蛍光が検出される。
【００５６】
実施例２小胞体ストレスによるＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質の検出
融合遺伝子が哺乳動物細胞において小胞体ストレスの指標として、実際にうまく働くかどうかを試験するため、融合遺伝子の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトした。
【００５７】
これらの実験における融合遺伝子として、実施例１で作成したＦ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓ（ＸＢＰ１のＤＮＡ結合ドメインを欠いている）を含むベクターを用いた。各々の融合遺伝子はＮ末端にＦＬＡＧタグを持つ蛋白質をコード化している。各指標プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へ、トランスフェクトした。
【００５８】
図４は、トランスフェクション３６時間後の細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡像である。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は画像を撮る１２時間前に開始された。これらの蛍光像を位相差像と重ね合わせた。Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ発現ベクターをトランスフェクトされた細胞において、ツニカマイシン処理処理により核内に検出可能な蛍光を生じ、一方、正常条件下ではどの区画でもほとんど検出されなかった（図４）。
【００５９】
図４の観察は、ウェスタンブロット分析の結果と一致した。具体的には、細胞をトランスフェクション３６時間後に採取および溶解した。Ｔｍ処理は細胞採取１２時間前に開始した。外因性Ｆｌａｇ融合蛋白質を、抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたウェスタンブロット分析により免疫検出した。結果を図５に示す。
【００６０】
ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質（４５ｋＤａ）のシグナルは小胞体ストレス条件下では非常に強かったが、正常条件下ではわずかであった。スプライスされていないｍＲＮＡから翻訳される短縮型ＸＢＰ１（３０ｋＤａ）は両方の条件下で検出された（図５Ａ）。短縮型ＸＢＰ１（３０ｋＤａ）が、正常条件下のみならず、ＥＲストレス条件下でも発現したのは、ストレス条件下でも必ずしも全てのｍＲＮＡがスプライスされるわけではないからである。
【００６１】
Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓも、生きている細胞において小胞体ストレスのための指標としてＦ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ同様に働いた。ただし融合蛋白質は細胞質に局在化し、短縮型ＸＢＰ１は検出されなかった（図４Ｂおよび図５Ｂ）。理論に拘束されるわけではないが、正常条件下でも短縮型ＸＢＰ１が検出されなかったのは、おそらく、ＤＮＡ結合ドメインを欠いたＸＢＰ１は構造的に不安定であるため、合成されても、直後に分解されてしまったからではないか、と考えられる。
【００６２】
以下に記載したすべてのデータはＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を使用して得られた。
実施例３種々の条件下における細胞中のＢｉＰ発現レベルのノーザンブロット分析による測定
小胞体は細胞内器官であり、その機能は分泌性および膜蛋白質を正しく折り畳みおよび組み立てること、およびこれらの蛋白質を他の細胞内器官へ輸送することである。細胞がある種の条件下で培養された場合、これらの小胞体機能は弱められ、細胞中でＵＰＲの誘導が生じる。種々の培養条件下でのＵＰＲ活性を決定するため、ノーザンブロット分析により細胞中のＢｉＰ発現レベルを測定した（図７）。
【００６３】
以下の条件を用いた：４２℃熱ショックまたはツニカマイシン（Ｎ−連結グリコシル化の阻害剤）、タプシガーギン（小胞体からのＣａ²⁺放出剤）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、小胞体におけるジスルフィド結合形成を破壊する還元剤）、ＭＧ１３２（ユビキチン−プロテアソーム系による蛋白質分解の阻害剤）、エトポシド（アポトーシス誘導剤）、またはテオニルトリフルオロアセトン（化学的低酸素の誘導剤）による処理。種々の処理に暴露されたヒーラー細胞におけるＢｉＰ発現レベルをノーザンブロット分析により試験した。処理後の時間は、図７の各々のレーンの上に示されている。内部標準としてＧＡＰＤＨ発現レベルを使用した。
【００６４】
図７に示したように、ツニカマイシン、タプシガーギンおよびＤＴＴによる処理後、ＢｉＰ刺激の放射活性は６時間の時点で１５倍増加した。加えて、細胞を４２℃で培養するかまたはＭＧ１３２で処理した６時間後、ＢｉＰレベルは各々２または４倍に増加した。ＢｉＰ遺伝子発現はエトポシド、テオニルトリフルオロアセトンまたは偽処理によっては活性化されなかった。これらのデータから、ツニカマイシン、タプシガーギンおよびＤＴＴは強力な小胞体ストレス剤と考えられ、熱（４２℃）およびＭＧ１３２は弱い小胞体ストレス剤と考えられ、およびエトポシドおよびテオニルトリフルオロアセトンは小胞体ストレス剤ではない。
【００６５】
実施例４小胞体ストレスを検出するためのＥＲＡＩに基づいた本願発明の方法の特性の検討
Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓトランスフェクト細胞を使用して、実施例４の図７で調べた条件を分析した。具体的には、ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓを、ｐＣＡＧ−βｇａｌと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を種々のストレス誘導剤に暴露した；熱（４２℃の培養温度）またはツニカマイシン（Ｔｍ）、タプシガーギン（Ｔｇ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＭＧ１３２、エトポシド（Ｅｔｐ）、またはテオニルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）による処理。図４のグラフは、トランスフェクトされた細胞における蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。各々の処理は細胞採取６または１２時間前に開始した。
【００６６】
Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓトランスフェクト細胞においては、図７のノザンブロット分析によれば、ＢｉＰ遺伝子誘導は６時間で飽和したが、蛍光強度は１２時間の間、時間と伴に増加し、強力な小胞体ストレス剤で処理した後は基礎レベルの３０−７０倍に達した。弱い小胞体ストレス剤に暴露された細胞においては、蛍光レベルは基礎レベルの５倍に増加した。エトポシドまたはテオニルトリフルオロアセトンで処理された細胞または対照細胞において、蛍光はほとんど検出されなかった（図６）。
【００６７】
従って、蛍光強度に基づいたこれらの図６のデータは、図７のノーザンブロット分析の結果と相関していた。これらの結果は、広い測定範囲で、小胞体ストレスのための特異的および高感度の指標として、本発明の方法が働くことを示している。加えて、この指標の基礎レベルは、ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターを使用するレポータープラスミドの基礎レベルよりも低い。本実施例の結果は、本発明の方法が生きている細胞における小胞体ストレスの可視化に応用可能であることを示している。
【００６８】
実施例５ＩＲＥ１α−過剰発現細胞における蛍光強度を測定
ＸＢＰ１ｍＲＮＡは、細胞中でＩＲＥ１αが過剰発現されている場合、ならびに細胞が小胞体ストレスに暴露されている場合にスプライスされる⁷。ＩＲＥ１α過剰発現はそれ自身のオリゴマー化および自己リン酸化を起こし、それはＵＰＲを誘導する³。本実施例では、ＩＲＥ１α−過剰発現細胞において蛍光強度を測定した。
【００６９】
本実施例では、ｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１αおよびｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１α Ｋ５９９Ａを、各々ヒトＩＲＥ１αおよびヒトＩＲＥ１α Ｋ５９９Ａの発現ベクターとして使用した。ＩＲＥの配列は、ヒトＩＲＥ１α Ｋ５９９Ａでは、５９９位のリジンがアラニンに突然変異している。５９９位のリジンは、ＩＲＥのキナーゼサブドメイン内の種間で広く保存されていることが知られている残基である⁶。
【００７０】
ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓを、ｐＣＡＧ−βｇａｌおよびＩＲＥ１発現ベクターと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトした。図８は、本指標ｍＲＮＡのＩＲＥ１α−依存性スプライシングの結果を示したものであり、ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞中の蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。
【００７１】
図８に示したように、蛍光はＩＲＥ１α−過剰発現細胞において高レベルで検出されたが、キナーゼ変異体ＩＲＥ１α、ＩＲＥ１α Ｋ５９９Ａを過剰発現している細胞ではほとんど観察されなかった。加えて、指標ｍＲＮＡのスプライシング部位が内在性ＸＢＰ１ｍＲＮＡと同一であることを確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列分析を行った（データは示されていない）。これらのデータから、指標ｍＲＮＡのスプライシングは内在性ＸＢＰ１ｍＲＮＡと同様の様式で、小胞体ストレス条件下でＩＲＥ１αに依存していることが確認された。
参考文献
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【００７２】
1. Mori, K. Tripatite management of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Cell 101, 451-454 (2000).
2. Chapman, R., Sidrauski, C. & Walter, P. Intracellular signaling from the endoplasmic reticulum to the nucleus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 459-485 (1998).
3. Tirasophon, W., Welihinda, A. A. & Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12, 1812-1824 (1998).
4. Wang, X. Z. et al. Cloning of mammalian Ire1. reveals diversity in the ER stress responses. EMBO J. 17, 5708-5717 (1998).
5. Tirasophon, W., Lee, K., Callaghan, B., Welihinda, A. A. & Kaufman, R. J. The endoribonuclease activity of mammalian IRE1 autoregulates its mRNA and is required for the unfolded protein response. Genes Dev. 14, 2725-2736 (2000).
6. Iwawaki, T et al. Translational control by the ER transmembrane kinaseribonuclease IRE1 under er stress. Nat. Cell Biol. 3, 158-164 (2001).
7. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T. & Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell 107, 881-891 (2001).
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9. Nakagawa et al. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature 403, 98-103 (2000).
10. Rao, R. V. et al. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. J. Biol. Chem. 276, 33869-33874 (2001).
11. Katayama, T. et al. Presenilin-1 mutations downregulate the signaling pathway of the unfolded-protein response. Nat. Cell Biol. 1, 479-485 (1999).
12. Imai, Y. et al. An unfolded putative transmembrane polypeptide, which can lead to endoplasmic reticulum stress, is a substrate of Parkin. Cell 105, 891-902 (2001).
13. Shen, X. et al. Complementary signaling pathways regulate the unfolded protein response and are required for C. elegans development. Cell 107, 893-903 (2001).
14. Kohno, K., Normington, K., Sambrook, J., Gething, M. J. & Mori, K. The promoter region of the yeast KAR2 (BiP) gene contains a regulatory domain that responds to the presence of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell. Biol. 13, 877-890 (1993).
15. Yoshida, H., Haze, K., Yanagi, H., Yura, T. & Mori, K. Identification of the cis-acting endoplasmic reticulum stress response element responsible for transcriptional induction of mammalian glucose regulated proteins. J. Biol. Chem. 273, 33741-33749 (1998).
16. Nagai, T. et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
17. Calfon, M. et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature 415, 92-96 (2002).
18. Waser, M., Mesaeli, N., Spencer, C. & Michalak, M. Regulation of calreticulin gene expression by calcium. J. Cell Biol. 138, 547-557 (1997).
【００７３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＵＰＲ標的遺伝子（ＢｉＰおよびカルレティキュリン）のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出の結果を示す。各々の指標プラスミドはｐＣＡＧ−βｇａｌとヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした。ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞の相対的蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取し、溶解した。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は細胞採取６時間前に開始された。
【図２】図２は、ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出の結果を示す。各々の指標プラスミドはｐＣＡＧ−βｇａｌとヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は細胞採取６時間前に開始された。図２は、細胞採取直前にトランスフェクトされた細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡写真である。これらの蛍光像は位相差像と重ね合わされた。
【図３】図３は、小胞体ストレス活性化指標（ＥＲＡＩ）のスキームである。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓまたはｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓからの転写産物は正常条件下ではスプライスされない。スプライスされていないｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つ短縮型ＸＢＰ１へ翻訳される。小胞体ストレス条件下では、これらの転写産物はスプライスされ、フレームシフトを導く。スプライスされたｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質へ翻訳される。それ故、小胞体ストレスへ暴露されている細胞のみで蛍光が検出される。
【図４】小胞体ストレス時のＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質の検出を示す。各々の指標プラスミドはＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトされた。図４は、トランスフェクション３６時間後の細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡像である。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は画像を撮る１２時間前に開始された。これらの蛍光像は位相差像と重ね合わされた。
【図５】図５は、小胞体ストレス時のＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質の検出を示す。各々の指標プラスミドはＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトされた。図５は、外因性Ｆｌａｇ融合蛋白質がウェスタンブロット分析により免疫検出されたことを示す。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。Ｔｍ処理は細胞採取１２時間前に開始された。
【図６】図６は、小胞体ストレスを検出するためのＥＲＡＩに基づいた方法の特異性を調べた結果を示す。
ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓは、ｐＣＡＧ−βｇａｌと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は種々のストレス誘導剤に暴露された；熱（４２℃の培養温度）またはツニカマイシン（Ｔｍ）、タプシガーギン（Ｔｇ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＭＧ１３２、エトポシド（Ｅｔｐ）、またはテオニルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ）による処理。グラフはトランスフェクトされた細胞における蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。各々の処理は細胞採取６または１２時間前に開始された。
【図７】図７は、図６と同様に種々の処理に暴露されたヒーラー細胞におけるＢｉＰ発現レベルを、ノーザンブロット分析により試験した結果を示す。処理後の時間は各々のレーンの上に示されている。ＧＡＰＤＨ発現レベルが内部標準として使用された。
【図８】図８は、ＸＢＰ１ｍＲＮＡのＩＲＥ１α−依存性スプライシングを示す。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓはｐＣＡＧ−βｇａｌおよびＩＲＥ１発現ベクターと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトされた。ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞中の蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for expressing a protein using a frame shift of mRNA in the presence of a biological stimulus.
[0002]
[Prior art]
In eukaryotic cells, endoplasmic reticulum stress conditions (including accumulation of unfolded protein in the endoplasmic reticulum) induce several adaptive responses. One of these is the abnormal folding protein response (UPR), which increases protein folding activity and prevents aggregation of abnormal folding proteins within the endoplasmic reticulum, to prevent endoplasmic reticulum-localized chaperones and folding catalysts. Leading to transcriptional activation of the gene encoding¹. The UPR signaling pathway is well investigated in yeast.
[0003]
IRE1 and HAC1 are essential molecules for UPR in budding yeast. IRE1 is a type I transmembrane protein located in the endoplasmic reticulum, and has a homologous region of serine / threonine protein kinase and RNase L at the carboxyl terminus. The amino terminal region of IRE1 senses the accumulation of abnormally folded proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum, leading to IRE1 oligomerization and trans-autophosphorylation. Ultimately, this molecule induces unusual splicing of HAC1 mRNA. Spliced HAC1 mRNA is efficiently translated, and HAC1 protein (transcription factor) activates various target gene promoters of UPR².
[0004]
In the mammalian genome, two homologs of yeast IRE1, IRE1α^ThreeAnd IRE1β^FourHowever, HAC1 homologs have not yet been identified. However, several RNA molecules have been identified as cleavage targets for the ribonuclease domain of mammalian IRE1. During ER stress, each IRE1 mRNA is cleaved by its own IRE1, and 28S rRNA is cleaved by IRE1β.^5,6. Recently, Yoshida et al. Reported that, under endoplasmic reticulum stress conditions, XBP1 precursor mRNA is a target for atypical splicing by IRE1. In human cells, XBP1 mRNA regions 531 to 556 (26 nucleotide introns) are spliced during endoplasmic reticulum stress, leading to a “frame shift” of XBP1 mRNA. The spliced XBP1 mRNA is translated into the mature XBP1 protein and induces transcription of the target gene via the cis sequences ERSE (endoplasmic reticulum stress response element) and UPRE (folded abnormal protein response element). Transcription through ERSE or UPRE results in the induction of endoplasmic reticulum chaperone genes such as BiP, PDI, and GRP94.
[0005]
Excessive endoplasmic reticulum stress is known to induce cell death. If the adaptive response to endoplasmic reticulum stress is not sufficient, an apoptotic response is initiated leading to activation of JNK and caspases 7 and 12 in mammalian cells^8-10. In studies of neurodegenerative diseases, it has been reported that endoplasmic reticulum stress and UPR are closely related to neuronal cell death caused by Alzheimer's disease and Parkinson's disease^11,12. Endoplasmic reticulum stress response signaling molecules have also been shown to be required for development¹³. Thus, studies on endoplasmic reticulum stress and endoplasmic reticulum stress response are expected to provide useful information for pathology and developmental biology and cell biology. As a first step to study endoplasmic reticulum stress in vivo, it is important to develop a method for visualizing cells undergoing endoplasmic reticulum stress.
[0006]
Conventionally, endoplasmic reticulum stress is detected by measuring the expression level of a certain type of endoplasmic reticulum molecular chaperone. Specifically, the expression level of BiP or calreticulin mRNA is measured by radioactivity by Northern blot analysis, or the promoter activity of genes encoding these molecules is measured by a reporter molecule such as luciferase. Endoplasmic reticulum stress has been detected. However, since these methods involve a step of lysing cells, it is impossible to accurately identify a histological region subjected to endoplasmic reticulum stress at a solid level. In addition, it is impossible to detect endoplasmic reticulum stress in living cells. Thus, these methods do not provide sufficient information about the spatial and temporal changes of endoplasmic reticulum stress in real time in vivo.
[0007]
Another possible method is to use a gene expression construct in which a fluorescent protein coding gene is linked under the control of a BiP or calreticulin gene promoter. This method has the advantage that the endoplasmic reticulum strel can be detected as a living cell at the cultured cell level, but is considered to be less useful due to its low sensitivity.
[0008]
In general, there is a demand for a method that can detect a biological stimulus other than endoplasmic reticulum stress with high sensitivity without destroying cells.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for expressing a protein in the presence of a biological stimulus. The method of the present invention introduces into a cell, embryo, organ, tissue or non-human individual a vector containing a gene whose mRNA is frame-shifted in the presence of a biological stimulus (stimulation response gene) and a gene encoding a target protein. Where the stimulus response gene and the target protein gene are frame-shifted in the vector of the stimulus response gene so that the reading frames of both genes match only when a biological stimulus is present in the vector. Are arranged.
[0010]
The method of the present invention is preferably for detecting the presence of a biological stimulus by measuring fluorescence in the cell, embryo, organ, tissue or non-human individual, for example, by applying a fluorescent protein as the target protein. Can be used. In vivo stimulation includes, for example, endoplasmic reticulum stress.
[0011]
The present invention also provides a fusion gene expression vector of a gene (stimulation response gene) whose mRNA is frame-shifted in the presence of a biological stimulus and a gene encoding a target protein for use in the protein expression method. For the purpose.
[0012]
A further object of the present invention is to provide a reagent for use in the method, comprising the vector together with a suitable adjuvant.
A further object of the present invention is to provide a cell, embryo, organ, tissue or non-human individual into which the vector has been introduced.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research, the present inventors have constructed a method for expressing a protein only in the presence of a biological stimulus using a gene whose mRNA is frame-shifted in the presence of the biological stimulus. The present invention has been conceived.
[0014]
Methods for expressing proteins in the presence of biological stimuli
Thus, the present invention provides a method for expressing a protein in the presence of a biological stimulus. In the method of the present invention, a fusion gene expression vector of a gene (stimulation response gene) whose mRNA is frame-shifted in the presence of a biological stimulus, and a gene encoding a target protein is used as a cell, embryo, organ, tissue or non-human individual. Where the stimulus response gene and the target protein gene are frame-shifted in the vector of the stimulus response gene and the reading frames of both genes match only when a biological stimulus is present in the vector. It arrange | positions so that it may carry out.
[0015]
The principle of the present invention is as follows. The vector contains a gene (stimulation response gene) whose mRNA is frame-shifted in the presence of biological stimulation, and a gene encoding a target protein. Stimulation response gene mRNA is a target for ribonuclease splicing in response to the presence of biological stimuli. When a frame shift occurs in the mRNA by splicing, the reading frame matches the gene encoding the target protein, and a fusion protein of the protein encoded by the stimulus response gene (stimulation response protein) and the target protein is expressed. In the absence of the desired biological stimulus, no frame shift occurs and the fusion protein with the target protein is not expressed because the reading frame with the stimulus response gene does not match. Therefore, the present invention is characterized in that the target protein is expressed only in the presence of the stimulus by utilizing the frame shift of the mRNA of the stimulus response gene in accordance with the presence of the biological stimulus.
[0016]
In the present specification, “biological stimulation” is not particularly limited. It is preferable that one or a plurality of ribonucleases are expressed or activated in response to the stimulation and a frame shift is caused in the mRNA by splicing a specific mRNA. Although not limited, endoplasmic reticulum stress etc. are mentioned. In a specific cancer cell, when a frame shift occurs in mRNA of a certain gene but not in a normal tissue, such a cancer state is also included in “biological stimulation” in the present specification.
[0017]
“A gene whose mRNA is frame-shifted in the presence of a biological stimulus” refers to a gene in which splicing is different in the presence and absence of a biological stimulus, resulting in a frame shift. That is, the gene has different lengths in the presence and absence of biological stimuli and the difference in base sequence length is not a multiple of 3, so that the reading frame is shifted. In this specification, for the sake of brevity, it is sometimes called a “stimulation response gene”. Splicing may occur only in the presence or absence of biostimulation, or alternatively splicing occurs in both the presence and absence of biostimulation, but in a different manner May occur.
[0018]
Examples of stimuli responsive genes include the XBP1 gene, in which a 26 nucleotide intron is spliced in response to endoplasmic reticulum stress. The XBP1 gene is known, for example, in humans, cows, mice, Xenopus and zebra fish, and its cDNA sequence is registered in the EST database as BE170119, AV604667, BF143019, AF358133, and AF399918, respectively. . In the sequence listing described later in this specification, the cDNA sequence of human XBP1 is shown as SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number AB076383).
[0019]
The target protein is a protein intended to be expressed only in the presence of a biological stimulus, and is not particularly limited. The stimulus response gene and the target protein gene are arranged in the vector so that the mRNA of the stimulus response gene is frame-shifted and the reading frames of both genes match only when a biological stimulus is present. Therefore, the target protein is expressed only when a biological stimulus is present.
[0020]
When a fluorescent protein is used as the target protein, it is possible to detect the presence or absence of biological stimulation by measuring fluorescence in cells, embryos, organs, tissues or non-human individuals into which a vector has been introduced. An example of the fluorescent protein is preferably green fluorescent protein (GFP) or a variant thereof. GFP is a general term for green fluorescent proteins possessed by luminescent jellyfish. Aequorea GFP is excited by ultraviolet rays of about 500 nm and emits green fluorescence. This fluorescence requires no special factors other than oxygen. When a GFP gene is introduced as a foreign gene, cultured cells having fluorescence, plants, nematodes, flies, fish, mice, and the like can be obtained, so that expression can be directly observed in living cells. Furthermore, EGFP (enhanced green fluor protein), YFP (yellow fluor protein), BFP (blue fluor protein), RFP (red fluor protein), and the like, which are GFP mutants that emit stronger fluorescence, have been developed. (For example, available from Clontech). In the method of the present invention, only when a biological stimulus is present in the introduced expression vector, the reading frames of the stimulus-responsive gene and the fluorescent protein gene match and the fusion protein of both is expressed. By measuring fluorescence, it is possible to obtain information on the intracellular localization, tissue localization, or temporal localization of biological stimulation.
[0021]
Alternatively, as a biostimulation, when a specific cancer cell undergoes a frame shift in the mRNA of a certain gene but does not occur in a normal tissue, the target protein can be converted into a cancer cell by using the method of the present invention. Can only be expressed. By expressing a toxic protein such as caspase or p53 as a target protein, it is possible to specifically attack cancer cells.
[0022]
Other examples of target proteins that can be expressed in the method of the present invention include luciferase and β-galactosylase.
Vector, cell and the like of the present invention, and vector introduction method
In the method of the present invention, a vector containing a stimulus response gene and a target protein, a cell into which the vector is introduced, a vector introduction method, and the like are not particularly limited, and a known vector or the like can be used.
[0023]
The cell or the like as a model system that can be used in the present invention is not particularly limited, and may be a single cell such as a bacterium (for example, Escherichia coli or lactic acid bacterium) or a yeast (for example, budding yeast or fission yeast). Alternatively, it can be used in cultured cells derived from humans (eg, HeLa, 293T, SH-SY5Y), mice (eg, Neuro2a, NIH3T3), and the like. All of these are known and are commercially available (for example, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) or available from public research institutions (for example, RIKEN Cell Bank). Alternatively, embryos, organs, tissues or non-human individuals can also be used.
[0024]
Although not limited thereto, methods for incorporating the DNA fragment of the gene of the present invention into a recombinant expression vector such as a plasmid include those described in Sambrook, J. et al. Et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989). For convenience, a commercially available ligation kit (for example, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can also be used. A recombinant vector (for example, a recombinant plasmid) thus obtained is introduced into the above-described cell, embryo, organ, tissue, non-human individual or the like.
[0025]
As a method for introducing a plasmid into a host cell, Sambrook, J. et al. Et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989), chemistry such as calcium phosphate method / calcium chloride / rubidium chloride method, electroporation method, electroinjection method, PEG, etc. And a method using a general treatment, a method using a gene gun, and the like.
[0026]
A vector can be conveniently prepared by linking a desired gene to a recombination vector (for example, plasmid DNA) available in the art by a conventional method. The type of expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene in various types of prokaryotic cells and / or eukaryotic cells and overexpressing a desired protein.
Established methods for introducing nucleic acids into mammalian cells are described in Kaufman, R .; J. et al. Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Additional protocols using commercially available reagents such as Lipofectamine lipid reagent (Gibco / BRL) or Lipofectamine-Plus lipid reagent can be used to transfect cells (Felner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987). Further, using electroporation, mammals using conventional methods, such as those in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). It is possible to transfect cells. Selection of stable transformants can be performed using methods known in the art, such as resistance to cytotoxic drugs.
[0027]
Transcriptional and translational regulatory sequences for mammalian host cell expression vectors can be excised from the viral genome. Commonly used promoter and enhancer sequences are derived from polyoma virus, adenovirus 2, simian virus 40 (SV40), or human cytomegalovirus. Preferably, an enhancer derived from human cytomegalovirus can be used. Providing other genetic elements for expression of structural gene sequences in mammalian host cells using DNA sequences from the SV40 viral genome, such as SV40 origin, early and late promoters, enhancers, splicing, and polyadenylation sites Is possible. In order to enable expression in cells derived from two or more species, the promoter and enhancer may be derived from different species.
[0028]
Alternatively, the vector can be introduced into lower eukaryotes such as yeast or into prokaryotes such as bacteria. Potentially suitable yeast strains include any yeast strain capable of expressing a heterologous polypeptide, such as Saccharomyces cerevisiae. Potentially suitable bacterial strains include any bacterial strain capable of expressing a heterologous polypeptide, such as Escherichia coli. Insect expression systems are also available.
[0029]
The present invention also provides a reagent for use in the method for expressing the protein of the present invention comprising the vector together with a suitable adjuvant. Appropriate adjuvants contained in the reagent of the present invention can be appropriately selected by the parties depending on the type of cells into which the vector is introduced, the method of introduction, and the like.
[0030]
Preferred Embodiments of the Invention
In pathological and developmental studies, there is a need for methods that can monitor endoplasmic reticulum stress in vivo. The method of the present invention can be used to non-destructively and continuously visualize endoplasmic reticulum stress in living cells. The inventors have developed an index for endoplasmic reticulum stress in living cells, termed “ERAI” (endoplasmic reticulum stress activation index).
[0031]
The principle of this embodiment is shown as a schematic diagram in FIG. This embodiment is based on XBP1 mRNA splicing by IRE1 that occurs under endoplasmic reticulum stress conditions. The endoplasmic reticulum stress indicator gene is constructed by fusing XBP1 and a fluorescent protein such as a GFP mutant, venus. The fusion mRNA is a target for unconventional splicing by IRE1α, and during endoplasmic reticulum stress, a 26 nucleotide intron (corresponding to bases 502-527 of SEQ ID NO: 1 in humans) is spliced, leading to a frameshift of the indicator mRNA. XBP1 is spliced under endoplasmic reticulum stress conditions, but this splicing is rarely observed under normal conditions⁷. Finally, translation of the spliced mRNA is terminated at the termination codon of the fluorescent protein. As a result, under endoplasmic reticulum stress conditions, bases 9-501 and 528-1165 in SEQ ID NO: 1 become the coding region by translation of XBP1 mRNA and are translated into an XBP1 protein consisting of 376 amino acid residues (SEQ ID NO: 2). The Since the gene encoding the fluorescent protein is bound in-frame to the spliced XBP1 mRNA, a fusion protein of XBP1 and the fluorescent protein is produced in this case. On the other hand, under normal conditions, that is, at the time of non-splicing, bases 9-794 in SEQ ID NO: become a coding region (SEQ ID NO: 3) and is translated into an XBP1 protein (short form) consisting of 261 amino acid residues (SEQ ID NO: 4). The
[0032]
Thus, under endoplasmic reticulum stress, a fusion protein of XBP1 and a fluorescent protein is produced, and cells exposed to endoplasmic reticulum stress can be detected by the fluorescent activity of the fluorescent protein. On the other hand, in the absence of endoplasmic reticulum stress, no frame shift occurs due to splicing, and translation is terminated at a termination codon near the junction between the genes of XBP1 and the fluorescent protein. Therefore, translation of the fluorescent protein that is the target protein is not induced.
[0033]
In this embodiment, the endoplasmic reticulum stress may be a naturally occurring biological stimulus or an artificially generated biological stimulus. In Example 3 to be described later, it was confirmed that when a certain condition was artificially given to a cell, endoplasmic reticulum stress occurred and UPR was induced in the cell. Specifically, tunicamycin, thapsigargin and DTT are considered strong endoplasmic reticulum invasion factors, and heat (42 ° C.) and MG132 are considered weak endoplasmic reticulum invasion factors. Therefore, it is possible to express target proteins (including fluorescent proteins) by artificially applying the above-described treatment using the method of the present invention. Alternatively, the target protein can also be expressed by overexpressing IRE1α, an essential molecule of UPR, in cells (Example 5, FIG. 8).
[0034]
The fluorescent protein can be detected by observing the fluorescence by a known method at a fluorescence maximum wavelength corresponding to the type of the fluorescent protein. Although not limited, GFP emits green fluorescence when excited by ultraviolet rays of about 500 nm. EGFP, YFP, BFP, and RFP are excited by wavelengths of 488 nm, 513 nm, 380 nm, and 558 nm, respectively, and observe wavelengths of 507 nm, 527 nm, 440 nm, and 583 nm.
[0035]
The vector pCAX described in FIG. 3 has a cytomegalovirus enhancer and a chicken β-actin promoter. Therefore, this vector can express downstream genes in both human and chicken cells.
[0036]
Further, the vector shown in FIG. 3 is a nucleotide sequence encoding a FLAG® peptide, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, in order to facilitate identification of the expressed fusion protein. Is included. The peptide is highly antigenic and provides an epitope to which specific monoclonal antibodies bind reversibly, allowing rapid assay and easy purification of the expressed recombinant protein. The murine hybridoma designated 4E11 is a FLAG® peptide in the presence of certain divalent metal cations, as described in US Pat. No. 5,011,912, incorporated herein by reference. Monoclonal antibodies that bind to The 4E11 hybridoma cell line has been deposited with the American Type Culture Collection under deposit number HB 9259. Alternatively, monoclonal antibodies that bind to the FLAG® peptide are available from, for example, Sigma, Eastman Kodak, and the like.
[0037]
The method of the present invention functions as a specific and highly sensitive endoplasmic reticulum stress index in a wider measurement range than a reporter regulated by a promoter of a target gene of folding abnormality protein response (UPR) (Reference Example 1). In addition, the basic level of this indicator is very low. Thus, the method of the present invention can be applied to visualize endoplasmic reticulum stress in living cells. Although an example using human cultured cells was described in the examples described later, the method of the present invention worked well not only in humans but also in mouse cultured cells (data not shown). Thus, nondestructive and continuous monitoring of specific tissues and organs of transgenic animals (including transgenic mice) expressing ERAI can be performed. These transgenic animals provide information about the physiological endoplasmic reticulum stress that occurs during development and the relationship between endoplasmic reticulum stress and several diseases. In addition, cells exposed to endoplasmic reticulum stress in vivo can be isolated from these transgenic animals by use of a cell sorting system.
[0038]
ERAI has two favorable properties: low basal activity and wide measurement range. Therefore, this indicator is useful for high-throughput screening for substances that induce or reduce endoplasmic reticulum stress.
[0039]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present specification, and these are included in the technical scope of the present invention. In the following Examples and Reference Examples, the following methods were used unless otherwise specified.
[0040]
Cell culture, transfection and processing
Healer cells and HEK293T cells (derived from human fetal kidney cells) were 5% CO in αMEM supplemented with 60 μg / ml kanamycin and 10% fetal calf serum.₂The culture was performed at 37 ° C. in an atmosphere. The composition of the MEM medium is as shown in Table 1 below.
[0041]
[Table 1]

Each plasmid was transfected into the cells by the calcium phosphate-DNA precipitation method. After transfection, the medium was changed every 6 hours to avoid glucose starvation causing endoplasmic reticulum stress. To test the cellular response to each drug, the cells were analyzed for various times at 5 μg / ml tunicamycin, 5 μg / ml tapsigargin, 1 mM dithiothreitol, 10 μM MG132, 100 μM etoposide, or 100 μg / ml theontritrie. Treated with fluoroacetone.
[0042]
Measurement of fluorescence intensity
Cells were lysed in digitonin buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 10 mM EGTA and 10 μM digitonin) for 30 minutes at 37 ° C., then the lysate was clarified by centrifugation at 16,500 g. The fluorescence of the supernatant (emission at 520 nm excited at 485 nm) was measured with a spectrofluorimeter (Biolumin 960, Molecular Dynamics). The fluorescence intensity of each sample was normalized to β-galactosidase activity. Values are given as mean ± SEM of data obtained from 3 experiments.
[0043]
Western blot analysis
Cells were lysed in SDS sample buffer (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 50 mM DTT, 10% glycerol, and 1 μg / ml bromophenol blue), then the lysate was boiled at 98 ° C. for 10 minutes. did. Proteins in the lysate were separated by SDS-PAGE (15% gel). After electrophoresis, the protein was electrically transferred onto a polyvinylidene fluoride microporous membrane and immunodetection was performed with an anti-Flag monoclonal antibody (Sigma) using standard methods.
[0044]
Northern blot analysis
Total RNA was prepared using Isogen reagent (Nippon gene). Twenty micrograms of total RNA was added to each lane of a 1% denaturing agarose gel and transferred onto a Hybond-N membrane (Amersham-Pharmacia). Hybridization was performed at 42 ° C. in a standard solution. The membrane was washed at 65 ° C. in 2 × SSC.
[0045]
The following probes were used for detection of BiP and GAPDH: BiP, +1 to +1959 of the coding region; GAPDH, +75 to +1019. The base sequences of BiP and GAPDH are disclosed in GenBank AF216292 (SEQ ID NO: 6) and BC004109 (SEQ ID NO: 7), respectively.
[0046]
Reference Example 1 Detection of endoplasmic reticulum stress in living cells using a venus expression vector regulated by the promoter of the UPR target gene
Under endoplasmic reticulum stress conditions, transcription of UPR target genes such as BiP and calreticulin is activated via the fold abnormal protein element (UPRE) and endoplasmic reticulum stress response element (ERSE), which are cis elements on the promoter. Ru^14,15. These elements are known to be essential and sufficient for UPR induction, so UPRE and ERSE derived reporter genes have often been used to monitor endoplasmic reticulum stress. Green fluorescent protein (GFP) and its variants have been widely used as indicators or markers in living cells.
[0047]
To monitor endoplasmic reticulum stress in living mammalian cells, two expression vectors were designed in which the cDNA of the GFP mutant “venus” is regulated by the promoter of human BiP or mouse calreticulin (FIG. 1). .
[0048]
Specifically, pBiP (−304) / venus is a human BiP promoter (−304).^14,15And the SV40 intron / polyA sequenceBglII /XhoIt was prepared by inserting venus cDNA into the I site. pCRT (-2.3k) / venus is the mouse calreticulin promoter (-2.3k)¹⁸And the SV40 intron / polyA sequenceBglII /XhoIt was prepared by inserting venus cDNA into the I site.
[0049]
Venus is a modification of EYFP, which is a mutant of GFP. EYFP is a known fluorescent protein, and its amino acid sequence has been deposited with NCBI as accession number AAF65455, and is described as SEQ ID NO: 5 in the sequence listing of the present specification. Venus is modified at the following 5 amino acid residues in the EYFP sequence, and exhibits very strong fluorescence activity: F47L / F65L / M154T / V164A / S176G. We chose venus as a marker because it shows high folding activity, and acidosis and Cl^-Because it showed resistance to exposure to¹⁶. These features are convenient for studying cells under stress-inducing conditions.
[0050]
Figures 1 and 2 show the results of endoplasmic reticulum stress detection in living cells with a venus expression vector regulated by the promoter of the UPR target gene. Each indicator plasmid was simultaneously transfected into pCAG-βgal and Healer cells. In FIG. 1, the histogram shows the relative fluorescence intensity of the transfected cells. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. The lysate was used to measure fluorescence intensity. Tunicamycin (Tm) treatment was started 6 hours before cell collection. FIG. 2 is a photomicrograph showing fluorescence activity (green) in cells transfected immediately prior to cell collection. These fluorescent images were superimposed on the phase contrast image.
[0051]
When each venus expression vector was transiently transfected into Healer cells, the fluorescence intensity of venus increased in cells treated with tunicamycin (an endoplasmic reticulum stress agent). However, the fluorescence level under endoplasmic reticulum stress conditions was only 2.5 to 3 times higher than under normal conditions (FIG. 1). This is because the basic fluorescence intensity in the cells was considerably high under normal conditions (FIG. 2). Under normal conditions, BiP and mouse calreticulin are expressed at some level in cells, so the high basal activity of this reporter is not unexpected.
[0052]
Example 1 Construction of a vector
In this example, a vector in which a venus coding region was fused downstream of a partial sequence of human XBP1 containing an endoplasmic reticulum stress-specific intron (26 nucleotides) was prepared.
[0053]
Two DNA fragments (F-XBP1 and F-XBP1ΔDBD) were generated by PCR; the former contains a Kozak sequence, Flag tag sequence and a portion of human XBP1 cDNA (12-604 nucleotides of SEQ ID NO: 1), and The latter contains a Kozak sequence, a Flag tag sequence and a smaller portion of the human XBP1 cDNA (381-604 nucleotides of SEQ ID NO: 1), which lacks a DNA binding domain. F-XBP1-venus and F-XBP1ΔDBD-venus are downstream of F-XBP1 and F-XBP1ΔDBD, respectively.BglIt was prepared by binding venus cDNA to site II.
[0054]
F-XBP1-venus and F-XBP1ΔDBD-venus are mammalian expression vectors, pCAX (activate downstream gene expression by cytomegalovirus enhancer and chicken β-actin promoter)KpnI /BamInserted into the HI site. The plasmid pCAX can be distributed, for example, from the Miura Laboratory of the Research Institute for Restoration Mechanism, RIKEN Brain Science Institute. pCAX-F-XBP1-venus and pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus serve as indicator plasmids in both human and mouse cultured cells. A plasmid containing the cytomegalovirus enhancer and the β-galactosidase gene linked to the chicken β-actin promoter (pCAG-βgal) was used as an internal standard for transfection efficiency.
[0055]
The scheme of endoplasmic reticulum stress activation index (ERAI) is shown in FIG. . Transcripts from pCAX-F-XBP1-venus or pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus are not spliced under normal conditions. Unspliced mRNA is translated into truncated XBP1 with a Flag tag at the N-terminus. Under endoplasmic reticulum stress conditions, these transcripts are spliced leading to a frameshift. The spliced mRNA is translated into an XBP1-venus fusion protein with a Flag tag at the N-terminus. Therefore, fluorescence is detected only in cells exposed to endoplasmic reticulum stress.
[0056]
Example 2 Detection of XBP1-venus fusion protein by endoplasmic reticulum stress
To test whether the fusion gene actually works well as an indicator of endoplasmic reticulum stress in mammalian cells, a fusion gene expression vector was transfected into HEK293T cells.
[0057]
As a fusion gene in these experiments, a vector containing F-XBP1-venus and F-XBP1ΔDBD-venus prepared in Example 1 (which lacks the DNA-binding domain of XBP1) was used. Each fusion gene encodes a protein having a FLAG tag at the N-terminus. Each indicator plasmid was transfected into HEK293T cells.
[0058]
FIG. 4 is a microscopic image showing fluorescence activity (green) in cells 36 hours after transfection. Tunicamycin (Tm) treatment was started 12 hours before taking an image. These fluorescent images were superimposed on the phase contrast image. In cells transfected with the F-XBP1-venus expression vector, tunicamycin treatment resulted in detectable fluorescence in the nucleus, whereas under normal conditions it was hardly detected in any compartment (FIG. 4).
[0059]
The observations in FIG. 4 were consistent with the results of Western blot analysis. Specifically, cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. Tm treatment was started 12 hours before cell collection. Exogenous Flag fusion protein was immunodetected by Western blot analysis using anti-Flag monoclonal antibody (Sigma). The results are shown in FIG.
[0060]
The signal of the XBP1-venus fusion protein (45 kDa) was very strong under endoplasmic reticulum stress conditions, but slight under normal conditions. A truncated XBP1 (30 kDa) translated from unspliced mRNA was detected under both conditions (FIG. 5A). The truncated XBP1 (30 kDa) was expressed not only under normal conditions but also under ER stress conditions because not all mRNAs are spliced even under stress conditions.
[0061]
F-XBP1ΔDBD-venus also worked similarly to F-XBP1-venus as an indicator for endoplasmic reticulum stress in living cells. However, the fusion protein was localized in the cytoplasm, and the truncated XBP1 was not detected (FIGS. 4B and 5B). Without being bound by theory, the short form of XBP1 was not detected even under normal conditions, probably because XBP1 lacking the DNA-binding domain is structurally unstable and immediately after synthesis. It may be because it has been disassembled.
[0062]
All data described below were obtained using cells transfected with the F-XBP1ΔDBD-venus expression vector.
Example 3 Northern blot analysis of BiP expression levels in cells under various conditions
The endoplasmic reticulum is an intracellular organ, its function is to correctly fold and assemble secreted and membrane proteins and to transport these proteins to other intracellular organs. When cells are cultured under certain conditions, these endoplasmic reticulum functions are weakened, leading to the induction of UPR in the cells. To determine UPR activity under various culture conditions, BiP expression levels in cells were measured by Northern blot analysis (FIG. 7).
[0063]
The following conditions were used: 42 ° C. heat shock or tunicamycin (inhibitor of N-linked glycosylation), thapsigargin (Ca from endoplasmic reticulum)²⁺Release agent), dithiothreitol (DTT, a reducing agent that disrupts disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum), MG132 (inhibitor of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system), etoposide (apoptosis inducer), or theonyl trifluoroacetone ( Chemical hypoxia inducer). BiP expression levels in Healer cells exposed to various treatments were tested by Northern blot analysis. The time after processing is shown above each lane in FIG. GAPDH expression level was used as an internal standard.
[0064]
As shown in FIG. 7, after treatment with tunicamycin, thapsigargin and DTT, BiP-stimulated radioactivity increased 15-fold at 6 hours. In addition, after 6 hours when cells were cultured at 42 ° C. or treated with MG132, BiP levels increased 2 or 4 fold, respectively. BiP gene expression was not activated by etoposide, theonyl trifluoroacetone or sham treatment. From these data, tunicamycin, thapsigargin and DTT are considered strong endoplasmic reticulum stress agents, heat (42 ° C.) and MG132 are considered weak endoplasmic reticulum stress agents, and etoposide and theonyltrifluoroacetone are endoplasmic reticulum stress agents. is not.
[0065]
Example 4 Examination of characteristics of the method of the present invention based on ERAI for detecting ER stress
The conditions examined in FIG. 7 of Example 4 were analyzed using F-XBP1ΔDBD-venus transfected cells. Specifically, pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus was transfected into healer cells simultaneously with pCAG-βgal. Transfected cells were exposed to various stress inducers; heat (42 ° C. culture temperature) or tunicamycin (Tm), thapsigargin (Tg), dithiothreitol (DTT), MG132, etoposide (Etp), or theoni Treatment with rutrifluoroacetone (TTFA). The graph in FIG. 4 shows the fluorescence intensity in the transfected cells. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. The lysate was used to measure fluorescence intensity. Each treatment was started 6 or 12 hours before cell collection.
[0066]
In F-XBP1ΔDBD-venus transfected cells, according to the Northern blot analysis of FIG. 7, BiP gene induction was saturated at 6 hours, but the fluorescence intensity increased with time for 12 hours, with strong endoplasmic reticulum. After treatment with the stress agent, it reached 30-70 times the basal level. In cells exposed to a weak endoplasmic reticulum stress agent, the fluorescence level increased to 5 times the basal level. Little fluorescence was detected in cells treated with etoposide or theonyltrifluoroacetone or control cells (FIG. 6).
[0067]
Therefore, these data of FIG. 6 based on the fluorescence intensity correlated with the result of the Northern blot analysis of FIG. These results indicate that the method of the present invention acts as a specific and sensitive indicator for endoplasmic reticulum stress over a wide measurement range. In addition, the basal level of this indicator is lower than the basal level of the reporter plasmid using the promoter of the UPR target gene. The results of this example show that the method of the present invention can be applied to visualization of endoplasmic reticulum stress in living cells.
[0068]
Example 5 Measurement of fluorescence intensity in IRE1α-overexpressing cells
XBP1 mRNA is spliced when IRE1α is overexpressed in the cell as well as when the cell is exposed to endoplasmic reticulum stress⁷. IRE1α overexpression causes its own oligomerization and autophosphorylation, which induces UPR^Three. In this example, fluorescence intensity was measured in IRE1α-overexpressing cells.
[0069]
In this example, pCAG-hIRE1α and pCAG-hIRE1α K599A were used as expression vectors for human IRE1α and human IRE1α K599A, respectively. Regarding the sequence of IRE, in human IRE1α K599A, the lysine at position 599 is mutated to alanine. The 599 lysine is a residue known to be widely conserved among species within the kinase subdomain of IRE.⁶.
[0070]
pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus was transfected into Healer cells simultaneously with the pCAG-βgal and IRE1 expression vectors. FIG. 8 shows the result of IRE1α-dependent splicing of this indicator mRNA, and the histogram shows the fluorescence intensity in the transfected cells. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. The lysate was used to measure fluorescence intensity.
[0071]
As shown in FIG. 8, fluorescence was detected at a high level in IRE1α-overexpressing cells, but was hardly observed in cells overexpressing the kinase mutants IRE1α and IRE1α K599A. In addition, sequence analysis of RT-PCR products was performed to confirm that the splicing site of the indicator mRNA was identical to endogenous XBP1 mRNA (data not shown). These data confirm that splicing of the indicator mRNA is dependent on IRE1α under endoplasmic reticulum stress conditions in a manner similar to endogenous XBP1 mRNA.
References
The contents of the following documents are incorporated herein by reference as references.
[0072]
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5. Tirasophon, W., Lee, K., Callaghan, B., Welihinda, AA & Kaufman, RJ The endoribonuclease activity of mammalian IRE1 autoregulates its mRNA and is required for the unfolded protein response. Genes Dev. 14, 2725-2736 (2000).
6. Iwawaki, T et al. Translational control by the ER transmembrane kinaseribonuclease IRE1 under er stress. Nat. Cell Biol. 3, 158-164 (2001).
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[0073]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of endoplasmic reticulum stress detection in living cells with a venus expression vector regulated by the promoter of a UPR target gene (BiP and calreticulin). Each indicator plasmid was simultaneously transfected into pCAG-βgal and Healer cells. The histogram shows the relative fluorescence intensity of the transfected cells. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. The lysate was used to measure fluorescence intensity. Tunicamycin (Tm) treatment was started 6 hours before cell collection.
FIG. 2 shows the results of endoplasmic reticulum stress detection in living cells with a venus expression vector regulated by the promoter of the UPR target gene. Each indicator plasmid was simultaneously transfected into pCAG-βgal and Healer cells. Tunicamycin (Tm) treatment was started 6 hours before cell collection. FIG. 2 is a photomicrograph showing fluorescence activity (green) in cells transfected immediately prior to cell collection. These fluorescent images were superimposed on the phase contrast image.
FIG. 3 is an endoplasmic reticulum stress activation index (ERAI) scheme. Transcripts from pCAX-F-XBP1-venus or pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus are not spliced under normal conditions. Unspliced mRNA is translated into truncated XBP1 with a Flag tag at the N-terminus. Under endoplasmic reticulum stress conditions, these transcripts are spliced leading to a frameshift. The spliced mRNA is translated into an XBP1-venus fusion protein with a Flag tag at the N-terminus. Therefore, fluorescence is detected only in cells exposed to endoplasmic reticulum stress.
FIG. 4 shows detection of XBP1-venus fusion protein during endoplasmic reticulum stress. Each indicator plasmid was transfected into HEK293T cells. FIG. 4 is a microscopic image showing fluorescence activity (green) in cells 36 hours after transfection. Tunicamycin (Tm) treatment was started 12 hours before taking an image. These fluorescent images were superimposed on the phase contrast image.
FIG. 5 shows detection of XBP1-venus fusion protein during endoplasmic reticulum stress. Each indicator plasmid was transfected into HEK293T cells. FIG. 5 shows that the exogenous Flag fusion protein was immunodetected by Western blot analysis. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. Tm treatment was started 12 hours before cell collection.
FIG. 6 shows the results of examining the specificity of an ERAI-based method for detecting endoplasmic reticulum stress.
pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus was transfected into healer cells simultaneously with pCAG-βgal. Transfected cells were exposed to various stress inducers; heat (42 ° C. culture temperature) or tunicamycin (Tm), thapsigargin (Tg), dithiothreitol (DTT), MG132, etoposide (Etp), or Treatment with theonyl trifluoroacetone (TTFA). The graph shows the fluorescence intensity in the transfected cells. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. The lysate was used to measure fluorescence intensity. Each treatment was started 6 or 12 hours before cell collection.
FIG. 7 shows the results of examining the BiP expression level in Healer cells exposed to various treatments as in FIG. 6 by Northern blot analysis. The time after treatment is indicated above each lane. GAPDH expression level was used as an internal standard.
FIG. 8 shows IRE1α-dependent splicing of XBP1 mRNA. pCAX-F-XBP1ΔDBD-venus was transfected into healer cells simultaneously with the pCAG-βgal and IRE1 expression vectors. The histogram shows the fluorescence intensity in the transfected cells. Cells were harvested and lysed 36 hours after transfection. The lysate was used to measure fluorescence intensity.

Claims

Introducing into a cell, embryo, organ, tissue or non-human individual a gene whose frame shifts in the presence of a biological stimulus (stimulation response gene) and a fusion gene expression vector of the gene encoding the target protein A method for expressing a fusion protein in the presence of a biological stimulus, wherein the stimulus response gene and the target protein gene are contained in a vector only when the stimulus of the stimulus response gene is present in the vector. It is arranged so that the reading frames of both genes coincide with each other, wherein the stimulation response gene is an XBP1 gene, and the biological stimulation causes an mRNA shift of the XBP1 gene , Said method.

The method, wherein the target protein is a fluorescent protein and the biological stimulus is detected by measuring fluorescence in the cell, embryo, organ, tissue or non-human individual.

The method according to claim 2, wherein the fluorescent protein is a green fluorescent protein or a variant thereof.

A vector comprising an XBP1 gene and a gene encoding a target protein for use in the method according to any one of claims 1 to 3.

A reagent for use in the method according to any one of claims 1 to 3, comprising the vector of claim 4 together with a suitable adjuvant.

A cell, embryo, organ, tissue or non-human individual into which a vector containing a gene encoding the XBP-1 gene and the target protein is introduced ,
Here, the XBP gene and the target protein gene are arranged in the vector so that the mRNA of the XBP gene is frame-shifted and the reading frames of both genes coincide only when biological stimulation exists, Biological stimulation causes an mRNA shift of the XBP1 gene.
Said cell, embryo, organ, tissue or non-human individual .

Introducing into a cell, embryo, organ, tissue or non-human individual a gene whose frame shifts in the presence of a biological stimulus (stimulation response gene) and a fusion gene expression vector of the gene encoding the target protein A method for expressing a fusion protein in the presence of a biological stimulus, wherein the stimulus response gene and the target protein gene are contained in a vector only when the stimulus of the stimulus response gene is present in the vector. The method is characterized by being arranged so that the reading frames of both genes coincide with each other, and the biological stimulus is endoplasmic reticulum stress.

The method according to claim 7, wherein the stimulation response gene is an XBP1 gene.