JP4452791B2 - Use of cathepsin E as a tumor marker and use of cathepsin E and cathepsin D as targets for tumor angiogenesis inhibition therapy - Google Patents
Use of cathepsin E as a tumor marker and use of cathepsin E and cathepsin D as targets for tumor angiogenesis inhibition therapy Download PDFInfo
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Description
この発明は、カテプシンＥの腫瘍マーカーとしての用途およびカテプシンＥならびにカテプシンＤの腫瘍血管新生阻害療法への用途に関し、更に詳細には、カテプシンＥの血清中の測定値に基づいて腫瘍の予知・予後を判別する方法、およびカテプシンＤならびにカテプシンＥのアンジオスタチン産生能ならびにエンドスタチン産生能の差に基づいて腫瘍細胞の発育増殖および転移を抑制する腫瘍血管新生阻害療法に関するものである。 The present invention relates to the use of cathepsin E as a tumor marker and the use of cathepsin E and cathepsin D in tumor angiogenesis inhibition therapy. More specifically, the present invention relates to the prediction and prognosis of tumors based on the measured values of cathepsin E in serum. And a tumor angiogenesis inhibitory therapy that suppresses the growth and metastasis of tumor cells based on the difference in angiostatin production ability and endostatin production ability of cathepsin D and cathepsin E.
血管新生は、発生、分化や創傷治癒過程に必須の機構であるが、その一方で疾患の発症進展を促すこともよく知られている。病的血管新生は、固形腫瘍の発育増殖や浸潤、転移過程、糖尿病および未熟児網膜症の発症、進展過程、関節リウマチの慢性炎症時などでよく観察される。 Angiogenesis is an essential mechanism for development, differentiation and wound healing processes, but it is also well known that it promotes the onset of disease. Pathological angiogenesis is often observed during solid tumor growth and invasion, metastasis, development of diabetes and retinopathy of prematurity, progression, and chronic inflammation of rheumatoid arthritis.
ところで、腫瘍組織が一定の大きさを超えて発育増殖するためには、主に腫瘍細胞から分泌される血管新生促進因子による新たな血管新生が必要不可欠である。一方、腫瘍部位では血管新生阻害因子も産生され腫瘍の発育増殖を抑制することが知られている。阻害因子の作用が促進因子の作用を上回れば、腫瘍は栄養補給を断たれ休眠状態ないし壊死に陥るとされている。 By the way, in order for a tumor tissue to grow and proliferate beyond a certain size, new angiogenesis by an angiogenesis promoting factor secreted mainly from tumor cells is indispensable. On the other hand, it is known that angiogenesis-inhibiting factors are also produced at the tumor site and suppress the growth and growth of the tumor. If the action of the inhibitory factor exceeds that of the promoting factor, the tumor is said to be deprived of nutrition and become dormant or necrotic.
そこで、この血管新生阻害療法はこれら疾病に対して新たな方法論を提供するものと期待されている。なかでも、腫瘍血管新生阻害療法は、癌細胞そのものを標的とする既存の治療法と異なり、癌細胞の変異による耐性を生じにくいなどの理由から有望な治療戦略と考えられている。実際、1995年頃から血管新生を阻害する物質の探索が精力的に行われ、表1に示すような多様な阻害物質としてプロテアーゼによって産生される内在性血管新生抑制因子群が報告され、こうした阻害物質の一部を用いた腫瘍血管新生阻害療法が米国を中心に進められている。しかし、血管新生が複雑なステップの反応であることや、阻害物質のインビボ（in vivo）での作用が一様でないことなどもあって、今のところ期待される成績からはほど遠い状況にある。 Thus, this angiogenesis inhibition therapy is expected to provide a new methodology for these diseases. In particular, tumor angiogenesis inhibition therapy is considered to be a promising therapeutic strategy because it is unlikely to cause resistance due to mutation of cancer cells, unlike existing therapies that target cancer cells themselves. In fact, since 1995, the search for substances that inhibit angiogenesis has been vigorously carried out, and endogenous angiogenesis inhibitory factor groups produced by proteases have been reported as various inhibitors as shown in Table 1. Tumor angiogenesis-inhibiting therapy using a part of this is being promoted mainly in the United States. However, angiogenesis is a complex step reaction and the in vivo action of inhibitors is not uniform, so far from the expected results.
ところで、これら血管新生阻害因子を産生する悪性腫瘍のプロテアーゼは、トリプシン、プラスミン、カリクレインなどのセリンプロテアーゼの阻害剤が癌の増殖や転移を抑制すること（非特許文献１）、リソソーム性システインプロテアーゼのカテプシンＢやＬの阻害剤に浸潤抑制効果があること（非特許文献１）、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）の阻害剤に癌の増殖、浸潤、転移抑制効果があること（非特許文献２）などから、生体侵襲や転移をひき起こす悪玉として考えられてきた。 By the way, proteases of malignant tumors that produce these angiogenesis inhibitors include that serine protease inhibitors such as trypsin, plasmin, and kallikrein suppress cancer growth and metastasis (Non-patent Document 1), and lysosomal cysteine proteases. Cathepsin B and L inhibitors have an infiltration suppression effect (Non-patent Document 1), Matrix metalloproteinase (MMPs) inhibitors have cancer growth, invasion, and metastasis suppression effects (Non-Patent Document 2), etc. Therefore, it has been considered as a bad guy causing biological invasion and metastasis.
しかしながら、最近のインビトロ（in vitro）のモデル実験から、腫瘍細胞から分泌されるプロテアーゼの中に血管新生阻害因子を産生するものが含まれていることが発見され、これらが血管新生阻害因子の産生を介して間接的に悪性腫瘍の発育増殖を抑制することが示唆された。つまり、血管新生阻害因子の産生プロテアーゼは、悪性腫瘍に対して善玉として作用すると考えられ、血管新生阻害療法の新たな標的分子になり得る可能性を示唆するものである。 However, recent in vitro model experiments have discovered that proteases secreted from tumor cells include those that produce angiogenesis inhibitors, which are the production of angiogenesis inhibitors. It was suggested that the growth and growth of malignant tumors is indirectly suppressed via That is, an angiogenesis inhibitor producing protease is considered to act as a good agent for malignant tumors, suggesting the possibility of becoming a new target molecule for angiogenesis inhibition therapy.
上記内因性血管新生抑制因子のうち、アンジオスタチン(angiostatin)およびエンドスタチン(endostatin)は、血管新生を強力に阻害する内在性血管新生阻害因子で、それぞれプラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIが腫瘍から分泌される何らかのプロテアーゼによって分解されてできるポリペプチドである。これらは増殖している血管内皮細胞に選択的に作用し、休止期にある正常な血管内皮細胞には作用しない特徴をもっている。しかし、これまで、アンジオスタチンおよびエンドスタチンの産生酵素の同定や作用機序には不明な点が多かった。 Among the above-mentioned endogenous angiogenesis inhibitors, angiostatin and endostatin are endogenous angiogenesis inhibitors that strongly inhibit angiogenesis, and plasminogen and collagen XVIII are secreted from tumors, respectively. A polypeptide that can be degraded by any protease. These have a feature that selectively acts on proliferating vascular endothelial cells and does not act on normal vascular endothelial cells in a resting state. However, until now, there were many unclear points in the identification and mechanism of action of angiostatin and endostatin producing enzymes.
アンジオスタチンは、内在性血管新生阻害因子として1994年に同定された38kDaのポリペプチドで、前駆基質プラスミノーゲンのクリングルドメイン(K1−K4)のうち少なくとも3つを含んでいる（非特許文献３）。in vitroの実験系では、MMP−12（非特許文献４）、ウロキナーゼ（非特許文献５）などのプロテアーゼがアンジオスタチンの産生に関与するとされたが、これらがインビボ（in vivo）の真のアンジオスタチン産生酵素かどうかは明らかにされていなかった。 Angiostatin is a 38 kDa polypeptide identified in 1994 as an endogenous angiogenesis inhibitor, and contains at least three of the kringle domains (K1-K4) of the precursor substrate plasminogen (Non-patent Document 3). ). In in vitro experimental systems, proteases such as MMP-12 (Non-patent Document 4) and urokinase (Non-patent Document 5) have been implicated in the production of angiostatin, but these are true angiogenes in vivo. Whether it is a statin-producing enzyme has not been revealed.
本発明者らは、プラスミノーゲンがヒト前立腺癌細胞(PC3)の産生するカテプシンＤによって特異的に切断されアンジオスタチンを産生することを見出した。また、本酵素はアンジオスタチン産生過程でプラスミンを分解し、プラスミンの産生を阻害することによって血管新生促進因子VEGF(vascular endothelial growth
factor)の潜在型から活性型への変換を阻害することを明らかにし、二重のメカニズムで血管新生を抑制することを報告した（非特許文献６）。
The present inventors have found that plasminogen is specifically cleaved by cathepsin D produced by human prostate cancer cells (PC3) to produce angiostatin. In addition, this enzyme degrades plasmin in the process of angiostatin production and inhibits plasmin production, thereby inhibiting the production of angiogenesis factor VEGF (vascular endothelial growth).
It was clarified that the conversion of the latent form of factor) from the latent form to the active form was reported, and it was reported that angiogenesis was suppressed by a dual mechanism (Non-patent Document 6).
さらに、ヒト乳癌細胞(MCF7)が分泌しているカテプシンＤは、PC3細胞から分泌される分子に比べて、同じ酵素量であっても、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを産生する活性が著しく低いことを報告した（非特許文献６）。 Furthermore, cathepsin D secreted by human breast cancer cells (MCF7) has a significantly lower activity to produce angiostatin from plasminogen even when the enzyme amount is the same as that of molecules secreted from PC3 cells. (Non-Patent Document 6).
他方、エンドスタチンは、同じく内在性血管新生抑制因子として、1997年にはじめて発見された（非特許文献７）。エンドスタチンは主に血管周囲に局在するコラーゲンXVIIIのＣ末端部分がプロテアーゼによって切断されてできる22kDaのポリペプチドである。また、マウス血管内皮腫細胞株から分泌されるカテプシンＬがエンドスタチンを産生する酵素であることが報告された（非特許文献８）。しかし、カテプシンＬによって切断されたエンドスタチン断片は、ヒトにおいては検出されておらず、果たしてヒトにおいてカテプシンLがエンドスタチンの産生酵素であるかどうか不明であった。その後、MMP−9がエンドスタチン産生能を有することが報告されたが（非特許文献９）、この場合もやはり切断部位がヒトエンドスタチンと一致していなかった。また、MMP−９については、子宮内膜の血管新生の時期に一致してその発現が誘導されることから、エンドスタチンの責任酵素であるかの疑問が残った。 On the other hand, endostatin was also discovered for the first time in 1997 as an endogenous angiogenesis inhibitor (Non-patent Document 7). Endostatin is a 22 kDa polypeptide formed by cleaving the C-terminal part of collagen XVIII located mainly around blood vessels with a protease. In addition, it was reported that cathepsin L secreted from a mouse hemangioendothelioma cell line is an enzyme that produces endostatin (Non-patent Document 8). However, the endostatin fragment cleaved by cathepsin L has not been detected in humans, and it has been unclear whether or not cathepsin L is an endostatin-producing enzyme in humans. Thereafter, it was reported that MMP-9 has the ability to produce endostatin (Non-patent Document 9), but again the cleavage site was not consistent with human endostatin. Moreover, since the expression of MMP-9 was induced in accordance with the endometrial neovascularization, the question whether it was the endostatin responsible enzyme remained.
本発明者らは、腫瘍細胞から分泌されるエンドソーム・リソソーム性アスパラギン酸プロテアーゼのカテプシンＤおよびカテプシンＥがそれぞれプラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIを特異的に分解してアンジオスタチンおよびエンドスタチンを産生することを明らかにした。両酵素は、本来、エンドソーム・リソソーム系蛋白質分解システムにおいて重要な役割を果たしているが（非特許文献１０、１１）、腫瘍細胞や活性化された抗原提示細胞では一部が細胞外に分泌され、細胞外蛋白質の分解に関与することが知られている。
The inventors have shown that the endosomal and lysosomal aspartic proteases cathepsin D and cathepsin E secreted from tumor cells specifically degrade plasminogen and collagen XVIII to produce angiostatin and endostatin, respectively. Revealed. Both enzymes originally play an important role in the endosomal / lysosomal proteolytic system (Non-Patent
ところで、アンジオスタチンおよびエンドスタチンは、少なくともマウスの系においては強力な血管新生阻害活性を持つため、ヒト臨床試験においてもその劇的な効果が期待されていた。しかしながら、ヒト腫瘍の持つ多様性のためか、あるいは種の違いによるものかは分からないが、当初期待されたほどの効果は見られていない。その原因のひとつは、これらの阻害因子の作用機序についての分子生物学的な解析が十分ではなく、これら物質のもつ特徴を十分に発揮させる方法論が確立されていないことが考えられる。
本発明者は、腫瘍細胞からのカテプシンＤおよびカテプシンＥがそれぞれプラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIを特異的に分解してアンジオスタチンおよびエンドスタチンを産生することに基づいて、カテプシンＤおよびカテプシンＥを腫瘍マーカーとしての可能性について鋭意検討した結果、カテプシンＤ分子のアンジオスタチン産生能と、カテプシンＥのエンドスタチン産生能とが腫瘍細胞の発育増殖能（悪性度）に関連することを見出して、この発明を完成した。 The inventors have determined that cathepsin D and cathepsin E from tumor cells are based on the specific degradation of plasminogen and collagen XVIII to produce angiostatin and endostatin, respectively. As a result of diligent examination as to the possibility, the angiostatin-producing ability of cathepsin D molecule and the endostatin-producing ability of cathepsin E are related to the growth / proliferation ability (malignancy) of tumor cells. completed.
したがって、この発明は、カテプシンＤまたはカテプシンＥを、例えば、扁平上皮ガンなどの腫瘍に対する腫瘍マーカーとして使用することからなる使用方法を提供することを目的としている。
また、この発明の別の目的は、カテプシンＤまたはカテプシンＥを腫瘍細胞に導入することからなる細胞導入法を提供するとともに、新たな腫瘍血管新生阻害療法を提供することである。
更に、カテプシンＤまたはカテプシンＥの産生能の差異によって腫瘍細胞の発育増殖・転移能、つまり悪性度ならびに予後を判別する方法を提供することを目的としている。
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method of use comprising using cathepsin D or cathepsin E as a tumor marker for a tumor such as squamous cell carcinoma.
Another object of the present invention is to provide a cell introduction method comprising introducing cathepsin D or cathepsin E into tumor cells and to provide a new tumor angiogenesis inhibition therapy.
It is another object of the present invention to provide a method for discriminating the growth / metastasis ability of tumor cells, that is, malignancy and prognosis based on the difference in the production ability of cathepsin D or cathepsin E.
上記目的を達成するために、この発明は、カテプシンＤまたはカテプシンＥを、腫瘍、例えば、扁平上皮ガンなどに対する腫瘍マーカーとして使用することからなる使用方法を提供する。この発明は、その好ましい態様としては、カテプシンＤまたはカテプシンＥを扁平上皮ガンに対する腫瘍マーカーとして使用する方法を提供する。
また、この発明の別の形態として、この発明は、カテプシンＤまたはカテプシンＥを腫瘍細胞に導入することからなる細胞導入法を提供する。この発明の形態における好ましい態様としては、カテプシンＤまたはカテプシンＥをタンパク質または遺伝子として腫瘍細胞に導入する方法が提供される。さらに、カテプシンＤまたはカテプシンＥを腫瘍組織・細胞に導入することによって新たな腫瘍血管新生阻害療法が提供される。
To achieve the above object, the present invention provides a method of use comprising using cathepsin D or cathepsin E as a tumor marker for tumors such as squamous cell carcinoma. In a preferred embodiment, the present invention provides a method of using cathepsin D or cathepsin E as a tumor marker for squamous cell carcinoma.
As another aspect of the present invention, the present invention provides a cell introduction method comprising introducing cathepsin D or cathepsin E into tumor cells. As a preferred embodiment in the form of the present invention, a method for introducing cathepsin D or cathepsin E into a tumor cell as a protein or gene is provided. Furthermore, a new tumor angiogenesis inhibition therapy is provided by introducing cathepsin D or cathepsin E into tumor tissues / cells.
更に、この発明は、その更に別の形態として、カテプシンＤまたはカテプシンＥの産生能の差異によって腫瘍細胞の発育増殖能、つまり悪性度ならびに予後を判別する方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides, as yet another form thereof, a method for discriminating the growth / proliferation ability of tumor cells, that is, the grade of malignancy and prognosis based on the difference in the production ability of cathepsin D or cathepsin E.
この発明に係る使用方法は、カテプシンＤおよびカテプシンＥを、例えば、扁平上皮ガンなどの腫瘍に対する腫瘍マーカーとして使用することからなる血管新生阻害因子としてのカテプシンＤおよびカテプシンＥの腫瘍マーカーとしての用途に関している。
また、この発明によれば、カテプシンＤおよびカテプシンＥは、タンパク質としてまたはその遺伝子の形態で腫瘍組織・細胞に導入することができる。
The use method according to the present invention relates to the use of cathepsin D and cathepsin E as tumor markers of angiogenesis, comprising using cathepsin D and cathepsin E as tumor markers for tumors such as squamous cell carcinomas, for example. Yes.
Further, according to the present invention, cathepsin D and cathepsin E can be introduced into tumor tissues / cells as proteins or in the form of their genes.
更に、この発明に係る腫瘍細胞の発育増殖能の判別方法は、カテプシンＤ分子のアンジオスタチン産生能の差によって腫瘍細胞の発育増殖能（悪性度）を判別することからなっている。 Furthermore, the method for discriminating the growth and proliferation ability of tumor cells according to the present invention comprises discriminating the growth and proliferation ability (grade of malignancy) of tumor cells based on the difference in angiostatin production ability of cathepsin D molecules.
カテプシンＤは、プラスミノーゲンを段階的に分解（L451−P452→L74−F75結合切断）し、4つのクリングルドメイン(K１−K4)を含むアンジオスタチンを産生するとともに、プラスミンを切断（E699−A700結合切断）することによって強力な抗血管新生作用を発揮することができる（図１）。 Cathepsin D gradually degrades plasminogen (L451-P452 → L74-F75 bond cleavage) to produce angiostatin containing four kringle domains (K1-K4) and cleaves plasmin (E699-A700). A strong anti-angiogenic effect can be exerted by cutting the bond (FIG. 1).
カテプシンＤ分子のアンジオスタチン産生能の差は、腫瘍の発生臓器の違いによるのではなく、腫瘍細胞の発育増殖能（悪性度）に依存していることが明らかとなった。つまり、同じ腫瘍細胞が分泌するカテプシンＤであっても、悪性度の高いと判定された癌細胞からのカテプシンＤはアンジオスタチン産生能が低く、悪性度の低い癌細胞からのカテプシンＤ分子はアンジオスタチン産生能が高いことが見出された（図２）。 It became clear that the difference in angiostatin-producing ability of cathepsin D molecules was not dependent on the difference in tumor organs, but was dependent on the growth / proliferation ability (grade of malignancy) of tumor cells. That is, even if cathepsin D is secreted by the same tumor cell, cathepsin D from cancer cells determined to have high malignancy has low angiostatin-producing ability, and cathepsin D molecules from cancer cells with low malignancy are It was found that the statin producing ability was high (FIG. 2).
そこで、カテプシンＤ分子のアンジオスタチン産生能の差が、腫瘍細胞の発育増殖能（悪性度）に依存していることの理由を探るために、各種腫瘍細胞からアンジオスタチン産生能の異なるカテプシンＤ分子を分離し、SDSゲル電気泳動や糖鎖分解酵素処理等にかけて比較検討した結果、アンジオスタチン産生能はカテプシンＤのＮ型糖鎖に含まれるシアル酸含量に逆比例することが分かった（図３）。もし、カテプシンＤのシアル酸付加の程度が腫瘍細胞の悪性度に影響を与えるとするならば、腫瘍細胞中のシアル酸転移酵素の発現や性状を知ることによって腫瘍の悪性度や予後を推定することが可能になる。 Therefore, in order to investigate the reason that the difference in angiostatin production ability of cathepsin D molecules depends on the growth and proliferation ability (malignancy) of tumor cells, cathepsin D molecules having different angiostatin production ability from various tumor cells. As a result of SDS-electrophoresis and glycosylation treatment, angiostatin production ability was found to be inversely proportional to the content of sialic acid contained in the N-type sugar chain of cathepsin D (FIG. 3). ). If the degree of sialic acid addition of cathepsin D affects the malignancy of tumor cells, the malignancy and prognosis of the tumor can be estimated by knowing the expression and properties of sialic acid transferase in the tumor cells. It becomes possible.
他方、本発明者は、癌細胞や活性化マクロファージなどの正常細胞から分泌されるカテプシンＥが、コラーゲンXVIIIのＣ末端部位を特異的に切断しエンドスタチンを産生することを見出した。カテプシンＥによって産生されるコラーゲンXVIII（ヒトコラーゲンXVIIIのアミノ酸配列を配列番号：１として示す）の切断部位は、ヒト血液中で同定されるエンドスタチンのN末端と一致した（図４）。 On the other hand, the present inventor found that cathepsin E secreted from normal cells such as cancer cells and activated macrophages specifically cleaves the C-terminal site of collagen XVIII to produce endostatin. The cleavage site of collagen XVIII produced by cathepsin E (the amino acid sequence of human collagen XVIII is shown as SEQ ID NO: 1) coincided with the N-terminus of endostatin identified in human blood (FIG. 4).
図４に示すように、ヒト血清中に検出されるエンドスタチンのＮ末端は、カテプシンＥおよびカテプシンＤによってTyr117−Val118結合が特異的に切断されてできるVHLで始まるポリペプチドである。この部位の切断は、カテプシンＤに比べカテプシンＥの方が強い。下段のアミノ酸配列はマウスコラーゲンXVIIIのうちヒトと異なるアミノ酸を示している。▲はマウス組織中より見つかったエンドスタチン、↓はヒト血液中より見つかったエンドスタチン、▽は各種プロテアーゼのin vitro実験での切断部位を示す。カテプシンＤのL71−H72結合切断部位とカテプシンLのH119−L12結合切断部位は、マウスで見つかったエンドスタチンとは一致したが、ヒトでは検出されていない。 As shown in FIG. 4, the N-terminus of endostatin detected in human serum is a polypeptide beginning with VHL that is formed by specifically cleaving the Tyr117-Val118 bond by cathepsin E and cathepsin D. The cleavage of this site is stronger with cathepsin E than with cathepsin D. The lower amino acid sequence shows amino acids different from human in mouse collagen XVIII. ▲ indicates endostatin found in mouse tissues, ↓ indicates endostatin found in human blood, and ▽ indicates cleavage sites of various proteases in in vitro experiments. The L71-H72 bond cleavage site of cathepsin D and the H119-L12 bond cleavage site of cathepsin L coincided with endostatin found in mice, but have not been detected in humans.
一方、悪性度の異なる各種のヒト前立腺癌細胞から分泌されるプロテアーゼ活性を測定してみると、カテプシンＥ量のみが腫瘍細胞の悪性度や血管新生能と逆相関していることが見出された（図５）。他の乳癌細胞、口腔癌細胞、メラノーマ細胞においても同様の結果が得られた。 On the other hand, when the protease activity secreted from various human prostate cancer cells with different malignancy was measured, it was found that only the amount of cathepsin E was inversely correlated with the malignancy and angiogenic ability of tumor cells. (FIG. 5). Similar results were obtained with other breast cancer cells, oral cancer cells, and melanoma cells.
腫瘍細胞から分泌されるカテプシンＥはほとんどが活性型分子でコラーゲンXVIIIやそのＣ末端フラグメント(NC1)を弱酸性領域で濃度依存性、時間依存性に分解しエンドスタチンを産生することが見出された（図６Ａ〜Ｄ）。各種ヒト前立腺腫瘍細胞上清とNC1をマトリゲル上で血管内皮細胞とインキュベーションするとカテプシンＥ産生量の多い腫瘍細胞ほど血管内皮細胞による管腔形成を抑制した（図７）。また、血管内皮細胞にあらかじめ管腔を形成させておき、それに各種ヒト前立腺腫瘍細胞の培養上清を加えると、カテプシンＥ活性量に比例して血管内皮細胞はアポトーシスに陥り、形成された管腔は消失した（図８）。カテプシンＥが実際に管腔破壊に関与しているか否かを検証する目的で、上記条件に加えて、カテプシンＥ特異的阻害剤を添加して同様の実験を行った。その結果、阻害剤添加によって管腔破壊が抑制された。その結果を図９に示す。すなわち、カテプシンＥを多く分泌する腫瘍細胞は、エンドスタチンの産生を介して血管新生を阻害し、同時に、高濃度では形成された血管の内皮細胞をアポトーシスに導くことが明らかとなった。 Cathepsin E secreted from tumor cells is mostly an active molecule, and it has been found that collagen XVIII and its C-terminal fragment (NC1) are degraded in a weakly acidic region in a concentration-dependent and time-dependent manner to produce endostatin. (FIGS. 6A-D). When various human prostate tumor cell supernatants and NC1 were incubated with vascular endothelial cells on Matrigel, tumor cells with higher cathepsin E production suppressed luminal formation by vascular endothelial cells (FIG. 7). Further, when a lumen is formed in advance in vascular endothelial cells and culture supernatants of various human prostate tumor cells are added thereto, the vascular endothelial cells fall into apoptosis in proportion to the amount of cathepsin E activity, and the formed lumen Disappeared (FIG. 8). In order to verify whether or not cathepsin E is actually involved in lumen destruction, a similar experiment was performed by adding a cathepsin E-specific inhibitor in addition to the above conditions. As a result, lumen destruction was suppressed by addition of the inhibitor. The result is shown in FIG. That is, it has been clarified that tumor cells secreting a large amount of cathepsin E inhibit angiogenesis through the production of endostatin, and at the same time, induce high-concentration vascular endothelial cells to apoptosis.
この発明に係る腫瘍細胞への導入方法は、当該技術分野の当業者によって常用されている導入方法、例えば、タンパク質局所投与方法などの投与方法や、ならびにエレクトロポレーション法などの遺伝子導入方法などであればいずれも使用することができる。この発明によれば、かかる方法を使用することによって、カテプシンＤならびにカテプシンＥの蛋白投与法などおよびカテプシンＤ遺伝子ならびにカテプシンＥ遺伝子の腫瘍細胞へのin vivoエレクトロポレーション法などによる腫瘍細胞へ導入することができる。 The introduction method to the tumor cell according to the present invention includes an introduction method commonly used by those skilled in the art, for example, an administration method such as a protein local administration method, and a gene introduction method such as an electroporation method. Any can be used. According to the present invention, by using such a method, the cathepsin D and cathepsin E proteins are administered to the tumor cells, and the cathepsin D gene and cathepsin E gene are introduced into the tumor cells by in vivo electroporation. be able to.
各種ヒト癌細胞の生体内での発育増殖能とそれぞれの培養上清によるアンジオスタチン産生能の違いを示すための実験を行なった。
５週齢ヌードマウスの背部皮下に各種ヒト前立腺癌細胞を1.5×107個の細胞数でリン酸緩衝溶液に懸濁し26ゲージ針にて移植し、経時的に腫瘍の発育増殖能を調べた。DU‐145およびLNCaPにおいては生着せず、またPPC−1、DU−145、PC−3、ALVA−41、ALVA−101ならびにLNCaP（ヒト前立腺癌細胞株）およびMCF−7（ヒト乳癌細胞株）においては生着し、カテプシンＤ量とアンジオスタチン産生能に逆比例した腫瘍増殖が認められた（図２）。
この結果から、カテプシンＤ分泌量の低い癌細胞ほど発育増殖能は高いことが判明した。
An experiment was conducted to show the difference between the growth and proliferation ability of various human cancer cells in vivo and the angiostatin production ability of each culture supernatant.
Various human prostate cancer cells were suspended in a phosphate buffer solution in the number of 1.5 × 10 7 cells subcutaneously in the back of 5-week-old nude mice, and transplanted with a 26 gauge needle, and the growth and proliferation ability of the tumor was examined over time. DU-145 and LNCaP do not engraft, and PPC-1, DU-145, PC-3, ALVA-41, ALVA-101 and LNCaP (human prostate cancer cell line) and MCF-7 (human breast cancer cell line) In Fig. 2, tumor growth was observed and the tumor growth was inversely proportional to the cathepsin D content and the angiostatin production ability (Fig. 2).
From these results, it was found that the growth and proliferation ability of cancer cells with lower cathepsin D secretion was higher.
また、各種ヒト癌細胞培養上清に含まれるカテプシンＤ活性の同一量を用いて、プラスミノーゲンからのアンジオスタチン産生量を比較した。その結果、生体内での増殖能の強い癌細胞ほどアンジオスタチン産生が低い傾向がみられることを見出した。つまり、（図３）。 Moreover, the production amount of angiostatin from plasminogen was compared using the same amount of cathepsin D activity contained in various human cancer cell culture supernatants. As a result, the present inventors have found that cancer cells with strong in vivo proliferation ability tend to have lower angiostatin production. That is (FIG. 3).
カテプシンＥとエンドスタチン産生能および血管内皮細胞の管腔形成阻害能との相関を示すために実験を行なった。
まず、カテプシンＥを特異的に計測できる合成基質MOCAc−Gly−Ser−Pro−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu−Ala−Lys(Dnp)−D−Arg−NH2を使用して、各種癌細胞の培養上清中のカテプシンＥ量を算出した。次に、エンドスタチン産生能をみるために、コラーゲンXVIIIのCOOH末端のNC1領域（0.5μg）と各種癌細胞培養上清(10μg)をpH6、37℃の条件にて12時間処理した。その際に、NC1よりエンドスタチンに変換した量比にてエンドスタチン産生能を算出した。血管内皮細胞の管腔形成阻害能をみるために、1×104個のヒト儕帯大静脈血管内皮細胞(HUVEC)をマトリゲル上に播種するとともに、NC1(20ng)と癌細胞培養上清(1μg)をpH6の条件にて添加し、37℃、5%CO2にて24時間培養した。24時間後の血管内皮細胞の管腔形成量をコントロールと比較して算出した。
その結果、図５に示すように、ヒト前立腺癌細胞から分泌されるカテプシンＥ量の多い細胞株ほどエンドスタチン産生能が高く、また、このエンドスタチン産生を介した血管内皮細胞の管腔形成阻害とも高い相関関係が認められた。
Experiments were conducted to show the correlation between cathepsin E and endostatin producing ability and ability to inhibit vascular endothelial cell lumen formation.
First, various cancer cells using a synthetic substrate MOCAc-Gly-Ser-Pro-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu-Ala-Lys (Dnp) -D-Arg-NH2 capable of specifically measuring cathepsin E The amount of cathepsin E in the culture supernatant was calculated. Next, in order to check the endostatin production ability, the COOH terminal NC1 region (0.5 μg) of collagen XVIII and various cancer cell culture supernatants (10 μg) were treated under conditions of
As a result, as shown in FIG. 5, the cell line with a greater amount of cathepsin E secreted from human prostate cancer cells has a higher endostatin production ability, and also inhibits vascular endothelial cell tube formation through this endostatin production. Both were highly correlated.
各種ヒト前立腺癌細胞培養上清のヒト膀帯大静脈血管内皮細胞(HUVEC)に対する影響について調べた。
マトリゲルを用いてあらかじめ1×104個のヒト臍帯大静脈血管内皮細胞(HUVEC)で管腔を形成させておき（16時間、37℃、5%CO2にて培養）、それに各種ヒト前立腺癌細胞上清(10μg)とNC1(2μg)を加えて６時間処理した。管腔の破壊量を培養上清のみを添加したコントロールと比較し算出した。
その結果を図７に示すように、カテプシンＥを多く含む細胞株ほど血管内皮細胞の管腔形成の阻害が強く認められた。
The effects of various human prostate cancer cell culture supernatants on human urinary vena cava vascular endothelial cells (HUVEC) were investigated.
Using Matrigel, a lumen was formed in advance with 1 × 10 4 human umbilical vena cava vascular endothelial cells (HUVEC) (16 hours, cultured at 37 ° C, 5% CO 2 ), and various human prostate cancers Cell supernatant (10 μg) and NC1 (2 μg) were added and treated for 6 hours. The amount of lumen destruction was calculated by comparison with a control to which only the culture supernatant was added.
As shown in FIG. 7, the cell line containing more cathepsin E showed stronger inhibition of vascular endothelial cell lumen formation.
カテプシンＥによるエンドスタチン産生のpH依存性について、NC1に対するカテプシンＥの分解を各種pHで比較することによって調べた。
NC1（3.0μg）をそれぞれ精製ラットカテプシンＤ、精製ラットカテプシンＥならびに精製ラットカテプシンＬとともに種々のpHで酵素対基質比（W/W）１：20の下で、37℃で10時間処理した。次いで、反応生成物は還元条件でSDS−PAGEによって分析した。
その結果、図６Ａで示すように、pH4では、NC1はカテプシンＥによって完全に分解され、エンドスタチンは検出されなかった。しかし、癌形成領域pHであるpH5〜pH6では、NC1はカテプシンＥによって限定的に分解され、エンドスタチンを安定的に産生した。なお、カテプシンＤでもpH6でエンドスタチンが産生された。更に、pH5〜pH6で、カテプシンＬもエンドスタチンを産生した。
The pH dependence of endostatin production by cathepsin E was examined by comparing the degradation of cathepsin E against NC1 at various pHs.
NC1 (3.0 μg) was treated with purified rat cathepsin D, purified rat cathepsin E and purified rat cathepsin L, respectively, at various pH at an enzyme to substrate ratio (W / W) of 1:20 at 37 ° C. for 10 hours. The reaction product was then analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions.
As a result, as shown in FIG. 6A, at pH 4, NC1 was completely degraded by cathepsin E, and endostatin was not detected. However, NC1 was limitedly degraded by cathepsin E and stably produced endostatin at
カテプシンＥ、カテプシンＤおよびカテプシンＬによるNC1からのエンドスタチン産生能を比較した。
NC1（5.0μg）をそれぞれ精製ラットカテプシンＤ、精製ラットカテプシンＥならびに精製ラットカテプシンＬとともにpH6でそれぞれの酵素対基質比(w/w)の下で、37℃で12時間処理した。次いで、反応生成物は還元条件でSDS−PAGEによって分析した。
その結果、図６Ｂに示すように、カテプシンＥは、他の酵素に比較して、低濃度でエンドスタチンを産生した。
The ability to produce endostatin from NC1 by cathepsin E, cathepsin D and cathepsin L was compared.
NC1 (5.0 μg) was treated with purified rat cathepsin D, purified rat cathepsin E and purified rat cathepsin L, respectively, at
As a result, as shown in FIG. 6B, cathepsin E produced endostatin at a lower concentration than other enzymes.
カテプシンＥ、カテプシンＤおよびカテプシンＬによるエンドスタチン産生能の時間依存性を、各種精製酵素を用いてNC1からのエンドスタチン産生能を比較した。
NC1（5.0μg）をそれぞれ精製ラットカテプシンＤ、精製ラットカテプシンＥならびに精製ラットカテプシンＬとともに酵素対基質比１：20(W/W)の下で、pH6、37℃で12時間処理した。次いで、反応生成物を還元条件でSDS−PAGEによって分析した。
その結果、図６ＣおよびＤで示すように、カテプシンＥは、他の酵素に比較して、速やかにエンドスタチンを産生し、それを長時間安定的に存在させた。
The time dependence of endostatin production ability by cathepsin E, cathepsin D and cathepsin L was compared with endostatin production ability from NC1 using various purified enzymes.
NC1 (5.0 μg) was treated with purified rat cathepsin D, purified rat cathepsin E and purified rat cathepsin L, respectively, under an enzyme to substrate ratio of 1:20 (W / W) at
As a result, as shown in FIGS. 6C and D, cathepsin E produced endostatin quickly and stably existed for a long time as compared with other enzymes.
悪性度の高い前立腺癌細胞にカテプシンＥを過剰発現させたときの血管内皮細胞の管腔形成阻害能に対する影響について調べた。
カテプシンＥの発現の少ない前立腺癌細胞株（DU145細胞）に、リポフェクチン法によりヒトカテプシンＥ発現ベクター（pcDNA3.1−hCE）を導入した。
図１０Ａには、カテプシンＥ遺伝子を過剰発現させた癌細胞の細胞内および細胞外での酵素活性量を示した結果を示している。
マトリゲル上でのHUVECによる管腔形成に対して、カテプシンＥ遺伝子を過剰発現させたヒト前立腺癌細胞（DU145−hCE）の培養上清の効果を対照（DU145−MOCK：ベクターのみを発現させたもの）と比較した。
血管内皮細胞の管腔形成阻害能を比較するために、HUVECをマトリゲル上に播種するとともに、NC1(20ng)とカテプシンＥ遺伝子を過剰発現した癌細胞培養上清(0.2μg)をpH6の条件にて添加し、37℃、5%CO2にて24時間培養した。24時間後の血管内皮細胞の管腔形成量を対照（ベクターのみを遺伝子導入した癌細胞の培養上清を同一条件にて処理）と比較した（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、培養上清による管腔形成阻害効果を、画像処理によって定量化したデータで示している。
これらの結果から、カテプシンＥが過剰発現することによって管腔形成阻害効果が強くなっていることが明らかとなった。
The effect of vascular endothelial cells on the ability to inhibit luminal formation when cathepsin E was overexpressed in high-grade prostate cancer cells was examined.
A human cathepsin E expression vector (pcDNA3.1-hCE) was introduced into a prostate cancer cell line (DU145 cells) with low cathepsin E expression by the lipofectin method.
FIG. 10A shows the results showing the intracellular and extracellular enzyme activity levels of cancer cells overexpressing the cathepsin E gene.
Control of the effect of culture supernatant of human prostate cancer cells (DU145-hCE) overexpressed cathepsin E gene on tube formation by HUVEC on Matrigel (DU145-MOCK: expression of vector only) ).
To compare the ability of vascular endothelial cells to inhibit tube formation, HUVECs were seeded on Matrigel, and NC1 (20 ng) and cancer cell culture supernatant (0.2 μg) overexpressing cathepsin E gene were adjusted to
From these results, it has been clarified that cathepsin E is overexpressed and the effect of inhibiting tube formation is enhanced.
カテプシンＥを過剰発現させた別のヒト前立腺癌細胞（ALVA101）のin vivoでの発育増殖能と血管新生能との関係を調べた。
カテプシンＥの発現量の少ない前立腺癌細胞株（ALVA101）に、先と同様にリポフェクチン法によりヒトカテプシンＥ発現ベクターを遺伝子導入した。
カテプシンＥ遺伝子を過剰発現させた前立腺癌細胞（ALVA101−hCE）とベクターのみを導入した癌細胞(ALVA101−MOCK)をヌードマウス皮下に移植し、それぞれの発育増殖能と血管新生能の比較をした。その結果、図１１Ａに示すように、カテプシンＥ遺伝子を過剰発現させた癌細胞培養上清は、ベクターのみを導入したものに比べて、マトリゲル上での管腔形成を強く阻害した。ALVA101−hCEはALVA101−MOCKに比べてin vivoでの発育増殖能が強く抑制されるとともに（図１１A）、血管新生能（血管内皮特異的マーカーである抗von Willebrand
factor抗体との反応性）も顕著に阻害されていることが分かった（図１１Ｂ）。さらに、ALVA101−hCEを移植したヌードマウスの血清中のカテプシンＥ活性量はALVA101−MOCKを移植した場合に比べて有意に増加していた（図１１Ｂ）。
The relationship between in vivo growth and proliferation ability and angiogenesis ability of another human prostate cancer cell (ALVA101) overexpressing cathepsin E was examined.
A human cathepsin E expression vector was introduced into the prostate cancer cell line (ALVA101) with a low expression level of cathepsin E by the lipofectin method as described above.
Prostate cancer cells overexpressing cathepsin E gene (ALVA101-hCE) and cancer cells into which only the vector was introduced (ALVA101-MOCK) were transplanted subcutaneously into nude mice, and their growth and proliferation ability and angiogenesis ability were compared. . As a result, as shown in FIG. 11A, the cancer cell culture supernatant in which the cathepsin E gene was overexpressed strongly inhibited the formation of lumens on Matrigel, compared with the one in which only the vector was introduced. In contrast to ALVA101-MOCK, ALVA101-hCE strongly suppresses the growth and proliferation ability in vivo (FIG. 11A) and also angiogenic ability (anti-von Willebrand, a vascular endothelium-specific marker).
It was found that the reactivity with the factor antibody was also significantly inhibited (FIG. 11B). Furthermore, the amount of cathepsin E activity in the serum of nude mice transplanted with ALVA101-hCE was significantly increased compared with the case of transplanting ALVA101-MOCK (FIG. 11B).
さらに前立腺癌細胞の発育増殖および転移に対するカテプシンＥの阻害効果について調べた。
ヒト前立腺癌細胞を５週齢ヌードマウス皮下に移植し、腫瘍径が1000mm3に発育増殖したところで精製したカテプシンＥを腫瘍部に連日注射(1日につき200μg/kgを0.1mlのリン酸緩衝溶液に溶解)を10日間施行し、癌細胞の発育増殖に対する抑制効果を調べた。対照群ではリン酸緩衝溶液を同様にして腫瘍部に注射（0.1ml）した。また、投与終了３週間後に肺転移を観察した。
その結果、図１２Ａに示すように、対照群に対して、カテプシンＥを投与した群では明らかに癌細胞の発育増殖が抑制されるとともに、肺転移も抑制された（図１２Ｂ）。
Furthermore, the inhibitory effect of cathepsin E on the growth and metastasis of prostate cancer cells was examined.
Human prostate cancer cells were transplanted subcutaneously into 5-week-old nude mice, and purified cathepsin E when the tumor diameter grew to 1000 mm 3 was injected into the tumor every day (200 μg / kg per day in 0.1 ml phosphate buffer solution). Was dissolved for 10 days, and the inhibitory effect on the growth and proliferation of cancer cells was examined. In the control group, a phosphate buffer solution was similarly injected into the tumor site (0.1 ml). In addition, lung metastasis was observed 3 weeks after the end of administration.
As a result, as shown in FIG. 12A, in the group administered with cathepsin E, growth and proliferation of cancer cells were clearly suppressed and lung metastasis was also suppressed as compared to the control group (FIG. 12B).
前立腺癌細胞の発育増殖に対するカテプシンＥ遺伝子発現の阻害効果を調べた。
前立腺癌細胞(ALVA−41)をヌードマウス皮下に移植し、腫瘍が500mm3に発育増殖したところで、カテプシンＥ発現プラスミド(pcDNA3.1−hCE)を29ゲージ針にて腫瘍部に注入し、即座にピンセット型電極にて腫瘍部を挟み込み、電気刺激(50V/0.5 msec、8回)を加えた（in vivoエレクトロポレーション法）。同様の操作を２日後に再度行なった。その後、経時的に癌細胞の発育増殖に対する抑制効果を調べた。対照群には発現ベクターのみ（pcDNA3.1）を注入し、同様の操作を行った。
その結果、図１３に示すように、対照群に対して、カテプシンＥ遺伝子を導入した群では、遺伝子導入最終日4日目から明らかに癌細胞の発育増殖が抑制された（P＜0.05）。
The inhibitory effect of cathepsin E gene expression on the growth and proliferation of prostate cancer cells was examined.
Prostate cancer cells (ALVA-41) were transplanted subcutaneously into nude mice, and when the tumor grew and proliferated to 500 mm 3 , a cathepsin E expression plasmid (pcDNA3.1-hCE) was injected into the tumor portion with a 29 gauge needle and immediately The tumor part was sandwiched between tweezers and electrical stimulation (50 V / 0.5 msec, 8 times) was applied (in vivo electroporation method). The same operation was repeated 2 days later. Thereafter, the inhibitory effect on the growth and proliferation of cancer cells was examined over time. In the control group, only the expression vector (pcDNA3.1) was injected, and the same operation was performed.
As a result, as shown in FIG. 13, in the group into which the cathepsin E gene was introduced, the growth and proliferation of cancer cells was clearly suppressed from the last day of gene introduction (P <0.05) as shown in FIG.
実施例１２と同様に、局所の腫瘍細胞にヒトカテプシンＤ遺伝子をエレクトロポレーション法によって導入すると、腫瘍の発育増殖ならびに転移が有意に抑制された（図１４）。 As in Example 12, when the human cathepsin D gene was introduced into local tumor cells by the electroporation method, tumor growth and metastasis were significantly suppressed (FIG. 14).
マウス角膜法によるin vivoでの血管新生に対するカテプシンＥおよびカテプシンＤの阻害効果について調べた。
カテプシンＥまたはＤを存在または非存在下（カテプシンＥあるいはカテプシンＤ量として0.2μg）で血管新生因子（60−80 ngのbFGF）含有ペレットを作成した。ネンブタールで６週齢Balb/cマウスを麻酔後、実体顕微鏡下にてマイクロメスとマイクロスパーテルを使用してマウス角膜へペレットを挿入し、５日後の血管新生能を比較した。
その結果、図１５に示すように、カテプシンＥを含ませたペレットは血管新生を強く阻害していることが分かった。
The inhibitory effect of cathepsin E and cathepsin D on angiogenesis in vivo by the mouse cornea method was examined.
A pellet containing angiogenic factor (60-80 ng bFGF) was prepared in the presence or absence of cathepsin E or D (cathepsin E or cathepsin D amount 0.2 μg). After anesthetizing a 6-week-old Balb / c mouse with Nembutal, a pellet was inserted into the mouse cornea using a micro knife and a micro spatula under a stereomicroscope, and the angiogenic ability after 5 days was compared.
As a result, as shown in FIG. 15, it was found that the pellet containing cathepsin E strongly inhibited angiogenesis.
カテプシンＥ遺伝子欠損による癌細胞転移への影響を調べた。
この実施例は、腫瘍細胞だけではなく、生体側のカテプシンＥが腫瘍細胞に対する生体防御にどう影響するのかを調べる目的で行なった。
野生型マウスおよびカテプシンＥ欠損マウスにマウスメラノーマ細胞（Ｋ−1735Ｍ2.1ｘ107）を尾静脈から注射して移植し腫瘍細胞の肺転移能を４週間後にコロニー形成を指標にして比較した。その結果、図１６に示すように、カテプシンＥ欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、明らかに癌細胞の肺転移が亢進されていることが分かった。このことは、腫瘍細胞から産生されるカテプシンＥのみならず、宿主のもつカテプシンＥも抗腫瘍作用をもつことを示していると共に、宿主生体防御系においてカテプシンＥが重要の役割を果たしていることを示している。
The effect of cathepsin E gene deficiency on cancer cell metastasis was examined.
This example was carried out for the purpose of examining not only tumor cells but also the influence of cathepsin E on the living body side on the defense against tumor cells.
Mouse melanoma cells (K-1735M2.1 × 10 7 ) were injected from the tail vein into wild type mice and cathepsin E deficient mice and transplanted, and the lung metastasis ability of the tumor cells was compared after 4 weeks using colony formation as an index. As a result, as shown in FIG. 16, it was found that lung metastasis of cancer cells was clearly enhanced in cathepsin E-deficient mice compared to wild-type mice. This indicates that not only cathepsin E produced from tumor cells but also host cathepsin E has an antitumor action, and that cathepsin E plays an important role in the host defense system. Show.
ヒト口腔癌患者血清中のカテプシンＥおよびカテプシンＤ量について調べた。
ヒト口腔癌患者の血清中のカテプシンＥおよびカテプシンＤ量を特異的合成基質を用いて測定した。その結果、図１７で示すように、癌患者では、正常人に比べて、有意に血清中のカテプシンＥ量が低下していることが分かった。また、血清中のカテプシンＥ量は、癌の悪性度の高い患者ほど低い傾向が見られた。これに対して、カテプシンＤ量は、癌患者と正常人では有意な差は認められなかった。
The amount of cathepsin E and cathepsin D in the serum of human oral cancer patients was examined.
The amount of cathepsin E and cathepsin D in the serum of human oral cancer patients was measured using a specific synthetic substrate. As a result, as shown in FIG. 17, it was found that the amount of cathepsin E in the serum was significantly reduced in cancer patients compared to normal people. In addition, the amount of cathepsin E in serum tended to be lower in patients with higher malignancy of cancer. In contrast, there was no significant difference in cathepsin D content between cancer patients and normal individuals.
本発明者は、口腔癌患者血液中のカテプシンＥが正常者に比べ有意に低下していることをすでに見出している上に、上記結果がカテプシンＥの発現や活性の低下が腫瘍細胞の増殖、転移を誘導する可能性を示唆している。
腫瘍組織でカテプシンＥによるエンドスタチン産生、カテプシンＤによるアンジオスタチン産生が誘導されるならば、腫瘍血管新生が阻害され、腫瘍の発育増殖ならびに転移が抑制されると考えられる。このことは、この発明に係るカテプシンＤおよびカテプシンＥは、腫瘍の悪性度や予後のマーカーとなり得るばかりでなく、血管新生阻害療法に基づく癌治療に新たな道を開くものと期待される。
また、これまでに本発明者の研究から、カテプシンＥは、生体防御系において重要な役割を果たしていることが示されている。特に、カテプシンＥノックアウトマウスの解析から、該動物が一定環境下でアトピー性皮膚炎を発症することから、本酵素が細胞性免疫を担う重要酵素であることが示唆されている。
The present inventor has already found that cathepsin E in the blood of oral cancer patients is significantly lower than that of normal individuals, and the above results indicate that the decrease in the expression and activity of cathepsin E is the growth of tumor cells, This suggests the possibility of inducing metastasis.
If endostatin production by cathepsin E and angiostatin production by cathepsin D are induced in the tumor tissue, tumor angiogenesis is inhibited, and tumor growth and metastasis are suppressed. This indicates that the cathepsin D and cathepsin E according to the present invention can be used not only as markers for tumor malignancy and prognosis, but also open a new path for cancer treatment based on angiogenesis inhibition therapy.
In addition, studies by the present inventors have shown that cathepsin E plays an important role in the biological defense system. In particular, analysis of cathepsin E knockout mice suggests that this enzyme is an important enzyme responsible for cellular immunity because the animal develops atopic dermatitis in a certain environment.
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