JP4452820B2

JP4452820B2 - Method for producing pipecolic acid

Info

Publication number: JP4452820B2
Application number: JP2003055011A
Authority: JP
Inventors: 憲和西野; 沙織理原中; 充瞭森口; 健次左右田
Original assignee: Kyushu Institute of Technology NUC
Current assignee: Kyushu Institute of Technology NUC
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2010-04-21
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: JP2004261086A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は L−ピペコリン酸およびD−ピペコリン酸を低原価で量産できるピペコリン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性ピペコリン酸は、図１に示すように天然に存在する種々の有用な生理活性物質の構成要素として含まれ、また合成医薬品の原料としても重要な化合物である。天然物質の構成成分としてはFK506 (免疫抑制剤)、Rapamicin (免疫抑制剤)、や Trapoxin A (HDAC阻害剤)が、合成医薬品では VX710 (抗がん剤)や Bupivacaine (局部麻酔剤)が挙げられる。また、L−ピペコリン酸を含む天然物に Cyl-2（非特許文献１）、及び Sandramycin（非特許文献２）がある。
さらに、人工的に設計され、薬理活性を有するため有用である化合物中にも L−ピペコリン酸が構成要素として導入されている。例えば、VX710 （非特許文献３）および L-365,209（非特許文献４）が挙げられる。
D−ピペコリン酸を含む天然物には例えば、Trapoxin A（非特許文献５）と Apicidin（非特許文献６）とが挙げられる。
これらの構造を元に新規様々な薬理活性を有する医薬品の開発および製造を行なおうとする時、分子構造の組み立て上、L−ピペコリン酸または D−ピペコリン酸が必要であるが、特殊な環状イミノ酸であるピペコリン酸を完全な光学活性体で安価に入手する事が困難であり、創薬上のネックになっていた。そこで過去２０年以上に渡って、主として天然物の生理活性と構造との相関解明のために、必要とされる光学活性ピペコリン酸の合成および製造が数々試みられてきた。
【０００３】
（１）例えば、ピペコリン酸の製造方法として（非特許文献７）には、L− または D−リシン、或いはその他のアミノ酸からの誘導法が、また、（非特許文献８）には酵素を用いた方法として、リパーゼ、アミダ―ゼ、または酪酸ビニル存在下でアシラーゼを用いる方法が記載されている。
（２）（特許文献１）や（非特許文献９）には、比較的安価な DL−ピペコリン酸に対して酒石酸、キラルなパラジウム複核錯体、または O−フェニル乳酸を反応させ、分別沈殿による光学分割法が開示されており、ここでは、DL−ピペコリン酸を混合物媒体中で光学活性フェノキシプロピオン酸と反応させ、得られた難溶性ジアステレオマー塩を水に溶解又は懸濁し、これに当量又は過剰の酸を加えて複分解して光学的に純粋な D−ピペコリン酸又は L−ピペコリン酸を製造する方法が記載されている。
（３）（非特許文献１０）には、不斉触媒を用いたり、不斉点を導入したりするなどの不斉合成法が試みられており、（非特許文献１１）には、ハロゲン化アルキルに対するアミン類の分子内 SN2 反応を用いてピペリジン環を形成する方法が記載されている。
（４）（非特許文献１２）には、L−リシンを原料として２種の酵素 (lysine 6-aminotransferase および L−Δ1−piperideine 6−carboxylate reductase) を応用した方法が提案されている。
【０００４】
【非特許文献１】
(Hirota, A., Suzuki, A., Aizawa, K., and Tamura, S. (1973). Structure of Cyl−2, a novel cyclotetrapeptide from Cylindrocladium scoparium. Arg. Biol. Chem. 37, 955-956)、Rapamycin (Vezina, C., Kudelski, A., and Sehgal, S. N. (1975). Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle. J. Antibiot. 28, 721-726)、FK506 (Tanaka, H., Kuroda, A., Marusawa, H., Hatanaka, H., Kino, T., Goto, T., and Hashimoto, M. (1987). Structure of FK506: a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces. J. Am. Chem. Soc. 109, 5031-5033)
【非特許文献２】
(Boger, D. L., Chen, J. H., and Saionz, K. W. (1996). (-)-Sandramycin: Total synthesis and characterization of DNA binding properties. J. Am. Chem. Soc. 118, 1629-1644)
【非特許文献３】
(Germann, U. A., Shlyakhter, D., Mason, V. S., Zelle, R. E., Duffy, J. P., Galullo, V., Armistead, D. M., Saunders, J. O., Boger, J., and Harding, M. W. (1997). Cellular and biochemical characterization of VX-710 as a chemosensitizer: Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in vitro. Anticancer Drugs 8, 125-140)、Bupivacaine (Adger, B., Dyer, U., Hutton, G., and Woods, M. (1996). Stereospecific synthesis of the anaesthetic levobupivacaine. Tetrahedron Lett. 37, 6399-6402)、
【非特許文献４】
(Pettibone, D. J., Clineschmidt, B. V., Anderson, P. S., Freidinger, R. M., Lundell, G. F., Koupal, L. R., Schwartz, C. D., Williamson, J. M., Goetz, M. A., Hensens, O. D., Liesch, J. M., and Springer, J. P. (1989). A structurally unique, potent, and selective oxytocin antagonist derived from Streptomyces silvensis. Endocrinology 125, 217-222)
【非特許文献５】
(Itagaki, H., Nagashima, K., Sugita, K., Yoshida, H., Kawamura, Y., Yasuda, Y., Matsumoto, K., Ishii, K., Uotani, N., Nakai, H., Terui, A., and Yoshimatsu, S. (1990). Isolation and structural elucidation of new cyclotetrapeptides, Trapoxins A and B, having detransformation activities as antitumor agents. J. Antibiotics 43, 1524-1532)
【非特許文献６】
(Darkin-Rattray, S. J., Gurnett, A. M., Myers, R. W., Dulski, P. M., Crumley, T. M., Allocco, J. J., Cannova, C., Meinke, P. T., Colletti, S. L., Bednarek, M. A., Singh, S. B., Goetz, M. A., Dombrowski, A. W., Polishook, J. D., and Schmatz, D. M. (1996). Apicidin: A novel antiprotozoal agent that inhibits parasite histone deacetylase. Proc. Natl. Acad. USA 93, 13143-13147, Singh, S. B., Zink, D. L., Liesch, J. M., Mosley, R. T., Dombrowski, A. W., Bills, G. F., Darkin-Rattray, S. J., Schmatz, D. M., and Goetz, M. A. (2002). Structure and chemistry of apicidins, a class of novel cyclic tetrapeptides without a terminal a-keto epoxide as inhibitors of histone deacetylase with potent antiprotozoal activities. J. Org. Chem. 67, 815-825)
【非特許文献７】
(Fujii, T. and Miyoshi, M. (1975). A novel synthesis of L-pipecolic acid. Bull. Chem. Soc. Jpn. 48, 1341-1342; Kisfaludy, L., and Korenczki, F. (1982). One-step synthesis of L-piperidine-2-carboxylic acid. Synthesis 9, 163; Ohtani, B., Tsuru, S., Nishimoto, S., and Kagiya, T. (1990). Photocatalytic one-step syntheses of cyclic imino acids by aqueous semiconductor suspensions. J. Org. Chem. 55, 5551-5553)。
【非特許文献８】
(Ng-Youn-Chen, M. C., Serreqi, A. N., Huang, Q. L., and Kazlauskas, R. J. (1994). Kinetic resolution of pipecolic acid using partially-purified lipase from Aspergillus niger. J. Org. Chem. 59, 2075-2081; Eichhorn, E., Roduit, J., Shaw, N., Heinzmann, K., and Kiener, A. (1997). Preparation of (S)-piperazine-2-carboxylic acid, (R)-piperazine-2-carboxylic acid, and (S)-piperidine-2-carboxylic acid by kinetic resolution of the corresponding racemic carboxamides with stereoselective amidases in whole bacterial cells. Tetrahedron: Asymmetry 8, 2533-2536; Sanchez-Sancho, F. and Herradon, B. (1998). Short syntheses of (S)-pipecolic acid, (R)-coniine, and (S)-d-coniceine using biocatalytically-generated chiral building blocks. Tetrahedron: Asymmetry 9, 1951-1965)
【非特許文献９】
(Portoghese, P. S., Pazdernik, T. L., Kuhn, W. L., Hite, G., Shafi'ee, A. (1968) Stereochemical studies on medicinal agents. V. Synthesis, configuration, and pharmacological activity of pipradrol enantiomers. J. Med. Chem. 11, 12-15; Hardtmann, G. E., Houlihan, W. J., and Giger, R. K. A. (1988). Trifluoromethyl substituted tetracyclic quinazolin-ones having tranquilizing activity. US patent 4760065; Hochless, D. C. R., Mayadunne, R. C., and Wild, S. B. (1995). Convenient resolution of (±)-piperidine-2-carboxylic acid ((±)-pipecolic acid) by separation of palladium(II) diastereomers containing orthometallated (S)-(-)-1-[1-(Dimethylamino)ethyl]naphthalene. Tetrahedron: Asymmetry 6, 3031-3037)
【非特許文献１０】
(Berrien, J. F., Royer, J., Husson, H. P. (1994). Asymmetric synthesis. 32. A new access to enantiomerically pure (S)-(-)-pipecolic acid and 2- or 6-alkylated derivatives. J. Org. Chem. 59, 3769-3774; Foti, C., J. and Comins, D. L. (1995). Synthesis and reactions of a-(trifluromethanesulfonyloxy)enecarbamates prepared from N-acyllactams. J. Org. Chem. 60, 2656-2657; Agami, C., Kadouri-Puchot, C., and Kizirian, J. C. (2000). A new enantioselective synthesis of (2S)-pipecolic acid. Synth. Commmun. 30, 2565-2572; Ginesta, X., Pericas, M. A., Riera, A. (2002). Straightforward entry to the pipecolic acid nucleus. Enantioselective synthesis of baikiain. Tetrahedron lett. 43, 779-782)。
【非特許文献１１】
(Fernandez-Garcia, C., and McKervey, M. A. (1995). A short enantioselective synthesis of pipecolic acid. Tetrahedron: Asymmetry 6, 2905-2906; Myers, A. G., Gleason, J. L., Yoon, T., and Kung, D. W. (1997). Highly practical methodology for the synthesis of D- and L-amino acids, N-protected amino acids, and N-methyl-amino acids. J. Am. Chem. Soc. 119, 656-673; Nazabadioko, S., Perez, R. J., Brieva, R., and Gotor, V. (1998). Chemoenzymatic synthesis of (S)-2-cyanopiperidine, a key intermediate in the route to (S)-pipecolic acid and 2-substituted piperidine alkaloids. Tetrahedron: Asymmetry 9, 1597-1604)。
【非特許文献１２】
(Agematsu, H., and Fujii, T. (2002). Production of L-pipecolic acid by recombinant Escherichia coli at an industrial scale. Bio Industry 19, 40-47)。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−１７８２５３号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記の従来の技術では以下のような課題があった。
（ａ）非特許文献７に記載のリシンなどのアミノ酸からの誘導法は、
α-位およびε-位のアミノ基の選択反応を必要とし、アミノ基の官能基変換の際に水酸化等の副反応が多く起こるため低収率、低純度であり、試薬の使用に危険が伴うなど操作上の問題があり、安価な供給が困難であるという課題があった。
（ｂ）非特許文献８に記載のリパーゼ、アミダ―ゼ、または酪酸ビニル存在下でアシラーゼを用いる方法では、ジアステレオマー選択性が不十分である
の理由で実用的な製造法となるに到らず、酵素の立体特異性の応用面で効率化を図る点で不十分であるという課題があった。
（ｃ）特許文献１や非特許文献９などに記載の分別沈殿法では、 DL−ピペコリン酸を原料として光学分割するので、光学異性体を別途準備し、使用後それを回収する必要がある点で非効率的であるという課題があった。
（ｄ）非特許文献１０に記載の不斉合成法は、不斉点を導入する試薬そのものが高価であり、規模も実験室レベルであるため量産性に欠け実用的ではなく工業的な適用が困難であるという課題があった。
（ｅ）非特許文献１１に記載のアミン類の分子内 SN2 反応を用いてピペリジン環を形成する方法では、ピペリジン環のものに限定されるため直接ピペコリン酸に到らず低収率であり、また、酵素による光学分割法ではないため
不要のジアステレオマーも副生してしまい高純度のものが得られ難いという課題があった。
（ｆ）非特許文献１２の L−リシンを原料として２種の酵素を適用した方法は、L−体の立体特異性を持った酵素を用いるため、また、D−体の立体特異性を有する同様酵素が開発されていないために D−ピペコリン酸の製造には適用できないという課題があった。
【０００７】
本発明は前記従来の課題を解決するためになされたもので、高純度に光学分割されたピペコリン酸を高収率で安価に供給することができるピペコリン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載のピペコリン酸の製造方法は、Ｄ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸、Ｌ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸を、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸のラセミ体溶液に、アスペルギルス・ジーナス（Aspergillus genus）L−アミノアシラーゼ、Thermococcus eitoralis Ｌ−アミノアシラーゼ、アシラーゼＩ（ブタスイ臓、Aspergillus melleus）Ｌ−アミノアシラーゼ、アルカリジーナスキシロースオキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans）D−アミノアシラーゼのいずれかのアミノアシラーゼを添加する調整工程と、前記ラセミ体溶液をｐＨ６〜９、温度２０〜５０℃で１０〜３０時間保持させる生成工程と、による前記アミノアシラーゼのエナンチオマー特異的作用により生成し、これに続く分子内環化反応によって、Ｄ−ピペコリン酸又はＬ−ピペコリン酸を生成させる構成を備えている。
請求項２に記載のピペコリン酸の製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記生成工程後の前記ラセミ体溶液から前記Ｄ−ピペコリン酸又は前記Ｌ−ピペコリン酸を溶媒抽出する抽出工程を備えて構成されている。
これによって、高純度に光学分割されたピペコリン酸を高収率で安価に製造することができる。すなわち、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸に光学活性なアミノアシラーゼを作用させることによって、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸をエナンチオマー特異的に加水分解させ、その直後に起こる分子内環化反応によって光学活性ピペコリン酸を効率的に生成させることができる。
また、アミノアシラーゼによるエナンチオマー特異的加水分解およびこれに伴う分子内環化反応を適正に維持させることができ、高純度の光学活性ピペコリン酸をさらに高収率で得ることができる。
【０００９】
ハロゲン基は、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸の分子内環化反応を誘発して脱離するためのもので、臭素、塩素、ヨウ素などのハロゲン元素を適用することができる。なお、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸の側鎖末端とは、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸におけるα−炭素から伸長した原子団の末端をいう。
アミノアシラーゼは微生物などから抽出され、Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸のアミド結合を加水分解させる酵素であり、アスペルギルスジーナス（ Aspergillus genus ）L−アミノアシラーゼ、アルカリジーナスキシロースオキシダンス（ Alcaligenes xylosoxydans ）D−アミノアシラーゼなどが含まれる。
分子内環化反応は、図３に例示されるようにＮ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸を自己環化させて特殊なイミノ酸を生成させる反応である。Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸を所定の分子内環化反応条件に保持してアミノアシラーゼの作用で加水分解させることにより自己環化させることができる。すなわち、アミノアシラーゼの酵素的エナンチオマー特異的加水分解およびこの加水分解に伴う分子内環化反応によって光学活性なピペコリン酸（ L−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸）を製造できる。
【００１０】
ここで、ラセミ体溶液におけるｐＨが６より低くなると、特異的加水分解の反応速度などが低下する傾向が現れ、逆にｐＨが９を超えるとアミノアシラーゼが変性して光学活性なピペコリン酸を有効に得ることができなくなる傾向が現れるので好ましくない。
ラセミ体溶液における温度が２０℃より低くなると、反応速度などが極端に低下する傾向が現れ、逆に温度が５０℃を超えるとアミノアシラーゼが変性して光学活性なピペコリン酸を有効に得ることができなくなる傾向が現れるので好ましくない。
溶液における分子内環化反応の保持時間が１０時間より短くなると、特異的加水分解の反応速度などが低下する傾向が現れ、逆に保持時間が３０時間より長くなるとアミノアシラーゼが変性して光学活性なピペコリン酸を有効に得ることができなくなる傾向が現れるので好ましくない。
【００１１】
アミノアシラーゼがアスペルギルス・ジーナス（ Aspergillus genus ）L−アミノアシラーゼ、Thermococcus eitoralis Ｌ−アシラーゼ、アシラーゼＩ（ブタスイ臓、Aspergillus melleus）、アルカリジーナスキシロースオキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans）D−アミノアシラーゼであるように構成されている。
これによって、光学活性なピペコリン酸を高収率で得ることができ、酵素を用いる光学分割によって得られるアミノ酸誘導体を中間体として、簡便かつ好収率で D−および L−ピペコリン酸を製造することができる。
【００１２】
抽出工程により L−ピペコリン酸が抽出除去された残溶液から D−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を回収する工程と、前記回収されたD−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸にアルカリジーナスキシロースオキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans）D−アミノアシラーゼを添加し、その D−エナンチオマー特異的作用により脱アセチル化させ、分子内環化させて D−ピペコリン酸を生成する工程と、を備えることにより、L−ピペコリン酸を抽出した残溶液を有効に用いて、付加価値の高い D−ピペコリン酸を無駄なく生成でき、生産性に優れたピペコリン酸製造システムを構成することができ、特殊なイミノ酸である光学活性なピペコリン酸の供給不足に対応して両光学異性体の供給を容易化して医療開発研究などを押し進めることができる。
【００１３】
抽出工程によりＤ−ピペコリン酸が抽出除去された残溶液からＬ−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を回収する工程と、前記回収されたＬ−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸にアスペルギルス・ジーナス（Aspergillus genus）Ｌ−アミノアシラーゼを添加し、そのＬ−エナンチオマー特異的作用により脱アセチル化させ、分子内環化させてＬ−ピペコリン酸を生成する工程と、を備えることにより、Ｄ−ピペコリン酸を抽出した残溶液を有効に用いて、付加価値の高いＬ−ピペコリン酸を無駄なく生成でき、生産性に優れたピペコリン酸製造システムを実現できる。
【００１４】
請求項３に記載のピペコリン酸の製造方法は、請求項１又は２に記載の発明において、前記Ｎ−アセチル−ＤＬ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸が、アセタミドマロン酸ジエチルと 1, 4−ジブロモブタンを反応させてアセタミド−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルを生成させる工程と、前記アセタミド−4−ブロモブチルマロン酸を半ケン化して加熱脱炭酸し DL−N−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチル得る工程と、前記 DL−N−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチルをケン化、結晶化させる工程と、を順次実行して製造されるように構成されている。
これによって、比較的安価で入手しやすいアセタミドマロン酸ジエチルを出発原料として、ピペコリン酸製造のため中間体となるDL−N−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を制御しやすい容易な工程で効率的に製造することができ、生産性に優れた製造システムを構築できる。
ここで、半ケン化の条件は、アセタミド−4−ブロモブチルマロン酸に氷冷下、１当量強のアルカリを添加する条件であり、加熱脱炭酸の条件はトルエンまたは酢酸エチル溶液を添加して加熱還流させる条件である。
【００１５】
請求項４に記載のピペコリン酸の製造方法は、Ｄ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸、Ｌ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸を、Ｎ−保護−Ｄ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸、Ｎ−保護−Ｌ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸のいずれかの溶液を保護基の脱着条件に保持することにより生成し、これに続く分子内環化反応によってＤ−ピペコリン酸又はＬ−ピペコリン酸を生成させるピペコリン酸の製造方法であって、前記脱着条件が、室温下におけるパラジウム炭を触媒とする水素添加反応条件又は、塩化水素含有ジオキサン溶液又は酢酸エチル中での脱着反応条件である構成を有している。
これによって、保護基の脱着や加水分解に伴う分子内環化反応によってピペコリン酸を有効に生成することができる。すなわち、図４に例示されるようにアミノ酸誘導体の保護基（アミノ基を修飾するｔ−ブトキシカルボニル基の部分）を所定の条件下で加水分解させ、これに続く分子内環化反応によってピペコリン酸を効率的に生成させるものである。こうして、L−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸並びにそれらの誘導体を個別に、安価に供給することができる。
保護基はジブロモブタンとの反応時におけるアミノ酸誘導体のアミノ基を保護するために導入される官能基であって、また分子内環化反応直前までアミノ基のブロモ結合炭素との反応を抑えるための保護基であり、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基などが用いられる。
また上記の脱着条件により、光学活性のピペコリン酸を得るために必要な脱着条件を適正に保持させることができ、１００％近い高純度のピペコリン酸を８０〜９０％の高収率で得ることができ、保護基を有するアミノ酸誘導体を用いて、工業的な規模でのピペコリン酸の製造を可能にする。
ここで、塩化水素の濃度は２モル濃度でアミノ酸誘導体に対し約１０当量用いられる。
【００１７】
請求項５に記載のピペコリン酸の製造方法は、請求項４に記載の発明において、前記Ｎ−保護−Ｌ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸が、Ｎ−保護−Ｌ−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸であって、前記N−保護−Ｌ−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸が、N−ベンジルオキシカルボニル−アミノマロン酸ジエチル、N−t−ブトキシカルボニル−アミノマロン酸ジエチルの保護基を有するアミノマロン酸誘導体と 1, 4−ジブロモブタンを反応させて N−保護−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルを生成せしめた後、氷冷下で希薄強アルカリ水を添加して半ケン化し、次いで加熱脱炭酸して得られるＤＬ−Ｎ−保護−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸エチルをタンパク質分解酵素またはエステラーゼの加水分解作用によって作成されるように構成されている。
請求項６に記載のピペコリン酸の製造方法は、請求項５に記載の発明において、前記Ｎ−保護−Ｄ−２−アミノ−６−ハロゲノへキサン酸が、Ｎ−保護−Ｄ−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸であって、前記Ｎ−保護−Ｄ−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸が、前記Ｎ−保護−Ｌ−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸の作成後の溶液から回収されたＮ−保護−Ｄ−２−アミノ−６−ブロモへキサン酸エチルを、氷冷下で希薄強アルカリ水を添加してケン化して作成されるように構成されている。
これによって、光学活性ピペコリン酸（ D−ピペコリン酸、L−ピペコリン酸）製造の際に（１）N−保護−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸や（２） N−保護−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を中間原料として、効率的な生産システムを構成することができ、医薬品原料となるような光学活性ピペコリン酸を低原価で量産することができる。
ここで、温和な条件とは、アミノ酸誘導体の反応保持温度が０℃以下であるような条件をいい、これによって半ケン化及びケン化の程度などを制御することができる。
タンパク質分解酵素としては、エステル分解作用を有するキモトリプシン、ズブチリシン、アルカリプロテアーゼなどや、立体特異性が厳密であるエステラーゼなどが好適に用いられる。
希薄強アルカリ水としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の約０．１Ｎ溶液が用いられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、L−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸を構成要素として含有する生理活性天然物をリードとする抗がん剤の開発ならびに特殊人工アミノ酸の開発中に、偶然ピペコリン酸を生成する副反応を発見した。この反応を利用すれば新規にL−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸並びにそれら誘導体を簡便に製造することができるのではないかと考え、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、図３に示すようにハロゲン基を側鎖末端に有するラセミのアミノ酸誘導体がアスペルギルスジーナス（ Aspergillus genus ）L−アミノアシラーゼ及び、アルカリジーナスキシロースオキシダンス（ Alcaligenes xylosoxydans ）D−アミノアシラーゼの作用により、定量的にL−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸を生成することを確認した。また、アミノ基をウレタン型等の保護基で保護し、側鎖末端にハロゲン基、アルキルスルホキシ基を有するラセミ体の２−アミノヘキサン酸エステルを、スブチリシン、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ（Aspergillus niger）、中性プロテアーゼ（Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis)又はアルカリプロテアーゼ（Bacillus subtilis, Aspergillus melleus, Bacillus lichenifomis）等のプロテアーゼで処理した後に、保護基の除去と同時にL−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸が生成することを確認した。本発明者らはこの酵素的エナンチオマー特異的加水分解および自動環化反応をL−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸の簡便な製造法に利用できることを見出して本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下の L−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸の製造方法を包含するものである。
[１] アセタミドマロン酸ジエチルよりN−アセチル−DL−2−アミノ−6−ハロゲノへキサン酸を原料として調製する方法。
[２] ラセミ体中のL−体にAspergillus genus L−アミノアシラーゼを、D−体にAlcaligenes xylosoxydans D−アミノアシラーゼを作用させて、L−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸を生成せしめる方法。
[３] N−アシル−DL−2−アミノ−6−ハロゲノへキサン酸エステルにプロテアーゼを作用させた後、アシル基を除去すると同時にL−ピペコリン酸を生成させる方法。
[４] 回収した D−N−アシル−2−アミノ−6−ハロゲノへキサン酸エステルより、脱保護によってD−ピペコリン酸またはその誘導体を生成せしめる方法。
【００１９】
すなわち、本実施の形態の概要は以下のとおりである。
アセタミドマロン酸ジエチルと1,4−ジブロモブタンを定法で反応させ、温和な条件でケン化反応を２回行い、得られるN−アセチル−DL−2−アミノ−6−へキサン酸をL−アミノアシラーゼによって処理すれば、酵素特異的光学分割によって生成したL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸は、反応溶液中で直ちにL−ピペコリン酸に変わる。続いて定量的に回収するN−アセチル−D−2−アミノ−6−へキサン酸に更にD−アミノアシラーゼを作用させ、同様にD−ピペコリン酸を得る事ができる。
【００２０】
一方、図４に示すように、N−t−ブトキシカルボニル−アミノマロン酸ジエチルのように脱着可能な保護基を用いる場合、同様に1,4−ジブロモブタンと反応させ、N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルを得、上記と同様に半ケン化、脱炭酸のステップを経て得られるN−t−ブトキシカルボニル−DL−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸エチルをズブチリシン等のタンパク質分解酵素またはエステラーゼによって処理すると、エチルエステルの酵素的、立体特異的加水分解によってN−t−ブトキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸と、酵素作用を受けないN−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸エチルとが得られる。両者は容易に分離可能である。N−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸エチルを、更にエタノール中で氷冷下ケン化を行ない、定量的にN−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸に変換する。N−t−ブトキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸を酸処理し、次いで中和すると生成したL−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸は自動的に分子内環化反応を起こして、L−ピペコリン酸を生成する。同様にしてD−ピペコリン酸を得る。
【００２１】
ベンジルオキシカルボニル基をアミノマロン酸ジエチルのアシル保護基として用いる場合、N−ベンジルオキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸をメタノール中でパラジウム等の触媒存在下、接触還元すれば、生成したL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸は自動的に分子内環化反応により、L−ピペコリン酸を生成する。N−ベンジルオキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸からは同様にD−ピペコリン酸が得られる。t−ブトキシカルボニル基以外の、ベンジルオキシカルボニル基等温和に脱着可能な保護基も用い得る。また、エチルエステル以外のエステルも用い得る。
【００２２】
本実施の形態において、2−アミノ−6−ハロゲノへキサン酸のアミノ保護基として、アセチル基以外にその他の置換アシル基およびウレタン型のアシル基を含む。同等の作用が得られるからである。 L−アミノアシラーゼおよび D−アミノアシラーゼのエナンチオマー特異的（光学特異性、立体特異性）加水分解活性が充分であればよい。エステラーゼ活性を示す酵素はエナンチオマー特異的（光学特異性、立体特異性）加水分解活性が充分であれば、その対象エステルの種類と本来の酵素反応の特異性を問わない。
【００２３】
以上のように本実施の形態のピペコリン酸の製造方法は、DL−N−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸にAspergillus genus L−アミノアシラーゼを作用させ、酵素による光学分割に続いて速やかに分子内環化反応を起こさせるL−ピペコリン酸を生成させる。また、この反応から回収されるD−N−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を更にAlcaligenes xylosoxydans D−アミノアシラーゼで処理すると、同様にD−ピペコリン酸が得られる。このように側鎖にブロモアルキル基を有するラセミ体アミノ酸の酵素分割を利用して、L−およびD−ピペコリン酸を高純度、高収率で合成できる優れた生産システムを構築できる。
【００２４】
以下、実施例により図面を用いてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
（実施例１）
図２にN−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の合成の概要を示す。
（１）アセタミド−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルの合成
300 ml ナスフラスコ中で脱水エタノール (100 ml) に金属ナトリウム (2.19 g, 95 mmol) を加え 30 分間攪拌後、アセタミドマロン酸ジエチル (21.08 g, 100 mmol) を加え 30 分間加熱（１２０℃）下攪拌した。そこに 1, 4−ジブロモブタン (59 ml, 500 mmol) を加えて 5 時間の還流を行った。放冷後、酢酸 (0.29 ml, 5 mmol) を加え、エタノールと 1, 4−ジブロモブタンをそれぞれ留去した。酢酸エチル (300 ml) で目的物を抽出した後、シリカゲルクロマトグラフィー (φ4.7 cm x 17 cm, 酢酸エチル/ヘキサン= 1 : 1) で精製した。溶媒を留去してアセタミド−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルの白色結晶を得た。収量 : 26.2 g、収率 : 73 %、Rf値 : 0.82(CHCl3 / MeOH = 9 : 1)。
（２）アセトアミド−4−ブロモブチルマロン酸モノエチルの合成
アセトアミド−4−ブロモブチルマロン酸ジエチル (26.2 g, 74.4 mmol) をエタノール (80 ml) に溶解し、氷冷下で 2 N 水酸化ナトリウム水溶液 (40 ml) を 30 分毎に 5 回に分けて加えた。3 時間後、反応溶液を濃縮しエーテルおよび4% 炭酸水素ナトリウム水溶液と振った。4% 炭酸水素ナトリウム水溶液をクエン酸で中和、酸性とした後、析出油状物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してアセトアミド−4−ブロモブチルマロン酸モノエチルの白色結晶を得た。収量 : 20.4 g、収率 : 85%、 Rf値 : 0.64(CHCl3 / MeOH / AcOH = 90 : 10 : 2)。
（３）N−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチルの合成
アセトアミド−4−ブロモブチルマロン酸モノエチル (20.4 g, 63.1 mmol) を酢酸エチル (100 ml) に溶解し、トルエンや酢酸エチル中で3時間加熱還流し脱炭酸を行った。溶液を濃縮し、エーテルに溶解させ4% 炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチルの油状物を得た。収量 : 17.0 g、収率 : 97%、 Rf値 : 0.62 (CHCl3 / MeOH = 9 : 1)。
（４）N−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の合成
N−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチル (17.0 g, 60.9 mmol) をエタノール (50 ml) に溶解し、氷冷下で 2 N 水酸化ナトリウム水溶液 (25 ml) を 30 分毎に 5 回に分けて加えた。3 時間後、溶液を濃縮しエーテルおよび4% 炭酸水素ナトリウム水溶液と振った。4% 炭酸水素ナトリウム水溶液をクエン酸で中和し、酸性とした後、目的物を酢酸エチルに抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の白色結晶を得た。収量 : 12.5 ｇ、収率 : 81%、Rf値 : 0.54 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90 : 10 : 2 )。
【００２５】
（実施例２）
次に、L−アミノアシラーゼによるL−ピペコリン酸の合成、 N−アセチル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の回収、およびD−アミノアシラーゼによるD−ピペコリン酸の合成について説明する。
図３はその合成などの概要を示す図である。
（１）N−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸 (10.3 g, 41.0 mmol) を 0.1 N 水酸化ナトリウム水溶液 (約200 ml) に溶解し、pH を 7.0 に調整した。この溶液に CoCl₂・6H₂O (48 mg) および Aspergillus genus L−アミノアシラーゼ (東京化成, 2.0 g) を加え 38℃ で24 時間反応させた。反応溶液を濃縮し 1 N 塩酸を加えて pH 3 とした後、N−アセチル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−アセチル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を白色結晶として得た。収量 : 4.59 g、収率 : 89%、Rf値 : 0.52(CHCl3 / MeOH / AcOH = 90 : 10 : 2)、 Rt : 13.38 min [B: 0%−100% 30min, (A: 100% AcCN / H2O / 0.1%TFA, B: 100% AcCN / 0.1%TFA) YMC-Pack ODS-A 150 x 4.6 mm, l = 220 nm] 。
（２）また、N−アセチル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の抽出後の水溶液を水酸化ナトリウムで pH 7 に調整した後、溶液陽イオン交換樹脂 (Amberlite IR-120, 200 ml) カラムに投じ、1 M アンモニア水溶液で溶出した。溶出液を濃縮乾固してL−ピペコリン酸を白色結晶として得た。収量 : 1.84 g、収率 : 80%、 [α]D ： -26.3 (c 1.0, H2O)、 FABHRMS : [M+H]+ (130.0842), C6H12O2N (130.0868)。
（３）N−アセチル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸 (3.5 g, 14 mmol) を 0.1 N 水酸化ナトリウム水溶液 (約7 ml) に溶解し、pH を 7.0 に調整した。この溶液に Alcaligenes xylosoxydans D−アミノアシラーゼ (45 mg/45 ml) を加え 38℃ で 3 日間反応させた。反応溶液を濃縮後、陽イオン交換樹脂 (Amberlite IR-120, 200 ml)カラムに投じ、1 M アンモニア水溶液で溶出した。溶出液を濃縮乾固してD−ピペコリン酸を白色結晶として得た。収量 : 1.55 g、収率 : 85%、[α]D ： +26.3 (c 1.0, H2O)、 FABHRMS :[M+H]+ (130.0877), C6H12O2N (130.0868)。
【００２６】
（実施例３）
次に、N−アシル−DL−2−アミノ−6−ハロゲノへキサン酸エステルの合成とプロテアーゼ作用および脱アシル基による L−ピペコリン酸の合成について説明する。
（１）N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルの合成
300 ml ナスフラスコ中で脱水エタノール (100 ml) に金属ナトリウム (2.3 g, 100 mmol) を加え 30 分間攪拌後、N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノマロン酸ジエチル (27.6 g, 100 mmol) を加え 30 分間加熱攪拌した。そこに 1, 4−ジブロモブタン (60 ml, 500 mmol) を加えて 5 時間の還流を行った。放冷後、クエン酸を加え中和、NaBr をろ過後、エタノールと 1, 4−ジブロモブタンをそれぞれ留去した。酢酸エチル (300 ml) で目的物を抽出、溶媒を留去しN−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸ジエチルの油状物を得た。収量 : 37.0 g、収率 : 92 %、Rf値 : 0.90(CHCl3 / MeOH = 9 : 1)。
（２）N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸モノエチルの合成
N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸ジエチル (37.0 g, 92 mmol) をエタノール (100 ml) に溶解し、氷冷下で 2 N 水酸化ナトリウム水溶液 (46 ml) を 30 分毎に 5 回に分けて加えた。3 時間後、反応溶液を濃縮しエーテルおよび4% 炭酸水素ナトリウム水溶液と振った。4% 炭酸水素ナトリウム水溶液をクエン酸で中和、酸性とした後、析出油状物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸モノエチルの白色結晶を得た。収量 : 27.5 g、収率 : 80%、Rf値 : 0.68(CHCl3 / MeOH / AcOH = 90 : 10 : 2)。
（３）N−t−ブトキシカルボニル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチルの合成
N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノ−4−ブロモブチルマロン酸モノエチル (27.5 g, 73 mmol) をトルエン (150 ml) に溶解し、3時間加熱還流した。溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー (φ4.7 cm x 18 cm, 酢酸エチル/ヘキサン= 1 : 8) で精製した。溶媒を留去してN−t−ブトキシカルボニル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチルの油状物を得た。収量 : 19.3 g、収率: 85%、Rf値 : 0.70 (CHCl3 / MeOH = 9 : 1)。
（４）N−t−ブトキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の合成
図４にその合成方法の概要を示す。
N−t−ブトキシカルボニル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチル(19.3 g, 58.6 mmol) をDMF (50 ml)、H2O (150 ml) に溶解し、1 M NH3aqでpHを8.0に調整し、subtilisin (60 mg) を加え37℃で 12 時間反応させた。エーテルおよび 4% 炭酸水素ナトリウム水溶液と振り無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−t−ブトキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸及びN−t−ブトキシカルボニル−Ｄ−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチルを得た。その後4%炭酸水素ナトリウム水溶液をクエン酸で酸性とした後、析出油状物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−t−ブトキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を油状で得た。収量 : 8.0 g、収率 : 89%、 Rf値 : 0.55(CHCl3 / MeOH / AcOH = 90 : 10 : 2)。
（５）L−ピペコリン酸の合成
N−t−ブトキシカルボニル−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸 (1.24 g, 4.0 mmol) を室温で２時間、２ＭＨＣｌ／ジオキサン（20ml, 10当量）（溶媒）で処理し、次いで溶媒を留去した後、DMF (10 ml) に溶解し氷冷下でトリエチルアミン (8 mmol, 1.1 ml) を加えてpHを 8.0 に調整し 5 時間反応させた。塩をろ過後、反応液を酢酸で中和、濃縮してアセトンを加え L−ピペコリン酸の白色結晶として得た。収量 : 494 mg、収率 : 95%。
【００２７】
（実施例４）
N−アシル−D−2−アミノ−6−ハロゲノへキサン酸の合成と脱アシル基による D−ピペコリン酸の合成
（１）N−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の合成
N−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸エチル (4.63 g, 13.6 mmol) をエタノール(20 ml)に溶解し、氷冷下で 2 N 水酸化ナトリウム水溶液 (7 ml) を30 分毎に 5 回に分けて加えた。3 時間後、反応溶液を濃縮しエーテルおよび4% 炭酸水素ナトリウム水溶液と振った。4% 炭酸水素ナトリウム水溶液をクエン酸で酸性とした後、析出油状物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去してN−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を油状で得た。収量 : 4.33 g、収率 : 100%、 Rf値 : 0.55(CHCl3 / MeOH / AcOH = 90 : 10 : 2)。
（２）D−ピペコリン酸の合成
N−t−ブトキシカルボニル−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸 (4.33 g, 14.0 mmol) を室温で２時間、２ＭＨＣｌ／ジオキサン（20ml, 10当量）（溶媒）で処理した後、溶媒を留去し、次いで、DMF (15 ml) に溶解し氷冷下でトリエチルアミン (28 mmol, 3.92 ml) を加えてpHを 8.0 に調整し 5 時間反応させた。塩をろ過後、反応液を酢酸で中和、濃縮してアセトンを加え D−ピペコリン酸の白色結晶として得た。収量 : 1.71 mg、収率 : 94%
【００２８】
【発明の効果】
請求項１に記載のピペコリン酸の製造方法によれば、高純度に光学分割されたピペコリン酸を高収率で低原価で製造することができる。
【００２９】
請求項２に記載のピペコリン酸の製造方法によれば、請求項１記載の効果に加えて、高純度の光学活性ピペコリン酸を高収率で得ることができ生産性に優れる。
【００３３】
請求項３に記載のピペコリン酸の製造方法によれば、請求項１又は２に記載の効果に加えて、比較的安価で入手しやすいアセタミドマロン酸ジエチルを出発原料として、ピペコリン酸製造のため中間体となるDL−N−アセチル−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を制御しやすい容易な工程で効率的に製造することができ、生産性や経済性に優れた製造システムを構築できる。
【００３４】
請求項４に記載のピペコリン酸の製造方法によれば、保護基の脱着に伴う分子内環化反応によってピペコリン酸を有効に生成することができる。すなわち、アミノ酸誘導体の保護基を所定の条件下で脱着させ、これに続く分子内環化反応によってピペコリン酸を効率的に生成でき、L−ピペコリン酸および D−ピペコリン酸並びにそれらの誘導体を個別かつ、安価に製造できる。更に、光学活性のピペコリン酸を得るために必要な脱着条件を適正に保持させることができ、高純度のピペコリン酸を高収率で得ることができ、保護基を有するアミノ酸誘導体を用いて、工業的な規模でのピペコリン酸の製造を可能にする。
【００３６】
請求項５に記載のピペコリン酸の製造方法によれば、請求項４に記載の効果に加えて、光学活性ピペコリン酸（ D−ピペコリン酸、L−ピペコリン酸）製造の際に（１）N−保護−L−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸や（２）N−保護−D−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸を中間原料として、効率的な生産システムを構成することができ、医薬品原料となるような光学活性ピペコリン酸を安価に提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 L− または D−ピペコリン酸を含む生理活性天然物および医薬品の例
【図２】 N−アセチル−DL−2−アミノ−6−ブロモへキサン酸の合成のフローチャート
【図３】 L−アミノアシラーゼの作用による L−ピペコリン酸の合成反応および D−アミノアシラーゼの作用による D−ピペコリン酸の合成反応のフローチャート
【図４】脱着可能保護基を用いる場合のプロテアーゼ作用を含む L− および D−ピペコリン酸の合成法のフローチャート[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing pipecolic acid capable of mass-producing L-pipecolic acid and D-pipecolic acid at low cost.
[0002]
[Prior art]
As shown in FIG. 1, optically active pipecolic acid is included as a component of various useful physiologically active substances that exist in nature, and is also an important compound as a raw material for synthetic pharmaceuticals. Constituents of natural substances include FK506 (immunosuppressant), Rapamicin (immunosuppressant), and Trapoxin A (HDAC inhibitor), and synthetic drugs include VX710 (anticancer agent) and Bupivacaine (local anesthetic). It is done. Further, natural products containing L-pipecolic acid include Cyl-2 (Non-patent Document 1) and Sandramycin (Non-patent Document 2).
Furthermore, L-pipecolic acid is also introduced as a component in compounds that are artificially designed and useful because they have pharmacological activity. For example, VX710 (nonpatent literature 3) and L-365,209 (nonpatent literature 4) are mentioned.
Examples of natural products containing D-pipecolic acid include Trapoxin A (Non-Patent Document 5) and Apicidin (Non-Patent Document 6).
Based on these structures, L-pipecolic acid or D-pipecolic acid is required for the assembly of the molecular structure when developing and producing new drugs with various pharmacological activities. It was difficult to obtain pipecolic acid, which is an acid, as a completely optically active substance at low cost, and this was a bottleneck in drug discovery. Thus, over the past 20 years, a number of attempts have been made to synthesize and produce the required optically active pipecolic acid, mainly to elucidate the correlation between the physiological activity and structure of natural products.
[0003]
(1) For example, as a method for producing pipecolic acid (Non-patent Document 7), L- or D-lysine or other amino acid-derived methods are used, and (Non-patent Document 8) an enzyme is used. As a conventional method, a method using acylase in the presence of lipase, amidase, or vinyl butyrate is described.
(2) In (Patent Document 1) and (Non-Patent Document 9), optically obtained by fractional precipitation by reacting tartaric acid, chiral palladium binuclear complex, or O-phenyllactic acid with relatively inexpensive DL-pipecolic acid. A resolution method is disclosed, wherein DL-pipecolic acid is reacted with optically active phenoxypropionic acid in a mixture medium, and the resulting poorly soluble diastereomeric salt is dissolved or suspended in water, equivalent to or A process is described for the addition of excess acid to metathesis to produce optically pure D-pipecolic acid or L-pipecolic acid.
(3) (Non-Patent Document 10) attempts an asymmetric synthesis method such as using an asymmetric catalyst or introducing an asymmetric point. Methods have been described for forming piperidine rings using intramolecular SN2 reactions of amines to alkyl.
(4) (Non-patent Document 12) proposes a method in which L-lysine is used as a raw material and two kinds of enzymes (lysine 6-aminotransferase and L-Δ1-piperideine 6-carboxylate reductase) are applied.
[0004]
[Non-Patent Document 1]
(Hirota, A., Suzuki, A., Aizawa, K., and Tamura, S. (1973) .Structure of Cyl-2, a novel cyclotetrapeptide from Cylindrocladium scoparium. Arg. Biol. Chem. 37, 955-956) Rapamycin (Vezina, C., Kudelski, A., and Sehgal, SN (1975) .Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic.I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle. 28, 721-726), FK506 (Tanaka, H., Kuroda, A., Marusawa, H., Hatanaka, H., Kino, T., Goto, T., and Hashimoto, M. (1987). of FK506: a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces.J. Am. Chem. Soc. 109, 5031-5033)
[Non-Patent Document 2]
(Boger, D. L., Chen, J. H., and Saionz, K. W. (1996). (-)-Sandramycin: Total synthesis and characterization of DNA binding properties.J. Am. Chem. Soc. 118, 1629-1644)
[Non-Patent Document 3]
(Germann, UA, Shlyakhter, D., Mason, VS, Zelle, RE, Duffy, JP, Galullo, V., Armistead, DM, Saunders, JO, Boger, J., and Harding, MW (1997). Cellular and biochemical characterization of VX-710 as a chemosensitizer: Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in vitro.Anticancer Drugs 8, 125-140) , M. (1996). Stereospecific synthesis of the anaesthetic levobupivacaine. Tetrahedron Lett. 37, 6399-6402),
[Non-Patent Document 4]
(Pettibone, DJ, Clineschmidt, BV, Anderson, PS, Freidinger, RM, Lundell, GF, Koupal, LR, Schwartz, CD, Williamson, JM, Goetz, MA, Hensens, OD, Liesch, JM, and Springer, JP ( 1989) .A structurally unique, potent, and selective oxytocin antagonist derived from Streptomyces silvensis.Endocrinology 125, 217-222)
[Non-Patent Document 5]
(Itagaki, H., Nagashima, K., Sugita, K., Yoshida, H., Kawamura, Y., Yasuda, Y., Matsumoto, K., Ishii, K., Uotani, N., Nakai, H. , Terui, A., and Yoshimatsu, S. (1990) .Isolation and structural elucidation of new cyclotetrapeptides, Trapoxins A and B, having detransformation activities as antitumor agents.J. Antibiotics 43, 1524-1532)
[Non-Patent Document 6]
(Darkin-Rattray, SJ, Gurnett, AM, Myers, RW, Dulski, PM, Crumley, TM, Allocco, JJ, Cannova, C., Meinke, PT, Colletti, SL, Bednarek, MA, Singh, SB, Goetz, MA, Dombrowski, AW, Polishook, JD, and Schmatz, DM (1996) .Apicidin: A novel antiprotozoal agent that inhibits parasite histone deacetylase.Proc. Natl. Acad. USA 93, 13143-13147, Singh, SB, Zink, DL , Liesch, JM, Mosley, RT, Dombrowski, AW, Bills, GF, Darkin-Rattray, SJ, Schmatz, DM, and Goetz, MA (2002) .Structure and chemistry of apicidins, a class of novel cyclic tetrapeptides without a terminal a-keto epoxide as inhibitors of histone deacetylase with potent antiprotozoal activities.J. Org. Chem. 67, 815-825)
[Non-Patent Document 7]
(Fujii, T. and Miyoshi, M. (1975). A novel synthesis of L-pipecolic acid. Bull. Chem. Soc. Jpn. 48, 1341-1342; Kisfaludy, L., and Korenczki, F. (1982) One-step synthesis of L-piperidine-2-carboxylic acid. Synthesis 9, 163; Ohtani, B., Tsuru, S., Nishimoto, S., and Kagiya, T. (1990). Photocatalytic one-step syntheses of cyclic imino acids by aqueous semiconductor suspensions. J. Org. Chem. 55, 5551-5553).
[Non-Patent Document 8]
(Ng-Youn-Chen, MC, Serreqi, AN, Huang, QL, and Kazlauskas, RJ (1994) .Kinetic resolution of pipecolic acid using partially-purified lipase from Aspergillus niger. J. Org. Chem. 59, 2075-2081 ; Eichhorn, E., Roduit, J., Shaw, N., Heinzmann, K., and Kiener, A. (1997). Preparation of (S) -piperazine-2-carboxylic acid, (R) -piperazine-2 -carboxylic acid, and (S) -piperidine-2-carboxylic acid by kinetic resolution of the corresponding racemic carboxamides with stereoselective amidases in whole bacterial cells.Tetrahedron: Asymmetry 8, 2533-2536; Sanchez-Sancho, F. and Herradon, B (1998). Short syntheses of (S) -pipecolic acid, (R) -coniine, and (S) -d-coniceine using biocatalytically-generated chiral building blocks. Tetrahedron: Asymmetry 9, 1951-1965)
[Non-patent document 9]
(Portoghese, PS, Pazdernik, TL, Kuhn, WL, Hite, G., Shafi'ee, A. (1968) Stereochemical studies on medicinal agents.V. Synthesis, configuration, and pharmacological activity of pipradrol enantiomers. J. Med. Chem. 11, 12-15; Hardtmann, GE, Houlihan, WJ, and Giger, RKA (1988) .Trifluoromethyl substituted tetracyclic quinazolin-ones having tranquilizing activity.US patent 4760065; Hochless, DCR, Mayadunne, RC, and Wild, SB (1995). Convenient resolution of (±) -piperidine-2-carboxylic acid ((±) -pipecolic acid) by separation of palladium (II) diastereomers containing orthometallated (S)-(-)-1- [1- (Dimethylamino ) ethyl] naphthalene. Tetrahedron: Asymmetry 6, 3031-3037)
[Non-Patent Document 10]
(Berrien, JF, Royer, J., Husson, HP (1994). Asymmetric synthesis. 32. A new access to enantiomerically pure (S)-(-)-pipecolic acid and 2- or 6-alkylated derivatives. J. Org Chem. 59, 3769-3774; Foti, C., J. and Comins, DL (1995). Synthesis and reactions of a- (trifluromethanesulfonyloxy) enecarbamates prepared from N-acyllactams. J. Org. Chem. 60, 2656- 2657; Agami, C., Kadouri-Puchot, C., and Kizirian, JC (2000). A new enantioselective synthesis of (2S) -pipecolic acid. Synth. Commmun. 30, 2565-2572; Ginesta, X., Pericas , MA, Riera, A. (2002). Straightforward entry to the pipecolic acid nucleus. Enantioselective synthesis of baikiain. Tetrahedron lett. 43, 779-782).
[Non-Patent Document 11]
(Fernandez-Garcia, C., and McKervey, MA (1995) .A short enantioselective synthesis of pipecolic acid.Tetrahedron: Asymmetry 6, 2905-2906; Myers, AG, Gleason, JL, Yoon, T., and Kung, DW (1997). Highly practical methodology for the synthesis of D- and L-amino acids, N-protected amino acids, and N-methyl-amino acids. J. Am. Chem. Soc. 119, 656-673; Nazabadioko, S ., Perez, RJ, Brieva, R., and Gotor, V. (1998). Chemoenzymatic synthesis of (S) -2-cyanopiperidine, a key intermediate in the route to (S) -pipecolic acid and 2-substituted piperidine alkaloids Tetrahedron: Asymmetry 9, 1597-1604).
[Non-Patent Document 12]
(Agematsu, H., and Fujii, T. (2002). Production of L-pipecolic acid by recombinant Escherichia coli at an industrial scale. Bio Industry 19, 40-47).
[0005]
[Patent Document 1]
JP 2000-178253 A
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, the above conventional techniques have the following problems.
(A) The method of induction from amino acids such as lysine described in Non-Patent Document 7 is as follows:
It requires a selective reaction of the α-position and ε-position amino groups, and many side reactions such as hydroxylation occur during the functional group conversion of amino groups, resulting in low yield and low purity, which is dangerous for the use of reagents. There has been a problem in that it is difficult to supply at a low cost due to operational problems such as being accompanied.
(B) The method using acylase in the presence of lipase, amidase, or vinyl butyrate described in Non-Patent Document 8 has insufficient diastereomeric selectivity.
For this reason, it has not been a practical production method, but there is a problem that it is insufficient in terms of improving efficiency in terms of application of the stereospecificity of the enzyme.
(C) In the fractional precipitation method described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 9, since optical resolution is performed using DL-pipecolic acid as a raw material, it is necessary to prepare an optical isomer separately and recover it after use. There was a problem of being inefficient.
(D) In the asymmetric synthesis method described in Non-Patent Document 10, the reagent itself for introducing the asymmetric point is expensive, and the scale is at the laboratory level, so it is not practical for mass production and is not practical. There was a problem that it was difficult.
(E) In the method of forming a piperidine ring using the intramolecular SN2 reaction of amines described in Non-Patent Document 11, it is limited to that of a piperidine ring, so it does not reach pipecolic acid directly and has a low yield. Also, it is not an optical resolution method using enzymes
There was a problem that unnecessary diastereomers were also by-produced and it was difficult to obtain high-purity ones.
(F) The method of applying two kinds of enzymes using L-lysine as a raw material of Non-Patent Document 12 uses an enzyme having stereospecificity of L-form, and also has stereospecificity of D-form. Similarly, there has been a problem that it cannot be applied to the production of D-pipecolic acid because no enzyme has been developed.
[0007]
The present invention was made to solve the above-described conventional problems, and an object of the present invention is to provide a method for producing pipecolic acid capable of supplying pipecolic acid optically resolved with high purity at a high yield at low cost. To do.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
  The method for producing pipecolic acid according to claim 1 comprises D-2-amino-6-halogenohexanoic acid, L-2-amino-6-halogenohexanoic acid.Is added to a racemic solution of N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid to Aspergillus genus L-aminoacylase, Thermococcus eitoralis L-aminoacylase, acylase I (pig water, Aspergillus melleus) L-aminoacylase, an adjustment step of adding any aminoacylase of Alcaligenes xylosoxydans D-aminoacylase, and the racemic solution at pH 6-9 at a temperature of 20-50 ° C. Produced by enantiospecific action of the aminoacylase followed by a production step that is maintained for 30 hoursIt has a structure for generating D-pipecolic acid or L-pipecolic acid by an intramolecular cyclization reaction.
  The method for producing pipecolic acid according to claim 2 is the invention according to claim 1.,The method comprises an extraction step of solvent-extracting the D-pipecolic acid or the L-pipecolic acid from the racemic solution after the generating step.
  Thereby, pipecolic acid optically resolved with high purity can be produced at high yield and at low cost. That is, N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid is enantiomer-specific by allowing an optically active aminoacylase to act on N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid. It is possible to efficiently produce optically active pipecolic acid by an intramolecular cyclization reaction that occurs immediately after the hydrolysis.
  In addition, the enantiomer-specific hydrolysis by aminoacylase and the accompanying intramolecular cyclization reaction can be appropriately maintained, and high-purity optically active pipecolic acid can be obtained in a higher yield.
[0009]
  Halogen group isN-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acidInduction of intramolecular cyclization reactionDoFor halogen elements such as bromine, chlorine, iodineTheCan be applied. In addition,N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acidThe side chain end ofN-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acidThe end of the atomic group extended from the α-carbon in.
  Aminoacylase is extracted from microorganisms,N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acidAspergillus genus L-aminoacylase, alkaline genus xylose oxydans (Alcaligenes xylosoxydans) D-aminoacylase, and the like.
  The intramolecular cyclization reaction is as illustrated in FIG.N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acidIs a reaction that produces a special imino acid by self-cyclization.N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acidCan be self-cyclized by maintaining them in predetermined intramolecular cyclization reaction conditions and hydrolyzing them with the action of aminoacylase. That is, optically active pipecolic acid (L-pipecolic acid and D-pipecolic acid) can be produced by enzymatic enantiomer-specific hydrolysis of aminoacylase and intramolecular cyclization reaction accompanying this hydrolysis.
[0010]
  Here, when the pH in the racemic solution is lower than 6, the reaction rate of specific hydrolysis tends to decrease. Conversely, when the pH exceeds 9, the aminoacylase is denatured and optically active pipecolic acid is effective. This is not preferable because it tends to be unable to be obtained.
  When the temperature in the racemic solution is lower than 20 ° C, the reaction rate tends to decrease extremely. Conversely, when the temperature exceeds 50 ° C, aminoacylase is denatured and optically active pipecolic acid can be obtained effectively. Since the tendency to become impossible appears, it is not preferable.
  If the retention time of the intramolecular cyclization reaction in the solution is shorter than 10 hours, the reaction rate of specific hydrolysis tends to decrease. Conversely, if the retention time is longer than 30 hours, the aminoacylase is denatured and optically active. Since it tends to be impossible to obtain effective pipecolic acid, it is not preferable.
[0011]
  AminoacylaseAspergillus genus (Aspergillus genus) L-aminoacylase, Thermococcus eitoralis L-acylase, acylase I (pig water, Aspergillus melleus), alkaline genus xylose oxydans (Alcaligenes xylosoxydans) D-aminoacylase .
  As a result, optically active pipecolic acid can be obtained in high yield, and D- and L-pipecolic acid can be produced easily and in good yield using an amino acid derivative obtained by optical resolution using an enzyme as an intermediate. Can do.
[0012]
  Extraction processRecovering D-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid from the residual solution from which L-pipecolic acid has been extracted and removed by the step, and the recovered D-acetyl-2-amino-6-bromohexane A step of adding Alcaligenes xylosoxydans D-aminoacylase to the acid, deacetylating it by its D-enantiomer specific action, and intramolecular cyclization to produce D-pipecolic acid;,WithByBy effectively using the residual solution extracted with L-pipecolic acid, it is possible to produce high-value-added D-pipecolic acid without waste and to construct a pipecolic acid production system with excellent productivity. Corresponding to the short supply of optically active pipecolic acid, it is possible to facilitate the supply of both optical isomers and promote medical development research.
[0013]
  Extraction processRecovering L-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid from the residual solution from which D-pipecolic acid has been extracted and removed by the step, and the recovered L-acetyl-2-amino-6-bromohexane Adding an Aspergillus genus L-aminoacylase to the acid, deacetylating it by its L-enantiomer-specific action, and intramolecular cyclization to produce L-pipecolic acid;,WithByBy effectively using the residual solution from which D-pipecolic acid has been extracted, L-pipecolic acid with high added value can be generated without waste, and a pipecolic acid production system with excellent productivity can be realized.
[0014]
  Claim3The method for producing pipecolic acid according to claim 1,1 or 2The N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid is reacted with diethyl acetamide malonate and 1,4-dibromobutane to produce diethyl acetamide-4-bromobutyl malonate A step of half-saponifying the acetamide-4-bromobutylmalonic acid to heat decarboxylate to obtain DL-N-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl, and the DL-N-acetyl- It is configured to be produced by sequentially performing saponification and crystallization of ethyl 2-amino-6-bromohexanoate.
  This makes it easy to control DL-N-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid, which is an intermediate for the production of pipecolic acid, using diethyl acetamidomalonate, which is relatively inexpensive and easily available, as a starting material. Can be manufactured efficiently, and a manufacturing system with excellent productivity can be constructed.
  Here, the conditions for semi-saponification are conditions in which a little more than one equivalent of alkali is added to acetamide-4-bromobutylmalonic acid under ice cooling, and the conditions for heat decarboxylation are the addition of toluene or ethyl acetate solution. Conditions for heating to reflux.
[0015]
  The method for producing pipecolic acid according to claim 4, wherein D-2-amino-6-halogenohexanoic acid and L-2-amino-6-halogenohexanoic acid are converted to N-protected-D-2-amino- It is produced by maintaining a solution of either 6-halogenohexanoic acid or N-protected-L-2-amino-6-halogenohexanoic acid under the desorption conditions of the protecting group, followed by an intramolecular cyclization reaction. To produce D-pipecolic acid or L-pipecolic acidIn the method for producing pipecolic acid, the desorption condition is a hydrogenation reaction condition using palladium charcoal as a catalyst at room temperature or a desorption reaction condition in a hydrogen chloride-containing dioxane solution or ethyl acetate.ConstitutionHaveing.
  Thereby, pipecolic acid can be effectively produced by an intramolecular cyclization reaction accompanying desorption or hydrolysis of the protecting group. That is, as shown in FIG. 4, the protecting group (the t-butoxycarbonyl group part that modifies the amino group) of the amino acid derivative is hydrolyzed under predetermined conditions, and pipecolic acid is then subjected to an intramolecular cyclization reaction. Is generated efficiently. In this way, L-pipecolic acid and D-pipecolic acid and their derivatives can be supplied individually and inexpensively.
  The protecting group is a functional group introduced to protect the amino group of the amino acid derivative during the reaction with dibromobutane, and is used to suppress the reaction of the amino group with the bromo-bonded carbon until immediately before the intramolecular cyclization reaction. Protecting groups such as benzyloxycarbonyl group and t-butoxycarbonyl group are used.
In addition, the above desorption conditions can properly maintain the desorption conditions necessary for obtaining optically active pipecolic acid, and can obtain pipecolic acid having a purity of nearly 100% in a high yield of 80 to 90%. The amino acid derivative having a protecting group can be used to enable the production of pipecolic acid on an industrial scale.
Here, the concentration of hydrogen chloride is 2 molar, and about 10 equivalents are used with respect to the amino acid derivative.
[0017]
Claim5The method for producing pipecolic acid according to claim 1,4Wherein the N-protected-L-2-amino-6-halohexanoic acid is N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid, and the N-protected- L-2-amino-6-bromohexanoic acid is diethyl N-benzyloxycarbonyl-aminomalonate,N-tert-Butoxycarbonyl-aminomalonateAfter reacting an aminomalonic acid derivative having a protecting group with 1,4-dibromobutane to form diethyl N-protected-amino-4-bromobutylmalonate, dilute strong alkaline water was added under ice cooling. DL-N-protected-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl obtained by semi-saponification and then heat decarboxylation is prepared by hydrolytic action of proteolytic enzyme or esterase.
Claim6The method for producing pipecolic acid according to claim 1,5Wherein the N-protected-D-2-amino-6-halohexanoic acid is N-protected-D-2-amino-6-bromohexanoic acid, and the N-protected- D-2-amino-6-bromohexanoic acid was recovered from the solution after the preparation of the N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid. It is configured to be prepared by saponifying ethyl 6-bromohexanoate by adding dilute strong alkaline water under ice cooling.
  As a result, (1) N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid and (2) N-protected-D can be used in the production of optically active pipecolic acid (D-pipecolic acid, L-pipecolic acid). An efficient production system can be constructed using -2-amino-6-bromohexanoic acid as an intermediate raw material, and optically active pipecolic acid that can be used as a pharmaceutical raw material can be mass-produced at low cost.
  Here, the mild condition refers to a condition that the reaction holding temperature of the amino acid derivative is 0 ° C. or less, and thereby the degree of semi-saponification and saponification can be controlled.
  As the proteolytic enzyme, chymotrypsin, subtilisin, alkaline protease, etc. having an esterolytic action, and esterase having strict stereospecificity are preferably used.
  As the dilute strong alkaline water, an about 0.1N solution such as sodium hydroxide or potassium hydroxide is used.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present inventors accidentally generate pipecolic acid during the development of anticancer agents led by bioactive natural products containing L-pipecolic acid and D-pipecolic acid as constituents and the development of special artificial amino acids. I found a side reaction. Assuming that this reaction could be used to easily produce L-pipecolic acid and D-pipecolic acid and their derivatives, we conducted intensive research to solve the above problems. As shown, the racemic amino acid derivative having a halogen group at the side chain terminal is quantitatively expressed by the action of Aspergillus genus L-aminoacylase and alkaline genus xylose oxydans (Alcaligenes xylosoxydans) D-aminoacylase. It was confirmed to produce pipecolic acid and D-pipecolic acid. In addition, the amino group is protected with a protecting group such as a urethane type, and a racemic 2-aminohexanoic acid ester having a halogen group and an alkylsulfoxy group at the end of the side chain is converted into subtilisin, chymotrypsin, acidic protease (Aspergillus niger), L-pipecolic acid and D-pipecolic acid are formed simultaneously with removal of the protecting group after treatment with a protease such as neutral protease (Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis) or alkaline protease (Bacillus subtilis, Aspergillus melleus, Bacillus lichenifomis). It was confirmed. The present inventors have found that this enzymatic enantiomer-specific hydrolysis and autocyclization reaction can be used in a simple method for producing L-pipecolic acid and D-pipecolic acid, and completed the present invention.
That is, the present invention includes the following methods for producing L-pipecolic acid and D-pipecolic acid.
[1] A process for preparing N-acetyl-DL-2-amino-6-halohexanoic acid from diethyl acetamidomalonate as a raw material.
[2] A method in which L-pipecolic acid and D-pipecolic acid are produced by allowing Aspergillus genus L-aminoacylase to act on the L-form in the racemate and Alcaligenes xylosoxydans D-aminoacylase to act on the D-form.
[3] A method in which a protease is allowed to act on N-acyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid ester, and then an acyl group is removed and simultaneously L-pipecolic acid is produced.
[4] A method for producing D-pipecolic acid or a derivative thereof by deprotection from the recovered D-N-acyl-2-amino-6-halogenohexanoic acid ester.
[0019]
That is, the outline of the present embodiment is as follows.
Acetamide malonate diethyl and 1,4-dibromobutane are reacted in a conventional manner, saponification reaction is performed twice under mild conditions, and the resulting N-acetyl-DL-2-amino-6-hexanoic acid is converted to L-aminoacylase. In the reaction solution, L-2-amino-6-bromohexanoic acid generated by enzyme-specific optical resolution is immediately converted to L-pipecolic acid in the reaction solution. Subsequently, D-aminoacylase is further allowed to act on N-acetyl-D-2-amino-6-hexanoic acid to be recovered quantitatively, whereby D-pipecolic acid can be obtained in the same manner.
[0020]
On the other hand, as shown in FIG. 4, in the case where a detachable protecting group such as diethyl Nt-butoxycarbonyl-aminomalonate is used, it is similarly reacted with 1,4-dibromobutane to give Nt-butoxycarbonyl. -N-t-butoxycarbonyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl obtained through steps of semi-saponification and decarboxylation in the same manner as above, obtained diethyl 2-amino-4-bromobutylmalonate Is treated with N-t-butoxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid by enzymatic and stereospecific hydrolysis of ethyl ester when treated with proteolytic enzymes such as subtilisin or esterase N-t-butoxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl ester is obtained. Both can be easily separated. N-t-butoxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl was further saponified in ethanol under ice-cooling to quantitatively determine N-t-butoxycarbonyl-D-2-amino-6. -Convert to bromohexanoic acid. When N-t-butoxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid is acid-treated and then neutralized, the resulting L-2-amino-6-bromohexanoic acid automatically undergoes an intramolecular cyclization reaction. Waking up to produce L-pipecolic acid. Similarly, D-pipecolic acid is obtained.
[0021]
When a benzyloxycarbonyl group is used as an acyl protecting group for diethyl aminomalonate, N-benzyloxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid can be catalytically reduced in methanol in the presence of a catalyst such as palladium. The produced L-2-amino-6-bromohexanoic acid automatically produces L-pipecolic acid by an intramolecular cyclization reaction. Similarly, D-pipecolic acid is obtained from N-benzyloxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid. Other than the t-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group isothermically detachable protecting group can also be used. Also, esters other than ethyl esters can be used.
[0022]
In the present embodiment, the amino protecting group of 2-amino-6-halogenohexanoic acid includes other substituted acyl groups and urethane type acyl groups in addition to the acetyl group. This is because an equivalent action can be obtained. It is sufficient that the enantiomer-specific (optical specificity, stereospecificity) hydrolysis activity of L-aminoacylase and D-aminoacylase is sufficient. As long as the enzyme showing esterase activity has sufficient enantiomer-specific (optical specificity, stereospecific) hydrolysis activity, the type of the target ester and the specificity of the original enzyme reaction are not limited.
[0023]
As described above, in the method for producing pipecolic acid according to the present embodiment, DL-N-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid is allowed to act on Aspergillus genus L-aminoacylase, followed by optical resolution by the enzyme. L-pipecolic acid that rapidly causes an intramolecular cyclization reaction is generated. Further, when DNN-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid recovered from this reaction is further treated with Alcaligenes xylosoxydans D-aminoacylase, D-pipecolic acid is similarly obtained. Thus, an excellent production system capable of synthesizing L- and D-pipecolic acid with high purity and high yield can be constructed by utilizing the enzymatic resolution of a racemic amino acid having a bromoalkyl group in the side chain.
[0024]
Hereinafter, although an example explains in detail using a drawing, the present invention is not restricted to the following example.
Example 1
FIG. 2 shows an outline of the synthesis of N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid.
(1) Synthesis of diethyl acetamide-4-bromobutylmalonate
Add sodium metal (2.19 g, 95 mmol) to dehydrated ethanol (100 ml) in a 300 ml eggplant flask and stir for 30 minutes. Add diethyl acetamidomalonate (21.08 g, 100 mmol) and stir for 30 minutes under heating (120 ° C). did. 1,4-Dibromobutane (59 ml, 500 mmol) was added thereto and refluxed for 5 hours. After allowing to cool, acetic acid (0.29 ml, 5 mmol) was added, and ethanol and 1,4-dibromobutane were distilled off. The target product was extracted with ethyl acetate (300 ml) and purified by silica gel chromatography (φ4.7 cm × 17 cm, ethyl acetate / hexane = 1: 1). The solvent was distilled off to obtain white crystals of diethyl acetamide-4-bromobutylmalonate. Yield: 26.2 g, Yield: 73%, Rf value: 0.82 (CHCl3 / MeOH = 9: 1).
(2) Synthesis of monoethyl acetamide-4-bromobutylmalonate
Acetamide-4-bromobutylmalonate diethyl (26.2 g, 74.4 mmol) was dissolved in ethanol (80 ml), and 2N aqueous sodium hydroxide solution (40 ml) was divided into 5 portions every 30 minutes under ice cooling. added. After 3 hours, the reaction solution was concentrated and shaken with ether and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution. The 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was neutralized with citric acid and acidified, and the precipitated oil was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated to give white crystals of monoethyl acetamide-4-bromobutylmalonate. Yield: 20.4 g, Yield: 85%, Rf value: 0.64 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90: 10: 2).
(3) Synthesis of ethyl N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoate
Acetamide-4-bromobutylmalonate monoethyl (20.4 g, 63.1 mmol) was dissolved in ethyl acetate (100 ml), and decarboxylated by heating under reflux in toluene or ethyl acetate for 3 hours. The solution was concentrated, dissolved in ether, and washed with 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine. After drying over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off to obtain an oily substance of ethyl N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoate. Yield: 17.0 g, Yield: 97%, Rf value: 0.62 (CHCl3 / MeOH = 9: 1).
(4) Synthesis of N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid
N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl ester (17.0 g, 60.9 mmol) was dissolved in ethanol (50 ml), and 2N aqueous sodium hydroxide solution (25 ml) was dissolved under ice-cooling. It was added in 5 portions every minute. After 3 hours, the solution was concentrated and shaken with ether and 4% aqueous sodium bicarbonate. A 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was neutralized with citric acid to be acidic, and the target product was extracted into ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated to obtain white crystals of N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid. Yield: 12.5 g, Yield: 81%, Rf value: 0.54 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90: 10: 2).
[0025]
(Example 2)
Next, synthesis of L-pipecolic acid by L-aminoacylase, recovery of N-acetyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid, and synthesis of D-pipecolic acid by D-aminoacylase will be described.
FIG. 3 is a diagram showing an outline of the synthesis and the like.
(1) N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid (10.3 g, 41.0 mmol) was dissolved in 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution (about 200 ml), and the pH was adjusted to 7.0. CoCl₂・ 6H₂O (48 mg) and Aspergillus genus L-aminoacylase (Tokyo Kasei, 2.0 g) were added and reacted at 38 ° C. for 24 hours. The reaction solution was concentrated and adjusted to pH 3 by adding 1 N hydrochloric acid, and then N-acetyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid was extracted with ethyl acetate. After drying over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off to obtain N-acetyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid as white crystals. Yield: 4.59 g, Yield: 89%, Rf value: 0.52 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90: 10: 2), Rt: 13.38 min (B: 0% -100% 30min, (A: 100% AcCN / H2O / 0.1% TFA, B: 100% AcCN / 0.1% TFA) YMC-Pack ODS-A 150 × 4.6 mm, l = 220 nm].
(2) The aqueous solution after extraction of N-acetyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid was adjusted to pH 7 with sodium hydroxide, and then the solution cation exchange resin (Amberlite IR-120, 200 ml) was applied to a column and eluted with 1 M aqueous ammonia solution. The eluate was concentrated to dryness to obtain L-pipecolic acid as white crystals. Yield: 1.84 g, Yield: 80%, [α] D: -26.3 (c 1.0, H2O), FABHRMS: [M + H] + (130.0842), C6H12O2N (130.0868).
(3) N-acetyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid (3.5 g, 14 mmol) was dissolved in 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution (about 7 ml), and the pH was adjusted to 7.0. Alcaligenes xylosoxydans D-aminoacylase (45 mg / 45 ml) was added to this solution and reacted at 38 ° C. for 3 days. After concentrating the reaction solution, it was applied to a cation exchange resin (Amberlite IR-120, 200 ml) column and eluted with 1 M aqueous ammonia solution. The eluate was concentrated to dryness to obtain D-pipecolic acid as white crystals. Yield: 1.55 g, yield: 85%, [α] D: +26.3 (c 1.0, H2O), FABHRMS: [M + H] + (130.0877), C6H12O2N (130.0868).
[0026]
(Example 3)
Next, synthesis of N-acyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoate, protease action, and synthesis of L-pipecolic acid by a deacyl group will be described.
(1) Synthesis of diethyl Nt-butoxycarbonyl-2-amino-4-bromobutylmalonate
Add sodium metal (2.3 g, 100 mmol) to dehydrated ethanol (100 ml) in a 300 ml eggplant flask and stir for 30 minutes, and then add N-t-butoxycarbonyl-2-aminomalonate (27.6 g, 100 mmol). The mixture was heated and stirred for 30 minutes. 1,4-Dibromobutane (60 ml, 500 mmol) was added thereto and refluxed for 5 hours. After standing to cool, citric acid was added for neutralization, NaBr was filtered off, and ethanol and 1,4-dibromobutane were distilled off. The desired product was extracted with ethyl acetate (300 ml), and the solvent was distilled off to obtain an oily product of diethyl Nt-butoxycarbonyl-2-amino-4-bromobutylmalonate. Yield: 37.0 g, Yield: 92%, Rf value: 0.90 (CHCl3 / MeOH = 9: 1).
(2) Synthesis of monoethyl Nt-butoxycarbonyl-2-amino-4-bromobutylmalonate
N-t-butoxycarbonyl-2-amino-4-bromobutylmalonate (37.0 g, 92 mmol) was dissolved in ethanol (100 ml), and 2N aqueous sodium hydroxide solution (46 ml) was added under ice-cooling. It was added in 5 portions every 30 minutes. After 3 hours, the reaction solution was concentrated and shaken with ether and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution. The 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was neutralized with citric acid and acidified, and the precipitated oil was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated to give white crystals of monoethyl Nt-butoxycarbonyl-2-amino-4-bromobutylmalonate. Yield: 27.5 g, Yield: 80%, Rf value: 0.68 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90: 10: 2).
(3) Synthesis of ethyl Nt-butoxycarbonyl-DL-2-amino-6-bromohexanoate
N-t-butoxycarbonyl-2-amino-4-bromobutylmalonate monoethyl (27.5 g, 73 mmol) was dissolved in toluene (150 ml) and heated to reflux for 3 hours. The solution was concentrated and purified by silica gel chromatography (φ4.7 cm × 18 cm, ethyl acetate / hexane = 1: 8). The solvent was distilled off to obtain an oily substance of ethyl Nt-butoxycarbonyl-DL-2-amino-6-bromohexanoate. Yield: 19.3 g, Yield: 85%, Rf value: 0.70 (CHCl3 / MeOH = 9: 1).
(4) Synthesis of Nt-butoxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid
FIG. 4 shows an outline of the synthesis method.
N-t-butoxycarbonyl-DL-2-amino-6-bromohexanoate (19.3 g, 58.6 mmol) was dissolved in DMF (50 ml), H2O (150 ml), and the pH was adjusted to 8.0 with 1 M NH3aq. And subtilisin (60 mg) was added and reacted at 37 ° C. for 12 hours. After drying with ether and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and shaking with anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off to give N-t-butoxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid and N-t-butoxycarbonyl- Ethyl D-2-amino-6-bromohexanoate was obtained. Thereafter, a 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was acidified with citric acid, and the precipitated oil was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated to give Nt-butoxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid as an oil. Yield: 8.0 g, Yield: 89%, Rf value: 0.55 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90: 10: 2).
(5) Synthesis of L-pipecolic acid
N-t-butoxycarbonyl-L-2-amino-6-bromohexanoic acid (1.24 g, 4.0 mmol) was treated with 2M HCl / dioxane (20 ml, 10 eq) (solvent) for 2 hours at room temperature and then the solvent. After distilling off, it was dissolved in DMF (10 ml), and triethylamine (8 mmol, 1.1 ml) was added under ice-cooling to adjust the pH to 8.0 and reacted for 5 hours. After filtering the salt, the reaction solution was neutralized with acetic acid, concentrated, and acetone was added to obtain white crystals of L-pipecolic acid. Yield: 494 mg, yield: 95%.
[0027]
Example 4
Synthesis of N-acyl-D-2-amino-6-halogenohexanoic acid and synthesis of D-pipecolic acid by deacyl group
(1) Synthesis of Nt-butoxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid
N-t-butoxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoate (4.63 g, 13.6 mmol) was dissolved in ethanol (20 ml), and 2N aqueous sodium hydroxide solution (7 ml ) Was added in 5 portions every 30 minutes. After 3 hours, the reaction solution was concentrated and shaken with ether and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution. 4% Aqueous sodium hydrogen carbonate solution was acidified with citric acid, and the precipitated oil was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated to give Nt-butoxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid as an oil. Yield: 4.33 g, Yield: 100%, Rf value: 0.55 (CHCl3 / MeOH / AcOH = 90: 10: 2).
(2) Synthesis of D-pipecolic acid
Nt-Butoxycarbonyl-D-2-amino-6-bromohexanoic acid (4.33 g, 14.0 mmol) was treated with 2M HCl / dioxane (20 ml, 10 equivalents) (solvent) for 2 hours at room temperature and then the solvent. Then, the residue was dissolved in DMF (15 ml), and triethylamine (28 mmol, 3.92 ml) was added under ice-cooling to adjust the pH to 8.0 and reacted for 5 hours. After filtering the salt, the reaction solution was neutralized with acetic acid, concentrated, and acetone was added to obtain white crystals of D-pipecolic acid. Yield: 1.71 mg, Yield: 94%
[0028]
【The invention's effect】
According to the method for producing pipecolic acid described in claim 1, pipecolic acid optically resolved with high purity can be produced at a high yield and at a low cost.
[0029]
According to the method for producing pipecolic acid described in claim 2, in addition to the effect of claim 1, high purity optically active pipecolic acid can be obtained in a high yield, and the productivity is excellent.
[0033]
  Claim3According to the method for producing pipecolic acid described in claim1 or 2Control of DL-N-acetyl-2-amino-6-bromohexanoic acid, which is an intermediate for the production of pipecolic acid, using diethyl acetamidomalonate, which is relatively inexpensive and readily available, as a starting material Therefore, it is possible to efficiently manufacture by an easy process, and it is possible to construct a manufacturing system excellent in productivity and economy.
[0034]
  According to the method for producing pipecolic acid according to claim 4, pipecolic acid can be effectively produced by an intramolecular cyclization reaction accompanying desorption of a protecting group. That is, the protecting group of the amino acid derivative can be desorbed under predetermined conditions, and pipecolic acid can be efficiently generated by the subsequent intramolecular cyclization reaction. L-pipecolic acid and D-pipecolic acid and their derivatives can be individually and Can be manufactured inexpensively.Furthermore, the desorption conditions necessary for obtaining optically active pipecolic acid can be properly maintained, high-pure pipecolic acid can be obtained in high yield, and an amino acid derivative having a protecting group can be used for industrial production. Enabling the production of pipecolic acid on a global scale.
[0036]
  Claim5According to the method for producing pipecolic acid described in claim4(1) N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid or (2) in the production of optically active pipecolic acid (D-pipecolic acid, L-pipecolic acid) An efficient production system can be constructed using N-protected-D-2-amino-6-bromohexanoic acid as an intermediate raw material, and optically active pipecolic acid that can be used as a pharmaceutical raw material can be provided at low cost.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Examples of bioactive natural products and pharmaceuticals containing L- or D-pipecolic acid
FIG. 2 is a flowchart of synthesis of N-acetyl-DL-2-amino-6-bromohexanoic acid.
FIG. 3 is a flow chart of L-pipecolic acid synthesis reaction by the action of L-aminoacylase and D-pipecolic acid synthesis reaction by the action of D-aminoacylase.
FIG. 4 is a flow chart of a method for synthesizing L- and D-pipecolic acid including protease action when a desorbable protecting group is used.

Claims

D-2-amino-6-halogenohexanoic acid, L-2-amino-6-halogenohexanoic acid,
In a racemic solution of N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid, Aspergillus genus L-aminoacylase, Thermococcus eitoralis L-aminoacylase, acylase I (porcine water, Aspergillus melleus) An adjustment step of adding an aminoacylase of any one of L-aminoacylase and Alcaligenes xylosoxydans D-aminoacylase, and the racemic solution at pH 6-9 and a temperature of 20-50 ° C. for 10-30 hours Produced by an enantiomeric specific action of said aminoacylase by
A method for producing pipecolic acid, characterized in that D-pipecolic acid or L-pipecolic acid is produced by a subsequent intramolecular cyclization reaction.

2. The method for producing pipecolic acid according to claim 1, further comprising an extraction step of extracting the D-pipecolic acid or the L-pipecolic acid from the racemic solution after the production step.

The N-acetyl-DL-2-amino-6-halogenohexanoic acid reacts with diethyl acetamide malonate and 1,4-dibromobutane to produce acetamide-4-bromobutyl malonate diethyl; and the acetamide A step of semi-saponifying -4-bromobutylmalonic acid and heat decarboxylation to obtain DL-N-acetyl-2-amino-6-bromohexanoate ethyl, DL-N-acetyl- The method for producing pipecolic acid according to claim 1 or 2, wherein the step of saponifying and crystallizing ethyl 2-amino-6-bromohexanoate is sequentially performed. .

D-2-amino-6-halogenohexanoic acid, L-2-amino-6-halogenohexanoic acid,
Produced by maintaining a solution of either N-protected-D-2-amino-6-halogenohexanoic acid or N-protected-L-2-amino-6-halogenohexanoic acid under deprotection conditions for the protecting group And
A method for producing pipecolic acid , wherein D-pipecolic acid or L-pipecolic acid is produced by a subsequent intramolecular cyclization reaction ,
The method for producing pipecolic acid, wherein the desorption condition is a hydrogenation reaction condition using palladium charcoal as a catalyst at room temperature or a desorption reaction condition in a hydrogen chloride-containing dioxane solution or ethyl acetate .

The N-protected-L-2-amino-6-halohexanoic acid is N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid,
The aminomalonic acid derivative in which the N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid has a protecting group of diethyl N- benzyloxycarbonyl-aminomalonate or diethyl Nt-butoxycarbonyl-aminomalonate With 1,4-dibromobutane to form diethyl N-protected-amino-4-bromobutylmalonate, then semi-saponified with dilute strong alkaline water under ice-cooling, and then heated decarboxylation The pipecoline according to claim 4, wherein the DL-N-protected-2-amino-6-bromohexanoic acid ethyl thus obtained is prepared by the hydrolysis action of a proteolytic enzyme or esterase. Acid production method.

The N-protected-D-2-amino-6-halohexanoic acid is N-protected-D-2-amino-6-bromohexanoic acid,
The N-protected-D-2-amino-6-bromohexanoic acid was recovered from the solution after preparation of the N-protected-L-2-amino-6-bromohexanoic acid. The production of pipecolic acid according to claim 5, which is prepared by saponifying ethyl 2-amino-6-bromohexanoate with addition of dilute strong alkaline water under ice-cooling. Method.