JP4453528B2

JP4453528B2 - New chemiluminescent reagent

Info

Publication number: JP4453528B2
Application number: JP2004338145A
Authority: JP
Inventors: 克倫寺西
Original assignee: Tokyo Chemical Industries Co Ltd
Current assignee: Tokyo Chemical Industries Co Ltd
Priority date: 2004-10-26
Filing date: 2004-10-26
Publication date: 2010-04-21
Anticipated expiration: 2024-10-26
Also published as: JP2006126152A

Description

Detailed Description of the Invention

本発明は新規化学発光試薬に関するもので，スーパーオキシドアニオンの分析に供するものである。さらに詳しくは，イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン類と長波長に蛍光を有する蛍光色素を適当なスペーサーで結合させた新規化学発光試薬で，分析化学の属する分野，臨床化学の属する分野，および他の分野において要求されているスーパーオキシドアニオンの分析に供するものである。 The present invention relates to a novel chemiluminescent reagent and is used for analysis of superoxide anion. More specifically, it is a novel chemiluminescent reagent in which imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one and a fluorescent dye having fluorescence at a long wavelength are combined with an appropriate spacer. It is used for the analysis of superoxide anions required in the field to which it belongs and in other fields.

スーパーオキシドアニオンは生体内に存在する活性酸素の一種で，解毒作用を始めとする種々の生理活性を有しており，生体内で重要な役割を演じている。その一方，このスーパーオキシドアニオンが生体内に過剰に存在すると正常細胞を破壊し，癌化，老化等を引き起こし，また，生活習慣病の原因物質の一つであることが知られている。そのため，このスーパーオキシドアニオンの検出，定量は，疾病の診断，疾病の研究と多方面で行なわれており，その高感度，簡便な分析手法の開発は重要な分析課題となっている。 Superoxide anion is a kind of active oxygen present in the body and has various physiological activities such as detoxification and plays an important role in the body. On the other hand, when this superoxide anion is excessively present in the living body, it destroys normal cells, causes canceration, aging, etc., and is known to be one of the causative substances of lifestyle-related diseases. Therefore, detection and quantification of this superoxide anion is performed in various fields, such as disease diagnosis and disease research, and the development of a highly sensitive and simple analytical method has become an important analysis subject.

従来，スーパーオキシドアニオンの分析はＥＳＲ法，蛍光法，化学発光法などが用いられており，中でも化学発光法は簡便な方法として盛んに利用されている。化学発光試薬としては，下記構造式に示すＣＬＡ，ＭＣＬＡ，ＦＣＬＡが知られ，市販もされており，幅広く利用されている。 Conventionally, the superoxide anion has been analyzed by ESR method, fluorescence method, chemiluminescence method and the like. Among them, the chemiluminescence method is actively used as a simple method. As chemiluminescent reagents, CLA, MCLA, and FCLA represented by the following structural formulas are known, are commercially available, and are widely used.

しかしながら，これら化学発光試薬から誘導される発光は，水溶液中，中性条件下ではＣＬＡ，ＭＣＬＡが青色で，ＦＣＬＡが緑色である。これらの発光波長では検体中の夾雑物の影響による消光や検体からの光透過性が低いという欠点を有している。さらに，これまでの化学発光試薬では誘導される発光波長の範囲が狭く，分析の多様化のためにはさらなる長波長域での発光，例えば，橙色，紅色，赤色の発光が可能な化学発光試薬が強く望まれている。 However, luminescence derived from these chemiluminescent reagents is blue in CLA and MCLA and green in FCLA under neutral conditions in an aqueous solution. At these emission wavelengths, there are disadvantages such as quenching due to the influence of impurities in the specimen and low light transmission from the specimen. Furthermore, conventional chemiluminescent reagents have a narrow range of induced emission wavelengths, and in order to diversify the analysis, chemiluminescent reagents that can emit light in longer wavelengths, such as orange, red, and red light. Is strongly desired.

そこで，発明者は鋭意研究を重ねた結果，下記式 Therefore, as a result of extensive research, the inventor found that

（式中，Ｄは化学発光することができ，Ａは蛍光を発することができ，Ａには少なくとも１以上の遊離スルホン酸あるいはスルホン酸塩を有し，ＳはＤとＡを連結するスペーサーを示す）で示され，Ｄがスーパーオキシドアニオンと反応した後の発光スペクトルとＡの励起スペクトルが重なり，Ａの蛍光が長波長であることを特徴と新規化学発光試薬を開発した。すなわち，本発明に係る化学発光試薬はスーパーオキシドアニオンとの反応により励起されたＤ（ドナー分子）が発光を伴わず，その遷移エネルギーを近傍の蛍光団Ａ（アクセプター分子）に移動させ，アクセプター分子を発光させる発光共鳴エネルギー移動現象を利用したものである。このスムーズな共鳴エネルギー移動により長波長での発光と高い感度を達成したものである。 (Wherein D can chemiluminescent, A can fluoresce, A has at least one free sulfonic acid or sulfonate, and S has a spacer connecting D and A. A new chemiluminescent reagent was developed, characterized in that the emission spectrum after D reacts with the superoxide anion and the excitation spectrum of A overlap, and the fluorescence of A has a long wavelength. That is, in the chemiluminescent reagent according to the present invention, D (donor molecule) excited by the reaction with the superoxide anion does not emit light, and its transition energy is transferred to the nearby fluorophore A (acceptor molecule) to accept the acceptor molecule. The light emission resonance energy transfer phenomenon that emits light is utilized. This smooth resonance energy transfer achieves light emission at a long wavelength and high sensitivity.

本発明の代表的な例として下記構造式（１）で示されるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体を取り上げ，その合成法を例示する。これは例示であり，これに限定されるものではない。 As a representative example of the present invention, a rhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative represented by the following structural formula (1) is taken up, and its synthesis method is exemplified. This is an example, and the present invention is not limited to this.

上記構造式で示されるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体は文献未載の新規化合物で，その合成法としては下記の例が挙げられる。 The rhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative represented by the above structural formula is a novel compound not yet described in the literature, and the synthesis method includes the following examples.

第１工程は，スルホローダミン１０１クロリドとエチレンジアミンとを反応させる工程で，スルホローダミンクロリドは市販品あるいは独自に合成したものでもよく，位置異性体の混合物であっても異性体の一方のみでもよい。合成されたエチレンジアミンを導入したスルホローダミンは，位置異性体の混合物あるいは一方の異性体のみでもよい。第２工程は，第１工程で得られたエチレンジアミンを導入したスルホローダミンと公知の６−（４−カルバモイルプロピルオキシフェニル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（例えば，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９８；３０６：１７７−１８７）を縮合剤の存在下，反応させる工程である。得られる本発明化合物（１）は位置異性体の混合物あるいは一方の異性体のみでもよい。 The first step is a step of reacting sulforhodamine 101 chloride with ethylenediamine, and the sulforhodamine chloride may be a commercially available product or one synthesized independently, and may be a mixture of positional isomers or only one of the isomers. The sulforhodamine into which the synthesized ethylenediamine is introduced may be a mixture of positional isomers or only one isomer. In the second step, sulforhodamine introduced with ethylenediamine obtained in the first step and known 6- (4-carbamoylpropyloxyphenyl) -2-methylimidazo [1,2-a] pyrazin-3-one (for example, , Carbohydr.Res., 1998; 306: 177-187) in the presence of a condensing agent. The obtained compound (1) of the present invention may be a mixture of positional isomers or only one isomer.

第１工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，ＴＨＦ，エーテルのごときハロゲン系溶媒，芳香族炭化水素，エーテル系溶媒，あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが，これに限定されるものではない。反応温度は−７８℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは−２０℃から室温である。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度などにより異なるが，１分から１２時間の間で適宜選択される。なお，反応混合物に脱酸剤とトリエチルアミンのごとき塩基を添加しても，無添加でもよい。 Reaction solvents that can be used in the first step are carbon tetrachloride, chloroform, methylene chloride, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, pyridine, THF, halogen solvents such as ethers, aromatic hydrocarbons, ether solvents, or these Although it selects suitably from a mixed solvent, it is not limited to this. The reaction temperature is selected between −78 ° C. and the reflux temperature of the solvent, but is preferably −20 ° C. to room temperature. The reaction time varies depending on the reaction solvent used, reaction temperature, etc., but is appropriately selected between 1 minute and 12 hours. The reaction mixture may be added with a deoxidizer and a base such as triethylamine, or may not be added.

第２工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，ＤＦＭ，ＴＨＦ，エーテルのごとき溶媒，あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが，これに限定されるものではない。反応温度は−７８℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは−２０℃から１００℃の間で選ばれる。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，ＤＣＣ，６−メチル−２−ニトロ安息香酸無水物などが挙げられるが，これに限定されるものではない。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度，縮合剤などにより異なるが，１分から２４時間で適宜選択される。 The reaction solvent that can be used in the second step is appropriately selected from solvents such as carbon tetrachloride, chloroform, methylene chloride, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, pyridine, DFM, THF, ether, or a mixed solvent thereof. It is not limited to this. The reaction temperature is selected between −78 ° C. and the reflux temperature of the solvent, but is preferably selected between −20 ° C. and 100 ° C. Examples of the condensing agent include, but are not limited to, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, DCC, 6-methyl-2-nitrobenzoic anhydride. The reaction time varies depending on the reaction solvent used, the reaction temperature, the condensing agent, etc., but is appropriately selected from 1 minute to 24 hours.

本発明化合物のその他の例として下記構造式（２）で示されるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体を挙げることができる。 Other examples of the compound of the present invention include rhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivatives represented by the following structural formula (2).

このローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（２）は，ローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）と同様にエチレンジアミンを導入したスルホローダミンと６−（４−メトキシフェニル）−２−（２−カルボキシエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンを脱水縮合することで得られる。 This rhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (2) was introduced with ethylenediamine in the same manner as the rhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1). It is obtained by dehydration condensation of sulforhodamine and 6- (4-methoxyphenyl) -2- (2-carboxyethyl) imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one.

以上のように本発明化合物（１）および（２）は簡便な操作で得ることができる。そして，（１）および（２）のイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンはスーパーオキシドアニオンと反応し，発光する。この発光スペクトルは近傍のローダミンの励起スペクトルと重なる。そのため，イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンは発光することなく，ローダミンを励起し，そして，ローダミンは強い蛍光を発する。この蛍光の極大波長は，およそ６１０ｎｍと長波長である。そのため，検体中に共存する夾雑物の影響を受け難く，精度よくスーパーオキシドアニオンの検出，定量が可能である。なお，スーパーオキシドアニオンと並び，生体内で重要な役割を演じている活性酸素である一重項酸素も同様に検出，定量がすることが可能である。 As described above, the compounds (1) and (2) of the present invention can be obtained by a simple operation. The imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one in (1) and (2) reacts with the superoxide anion to emit light. This emission spectrum overlaps with the excitation spectrum of nearby rhodamine. Therefore, imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one excites rhodamine without emitting light, and rhodamine emits strong fluorescence. The maximum wavelength of this fluorescence is a long wavelength of about 610 nm. Therefore, the superoxide anion can be detected and quantified accurately without being affected by contaminants coexisting in the sample. In addition, singlet oxygen, which is an active oxygen that plays an important role in the living body, along with the superoxide anion, can be similarly detected and quantified.

スーパーオキシドアニオンの検出，定量は，検体に本発明化合物を混合し，誘導される発光強度を測定することで行なわれる。この際，発光拭薬の濃度は特に限定されず，分析系に影響を与えない濃度で行なわれる。また，必要に応じて緩衝剤，マスキング剤，界面活性剤を加えても，加えなくともよい。発光は，通常，室温で生じるが，必要に応じ，冷却しても加温してもよい。 Superoxide anion is detected and quantified by mixing the compound of the present invention in a specimen and measuring the induced emission intensity. At this time, the concentration of the luminescent wipe is not particularly limited, and is performed at a concentration that does not affect the analysis system. Further, a buffering agent, a masking agent, and a surfactant may or may not be added as necessary. Luminescence usually occurs at room temperature, but may be cooled or warmed as necessary.

以下に参考例として本発明の代表例であるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）を用いるスーパーオキシドアニオンの分析を例示し，本発明の有用性をさらに明らかにする。 The analysis of superoxide anion using a rhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1), which is a representative example of the present invention, is illustrated below as a reference example, and the usefulness of the present invention is further illustrated. To clarify.

Reference example 1

スーパーオキシドアニオンはヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させ，キサンチンを尿酸に変化させる過程で生じる。この系に実施例２で得たスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）を共存させ，スーパーオキシドアニオン検出の性能を明らかにする。また，従来用いられているスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬の中で最も発光波長が長く高い感度を有するＦＣＬＡと比較した。 The superoxide anion is generated in the process of converting xanthine into uric acid by causing xanthine oxidase to act on hypoxanthine. In this system, the sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) obtained in Example 2 is allowed to coexist to clarify the performance of superoxide anion detection. In addition, it was compared with FCLA having the longest emission wavelength and high sensitivity among the conventionally used reagents for superoxide anion emission analysis.

ＫＣｌ（０．２Ｍ），ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ），３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．５ｍｌ）に２５℃で，ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ，０．５ｍｌ），スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）水溶液（２，５ｘ１０^−５Ｍ，４０μｌ）およびキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．３７ｕｎｉｔ／ｍｌ，４０μｌ）を加え，アロカ社ルミネッセンスリーダーＢＬ２０１を用いて発光強度を測定した（発光波長による発光量の補正はせず）。発光はキサンチンオキシダーゼ水溶液の添加後，すぐに最高強度を示した。比較のためスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体に代えてＦＣＬＡを用いた。得られた相対発光強度はスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）が２５７であり，ＦＣＬＡは２００であった。A solution of hypoxanthine (0,2) in a buffered aqueous solution (pH 7.2, 0.5 ml) containing KCl (0.2 M), EDTA (0.1 mM), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (20 mM) at 25 ° C. .3 mM, 0.5 ml), sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) aqueous solution (2,5 × 10 ⁻⁵ M, 40 μl) and xanthine oxidase aqueous solution (0.37 unit / ml) , 40 μl) was added, and the light emission intensity was measured using an Aroka luminescence reader BL201 (the light emission amount was not corrected by the light emission wavelength). Luminescence showed the highest intensity immediately after the addition of an aqueous xanthine oxidase solution. For comparison, FCLA was used in place of the sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative. The obtained relative luminescence intensity was 257 for sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1), and FCLA was 200.

Reference example 2

ＫＣｌ（０．２Ｍ），ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ），３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．５ｍｌ）に２５℃で，ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ，０．５ｍｌ），スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）水溶液（２、５ｘ１０^−５Ｍ，４０μｌ）を加え，蛍光分光光度を用いて発光スペクトルを測定した（ただし，励起光は使用しない）。発光スペクトルは最大発光波長約６１０ｎｍを示した。発光スペクトルを図１に示した。A hypoxanthine aqueous solution (0. 0. 5) was added to a buffer aqueous solution (pH 7.2, 0.5 ml) containing KCl (0.2 M), EDTA (0.1 mM), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (20 mM) at 25 ° C. 3 mM, 0.5 ml), sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) aqueous solution (2, ⁵ × 10 ⁻⁵ M, 40 μl) was added, and the emission spectrum was measured using fluorescence spectrophotometry. Was measured (however, excitation light was not used). The emission spectrum showed a maximum emission wavelength of about 610 nm. The emission spectrum is shown in FIG.

Reference example 3

ＫＣｌ（０．２Ｍ），ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ），３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．５ｍｌ）に２５℃で，ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ，０．５ｍｌ），スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）水溶液（最終濃度が２．４ｘ１０^−７Ｍから１．８ｘ１０^−５Ｍになるように加える）およびキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．３７ｕｎｉｔ／ｍｌ，４０μｌ）を加え，アロカ社ルミネッセンスリーダーＢＬ２０１を用いてスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）の各種濃度における発光強度を測定した。発光はキサンチンオキシダーゼ水溶液の添加後，すぐに最高強度を示した。比較のためスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）の代わりに従来用いられているスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬のなかでもっとも発光波長が長く高い感度を有するＦＣＬＡも同様にして実験を行なった。得られた相対発光強度の結果を図２に示した。A hypoxanthine aqueous solution (0. 0. 5) was added to a buffer aqueous solution (pH 7.2, 0.5 ml) containing KCl (0.2 M), EDTA (0.1 mM), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (20 mM) at 25 ° C. 3 mM, 0.5 ml), sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) aqueous solution (final concentration from 2.4 × 10 ⁻⁷ M to 1.8 × 10 ⁻⁵ M And xanthine oxidase aqueous solution (0.37 unit / ml, 40 μl), and various concentrations of sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) using a luminescence reader BL201 from Aloka The luminescence intensity was measured. Luminescence showed the highest intensity immediately after the addition of an aqueous xanthine oxidase solution. For comparison, it has the longest emission wavelength and the highest sensitivity among the superoxide anion emission analysis reagents conventionally used in place of the sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1). An experiment was conducted in the same manner with FCLA. The obtained relative light emission intensity results are shown in FIG.

The invention's effect

以上のように，スーパーオキシドアニオンの分析において，本発明の代表例であるスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）は，従来の化学発光試薬よりも発光波長が長く，紅色〜赤色の発光を誘導する。スーパーオキシドアニオンと反応して発光する極大波長は約６１０ｎｍであり，効率的なスーパーオキシドアニオンの分析が可能である。また，その発光強度は従来から知られている化学発光試薬より強く，高感度での検出が可能である。従って，本発明は，従来の化学発光試薬を凌駕するスーパーオキシドアニオンの化学発光試薬である。 As described above, in the analysis of the superoxide anion, the sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1), which is a representative example of the present invention, emits light more than conventional chemiluminescent reagents. Long wavelength, induces red to red light emission. The maximum wavelength of light emitted by reacting with the superoxide anion is about 610 nm, and efficient analysis of the superoxide anion is possible. Further, its luminescence intensity is stronger than that of conventionally known chemiluminescence reagents, and detection with high sensitivity is possible. Accordingly, the present invention is a superoxide anion chemiluminescent reagent that surpasses conventional chemiluminescent reagents.

以下に好ましい実施例を示し，本発明の有用性をさらに明らかにする。この実施例は例示であり，これに限定されるものではない。細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。 The preferred embodiments are shown below to further clarify the usefulness of the present invention. This example is illustrative and not limiting. It goes without saying that various aspects of the details are possible.

エチレンジアミン（１．０ｍｌ）を含むクロロホルム（１００ｍｌ）溶液に０℃でスルホローダミンクロリド［２−クロロスルホニル体と４−クロロスルホニル体の１：１の混合物］の位置異性体混合物（０．１ｇ）を加え，３０分後，減圧濃縮した。その後，メタノール（２０ｍｌ）を加え，再度減圧濃縮し，残さをメタノール−水の混合液で溶解し，イオン交換カラムに供し，水で不純物を溶出後，１Ｍアンモニア水を用いてスルホローダミンエチレンジアミン体を溶出した。溶出液を減圧濃縮，メタノールに溶解し，エチルエーテルを加えて粉体化し，青紫色の粉体を遠心分離により０．０７６ｇ得た。この粉体は，約１：１の位置異性体の混合物であった。
青紫色粉末
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，２３℃，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：１．７−２．１（１６Ｈ，ｍ），２，４−３．８（４０Ｈ，ｍ），６．２８（２Ｈ，ｓ），６．５０（２Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ），７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２４，２９４１，１５９８，１４９７，１８００，１１９８，１１０１，１０３５ｃｍ^−１
ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）：２６８（ε２４５００），２９７（ε１５３００），３６９（ε５５４０），４２４（ε２１００），５８４（ε８３８００）ｎｍA regioisomer mixture (0.1 g) of sulforhodamine chloride [1: 1 mixture of 2-chlorosulfonyl and 4-chlorosulfonyl] at 0 ° C. to a chloroform (100 ml) solution containing ethylenediamine (1.0 ml). After 30 minutes, the solution was concentrated under reduced pressure. Thereafter, methanol (20 ml) was added, and the mixture was concentrated again under reduced pressure. The residue was dissolved in a methanol-water mixture, applied to an ion exchange column, and impurities were eluted with water. Then, sulforhodamine ethylenediamine compound was obtained using 1 M ammonia water. Eluted. The eluate was concentrated under reduced pressure, dissolved in methanol, powdered with ethyl ether, and 0.076 g of a blue-violet powder was obtained by centrifugation. This powder was a mixture of about 1: 1 regioisomers.
Blue purple powder
¹ H NMR (500 MHz, 23 ° C., DMSO-d ₆ ): 1.7-2.1 (16H, m), 2,4-3.8 (40 H, m), 6.28 (2H, s), 6.50 (2H, s), 6.87 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.36 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.78 (1H, dd, J = 1) .8, 7.9 Hz), 7.88 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.90 (1H, dd, J = 1.8, 7.9 Hz), 8.40 (1H, d, J = 1.8Hz) ppm
IR (KBr): 3424, 2941, 1598, 1497, 1800, 1198, 1101, 1035 cm ⁻¹
UV-vis (MeOH): 268 (ε24500), 297 (ε15300), 369 (ε5540), 424 (ε2100), 584 (ε83800) nm

実施例１で得られたスルホローダミンエチレンジアミン体の異性体混合物（０．０３ｇ），６−［４−（３−カルバモイルプロピルオキシ）］−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（０．０１５ｇ），１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０２７ｇ）をピリジン（１．５ｍｌ）に溶解し，室温で４時間撹拌した。その後，減圧濃縮した。残さをメタノールに溶解し，シリカゲルカラムに供し，アセトニトリル−水の混合液を流し，スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン化合物［構造式（１）］の位置異性体混合物を溶出させた。溶出液を減圧濃縮し，メタノールに溶解し，アセトンを加え粉体化した後，遠心分離により紅青紫色の粉体としてスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−８−オン化合物［化学式（１），約１：１の混合物］を０．０１ｇを得た。
紅青紫色粉末
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，２３℃，ＣＤ_３ＯＤ−ＤＭＳＯ−ｄ_６＝１０：１）１．８−３．６（６４Ｈ，ｍ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．４３（３Ｈ，ｓ），４．００（４Ｈ，ｍ），６．５４（２Ｈ，ｓ），６．５８（２Ｈ，ｓ），６．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）１７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．９０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），８．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｓ），８．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ）ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２３，２９４２，１５９６，１４９６，１２９８，１１９８，１１０１，１０３５ｃｍ^−１
ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）：２６８（ε４７７００），３６９（ε１１８００），４２８（ε１００００），５８４（ε９９１００）ｎｍThe sulforhodamine ethylenediamine isomer mixture obtained in Example 1 (0.03 g), 6- [4- (3-carbamoylpropyloxy)]-2-methylimidazo [1,2-a] pyrazine-3- On (0.015 g), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (0.027 g) was dissolved in pyridine (1.5 ml) and stirred at room temperature for 4 hours. Then, it concentrated under reduced pressure. The residue is dissolved in methanol, applied to a silica gel column, and a mixed solution of acetonitrile-water is passed through. Regioisomer of sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one compound [Structural Formula (1)] The mixture was eluted. The eluate was concentrated under reduced pressure, dissolved in methanol, powdered by adding acetone, and then a sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-8-one compound as a crimson-purple powder by centrifugation [ 0.01 g of the chemical formula (1), about 1: 1 mixture] was obtained.
Crimson purple powder
¹ H NMR (500 MHz, 23 ° C., CD ₃ OD-DMSO-d ₆ = 10: 1) 1.8-3.6 (64H, m), 2.14 (3H, s), 2.43 (3H, s), 4.00 (4H, m), 6.54 (2H, s), 6.58 (2H, s), 6.94 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.01 (2H) , D, J = 8.6 Hz), 7.32 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.43 (1H, d, J = 7.9 Hz) 17.51 (2H, d, J = 8) .6Hz), 7.56 (1H, br.s), 7.58 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.61 (1H, br.s), 7.72 (1H, br.s) ), 7.90 (1H, br.s), 8.03 (1H, dd, J = 1.8, 7.9 Hz), 8.18 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.53 (1H, s), 8 61 (1H, dd, J = 1.8,7.9Hz) ppm
IR (KBr): 3423, 2942, 1596, 1496, 1298, 1198, 1101, 1035 cm ⁻¹
UV-vis (MeOH): 268 (ε47700), 369 (ε11800), 428 (ε10000), 584 (ε99100) nm

実施例１で得られたスルホローダミンエチレンジアミン体の異性体混合物（０．０２ｇ），６−（３−メトキシフェニル）−２−（２−カルボキシエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン，３−オン（０．０１２ｇ），１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０１８ｇ）をピリジン（１．０ｍｌ）に溶解し，室温で２時間撹拌し，その後減圧濃縮した。残さをメタノールに溶解，逆相ＯＤＳカラムに供し，０．１％ＴＦＡ−メタノールと０．１％ＴＦＡ−水の混合液を流し，スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（２）を溶出させた。溶出液を減圧濃縮し，青紫色の粉体０．０１ｇを得た。
青紫色粉末
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，２３℃，１．０％ＴＦＡ／Ｄ_２Ｏ−ＤＭＳＯ−ｄ_６＝１０：１）：１．７−２．０（ｍ），２．４−３．０（ｍ），３．３−３．８（ｍ），６．４４（２Ｈ，ｓ），７．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｓ），８．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．２６（１Ｈ，ｓ），８．３７（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ．
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２３２９３９，１５９７，１４９７，１２９９，１１９８，１１０１，１０３５ｃｍ^−１．
ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）：２６８（ε３９４００），３７０（ε９３２０），４３３（ε８０９０），５８７（ε８４８００）ｎｍ．The sulforhodamine ethylenediamine isomer mixture obtained in Example 1 (0.02 g), 6- (3-methoxyphenyl) -2- (2-carboxyethyl) imidazo [1,2-a] pyrazine, 3- On (0.012 g), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (0.018 g) was dissolved in pyridine (1.0 ml), stirred at room temperature for 2 hours, and then concentrated under reduced pressure. . The residue was dissolved in methanol, applied to a reverse phase ODS column, and a mixed solution of 0.1% TFA-methanol and 0.1% TFA-water was flowed, and sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazine-3- The on derivative (2) was eluted. The eluate was concentrated under reduced pressure to obtain 0.01 g of a blue-violet powder.
Blue purple powder
¹ H NMR (500 MHz, 23 ° C., 1.0% TFA / D ₂ O-DMSO-d ₆ = 10: 1): 1.7-2.0 (m), 2.4-3.0 (m) 3.3-3.8 (m), 6.44 (2H, s), 7.05 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.36 (1H, d, J = 7.9 Hz) , 7.72 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.90 (1H, s), 8.01 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.26 (1H, s), 8 37 (1H, s) ppm.
IR (KBr): 3423 2939, 1597, 1497, 1299, 1198, 1101, 1035 cm ⁻¹ .
UV-vis (MeOH): 268 (ε39400), 370 (ε9320), 433 (ε8090), 587 (ε84800) nm.

実施例５で得られたスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）の発光スペクトルを示す図である。横軸は発光波長（ｎｍ）であり，縦軸は発光強度（Ｉｎｔ．）である。 6 is a graph showing an emission spectrum of the sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) obtained in Example 5. FIG. The horizontal axis is the emission wavelength (nm), and the vertical axis is the emission intensity (Int.). 実施例７で得られたヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）およびＦＣＬＡの濃度と発光強度の相関図である。横軸はそれぞれの化合物の濃度（μＭ）であり，縦軸は発光量（カウント／分）である。 FIG. 4 is a correlation diagram between the concentration and emission intensity of sulforhodamine-linked imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative (1) and FCLA in the hypoxanthine-xanthine oxidase system obtained in Example 7. The horizontal axis represents the concentration (μM) of each compound, and the vertical axis represents the amount of luminescence (count / min).

Claims

Following formula

(Wherein D is an imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative, A is one or more free sulfonic acids or sulfonates, rhodamine 123, rhodamine B, rhodamine 6G, rhodamine 19, rhodamine 110, Selected from rhodamine 575 or sulforhodamine 101, and S has an alkylene, an alkylene having an amide bond, an azaalkylene, an azaalkylene having an amide bond, a polyazaalkylene, a polyazaalkylene having an amide bond, an oxaalkylene, an amide bond Selected from oxaalkylene, polyoxaalkylene, or polyoxaalkylene having an amide bond), the emission spectrum after D reacts with the superoxide anion and the excitation spectrum of A overlap, and the fluorescence of A has a long wavelength In New chemiluminescent reagent, characterized in that.

Wherein D is an imidazo [1,2-a] pyrazin-3-one derivative, S is an azaalkylene having an amide bond, and A is sulforhodamine 101

The novel chemiluminescent reagent of Claim 1 shown by these.

The novel chemiluminescent reagent according to claim 1, wherein R is selected from methoxy and a hydrogen atom.