JP4460764B2 - アルデヒドで固定化した生体補綴物質のカルシウム沈着を阻害するための方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、医療の方法／デバイスに、そしてより詳細にはそれらが移植後にカルシウム沈着に対する傾向を軽減するためのグルタルアルデヒドで固定化した生体補綴物質を化学的に修飾するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
現代の医療の実施において、多数の移植可能なデバイスまたは補綴物は、化学的に「固定化されている」または保存されている生物学的組織から全体的にまたは部分的に形成される。生物学的組織の化学的な固定化のために使用される技法は代表的に、生物学的組織をこの組織中に存在する結合組織タンパク質の分子間で架橋を形成することが可能である１つ以上の化学的な試剤に曝すことを必要とする。
【０００３】
生体補綴物として使用されている固定化された生物学的組織の例としては、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靭帯、および腱が挙げられる。これらの組織は、代表的には、組織の支持的フレームワークとして作用する結合組織タンパク質のマトリクスを含む。
【０００４】
コラーゲンおよびエラスチンは、ほとんどの生物学的組織の結合組織フレームワークを構成する２つの結合組織タンパク質である。各生物学的組織の柔軟性または硬直性は、大部分は、コラーゲンおよびエラスチンの相対量によって、ならびに／または結合組織フレームワークの物理学的構造およびコンフォメーションによって決定される。
【０００５】
各コラーゲン分子は、コイルドヘリカルコンホメーションで絡み合わされる３つのポリペプチド鎖からなる。生物学的組織を保存するために使用される化学的固定化剤（すなわち、なめし剤）は一般に、所定のコラーゲン分子内のポリペプチド鎖の間に化学的架橋（すなわち、分子内架橋）を、または隣接コラーゲン分子間に化学的架橋（すなわち、分子間架橋）を形成する。
【０００６】
コラーゲン性生物学的組織を架橋するために利用されている化学的固定化剤の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスターチ、ヘキサメチレンジイソシアネート、および特定のポリエポキシ化合物が挙げられる。入手可能な種々の化学的架橋剤のうちグルタルアルデヒドは最も広範に使用される。グルタルアルデヒドは、多くの市販の生体補綴製品のための固定化剤として広く使用されている。生体補綴製品は、例えば、ブタ生体補綴心臓弁（すなわち、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）ステント付のブタ生体補綴物；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｅｄｗａｒｄｓ ＣＶＳ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ ９２７１４−５６８６）、ウシ心膜の心臓弁補綴物（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＣＶＳ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ；Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ ９２７１４−５６８６）、およびステントなしのブタ大動脈補綴物（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）ＰＲＩＭＡＯ Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ Ａｏｒｔｉｃ Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ， Ｂａｘｔｅｒ Ｅｄｗａｒｄｓ ＡＧ， Ｓｐｉｅｒｓｔｒａｓｓｅ ５， ＧＨ６０４８， Ｈｏｒｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。
【０００７】
生体補綴物質の移植に関連する１つの問題は、これらの物質中の結合組織タンパク質が、カルシウム沈着を被る傾向があることである。このようなカルシウム沈着は、生体補綴物の望ましくない硬化または分解を生じ得る。内因性および外因性の両方のカルシウム沈着は、固定化されたコラーゲン性生体補綴物で生じることが公知であるが、このようなカルシウム沈着が生じる正確なメカニズムは不明である。
【０００８】
臨床経験および実験データは、グルタルアルデヒドで固定化したコラーゲン性生体補綴物が、他の非アルデヒド固定化剤によって固定化されている生体補綴物よりも早くカルシウム沈着する傾向があり得ることを教示している。グルタルアルデヒドで固定化した生体補綴物のこのような促進されたカルシウム沈着は、主に、小児患者で生じることが報告されている。（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｌｖｕｌａｒ Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．８３：２７−４２，１９８２）。このような促進されたカルシウム沈着は、移植された生体補綴物の劣化および／または破損を導き得るので、望ましくない。グルタルアルデヒドで固定化した生体補綴物の促進されたカルシウム沈着についての若年患者でのこの傾向を考慮して、外科医は、代表的には、グルタルアルデヒドで固定化した生体補綴弁よりもむしろ、小児または比較的若い患者（すなわち、６５歳未満の患者）への機械的心臓弁または同種移植片（利用可能ならば）を移植することを選択する。しかし、機械的弁移植を受ける患者は、抗凝固剤投与での移植中の処置を必要とし、これは出血の危険性の増加と関連し得る。また、同種移植片は、利用可能性が限定され、そして感染を生じ得る病原体を有し得る。
【０００９】
グルタルアルデヒドで固定化した生体補綴移植片がカルシウム沈着を被る速度を決定する因子は、十分には明らかにされていない。しかし、カルシウム沈着の速度に影響を及ぼすと教示される因子には、以下を含む：
ａ）患者の年齢；
ｂ）現存する代謝障害（すなわち、高カルシウム血症、糖尿病など）；
ｃ）食餌因子；
ｄ）人種；
ｅ）感染；
ｆ）非経口的カルシウム投与；
ｇ）脱水；
ｈ）湾曲／機械的因子；
ｉ）外科的移植後の初期の不適切な抗凝固治療；および
ｊ）宿主組織応答。
【００１０】
多くの研究者らは、グルタルアルデヒドで固定化した生体補綴物のインサイチュカルシウム沈着を軽減する方法を発見しようと試みている。これらのカルシウム沈着軽減技法の中には、以下に記載の方法が含まれる：Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された、米国特許第４，８８５，００５号（Ｎａｓｈｅｆら）；Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒｅｏｆと題された、米国特許第４，６４８，８８１号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら）；Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された、米国特許第４，９７６，７３３号（Ｇｉｒａｒｄｏｔ）；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓと題された、米国特許第４，１２０，６４９号（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）；Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ Ｉｍｐｌａｎｔｓと題された、米国特許第５，００２，２５６６号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ）；Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎと題された、ＥＰ １０３９４７Ａ２（Ｐｏｌｌｏｃｋら）およびＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｉｓｓｕｅ ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された、ＷＯ８４／０１８７９（Ｎａｓｈｅｆら）；および、Ｙｉ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ｄｏｎｇ，Ｇ．，およびＴａｎ，Ｈ．；Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ １７−２２頁，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｖａｌｖｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，１９９５年６月。
【００１１】
グルタルアルデヒドで固定化された組織に対して最適であると証明されたカルシウム沈着の軽減技術が以前から知られていないため、当該技術分野において、グルタルアルデヒドで固定化した生物学的組織のカルシウム沈着を阻害または軽減するための新しい方法の開発の必要性がある。
【００１２】
（発明の要旨）
広く述べられると、本発明は、グルタルアルデヒドで固定化した生物学的組織の生体適合性および／または性能を、グルタルアルデヒドでの固定化と同時にまたはその後でポリグリシジルエーテルでこの組織を処理することによって改善するための方法を提供する。
【００１３】
多くの適用において、本発明の方法は以下の工程によって実行される：
ａ．結合組織タンパク質を含む生物学的組織を調製する工程；
ｂ．生物学的組織とアルデヒド固定化剤（例えば、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）とを接触させてこの組織内に結合組織タンパク質の架橋をもたらす工程；および
ｃ．工程（ｂ）の完了と同時にまたは工程（ｂ）の完了後に組織をポリグリシジルエーテルと接触させる工程。
【００１４】
上で要約された本発明の方法に従い、工程ｂおよび工程ｃは、別々のアルデヒド溶液およびポリグリシジルエーテル溶液を使用して、またはアルデヒド／ポリグリシジル混合物を使用することによって実行され得る。例えば、まず、組織をアルデヒドと接触させて工程ｂの完了を実行し得、そしてその後、この組織をアルデヒド固定剤から取り出し得、続いてポリグリシジルエーテルと接触させ得る。あるいは、この組織を最初に、初期にアルデヒドと接触させて結合組織タンパク質（単数または複数）の部分的または完全な架橋を可能にし、その後ポリグリシジルエーテル（単数または複数）をアルデヒドに添加して完全にまたは部分的に架橋された組織の存在下でポリグリシジルエーテル／アルデヒド混合物を形成し得る。あるいは、ポリグリシジルエーテル／アルデヒド混合物を最初に調製し得、次いで新鮮な組織をこのような混合物と接触させて、単一の混合物を使用する工程ｂ（架橋）および工程ｃ（架橋後エーテル処理）を実行し得る。
【００１５】
さらに、本発明に従い、様々な型の生体補綴物が提供される。これらは、上で要約された本発明の方法によって調製された組織から、全体的にまたは部分的に形成される。本発明に従って生体補綴物を調製するために利用され得る生物学的組織の型の例は、以下を含むが、必ずしも以下に限定されない：心臓弁；静脈弁；血管；尿管；腱；硬膜；皮膚；心膜；軟骨（例えば、半月板）；靭帯；骨；腸（例えば、腸壁（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｗａｌｌ））、および骨膜（ｐｅｒｉｏｓｔｉｕｍ）。
【００１６】
本発明のさらなる局面および目的は、本明細書の以下に記載される現在好ましい実施態様の詳細な説明を読み、そして理解すれば当業者に明らかとなる。
【００１７】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
以下の詳細な説明および詳細な説明で言及する添付図は説明を目的として提供され、そして本発明の現在の好ましい実施態様のみを例示し、いずれにおいても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００１８】
図１のフローダイヤグラムを参照して、本発明に従って固定化した生物学的物質を調製するための現在好ましい方法は、以下の工程：
（ａ）結合組織タンパク質を含む生物学的組織を調製する工程；
（ｂ）この生物学的組織と、アルデヒド固定剤（例えば、グルタルアルデヒド）とを接触させてこの組織内の結合組織タンパク質の架橋をもたらす工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の完了と同時にまたは工程（ｂ）の完了後に、この組織とポリグリシジルエーテルとを接触させる工程、
を含む。
【００１９】
本発明のこの方法を実施する際、工程ｂおよび工程ｃは、個別のアルデヒド溶液およびポリグリシジルエーテル溶液を使用して、またはアルデヒド／ポリグリシジル混合物を使用することによって実行され得る。例えば、この組織をまず、アルデヒドと接触させて工程ｂの完了を実行し得、そしてその後、この組織をアルデヒド固定剤から取り出し得、続いてポリグリシジルエーテルと接触させ得る。あるいは、この組織を最初に、初期にアルデヒドと接触させて結合組織タンパク質（単数または複数）の部分的または完全な架橋を可能にし、その後ポリグリシジルエーテル（単数または複数）をアルデヒドに添加して完全にまたは部分的に架橋された組織の存在下でポリグリシジルエーテル／アルデヒド混合物を形成し得る。あるいは、ポリグリシジルエーテル／アルデヒド混合物を最初に調製し得、次いで新鮮な組織を、このような混合物と接触させて単一の混合物を使用する工程ｂ（架橋）および工程ｃ（架橋後エーテル処理）を実行し得る。
【００２０】
この方法の工程ｂのために好ましい固定剤溶液は、適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）によって約７．４のｐＨに緩衝化された０．６２５％のグルタルアルデヒドである。
【００２１】
この方法の工程ｃのためのポリグリシジルエーテルの例は、エチレングリコールジグリシジルエーテル（Ｄｅｎａｃｏｌ ＥＸ８１０，Ｎａｇａｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）およびグリセロールポリグリシジルエーテル（Ｄｅｎａｃｏｌ ＥＸ３１３，Ｎａｇａｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）である。工程ｃは、１体積％と１０体積％との間のポリグリシジルエーテルを含む溶液中で組織を浸漬することで実行され得る。あるいは、工程ｃで用いるポリグリシジルエーテル溶液は、１つ以上のアルコール（単数または複数）（例えば、エタノール、好ましくは約１０〜３０体積％のエタノール濃度で）を含み得る。
【００２２】
（実施例１：エチレングリコールジグリシジルエーテルを用いるグルタルアルデヒド固定化後処理）
手順：ウシ心膜組織を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中の０．６２５％溶液で１４日間処理することによりグルタルアルデヒドで固定化する。水中で３回洗浄した後、この組織を２％のＤｅｎａｃｏｌ ＥＸ−８１０および２０％のエタノールの水溶液で４３〜４６℃で１２０時間処理する。コントロールとして、グルタルアルデヒドで固定化した組織を、グルタルアルデヒド（ｐＨ７．４のホスフェート中、０．６２５％）、エタノール（２０％）およびＴｗｅｅｎ８０（０．２％）の滅菌溶液を用いて４３〜４６℃で２４〜２８時間、処理する。組織を使用するまでこの最終的な溶液中に室温で貯蔵する。
【００２３】
カルシウム沈着能を、この組織を以下の溶液：
（１）塩化カルシウム（ｐＨ７．０のトリシン緩衝液中、２．５ｍＭ）または
（２）ヒト血清
に曝すことで測定する。
【００２４】
各条件につき、３×１ｃｍ²の固定化した組織片（複数）を５０ｍｌの処理溶液に添加し、そしてオービタルシェーカー中、３７℃で３週間インキュベートする。組織片の１つを元素分析のために毎週取り出す。この組織を水で４回、各回４０分間洗浄し、凍結乾燥し、計量し、次いで７０％の硝酸４ｍｌを用いて１００℃で消化する。次いで試料を元素カルシウムについて分析する。
【００２５】
結果：この組織の全重量の％で表したカルシウム含量を下記の表にまとめる。
【００２６】
【表１】

この実験はエチレングリコールジグリシジエーテルがグルタルアルデヒド固定化後の組織カルシウム沈着を軽減する能力を有することを例証する。このポリグリシジルエーテル処理がグルタルアルデヒドで固定化した組織のカルシウム沈着を軽減するのに役立つ１つの可能な機構は、グルタルアルデヒド架橋結合（またはこの組織内に存在したままの遊離グルタルアルデヒド）とポリグリシジルエーテルとの間での直接反応を介し得る。
【００２７】
（実施例２：ポリグリシジルエーテルとグルタルアルデヒドの反応）
手順：４％のエチレングリコールジグリシジルエーテル（Ｄｅｎａｃｏｌ ＥＸ ８１０）溶液および４％のグリセロールポリグリシジルエーテル（Ｄｅｎａｃｏｌ ＥＸ ３１３）溶液の両方をホスフェートでｐＨ７．４に緩衝化した水溶液中の０．６２５％のグルタルアルデヒドと混合する。反応を室温で７日間進行させる。単独の各成分または緩衝液中の各成分のコントロールとともに、反応混合物および新たに調製した各成分のコントロールを、紫外（ＵＶ）−可視分光法、１、２、３および７日目のＮ−ａ−アセチル−リジンに対する反応性、ならびに７日目の薄層クロマトグラフィーによって分析する。
【００２８】
結果：反応溶液のＵＶスペクトルは２３５ｎｍでの経時変化を示す。この波長は、グルタルアルデヒドのホモポリマーに特有であることが以前に示されたが、この場合、この波長は恐らくポリグリシジルエーテルおよびグルタルアルデヒドのコポリマーの形成による。以下の表は、０日目〜７日目の２３５ｎｍの吸光度を示す。吸光度の読み取り値を分光光度計のダイナミックレンジ内にすることが必要な場合、希釈を行なう。
【００２９】
【表２】

グルタルアルデヒドの反応性を、２６５ｎｍで強い吸収を有するＮ−ａ−アセチル−リジンと複合体を形成する能力により測定する。各時点で、各溶液のアリコートを取り出し、１：１０に希釈し、そして１．０ｍｌを、ｐＨが７．４のリン酸緩衝液中の１５ｍＭ Ｎ−ａ−アセチル−リジン（０．５ｍｌ）に添加する。４５分後、反応物をさらに４：１に希釈し、そして２６５ｎｍで読み取る。反応性を、新たに調製したＤｅｎａｃｏｌと混合し等しくエイジングしたグルタルアルデヒドと比較する。以下の表は、新たなＤｅｎａｃｏｌ溶液の２６５の吸光度と比較した、２６５の吸光度における減少によって測定した場合の、グルタルアルデヒドの反応性の欠損％を示す。
【００３０】
【表３】

反応生成物を、クロロホルム：メタノール（９５：５）で展開するＷｈａｔｍａｎ Ｋ６ シリカプレートからなる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）系で検出する。可視化をヨウ素の蒸気に曝すことで成し遂げた。グルタルアルデヒドおよびＤｅｎａｃｏｌのそれぞれは可視化後に特徴的な構成要素を示すが、しかし７日目での反応混合物は、新しい反応生成物を示し、そしてコポリマーの形成と一致する暗色の残渣を原点で示す。
【００３１】
本発明を、特定の現在好ましい実施態様または実施例のみを参照して本明細書に記しており、そして本発明の全ての可能な実施態様または実施例を徹底的に記載する試みは行なっていない。当業者は、様々な変更、付加および改変を本発明の意図された精神および範囲から逸脱することなく、本明細書上記の特定の実施態様および実施例に対してなし得ることを認識する。従って、以下の特許請求の範囲の範囲内にすべてのこのような変更、付加および改変が含まれることを意図する。

Claims (19)

1. アルデヒド架橋剤で予め架橋されたコラーゲン性生体補綴物質のカルシウム沈着を軽減するための方法であって、該方法は以下の工程：
   ａ．該コラーゲン性生体補綴物質が該アルデヒド架橋剤によって架橋された後に、該架橋されたコラーゲン性生体補綴物質をポリグリシジルエーテルと接触させる工程、を包含する、方法。
2. 工程ａで使用される前記ポリグリシジルエーテルが以下：
   エチレングリコールジグリシジルエーテル；および
   グリセロールポリグリシジルエーテル
   からなるポリグリシジルエーテルの群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、約１〜１０体積％の少なくとも１つのポリグリシジルエーテルを含む溶液とを接触させる工程、
   を包含する、請求項１に記載の方法。
4. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、約１〜１０体積％のエチレングリコールジグリシジルエーテルを含む溶液とを接触させる工程
   を包含する、請求項１に記載の方法。
5. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、約１〜１０体積％のグリセロールポリグリシジルエーテルを含む溶液とを接触させる工程
   を包含する、請求項１に記載の方法。
6. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、約１〜１０体積％のエチレングリコールジグリシジルエーテルを約１０〜３０体積％のエタノールと組み合わせて含む溶液とを接触する工程
   を包含する、請求項１に記載の方法。
7. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、約１〜１０体積％のグリセロールポリグリシジルエーテルを約１０〜３０体積％のエタノールと組み合わせて含む溶液とを接触させる工程を包含する、請求項４に記載の方法。
8. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、少なくとも２つのポリグリシジルエーテルを含有する混合物とを接触させる工程
   を包含する、請求項１に記載の方法。
9. 工程ａが以下：
   前記生体補綴物質と、エチレングリコールジグリシジルエーテルおよびグリセロールポリグリシジルエーテルの混合物とを接触させる工程
   を包含する、請求項８に記載の方法。
10. 請求項１に記載の方法によって調製されたコラーゲン性生物学的組織を包含する生体補綴物。
11. 前記コラーゲン性生物学的組織が以下：
    心臓弁；
    静脈弁；
    血管；
    尿管；
    腱；
    硬膜；
    皮膚；
    心膜；
    軟骨；
    靭帯；
    骨；
    腸；および
    骨膜；
    からなる組織の群から選択される、請求項１０に記載の生体補綴物。
12. 結合組織タンパク質を含む固定化した生物学的組織を調製するための方法であって、該方法は以下の工程：
    （ａ）少なくとも１つの結合組織タンパク質を含む生物学的組織を調製する工程；
    （ｂ）該生物学的組織とアルデヒド固定剤とを接触させて、該組織内での単数または複数の該結合組織タンパク質の架橋をもたらす工程；および
    （ｃ）該アルデヒドで固定化した生物学的組織と、ポリグリシジルエーテルとを接触させる工程
    を包含する、方法。
13. 工程（ｂ）が以下：
    前記生物学的組織と、リン酸緩衝液でｐＨ７．４に緩衝化された約０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液とを接触させる工程
    を包含する、請求項１２に記載の方法。
14. 工程（ｂ）および工程（ｃ）が別々のアルデヒドおよびポリグリシジルエーテル溶液を用いて実行される、請求項１２に記載の方法。
15. 前記方法が工程（ａ）と工程（ｃ）との間に、前記生物学的組織をリンスする工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
16. 工程（ｂ）がアルデヒド固定剤を含有する第１の溶液中の前記生物学的組織を、該組織のアルデヒド架橋をもたらすに十分な時間の間接触させることにより達成され、そしてその後工程（ｃ）が、ポリグルシジルエーテルを該第１の溶液に添加することにより達成され、ここで該生物学的組織が接触する、請求項１２に記載の方法。
17. 工程（ｂ）および工程（ｃ）が、まずアルデヒド溶液中に前記生物学的組織を浸漬させ、そしてその後、少なくとも１つのポリグリシジルエーテルを、グルタルアルデヒド溶液へ添加してアルデヒド／ポリグリシジルエーテル混合物を形成することによって実行される、請求項１２に記載の方法。
18. 請求項１２に記載の方法によって調製されたコラーゲン性生物学的組織を含有する、生体補綴物。
19. 前記コラーゲン性生物学的組織が以下：
    心臓弁；
    静脈弁；
    血管；
    尿管；
    腱；
    硬膜；
    皮膚；
    心膜；
    軟骨；
    靭帯；
    骨；
    腸；および
    骨膜；
    からなる組織の群から選択される、請求項１８に記載の生体補綴物。