JP4465779B2 - Hair restorer - Google Patents

Description

［式中、ｎは０または１、Ｒ₁〜Ｒ₂はそれぞれ水素原子または炭素原子数１〜５のアシル基を示し、Ｒ₃は水素原子または保護基を示す。］で示される化合物であってもよい。
【００１２】
アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する前記化合物としては、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の取り込み阻害剤が好ましい。ここで、「取り込み阻害剤」とは、対象となる化合物の細胞又は組織等への吸収、取り込みを阻害する作用を有する化合物を指す。前記取り込み阻害剤としては、ジピリダモール、ジラセップ、リドフラジン、ヘキソベンジン、カルボクロメン、クロモナール酸、シネパジド、ジアゼパム、パパベリン、６−（２’−ハイドロキシニトロベンジル）チオグアノシン、プロベントフィリンが好ましい。
【００１３】
また、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物は、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の不活性化阻害剤であってもよい。ここで、「不活性化阻害剤」とは、対象となる化合物のある特性、機能又は作用の減少を阻害する作用を有する化合物を指す。したがって、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の不活性化阻害剤は、当該化合物のアデノシン受容体刺激作用の減少を妨げる機能を有する。アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の前記不活性化阻害剤としては、２’−デオキシコホルマイシン、エリスロ−９−（２−ハイドロキシ−３−ノニル）アデニンが好ましい。
【００１４】
本発明の別の形態は、ＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物の１種または２種以上を有効成分として含有する育毛剤である。
【００１５】
本発明のＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物としては、例えば、アデノシンジリン酸、アデノシントリリン酸及びこれらの誘導体が挙げられるが、その中ではアデノシン−５’−ジリン酸、アデノシン−５’−トリリン酸及びこれらの誘導体が好ましい。なお、アデノシン−５’−ジリン酸の誘導体又はアデノシン−５’−トリリン酸の誘導体としては、エステル誘導体が好ましい。
【００１６】
前記アデノシン−５’−ジリン酸誘導体及び前記アデノシン−５’−トリリン酸誘導体は、下記［化４］：
【化４】

［式中、ｎは２または３、Ｒ₁〜Ｒ₂はそれぞれ水素原子または炭素原子数１〜５のアシル基を示し、Ｒ₃は水素原子または保護基を示す。］で示される化合物であってもよい。
【００１７】
前記アデノシン−５’−ジリン酸誘導体としては、α、β−メチレンアデノシン−５’−ジリン酸、２−メチルチオアデノシン−５’−ジリン酸、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸が好ましい。
【００１８】
前記アデノシン−５’−トリリン酸誘導体としては、α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸、２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸が好ましい。
【００１９】
本発明の他の形態は、プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用を有する化合物の１種又は２種以上を有効成分として含有する育毛剤である。プリン受容体刺激作用を有する化合物はアデノシン、アデノシン誘導体またはアデノシン代謝物であってもよく、また、ＡＴＰ、ＡＴＰ誘導体またはＡＴＰ代謝物であってもよい。
【００２０】
細胞から放出されるアデノシン誘導体またはアデノシン代謝物は、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェート、またはアデノシントリホスフェートでありうる。
【００２１】
プリン受容体刺激作用を有する化合物、特に、アデノシン、アデノシン誘導体またはアデノシン代謝物、を細胞から放出させる作用を有する化合物は細胞に存在するＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を有する化合物とすることができる。
【００２２】
ＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を有する化合物は、スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物とすることができる。
【００２３】
スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物は、メグリチニド、ニコランジル、レボクロマカリム、クロマカリム、ピナシジル、ジアゾキサイド、ジソピラミド、チリソロール、アプリカム、ビマカリム、ＭｇＡＴＰ、ＭｎＡＴＰ、ＣａＡＴＰ、ＺｎＡＴＰ、ＳｒＡＴＰ、ＭｇＡＤＰ、ＭｎＡＤＰ、ＣａＡＤＰ、ＺｎＡＤＰ、ＳｒＡＤＰ、ＭｇＡＭＰ、ＭｎＡＭＰ、ＣａＡＭＰ、ＺｎＡＭＰ、ＳｒＡＭＰ、アデニル-５-イルイミドジホスフェート、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンからなる群より選択される化合物であってよい。
【００２４】
スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物は、カルシウム、マンガン、マグネシウム、亜鉛、およびストロンチウムからなる群より選ばれる二価陽イオンを含む塩であってよい。
【００２５】
スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物は、下記式：
Ｒ−Ｓ−ＣｏＡ
[式中、Ｒは分岐しても良い炭素数１４〜３０のアシル基で、二重結合を０〜３個含む]で示される長鎖アシルコエンザイムＡであってよい。
【００２６】
上記の各化合物を有効成分として含有する本発明の育毛剤は、外用剤であることが好ましく、また、本発明の育毛剤において、当該有効成分の含有量は、製剤全体の０．０１〜５重量％であることが好ましい。
【００２７】
本発明の更なる他の形態は、ＡＢＣトランスポーター遺伝子とプリン誘導体に対する受容体遺伝子で形質転換させた細胞に対して被験物質を添加し、そのときの細胞内へのカルシウム流入量を指標とすることを特徴とする、育毛作用を有する物質のスクリーニング方法である。
【００２８】
上記ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、スルホニルウレア受容体遺伝子とすることができる。
【００２９】
上記プリン誘導体に対する受容体遺伝子はアデノシン受容体遺伝子またはＡＴＰ受容体遺伝子とすることができる。
【００３０】
細胞内へのカルシウム流入量は蛍光カルシウム指示薬を用いた蛍光強度で測定することができる。
【００３１】
ＡＢＣトランスポーター遺伝子またはプリン誘導体に対する受容体遺伝子の形質転換を、宿主ベクター系による遺伝子組み換え技術によって行うことができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の育毛剤について記述する。
【００３３】
本発明者らは、優れた有効性を有する育毛成分について鋭意研究の結果、驚くべきことに、アデノシン受容体及びＡＴＰ受容体を含むプリン受容体への刺激作用が育毛効果と密接な関連を有していることを見出した。本発明は、この知見に基づくものであり、
Ａ．プリン受容体刺激作用を有する化合物、生体に適用後にプリン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物、及び、プリン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物；及び
Ｂ．プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用を有する化合物、例えば、ＡＢＣトランスポーター刺激作用を有する化合物、特にスルホニルウレア受容体刺激作用を有する化合物；
を育毛成分として使用することを特徴とする。
【００３４】
以下、上記Ａ及びＢのタイプの化合物をそれぞれ含む育毛剤（以下、各々、プリン受容体直接刺激型、及び、プリン受容体間接刺激型と称する）について詳細に説明を行う。
【００３５】
１．プリン受容体直接刺激型育毛剤
既述したように、プリン受容体はアデノシン受容体及びＡＴＰ受容体に大別される。そこで、まずアデノシン受容体を特に刺激するタイプの化合物を含有する育毛剤について説明する。
【００３６】
アデノシン受容体は、薬理学的及び構造的な特徴をもとに、現在、Ａ１、Ａ２a、Ａ２ｂ、Ａ３の４種類のサブタイプに分類されている。そして、Ａ１受容体は抗けいれん効果、神経保護効果、行動抑制効果、睡眠効果等を、Ａ２（Ａ２ａ又はＡ２ｂ）受容体は行動抑制効果、睡眠効果等を、そしてＡ３受容体は肥満細胞の脱顆粒促進効果等の生理作用を有することが知られている。
【００３７】
アデノシン受容体は生体中において様々な臓器に分布しており、細胞機能及び生理機能の調節に関与しているものと考えられている。例えば、心臓の血管平滑筋に分布するアデノシン受容体は、血中のアデノシン受容体刺激作用を有する化合物との結合により、血管を拡張し、冠血管の血流量を増大させることが知られている。また、近年、細胞上に存在するアデノシン受容体の刺激が細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる等の現象を発生させることが明らかとなっている。
【００３８】
本発明者らは、アデノシン受容体刺激作用がもたらす様々な現象が細胞組織の他の機能の調節に重要な役割を有する可能性について様々な側面から研究を重ねた結果、アデノシン受容体刺激作用が毛髪の生育に関して深く関与していることを突き止め、この知見に基づき、高い育毛効果を有する新規な育毛剤を開発した。
【００３９】
すなわち、本発明の育毛剤の１つの形態は、アデノシン受容体刺激作用に基づくものである。
【００４０】
この育毛剤の有効成分としては、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の１種又は２種以上の他に、生体に適用後にアデノシン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物、若しくは、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物の１種又は２種以上が挙げられる。これらの化合物は単独で使用されてもよく、また、複数の種類が混合されて使用されてもよい。
【００４１】
アデノシン受容体刺激作用を有する前記化合物は、アデノシン受容体を刺激する作用を有するものであれば特に限定されるものではないが、アデノシン受容体との結合性の点では、アデノシン、Ｎ６−シクロヘキシルアデノシン、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、（Ｒ）−Ｎ６−フェニルイソプロピルアデノシン、（Ｓ）−Ｎ６−フェニルイソプロピルアデノシン、（Ｒ）−フェニル−イソプロピルアデノシン、Ｎ−［Ｒ−（２−ベンゾチアゾリル）チオ−２−プロピル］−２−クロロアデノシン、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ６−[４−[[[４−[[[２−[[[（ｐ−イソチオシアナトフェニル）アミノ]チオカルボニル]アミノ]エチル]アミノ]カルボニル]メチル]アミノカルボニル]メチル]フェニル]アデノシン、Ｎ６−[４−[[[４−[[[２−[[[（ｍ−イソチオシアナトフェニル）アミノ]チオカルボニル]アミノ]エチル]アミノ]カルボニル]メチル]アミノカルボニル]メチル]フェニル]アデノシン、Ｎ−(メチル−フェネチル）アデノシン、ミノプリニル−デオキシ−Ｎ−エチルリボフラヌロアミド、５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、２−クロロアデノシン、Ｎ−エチル−１’−デオキシ−１’−[６−アミノ−２−[１−（３−ヒドロキシ−３−フェニル）プロピニル]−９Ｈ−プリン−９−イル]−β−Ｄ−リボフラン−５’−ウロナミド、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン、５’−Ｎ−シクロプロピルカルボキサミドアデノシン、Ｎ６−（ｐ−スルホフェニル）アデノシン、１−デアザ−２−クロロ−−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、８−ブチルアデノシン、１−シクロプロピルイソグアノシン、６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルアデノシン、２−β−Ｄ−リボフラノシルオキサゾール−４−カルボキサミド、２−ヨード−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ６−シクロペンチル−２’−メチル−２−クロロアデノシン、Ｎ６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルデノシン、２−［Ｐ−（２−カルボキシエチル）フェニルエチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、２−[（２−アミノエチルアミノ）カルボニルエチルフェニルエチルアミノ]−５’−エチルカルボキサミドアデノシン、２−ヘキシニル−５−メチルカルボキサミドアデノシン、２−シクロヘキシルメチリデンヒドラジノアデノシン、Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、５’−（Ｎ−シクロプロピル）カルボキサミドアデノシン、Ｎ−[２−（３，５−ジメトキシフェニル）フェニルエチル]アデノシン、Ｎ−（２−メチルベンジル）アデノシン、２−オクチニルアデノシン、２−フェニルアミノアデノシン、２−［２−（４−フルオロフェニル）エトキシ］アデノシン、２−［（シクロヘキシルメチレン）ヒドラジノ］アデノシン、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、Ｎ６−（３−イソチオシアナートベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジルアデノシン−５’−Ｎ−メチルカルボキサミド、デフィブロチド（短鎖デオキシリボヌクレオチド）、ピナシジル、アデノシン−５’−モノリン酸、アデノシン−５’−モノリン酸メチルエステル、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−モノリン酸、８−ブチルアミノアデノシン又はこれらの過ヨウ素酸酸化物が好ましく、また、育毛効果の面では、Ａ１及びＡ２タイプのアデノシン受容体への刺激作用が高い化合物がより好ましい。
【００４２】
また、育毛効果の点では、アデノシン受容体刺激作用を有する前記化合物又は生体に適用後にアデノシン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する前記化合物は、上記［化３］に示される構造を有する化合物であることが好ましく、その場合は、Ｒ₁〜Ｒ₂はそれぞれ水素原子又は炭素原子数１〜５のアシル基、Ｒ₃は水素原子又は保護基とされることが好ましい。
【００４３】
ところで、アデノシンをはじめとするアデノシン受容体刺激作用を有する化合物は、生体の様々な組織においてその生成と代謝が行われている。したがって、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物にも、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物と同様の効果が存在する。本発明の育毛剤に配合されるアデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物としては、具体的には、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の取り込み阻害剤及び不活性化阻害剤が好ましい。なお、前記不活性化剤としては、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の酵素による代謝を阻害する化合物を挙げることができ、例えば、アデノシンを生体内で不活性なイノシンに代謝するアデノシンデアミナーゼの阻害剤を使用してもよい。
【００４４】
前記取り込み阻害剤としては、取り込み阻害効果の点で、がジピリダモール、ジラセップ、リドフラジン、ヘキソベンジン、カルボクロメン、クロモナール酸、シネパジド、ジアゼパム、パパベリン、６−（２’−ハイドロキシニトロベンジル）チオグアノシン、プロベントフィリンが好ましく、また、前記不活性化阻害剤としては、その効果の点で、２’−デオキシコホルマイシン、エリスロ−９−（２−ハイドロキシ−３−ノニル）アデニンが好ましい。
【００４５】
次に、ＡＴＰ受容体を特に刺激するタイプの化合物を含有する育毛剤について説明する。
【００４６】
ＡＴＰ受容体には、リガンドの刺激を細胞内に伝達する方法としてイオンの細胞膜透過を利用するものとＧＴＰ結合蛋白を介するものの２種類があるとされており、Ｐ２Ｘ型及びＰ２Ｙ型（それぞれ７つのサブタイプを有する）と称呼されている。
【００４７】
ＡＴＰ受容体は生体中では様々な臓器に分布しており、情報伝達や機能調節に関与しているものと考えられている。例えば、神経系ではシナプス変調作用、大動脈では血圧調節を担っているものと考えられている。しかし、いまだその分布の詳細や機能については明確にされていないのが現状である。アデノシン及びＡＴＰ（アデノシントリリン酸）はいずれもプリン環を有することから、プリン受容体の概念には、アデノシン受容体及びＡＴＰ（アデノシントリリン酸）受容体が含まれる。
【００４８】
ところで、近年、細胞上に存在するＡＴＰ受容体の刺激が細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇を引き起こすこと等が明らかとなってきている。本発明者らは、ＡＴＰ受容体刺激作用が細胞組織の他の機能の調節に重要な役割を有する可能性について、様々な側面から研究を重ねた結果、ＡＴＰ受容体刺激作用が毛髪の生育に関して深く関与していることを突き止め、この知見に基づき、高い育毛効果を有する新規な育毛剤を開発した。
【００４９】
すなわち、本発明の育毛剤の他の形態は、アデノシン受容体以外のプリン受容体、すなわちＡＴＰ受容体への刺激作用に基づくものである。
【００５０】
このタイプの育毛剤の有効成分としては、ＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物の１種又は２種以上が挙げられる。これらの化合物は単独で使用されてもよく、また、複数の種類が混合されて使用されてもよい。
【００５１】
この育毛剤の有効成分は、ＡＴＰ受容体刺激作用を有するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、アデノシンジリン酸、アデノシントリリン酸又はそれらの誘導体を挙げることができる。生体における機能の点では、前記アデノシンジリン酸及び前記アデノシントリリン酸において、リン酸部分の結合位は、５’位の炭素が好ましい。したがって、上記した例の中では、アデノシン−５’−ジリン酸、アデノシン−５’−トリリン酸及びこれらの誘導体が好ましい。
【００５２】
また、育毛効果の面では、アデノシン−５’−ジリン酸の誘導体又はアデノシン−５’−トリリン酸の誘導体としてエステル誘導体が好ましい。なお、エステル誘導体としては、アデノシン部位の２’又は３’位の炭素に結合した酸素原子が、１〜１０、好適には１〜５の炭素原子を含むアシル基と共にエステルを形成していることが好ましい。
【００５３】
アデノシン−５’ジリン酸の誘導体及びアデノシン−５’−トリリン酸の誘導体は、具体的には、上記［化４］に示される化合物であってもよく、その場合は、Ｒ₁〜Ｒ₂はそれぞれ水素原子又は炭素原子数１〜５のアシル基、Ｒ₃は水素原子または適当な保護基とされることが好ましい。
【００５４】
なお、育毛効果の点では、前記アデノシン−５’−ジリン酸誘導体は、α、β−メチレンアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体、２−メチルチオアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体、又は、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体であることが好ましい。
【００５５】
同様に、育毛効果の点では、前記アデノシン−５’−トリリン酸エステル誘導体は、α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸エステル、２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸、又は、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸であってもよい。
【００５６】
２．プリン受容体間接刺激型育毛剤
ＡＢＣトランスポーターは、細胞内のＡＴＰの細胞外への放出を引き起こす作用を有する類似タンパクの総称であり、タンパクとしては、いわゆるＡＢＣタンパクスーパーファミリーを構成する一部で、ＡＴＰバインディングカセット、ＡＴＰ結合タンパク、ＡＢＣ結合トランスポーターまたはＡＢＣタンパクとも呼ばれており、ＭＤＲ（Ｐ糖タンパク質、multidrug resistance protein）、ＭＲＰ（MDR-related protein）、ＣＦＴＲ（cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator）、ＳＵＲ（スルホニルウレア受容体）などが挙げられ、様々な細胞機能の発現やその調節に重要な役割を果たしていることが明らかになっている。
【００５７】
例えば膵臓のベータ細胞膜に存在するＡＢＣトランスポーターは、隣接するＡＴＰ依存性カリウムチャンネルの開閉をコントロールしてカリウムイオンの細胞外への放出とその後のカルシウムイオンの流入を調節し、細胞小胞内のインスリンの細胞外への分泌をコントロールしている。さらに、心筋のＡＢＣトランスポーターはミトコンドリアに存在し、同じくミトコンドリアに存在するＡＴＰ感受性カリウムチャンネルの機能を調節し、虚血再灌流時のプレコンディショニング効果（心筋保護効果）の発現に関与していることが明らかとなってきている。一方、ＡＢＣトランスポーターは心筋や血管平滑筋をはじめとして、生体の様々な組織に存在していることが知られるようになってきており、トランスポーターとしての役割、即ち細胞内のＡＴＰの細胞外への放出を引き起こす作用も様々な調節作用に関与していることが推察されている。また、膵臓のβ細胞、血管平滑筋及び心筋に存在するＡＢＣトランスポーターはスルホニルウレア受容体であることが明らかになっている。
【００５８】
スルホニルウレア受容体は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルの制御因子として機能することが知られている（稲垣ら、「スルホニル尿素受容体」（生化学第６９巻第９号1067頁、１９９７年））。
【００５９】
本発明者らは、毛乳頭細胞にＡＢＣトランスポーターとＡＴＰ受容体またはアデノシン受容体が発現していることを見出した。そして、これらの受容体、すなわちプリン受容体の刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用を有する化合物、特にＡＢＣトランスポーターを刺激することによりその作用を発揮する化合物が、従来の育毛成分には見られなかった優れた有効性を示すことを見出した。プリン受容体刺激作用を有する化合物には、ＡＴＰ受容体及び／又はアデノシン受容体刺激作用を有する化合物が含まれ、具体的には、ＡＴＰ、ＡＴＰ誘導体又はＡＴＰ代謝物、及び／又は、アデノシン、アデノシン誘導体又はアデノシン代謝物が挙げられる。
【００６０】
プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用と育毛効果との関連性について、本発明者らは、図１に示すように、例えばスルホニルウレア受容体などのＡＢＣトランスポーターを刺激することにより、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）が細胞内から放出され、これがＡＴＰ受容体に作用するか、またはＡＴＰが分解して生成したアデノシンがアデノシン受容体に作用し、細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こし、毛成長速度や毛周期を調節する機構を司っているものと考えている。または、ミトコンドリアに存在するスルホニルウレア受容体の刺激がミトコンドリアに存在するＡＴＰ感受性カリウムチャンネルに作用し、これがＡＴＰ、アデノシン、それらの誘導体又は代謝物を細胞から放出させることも考えられる。
【００６１】
したがって、本発明の育毛剤の更なる他の形態は、プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用に基づくものである。具体的には、この育毛剤の有効成分としては、ＡＴＰ、アデノシン、それらの誘導体または代謝物を細胞から放出させる作用を有する化合物の１種又は２種以上が挙げられる。これらの化合物は単独で使用されてもよく、また、複数の種類が混合されて使用されてもよい。
【００６２】
プリン受容体刺激作用を有する化合物、例えばアデノシンおよびその誘導体または代謝物、を細胞から放出させる作用の具体例としては、例えば当該細胞に存在するＡＢＣトランスポーターを刺激することがあげられる。
【００６３】
本発明において、アデノシンおよびその誘導体または代謝物としては、アデノシン、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェートおよびアデノシントリホスフェートなどが挙げられる。
【００６４】
ＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を有する化合物としては、ＭＤＲ、ＭＲＰ、ＣＦＴＲ、スルホニルウレア受容体のいずれかへの刺激作用を有する化合物を用いることができるが、好ましくはスルホニルウレア受容体を刺激作用を有する化合物が挙げられる。
【００６５】
スルホニルウレア受容体を刺激作用を有する化合物としては、例えば、メグリチニド、ニコランジル、レボクロマカリム、クロマカリム、ピナシジル、ジアゾキサイド、ジソピラミド、チリソロール、アプリカム、ビマカリム、ＭｇＡＴＰ、ＭｎＡＴＰ、ＣａＡＴＰ、ＺｎＡＴＰ、ＳｒＡＴＰ、ＭｇＡＤＰ、ＭｎＡＤＰ、ＣａＡＤＰ、ＺｎＡＤＰ、ＳｒＡＤＰ、ＭｇＡＭＰ、ＭｎＡＭＰ、ＣａＡＭＰ、ＺｎＡＭＰ、ＳｒＡＭＰ、アデニル-５-イルイミドジホスフェート、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、カルシウム、マンガン、マグネシウム、亜鉛またはストロンチウムの二価陽イオンを含む塩、および下記式
Ｒ−Ｓ−ＣｏＡ
［式中、Ｒは分岐しても良い炭素数１４〜３０のアシル基で、二重結合を０〜３個含む］で示される長鎖アシルコエンザイムＡ、その中でも特にオレオイル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、オレイル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、ペンタデカノイル−ＣｏＡ、ステアリル−ＣｏＡが挙げられる。
【００６６】
これらの物質は、カリウムチャネルの開口剤として知られている（例えば、高橋ら、「Ｋチャネル開口薬」、医薬ジャーナル、vol.34, S-1, P.70-74 (1998)、および遠藤ら、「カリウムチャネル開口薬」、医薬ジャーナル、vol.35, S-1, P.112-119 (1999)参照）。スルホニルウレア受容体は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルの制御因子として機能しており、カリウムチャネルの開口剤が、スルホニルウレア受容体に結合することはすでに知られている（例えば、Brayら、Jounal of Bailogical Chemistry, vol.267, p.11689 (1992)参照）。そして、スルホニルウレア受容体が、細胞内より細胞外へＡＴＰの放出に関与していることもすでに提唱されている（Awqatiら、Science vol.269, 805 (1995)参照）。
【００６７】
したがって、カリウムチャネルの開口剤として知られている上記物質は、スルホニルウレア受容体に結合して、これを刺激するものと考えられる。本発明は、これらの物質のスルホニルウレア受容体への結合によるスルホニルウレア刺激作用、すなわちＡＢＣトランスポーターへの刺激作用が、ＡＴＰ、アデノシン、それらの誘導体または代謝物等のプリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させ、育毛効果を発揮させることに初めて着目したものである。
【００６８】
本発明の育毛剤は、外用剤であることが好ましく、１日１〜数回、適量を頭皮、皮膚上に塗布して使用することができる。また、本発明の育毛剤に含有される各有効成分の配合量は、好ましくは製剤全体中０．０１〜５重量％であり、より好ましくは０．１〜５重量％、特に好ましくは１〜５重量％である。 この配合量が０．０１重量％未満であると、育毛効果が十分でなく、５重量％を超えると、有効成分の製剤中での溶解安定性が低下することが多く、例えば低温保存時に結晶析出が認められるなど品質への悪影響が懸念されるため好ましくない。
【００６９】
本発明の育毛剤は、 外用剤として通常用いられる剤形、 例えばローション剤、 乳剤、 クリーム剤、トニック剤、軟膏剤、ゲル剤、エアゾール剤等として使用することができるが、外用剤として使用される剤形であればこれらに限定されるものではない。なお、エアゾール剤として使用する場合は、原液に対して上記のように配合量が設定される。
【００７０】
なお、本発明の育毛剤には、それぞれ、必要に応じ水、低級アルコール（メタノール、エタノール、変性エタノール、イソプロピルアルコール等）、溶解補助剤、界面活性剤、乳化安定剤、ゲル化剤、粘着剤、その他、所望する剤型を得るために通常使用される基剤成分を配合でき、使用目的に応じて、ミノキシジル、 塩化カルプロニウム等の血管拡張剤、スピロノラクトン、 フルタミド、 シプロテロンアセテート、オキセンドロン等の男性ホルモン受容体阻害剤、フィナステライド、 エピリステライド等のステロイド−５α−レダクターゼ阻害剤、グリチルレチン酸、アズレン等の抗炎症剤、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸デキサメサゾン等の副腎皮質ホルモン、尿素、サリチル酸等の角質溶解剤、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、マクロゴール、グリセリン、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類、グリセリルモノペンタデカノエート等の脂肪酸グリセリンエステル、 塩酸イソペンジル、塩酸ジフェンヒドラミン等の抗ヒスタミン剤、グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルペチルフェノール、第４級アンモニウム塩、ヒノキチオール、ピロクトンオラミン等の殺菌剤、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、コンドロイチン硫酸等の保湿剤、イチイ、ボタンビ、カンゾウ、オトギリソウ、附子、ビワ、カワラヨモギ、コンフリー、アシタバ、サフラン、サンシン、ローズマリー、セージ、モッコウ、セイモッコウ、ホップ、プラセンタなどの動植物の抽出物、酢酸レチノール、塩酸ピリドキシン、アスコルビン酸、硝酸チアミン、シアノコバラミン、ビオチン、酢酸トコフェノール等のビタミン類、ミリスチン酸イソプロピル、パルチミン酸イソプロピル、スクワラン、流動パラフィン、レシチン等の油分、ポリエキシエチレンソルビダン脂肪酸エステル、ソルビダン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリエキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤、ジブチルヒドロキシトルエン、イソプロピルガレート等の抗酸化剤、 エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤、メントール、カンフル等の清涼化剤、色素、香料、経皮吸収促進剤等の成分を本発明の効果を損なわない範囲で配合することができる。
【００７１】
また、適用対象又は必要とされる育毛効果の程度等にも依存するが、必要であれば、本発明の育毛剤は、上記Ａ及びＢのタイプの化合物の両方を含んでもよい。
【００７２】
次に、本発明の育毛物質のスクリーニング方法について記述する。
【００７３】
図１に関連して既に説明したとおり、毛乳頭細胞にはＡＢＣトランスポーターとＡＴＰ受容体又はアデノシン受容体が発現しており、これらは相互に密接に関連して育毛作用を示すものと思われる。特に、ＡＢＣトランスポーターに対する刺激作用を有する化合物については、このＡＢＣトランスポーターに対する刺激作用を介するＡＴＰ受容体またはアデノシン受容体の刺激により、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴って育毛効果を示すのではないかと考えられる。
【００７４】
そこで、毛乳頭細胞を用いて育毛剤のスクリーニングを実施したが、目的とする毛乳頭細胞は、増殖能が極めて悪く、スクリーニングに必要な細胞数を確保するには多量の毛組織が必要で、その実施には多大な労力と費用を要した。そのため、ＡＢＣトランスポーターを介してＡＴＰ受容体またはアデノシン受容体に作用して効果を示す物質を見出す簡便な方法の開発が望まれた。
【００７５】
そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、ＡＢＣトランスポーター遺伝子と、ＡＴＰ受容体遺伝子またはアデノシン受容体遺伝子を適当な宿主ベクター法による遺伝子組み替え技術によって遺伝子組み替え細胞とし、この細胞へのカルシウムの流入を測定することにより育毛物質をスクリーニングする方法を確立し、本発明を完成させた。
【００７６】
即ち、本発明の育毛物質のスクリーニング方法は、ＡＢＣトランスポーター遺伝子およびプリン誘導体に対する受容体遺伝子を宿主ベクター法によって発現させた細胞を使用し、細胞内へのカルシウムの流入を指標とすることを特徴とする。
【００７７】
上記したとおり、ＡＢＣトランスポーターは、細胞内のＡＴＰの細胞外への放出を引き起こす作用を有する類似タンパクの総称であり、タンパクとしては、いわゆるＡＢＣタンパクスーパーファミリーを構成する一部で、ＡＴＰバインディングカセット、ＡＴＰ結合タンパク、ＡＢＣ結合トランスポーターまたはＡＢＣタンパクとも呼ばれている。ＡＢＣトランスポーターとしては、例えば、ＭＤＲ（Ｐ糖タンパク質、multidrug resistance protein）、ＭＲＰ（MDR-related protein）、ＣＦＴＲ（cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator）、ＳＵＲ（スルホニルウレア受容体）などが挙げられる。中でも、本発明に用いられるＡＴＰ結合トランスポーター遺伝子としては特にスルホニルウレア受容体遺伝子（以下SUR遺伝子ともいう）が好ましい。
【００７８】
スルホニル受容体遺伝子は、すでに知られているSUR遺伝子配列の情報、例えばY.Tokuyamaら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 220, p.532-538 (1996)に記載されたハムスターSUR遺伝子配列の情報を元に該配列から作成した適当なプローブを用いて、周知のPCR法やｃDNAライブラリーからのハイブリダイゼーション法などにより得られることができる。また、ラットのSURcDNA配列も知られている（GenBank Accession No.L40624）。ハムスターSUR遺伝子導入に関しては、Aguilar-Bryanら、Science, vol.268, p.423 (1995)に記載されている。ラット、マウスSURのアミノ酸配列については、稲垣ら、「スルホニル尿素受容体」（生化学第６９巻、第９号、1067頁、１９９７年）に記載されている。
【００７９】
上記アデノシン誘導体に対する受容体遺伝子としては、プリン受容体遺伝子またはアデノシン受容体遺伝子が挙げられる。
【００８０】
アデノシン受容体遺伝子としては、すでにヒトのcDNA遺伝子配列が知られている（GenBank Accession No.X68485）。あるいはスルホニル受容体遺伝子と同様に、周知のPCR法またはcDNAライブラリーからのハイブリダイゼーション法などにより得られることができる。
【００８１】
ＡＴＰ受容体遺伝子についても、ヒトのｃＤＮＡ遺伝子配列が知られている（GenBank Accession No.X83688）。
【００８２】
これらの遺伝子の種に関しては特に制限はなく、例えば、ヒト、ラット、マウス、ハムスター由来のものが挙げられる。
【００８３】
これらの遺伝子をクローン化する方法としては、例えば、Sambrookら, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989等に記載された一般的な方法を用いることができる。
【００８４】
上記ＡＢＣトランスポーター遺伝子またはプリン誘導体に対する受容体遺伝子としては、形質転換後に形質転換細胞内でＡＢＣトランスポーターまたはプリン誘導体に対する受容体として機能する範囲で、遺伝子配列の内部または末端の一部が、挿入、置換あるいは削除されたものも含む。
【００８５】
また、本発明に用いられる宿主としては導入した遺伝子が効率よく発現され、培養が容易なものであれば特に限定されないが、エシェリヒア属菌であるEscherichia coliの各種菌株、バチルス属菌種であるBacillus subtilisの各種菌株、酵母としてはSaccharomyces cerevisiaeの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＣ１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＮＲＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞等が好ましい。
【００８６】
ベクターとしては、調製が容易で効率よく導入できるものであれば特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８など）、枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド（例：ｐＳＨ１９など）、さらにバクテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が好ましい。さらに、該当遺伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、γＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。
【００８７】
形質転換は、ＤＮＡが、染色体外要素として、あるいは染色体組み込みによりＤＮＡが複製可能となるように、ＤＮＡを生体内に導入することを意味する。
【００８８】
上記組み替えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法としては、各宿主細胞に対して一般に用いられる形質転換方法、例えば塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションなどが適用できる（Sambrookら, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989など）。
【００８９】
こうして得られた形質転換細胞を適当な選択培地で培養してスクリーニングに供する。このスクリーニングのための培養は、細胞をカバーグラス上で培養して供することが好ましい。例えば、形質転換細胞を細胞濃度３×１０⁷ _/ｍＬとなるように培地に懸濁し、適量をカバーグラス上に載せ、２４〜４８時間程度、約３７℃で培養する。
【００９０】
スクリーニングの方法としては、培養細胞に、被験物質溶液を添加し、細胞内へのカルシウムの流入量を測定することにより行う。
【００９１】
細胞内カルシウム濃度測定法としては、カルシウムキレート剤でありカルシウム結合量に応じてその蛍光特性が変化する周知の蛍光カルシウム指示薬、例えばｆｕｒａ−２、ｆｕｒａ−２−ＡＭ、ｉｎｄｏ−１、ｑｕｉｎ２、ｆｌｕｏ−３、ｒｈｏｄ−２などを用いることができるが、なかでもｆｕｒａ−２−ＡＭ（1-(2-(5'-カルボキシオキサゾール-2'-イル)-6-アミノベンゾフラン-5-オキシ)-2-(2'-アミノ-5'-メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-テトラアセチックアシッドペンタアセトキシメチルエステル、和光純薬（東京））を使用した蛍光強度法を用いることが好ましい（唐木、実験医学、7（6）、626（1989））。
【００９２】
例えば、１〜２０μｇ／ｍｌのｆｕｒａ−２−ＡＭを２０〜４０分間ロードし、タイロード液（１３５ｍＭ ＮａＣｌ, ５．６ｍＭ ＫＣｌ, １．２ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ^, ２．２ｍＭ ＣａＣｌ₂ ^, １０ｍＭグルコース, ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ([4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン]エタンスルホン酸)／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４））にて洗浄した後、細胞内カルシウム濃度の指標として３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光強度の比を求める。これには、例えばカバーガラスを循環定温チャンバー付蛍光測定装置（ＡＲＧＵＳ-50、浜松フォトニクス社、浜松）を用いることができる。
【００９３】
【実施例】
次に、製剤例及び試験例（実施例及び比較例）を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００９４】
育毛剤
製剤例１（外用ローション剤）：

上記成分を撹拌し、均一に溶解させ外用ローション剤を調製した。
【００９５】
製剤例２ （外用クリーム剤）：
（成分） 配合量(W/W%)
アデノシン １．０
中鎖脂肪酸トリグリセリド １８．０
ミリスチン酸イソプロピル １．０
２−ヘキシルドデカノール ４．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ５．０
ソルビタンモノステアレート ３．０
グリセリンモノステアレート ６．０
セタノール １．０
ステアリルアルコール ２．０
プロピレングリコール １５．０
ｐ−アミノ安息香酸メチル ０．０５
ｐ−アミノ安息香酸プロピル ０．０５
精製水 全１００ｇ
上記成分について、乳化剤の通常の製法に準じて外用クリーム剤を調製した。
【００９６】
製剤例３（外用ゲル剤）：
（成分） 配合量(W/W%)
Ｎ６−（Ｌ−２−フェニルイソプロピル）アデノシン ０．５
ポリエチレングリコール（１０）モノステアレート １．０
１，３−ブチレングリコール ７．０
カルボキシビニルポリマー １．５
ジイソプロパノールアミン 適量
エタノール ４０．０
精製水 全１００ｇ
上記成分について、ゲル剤の通常の製法に準じて外用ゲル剤を調製した。
【００９７】
製剤例４（エアゾール剤）：
（成分） 配合量(W/W%)
ピナシジル ０．１
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート １．０
グリセリン ３．０
エタノール ２０．０
精製水 １５．０
イソペンタン １０．０
液化石油ガス ３．０
ジメチルエーテル ４８．０
上記成分について、エアゾール剤の通常の製法に準じて外用エアゾール剤を調製した。
【００９８】
試験例：
実施例１〜１５（表１及び表２）の育毛剤の発毛試験をＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを用い行った。試験法はマウスを１群１０匹とし、実施例１〜１５、比較例１及び２、並びに、無投与群の１７群に分け、マウスの背部をバリカンおよびカミソリにて剃毛し、それぞれのサンプルを１日１回、剃毛した背部８平方ｃｍ当たり１００μＬずつ塗布した。実施例１〜１５、比較例１及び２の育毛剤は製剤例１と同様に、表１及び表２に示す各成分を全体が均一な状態となるまで攪拌して調製した。実施例１〜１５の育毛剤及び比較例１、２の育毛剤の投与群、並びに無投与群の塗布面積に対する毛の再生面積（１５日後）を表３及び表４に示す。
【００９９】
【表１】

【０１００】
【表２】

【０１０１】
【表３】

【０１０２】
【表４】

表１乃至表４の結果から明らかなように、本発明の育毛剤は毛の再生に関して高い効果を有する。
【０１０３】
製剤例５（外用ローション剤）：
（成分） 配合量(W/V%)
α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸 ０．５
プロピレングリコール １０．０
エタノール ５０．０
精製水 全１００ ｍｌ
上記成分を撹拌し、均一に溶解させ外用ローション剤を調製した。
【０１０４】
製剤例６（外用クリーム剤）：
（成分） 配合量(W/W%)
２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸 １．０
中鎖脂肪酸トリグリセリド ２０．０
ミリスチン酸イソプロピル １．０
２−ヘキシルドデカノール ４．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ５．０
ソルビタンモノステアレート ３．０
グリセリンモノステアレート ６．０
セタノール １．０
ステアリルアルコール ２．０
プロピレングリコール １５．０
ｐ−アミノ安息香酸メチル ０．０５
ｐ−アミノ安息香酸プロピル ０．０５
精製水 全１００ｇ
上記成分について、乳化剤の通常の製法に準じて外用クリーム剤を調製した。
【０１０５】
製剤例７（外用ゲル剤）：
（成分） 配合量(W/W%)
２’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸 ５．０
ポリエチレングリコール（１０）モノステアレート １．０
１，３−ブチレングリコール ７．０
カルボキシビニルポリマー １．５
ジイソプロパノールアミン 適量
エタノール ４０．０
精製水 全１００ｇ
上記成分について、ゲル剤の通常の製法に準じて外用ゲル剤を調製した。
【０１０６】
製剤例８（エアゾール剤）：
（成分） 配合量(W/W%)
３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸 ０．１
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート １．０
グリセリン ３．０
エタノール ２０．０
精製水 １５．０
イソペンタン １０．０
液化石油ガス ３．０
ジメチルエーテル ４８．０
上記成分について、エアゾール剤の通常の製法に準じて外用エアゾール剤を調製した。
【０１０７】
製剤例９（外用ローション剤）：
（成分） 配合量(W/V%)
アデノシン−５’−トリリン酸メチル ０．０１
プロピレングリコール １０．０
エタノール ５０．０
精製水 全１００ ｍｌ
【０１０８】
試験例：
実施例１６〜２２（表５）の育毛剤の発毛試験をＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを用い行った。試験法はマウスを１群１０匹とし、実施例１６〜２２の育毛剤投与群、比較例３の育毛剤投与群及び無投与群の９群に分け、マウスの背部をバリカンおよびカミソリにて剃毛し、それぞれのサンプルを１日１回、剃毛した背部８平方ｃｍ当たり１００μＬずつ塗布した。実施例１６〜２２及び比較例３の育毛剤は、製剤例５と同様に、表５に示す各成分を全体が均一な状態となるまで攪拌して調製した。実施例１６〜２２の育毛剤及び比較例３の育毛剤の投与群並びに無投与群の塗布面積に対する毛の再生面積（１５日後）を表６に示す。
【０１０９】
【表５】

【０１１０】
【表６】

表５及び表６の結果から明らかなように、本発明の育毛剤は毛の再生に関して高い効果を有する。また、本発明の化合物群の中では、アデノシン−５’−ジリン酸（実施例２１）又はアデノシン−５’−トリリン酸(実施例２２）と比べて、それらの誘導体の方がより高い育毛効果を有することが明らかとなった。
【０１１１】
製剤例１０（外用クリーム剤）
（成分） 配合量(W/W%)
クロマカリム １．０
中鎖脂肪酸トリグリセリド １８．０
ミリスチン酸イソプロピル １．０
２−ヘキシルドデカノール ４．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ５．０
ソルビタンモノステアレート ３．０
グリセリンモノステアレート ６．０
セタノール １．０
ステアリルアルコール ２．０
プロピレングリコール １５．０
ｐ−アミノ安息香酸メチル ０．０５
ｐ−アミノ安息香酸プロピル ０．０５
精製水 全１００ｇ
上記成分について、乳化剤の製法に準じ、外用クリーム剤を調製した。
【０１１２】
製剤例１１（外用ゲル剤）
（成分） 配合量(W/W%)
ＭｇＡＴＰ １．０
ポリエチレングリコール（１０）モノステアレート １．０
１，３−ブチレングリコール ７．０
カルボキシビニルポリマー １．５
ジイソプロパノールアミン 適量
エタノール ４０．０
精製水 全１００ｇ
上記成分について、ゲル剤の製法に準じ、外用ゲル剤を調製した。
【０１１３】
製剤例１２（エアゾール剤）
（成分） 配合量(W/W%)
オレオイル−ＣｏＡ ０．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート １．０
グリセリン ３．０
エタノール ２０．０
精製水 １５．０
イソペンタン １０．０
液化石油ガス ３．０
ジメチルエーテル ４８．０
上記成分について、エアゾール剤の製法に準じ、外用エアゾール剤を調製した。
【０１１４】
実施例２３（外用ローション剤）
（成分） 配合量(W/V%)
ニコランジル １．０
プロピレングリコール ２０．０
エタノール ５０．０
精製水 全１００ ｍｌ
上記成分を撹拌し、均一に溶解させ外用ローション剤を調製した。
【０１１５】
実施例２４−２８
表７に示すように、実施例２３におけるニコランジルを、ピナシジル（実施例２４）、クロマカリム（実施例２５）、ＭｎＡＴＰ（実施例２６）、メグロチニド（実施例２７）、Ｌ−アルギニン（実施例２８）に代えた以外は実施例２３と同様に外用ローション剤を調製した。
【０１１６】
比較例４
表７に示すように、実施例２３におけるニコランジルを除いた以外は実施例２３と同様に外用ローション剤を調製した。
【０１１７】
【表７】

【０１１８】
試験例
実施例２３〜２８と比較例４の外用ローション剤を用いた発毛試験を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを用い、以下の通り行った。
試験法はマウスを１群１０匹とし、試料投与群および無投与群の８群に分け、マウスの背部をバリカンおよびカミソリにて剃毛し、それぞれのサンプルを１日１回、剃毛した背部８平方ｃｍ当たり１００μＬずつ塗布した。実施例２３〜２８の試料投与群、比較例４の試料投与群および無投与群の塗布面積に対する毛の再生面積（１５日後）を表８に示す。
【０１１９】
【表８】

上記試験例より、本発明の育毛剤は、毛の再生に関して、高い効果を持つことが確認された。
【０１２０】
スクリーニング方法
＜目的遺伝子の細胞への形質転換＞
ＣＯＳ−１細胞（３×１０⁵個 ／直径３５ｍｍシャーレ）を１０％牛胎児血清を含んだダルベッコ変性ＭＥＭ培地にて５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で培養した。 別に、ヒトアデノシン受容体ｃＤＮＡ（GenBank Accession No.X68485、参考文献：C.A.Kollias-Bakerら、The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,281(2),761-768(1997)）とラットスルホニルウレア受容体ｃＤＮＡ（GenBank Accession No.L40624、参考文献：Y.Tokuyamaら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 220, 532-538 (1996)）をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社、カリフォルニア、米国）とｐｃＤＮＡ３．１/Hygroベクター（インビトロジェン社、カリフォルニア、米国）に常法に従ってそれぞれ導入し、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＡＤおよびｐｃＤＮＡ３．１/Hygro raＳＵＲを得た。
【０１２１】
ｐｃＤＮＡ３．１ｈＡＤは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのEcoRI/NotI部位に、ヒトアデノシン受容体ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ/ＸｂａＩ断片（１．４ｋｂ）が挿入されたものである。
【０１２２】
ｐｃＤＮＡ３．１/Hygro raＳＵＲは、ｐｃＤＮＡ３．１/HygroベクターのHindIII/XbaI部位に、ラットスルホニルウレア受容体ｃＤＮＡの塩基番号２０８−５０８６のＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【０１２３】
こうして得られたｐｃＤＮＡ３．１ｈＡＤ（１μｇ）およびｐｃＤＮＡ３．１/Hygro raＳＵＲ（１μｇ）を、先に培養しておいたＣＯＳ−１細胞中に、リポフェクタミンとＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ試薬、Nobuya Inagakiら、Science, 270, 1166-1170 (1995)に記載された方法に準じて、トランスフェクトした。
【０１２４】
その後、細胞をさらに培養し、コンフルーエントに達したところでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、０．０５％トリプシンと０．５３ｍＭのＥＤＴＡ溶液で処理した。
【０１２５】
ネオマイシンおよびハイグロマイシン耐性を指標にして高発現細胞株を得た。
【０１２６】
スクリーニングには細胞をカバーグラス上で培養して供した。また、細胞内カルシウム濃度の測定には、ＦＵＲＡ−２を使用した蛍光強度法を用いた。すなわち５μｇ／ｍｌのｆｕｒａ−２ ａｍを３０分間ロードし、タイロード液にて洗浄した後、細胞内カルシウム濃度の指標として３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光強度の比を求めた。
【０１２７】
試験例
上記操作によって得られた細胞を用いて、以下の試験を行った。
【０１２８】
試験例１
スルホニルウレア受容体刺激剤として知られているニコランジルを用いて、本発明のスクリーニング法の有効性を確認した。その結果、図２に示す通り、ニコランジル２５、１００μＭ添加により細胞内カルシウム濃度が上昇するが、この作用はアデノシン受容体の阻害剤である８−スルホフェニルテオフィリン１μＭの前処理により抑制されることが確認された。
【０１２９】
試験例２
アデノシン受容体刺激剤としてアデノシン１．０および１０．０μＭを添加すると、図３に示す通り、細胞内カルシウム濃度は濃度依存的に上昇した。この作用はアデノシン受容体阻害剤である８−スルホフェニルテオフィリン１μＭの前処理により抑制された。
【０１３０】
試験例１および２の結果から、本発明の形質導入細胞では、スルホニルウレア受容体とアデノシン受容体が発現し、機能していることが確認できた。
【０１３１】
なお、カルシウム除去培地ではニコランジルおよびアデノシンの作用は認められなかった。このことから、細胞内カルシウム濃度の増大は、細胞外カルシウムの流入によるものであることは明らかである。本発明で得られた形質転換細胞は、増殖能も良好で、育毛剤のスクリーニングに容易に使用することができる。
【０１３２】
【発明の効果】
本発明により、従来の育毛剤よりも高い育毛効果を有する育毛剤を提供することが可能である。
【０１３３】
特に、本発明の育毛剤は、例えば、ＡＴＰ、ＡＴＰ誘導体、アデノシン、アデノシン誘導体等を細胞から放出させて、ＡＴＰ受容体及び／又はアデノシン受容体を刺激して、育毛効果を発揮するという新規な作用機構に基づいており、顕著な育毛効果を奏するものである。
【０１３４】
なお、ＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物を有効成分とする育毛剤では、当該化合物としてアデノシン−５’−ジリン酸誘導体又はアデノシン−５’−トリリン酸誘導体を用いた場合に、特に高い育毛効果を得ることができる。
【０１３５】
また、本発明により、ＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を介するプリン受容体刺激作用、すなわちＡＴＰ受容体及び／又はアデノシン受容体刺激作用、により、育毛効果を発揮するという新規な作用機構を有する育毛作用物質のスクリーニングを、容易に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の育毛剤及び本発明の方法によってスクリーニングされる物質の、作用機構を示す説明図である。
【図２】本発明のスクリーニング方法の実施例の結果を示すグラフである。
【図３】本発明のスクリーニング方法の実施例の結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a hair restorer, and more particularly to a hair restorer that can be used as various external preparations and has a novel action mechanism showing excellent effectiveness. The present invention also relates to a method for screening a substance having a hair-growth action, and particularly relates to a method for screening a hair-growth action substance having a novel action mechanism.
[0002]
[Prior art]
To date, the use of many drugs has been proposed in attempts to treat or prevent human hair loss, particularly male pattern hair loss. Examples of such drugs include vasodilators, male hormone receptor inhibitors, steroid-5α-reductase inhibitors, vitamins, immunosuppressants and the like. However, in reality, the effectiveness of these drugs as hair restorers is not fully satisfactory.
[0003]
In the past, several methods for screening hair growth substances have been proposed in an attempt to treat or prevent human hair loss, particularly male pattern hair loss. For example, small animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, etc., especially methods such as C3H mice and C57BL mice of suitable weeks of age, mainly shaving the back hair, applying a test substance and observing the degree of hair growth, A method of removing human hair, etc., organ-culturing the obtained hair tissue, adding a test substance to evaluate the degree of growth, or further dividing the hair tissue to the cellular level, especially the hair papilla A method of testing the growth promoting effect by adding a test substance to a system in which cells or outer hair root sheath cells are individually or co-cultured, or testing the vasodilatory effect or blood flow promoting effect in an appropriate animal or human Has been tried. In addition, since male hormones are involved in the onset of male pattern hair loss, male hormone receptor inhibition test and steroid-5α-reductase inhibition test which is an enzyme that converts male hormone testosterone into dihydrotestosterone Etc. have also been applied.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a hair growth agent that is superior in hair growth effect as compared with conventional hair growth agents.
[0005]
Another object of the present invention is to provide a screening method for providing an excellent hair restorer having a novel action mechanism different from that of conventional hair restorers.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
One embodiment of the present invention enhances the action of a compound having a purine receptor stimulating action, a compound releasing a compound having a purine receptor stimulating action after application to a living body, or a compound having a purine receptor stimulating action. A hair restorer containing one or more compounds as active ingredients.
[0007]
In the present invention, the “purine receptor stimulating action” refers to an action of stimulating a purine receptor to generate some phenomenon on a cell. Usually, such a stimulus is a purine receptor and the purine receptor. It is brought about by interaction with substances that can specifically bind to the body.
[0008]
In the present invention, “a compound that releases a compound having purine receptor stimulating activity after application to a living body” refers to a compound having purine receptor stimulating activity after application or administration to the skin, mucous membrane, body tissue or the like. It is a compound having a function of separating and releasing, and is usually a compound in which some chemical modification is applied to a compound having a purine receptor stimulating action. Specific examples of the chemical modification include operations such as esterification and amidation.
[0009]
By the way, purine receptors are roughly classified into P1 and P2 receptors. The P1 receptor is also called an adenosine receptor because of its high affinity for adenosine, and the P2 receptor is also called an ATP receptor because of its high affinity for ATP. Therefore, the compounds having a purine receptor stimulating action of the present invention include compounds having adenosine receptor and / or ATP receptor stimulating action.
[0010]
Examples of the compound having adenosine receptor stimulation according to the present invention include adenosine, N6-cyclohexyladenosine, N6-cyclopentyladenosine, (R) -N6-phenylisopropyladenosine, (S) -N6-phenylisopropyladenosine, (R) -phenyl. -Isopropyladenosine, N- [R- (2-benzothiazolyl) thio-2-propyl] -2-chloroadenosine, 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine, N- (methyl-phenethyl) adenosine, minopurinyl-deoxy-N- Ethyl ribofuranuramide, defibrotide, 5'-N-ethylcarboxamide adenosine, 2-chloroadenosine, N-ethyl-1'-deoxy-1 '-[6-amino-2- [1- (3-hydroxy-3 -Phenyl) propynyl] -9H-purine -9-yl] -β-D-ribofuran-5'-uronamide, N6-2- (4-aminophenyl) ethyladenosine, 5'-N-cyclopropylcarboxamide adenosine, N6- (p-sulfophenyl) adenosine, 1-deaza-2-chloro-N6-cyclopentyladenosine, 8-butyladenosine, 1-cyclopropylisoguanosine, 6-cyclohexyl-2′-O-methyladenosine, 2-β-D-ribofuranosyloxazole-4 -Carboxamide, 2-iodo-N6-cyclopentyladenosine, N6-cyclopentyl-2'-methyl-2-chloroadenosine, N6-cyclohexyl-2'-O-methyldenosine, 2- [P- (2-carboxyethyl) phenyl Ethylamino] -5'-N-ethylcarboxamide adenosine, N6 [4-[[[4-[[2-[[[(p-isothiocyanatophenyl) amino] thiocarbonyl] amino] ethyl] amino] carbonyl] methyl] aminocarbonyl] methyl] phenyl] adenosine, N6- [4-[[[4-[[2-[[[(m-isothiocyanatophenyl) amino] thiocarbonyl] amino] ethyl] amino] carbonyl] methyl] aminocarbonyl] methyl] phenyl] adenosine, 2- [(2-aminoethylamino) carbonylethylphenylethylamino] -5′-ethylcarboxamide adenosine, 2-hexynyl-5-methylcarboxamide adenosine, 2-cyclohexylmethylidenehydrazinoadenosine, N-ethylcarboxamide adenosine, N6- [ 2- (3,5-dimethoxyphenyl) -2- (methylphenyl) ethyl] adenosine, 5 ′-(N-cyclopropy ) Carboxamide adenosine, N- [2- (3,5-dimethoxyphenyl) -2-phenylethyl] adenosine, N- (2-methylbenzyl) adenosine, 2-octynyladenosine, 2-phenylaminoadenosine, 2- [ 2- (4-fluorophenyl) ethoxy] adenosine, 2-[(cyclohexylmethylene) hydrazino] adenosine, 2-chloro-N6- (3-iodobenzyl) adenosine-5′-N-methyluronamide, N6- (3-isothi Oceanate benzyl) adenosine-5'-N-methyluronamide, 2-chloro-N6- (3-iodobenzyladenosine-5'-N-methylcarboxamide, pinacidil, defibrotide (short-chain deoxyribonucleotide), adenosine-5'-monoline Acid, adenosine-5'-monophosphate Preference is given to methyl esters, N6-methyladenosine-5'-monophosphate, 8-butylaminoadenosine or their periodate oxides.
[0011]
The compound having an adenosine receptor stimulating action or a compound that liberates a compound having an adenosine receptor stimulating action after application to a living body is represented by the following [formula 3]:
[Chemical Formula 3]

[Wherein n is 0 or 1, R₁~ R₂Each represents a hydrogen atom or an acyl group having 1 to 5 carbon atoms;_ThreeRepresents a hydrogen atom or a protecting group. ] May be sufficient.
[0012]
The compound that enhances the action of a compound having adenosine receptor stimulating action is preferably a compound uptake inhibitor of the compound having adenosine receptor stimulating action. Here, the “uptake inhibitor” refers to a compound having an action of inhibiting absorption or uptake of a target compound into cells or tissues. As the uptake inhibitor, dipyridamole, diracep, ridofurazine, hexobenzine, carbochromene, chromonal acid, cinepazide, diazepam, papaverine, 6- (2'-hydroxynitrobenzyl) thioguanosine, and proventophilin are preferable.
[0013]
In addition, the compound that enhances the action of the compound having adenosine receptor stimulating action may be an inactivation inhibitor of the compound having adenosine receptor stimulating action. Here, the “inactivation inhibitor” refers to a compound having an action of inhibiting a decrease in a certain property, function or action of a target compound. Therefore, an inactivation inhibitor of a compound having an adenosine receptor stimulating action has a function of preventing a decrease in the adenosine receptor stimulating action of the compound. As the inactivation inhibitor of the compound having adenosine receptor stimulating action, 2'-deoxycoformycin and erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine are preferable.
[0014]
Another embodiment of the present invention is a hair restorer containing one or more compounds having an ATP receptor stimulating action as an active ingredient.
[0015]
Examples of the compound having an ATP receptor stimulating action of the present invention include adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, and derivatives thereof, among which adenosine-5′-diphosphate, adenosine-5′-triphosphate And their derivatives are preferred. The derivative of adenosine-5'-diphosphate or the derivative of adenosine-5'-triphosphate is preferably an ester derivative.
[0016]
The adenosine-5'-diphosphate derivative and the adenosine-5'-triphosphate derivative are represented by the following [formula 4]:
[Formula 4]

[Wherein n is 2 or 3, R₁~ R₂Each represents a hydrogen atom or an acyl group having 1 to 5 carbon atoms;_ThreeRepresents a hydrogen atom or a protecting group. ] May be sufficient.
[0017]
Examples of the adenosine-5′-diphosphate derivative include α, β-methyleneadenosine-5′-diphosphate, 2-methylthioadenosine-5′-diphosphate, 2′-benzoyladenosine-5′-diphosphate, 3 ′. -Benzoyladenosine-5'-diphosphate is preferred.
[0018]
Examples of the adenosine-5′-triphosphate derivative include α, β-methyleneadenosine-5′-triphosphate, 2-methylthioadenosine-5′-triphosphate, 2′-benzoyladenosine-5′-triphosphate, and 3 ′. -Benzoyladenosine-5'-triphosphate is preferred.
[0019]
Another embodiment of the present invention is a hair restorer containing one or more compounds having an action of releasing a compound having a purine receptor stimulating action from cells as an active ingredient. The compound having a purine receptor stimulating action may be adenosine, adenosine derivative or adenosine metabolite, and may be ATP, ATP derivative or ATP metabolite.
[0020]
The adenosine derivative or adenosine metabolite released from the cell can be adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, or adenosine triphosphate.
[0021]
A compound having a purine receptor stimulating action, in particular, a compound having an action of releasing adenosine, an adenosine derivative or an adenosine metabolite from a cell can be a compound having a stimulating action on an ABC transporter present in the cell.
[0022]
The compound having a stimulating action on ABC transporter can be a compound having a stimulating action on sulfonylurea receptor.
[0023]
Compounds having stimulatory action on sulfonylurea receptors are meglitinide, nicorandil, levochromacarim, cromakalim, pinacidil, diazoxide, disopyramide, chillisolol, apricam, bimacarim, MgATP, MnATP, CaATP, ZnATP, SrATP, MgADP, MnADP, CaADP It may be a compound selected from the group consisting of SrADP, MgAMP, MnAMP, CaAMP, ZnAMP, SrAMP, adenyl-5-ylimidodiphosphate, L-lysine and L-arginine.
[0024]
The compound having a stimulating action on the sulfonylurea receptor may be a salt containing a divalent cation selected from the group consisting of calcium, manganese, magnesium, zinc, and strontium.
[0025]
The compound having a stimulating action on the sulfonylurea receptor has the following formula:
R-S-CoA
[Wherein, R is an acyl group having 14 to 30 carbon atoms which may be branched and contains 0 to 3 double bonds], and may be a long-chain acyl coenzyme A.
[0026]
The hair restorer of the present invention containing each of the above compounds as an active ingredient is preferably an external preparation, and in the hair restorer of the present invention, the content of the active ingredient is 0.01 to 5 of the entire preparation. It is preferable that it is weight%.
[0027]
In still another embodiment of the present invention, a test substance is added to a cell transformed with an ABC transporter gene and a receptor gene for a purine derivative, and the amount of calcium inflow into the cell at that time is used as an index. This is a screening method for a substance having a hair-growth effect.
[0028]
The ABC transporter gene can be a sulfonylurea receptor gene.
[0029]
The receptor gene for the purine derivative can be an adenosine receptor gene or an ATP receptor gene.
[0030]
The amount of calcium inflow into the cell can be measured by fluorescence intensity using a fluorescent calcium indicator.
[0031]
Transformation of a receptor gene for an ABC transporter gene or a purine derivative can be performed by a gene recombination technique using a host vector system.
[0032]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
First, the hair restorer of the present invention will be described.
[0033]
As a result of diligent research on hair-growth ingredients having excellent effectiveness, the present inventors have surprisingly found that the stimulating action on purine receptors including adenosine receptors and ATP receptors is closely related to the hair-growth effect. I found out. The present invention is based on this finding,
A. A compound having purine receptor stimulating action, a compound that releases a compound having purine receptor stimulating action after application to a living body, and a compound that enhances the action of the compound having purine receptor stimulating action; and
B. A compound having an action of releasing a compound having a purine receptor stimulating action from a cell, for example, a compound having an ABC transporter stimulating action, particularly a compound having a sulfonylurea receptor stimulating action;
Is used as a hair-growth ingredient.
[0034]
Hereinafter, the hair growth agent (hereinafter referred to as the purine receptor direct stimulation type and the purine receptor indirect stimulation type) each containing the compounds of types A and B will be described in detail.
[0035]
1. Purine receptor direct stimulation hair restorer
As described above, purine receptors are roughly classified into adenosine receptors and ATP receptors. Therefore, first, a hair restorer containing a compound that specifically stimulates adenosine receptors will be described.
[0036]
Adenosine receptors are currently classified into four subtypes, A1, A2a, A2b, and A3, based on pharmacological and structural characteristics. The A1 receptor has an anticonvulsant effect, a neuroprotective effect, a behavior inhibitory effect, a sleep effect, the A2 (A2a or A2b) receptor has a behavior inhibitory effect, a sleep effect, etc., and the A3 receptor has a deprivation of mast cells. It is known to have physiological actions such as granule promoting effects.
[0037]
Adenosine receptors are distributed in various organs in the living body and are considered to be involved in the regulation of cell functions and physiological functions. For example, adenosine receptors distributed in vascular smooth muscle of the heart are known to dilate blood vessels and increase coronary blood flow by binding to compounds that have adenosine receptor stimulating action in the blood. . In recent years, it has been clarified that stimulation of adenosine receptors present on cells causes phenomena such as an increase in intracellular calcium ion concentration.
[0038]
The present inventors have conducted research from various aspects regarding the possibility that various phenomena caused by adenosine receptor stimulation have an important role in regulating other functions of cellular tissues. Based on this finding, we have developed a new hair-restoring agent that has a high hair-growth effect.
[0039]
That is, one form of the hair restorer of the present invention is based on adenosine receptor stimulating action.
[0040]
As an active ingredient of this hair restorer, in addition to one or more compounds having an adenosine receptor stimulating action, a compound that releases an adenosine receptor stimulating action after application to a living body, or an adenosine receptor One type or two or more types of compounds that enhance the action of the compound having a stimulating action may be mentioned. These compounds may be used alone, or a plurality of types may be mixed and used.
[0041]
The compound having an adenosine receptor stimulating action is not particularly limited as long as it has an action to stimulate an adenosine receptor. However, in terms of binding to the adenosine receptor, adenosine, N6-cyclohexyladenosine. N6-cyclopentyladenosine, (R) -N6-phenylisopropyladenosine, (S) -N6-phenylisopropyladenosine, (R) -phenyl-isopropyladenosine, N- [R- (2-benzothiazolyl) thio-2-propyl ] -2-chloroadenosine, 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine, N6- [4-[[[4-[[2-[[(p-isothiocyanatophenyl) amino] thiocarbonyl] amino] ethyl ] Amino] carbonyl] methyl] aminocarbonyl] methyl] phenyl] adenosine, N6- [4-[[[[ -[[[2-[[[(m-isothiocyanatophenyl) amino] thiocarbonyl] amino] ethyl] amino] carbonyl] methyl] aminocarbonyl] methyl] phenyl] adenosine, N- (methyl-phenethyl) adenosine, Minoprinyl-deoxy-N-ethylribofuranuramide, 5'-N-ethylcarboxamide adenosine, 2-chloroadenosine, N-ethyl-1'-deoxy-1 '-[6-amino-2- [1- (3 -Hydroxy-3-phenyl) propynyl] -9H-purin-9-yl] -β-D-ribofuran-5'-uronamide, N6-2- (4-aminophenyl) ethyladenosine, 5'-N-cyclopropyl Carboxamide adenosine, N6- (p-sulfophenyl) adenosine, 1-deaza-2-chloro-N6-cyclopentyladenosine, 8-butyl Tiladenosine, 1-cyclopropylisoguanosine, 6-cyclohexyl-2′-O-methyladenosine, 2-β-D-ribofuranosyloxazole-4-carboxamide, 2-iodo-N6-cyclopentyladenosine, N6-cyclopentyl- 2′-methyl-2-chloroadenosine, N6-cyclohexyl-2′-O-methyldenosine, 2- [P- (2-carboxyethyl) phenylethylamino] -5′-N-ethylcarboxamide adenosine, 2- [ (2-aminoethylamino) carbonylethylphenylethylamino] -5'-ethylcarboxamide adenosine, 2-hexynyl-5-methylcarboxamide adenosine, 2-cyclohexylmethylidenehydrazinoadenosine, N-ethylcarboxamide adenosine, 5 '-( N-shi Chloropropyl) carboxamide adenosine, N- [2- (3,5-dimethoxyphenyl) phenylethyl] adenosine, N- (2-methylbenzyl) adenosine, 2-octynyladenosine, 2-phenylaminoadenosine, 2- [2 -(4-Fluorophenyl) ethoxy] adenosine, 2-[(cyclohexylmethylene) hydrazino] adenosine, 2-chloro-N6- (3-iodobenzyl) adenosine-5'-N-methyluronamide, N6- (3-isothiocyan Natobenzyl) adenosine-5′-N-methyluronamide, 2-chloro-N6- (3-iodobenzyladenosine-5′-N-methylcarboxamide, defibrotide (short-chain deoxyribonucleotide), pinacidil, adenosine-5′-monophosphate , Adenosine-5'-mono Preference is given to acid methyl ester, N6-methyladenosine-5′-monophosphate, 8-butylaminoadenosine or their periodate oxides, and in terms of the hair-growth effect, they are suitable for A1 and A2 type adenosine receptors. A compound having a high stimulating action is more preferable.
[0042]
In terms of hair growth effect, the compound having adenosine receptor stimulating action or the compound releasing a compound having adenosine receptor stimulating action after application to a living body is a compound having the structure shown in the above [Chemical Formula 3]. Preferably, in which case R₁~ R₂Are each a hydrogen atom or an acyl group having 1 to 5 carbon atoms, R_ThreeIs preferably a hydrogen atom or a protecting group.
[0043]
By the way, a compound having adenosine receptor stimulating action including adenosine is produced and metabolized in various tissues of the living body. Therefore, a compound that enhances the action of a compound having an adenosine receptor stimulating action has the same effect as a compound having an adenosine receptor stimulating action. Specific examples of the compound that enhances the action of the compound having adenosine receptor stimulating action blended in the hair growth agent of the present invention include an uptake inhibitor and an inactivation inhibitor of the compound having adenosine receptor stimulating action. Is preferred. Examples of the inactivating agent include compounds that inhibit the metabolism of a compound having adenosine receptor stimulating activity by an enzyme. For example, inhibition of adenosine deaminase that metabolizes adenosine to inosine in vivo in vivo. An agent may be used.
[0044]
Examples of the uptake inhibitor include dipyridamole, diracep, ridofurazine, hexobenzine, carbochromene, chromonal acid, cinepazide, diazepam, papaverine, 6- (2′-hydroxynitrobenzyl) thioguanosine, and provent. Filin is preferable, and the inactivation inhibitor is preferably 2′-deoxycoformycin or erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine in view of its effect.
[0045]
Next, a hair restorer containing a compound that specifically stimulates the ATP receptor will be described.
[0046]
There are two types of ATP receptors, one using a cell membrane permeation of ions and one using a GTP-binding protein as a method for transmitting a ligand stimulus into a cell. P2X type and P2Y type (7 types each) Has a subtype).
[0047]
ATP receptors are distributed in various organs in the living body and are considered to be involved in information transmission and functional regulation. For example, it is thought to be responsible for synaptic modulation in the nervous system and blood pressure regulation in the aorta. However, the details and functions of the distribution have not been clarified yet. Since both adenosine and ATP (adenosine triphosphate) have a purine ring, the concept of purine receptors includes adenosine receptors and ATP (adenosine triphosphate) receptors.
[0048]
In recent years, it has become clear that stimulation of ATP receptors present on cells causes an increase in intracellular calcium ion concentration. The present inventors have studied from various aspects about the possibility that the ATP receptor stimulating action has an important role in the regulation of other functions of cellular tissues. As a result, the ATP receptor stimulating action is related to the growth of hair. Based on this finding, we have developed a new hair growth agent that has a high hair growth effect.
[0049]
That is, the other form of the hair restorer of the present invention is based on a stimulating action on purine receptors other than adenosine receptors, that is, ATP receptors.
[0050]
Examples of the active ingredient of this type of hair restorer include one or more compounds having an ATP receptor stimulating action. These compounds may be used alone, or a plurality of types may be mixed and used.
[0051]
The active ingredient of this hair restorer is not particularly limited as long as it has an ATP receptor stimulating action, and examples thereof include adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, and derivatives thereof. In terms of the function in the living body, in the adenosine diphosphate and the adenosine triphosphate, the binding position of the phosphate moiety is preferably 5 ′ carbon. Therefore, in the above-mentioned examples, adenosine-5'-diphosphate, adenosine-5'-triphosphate and derivatives thereof are preferable.
[0052]
In terms of hair restoration effect, ester derivatives are preferred as adenosine-5'-diphosphate derivatives or adenosine-5'-triphosphate derivatives. In addition, as an ester derivative, the oxygen atom couple | bonded with 2 'or 3' carbon of an adenosine site | part should form ester with the acyl group containing 1-10, preferably 1-5 carbon atoms. Is preferred.
[0053]
Specifically, the derivative of adenosine-5 'diphosphate and the derivative of adenosine-5'-triphosphate may be a compound represented by the above [Chemical Formula 4], in which case R₁~ R₂Are each a hydrogen atom or an acyl group having 1 to 5 carbon atoms, R_ThreeIs preferably a hydrogen atom or a suitable protecting group.
[0054]
In terms of hair growth effect, the adenosine-5′-diphosphate derivative is an α, β-methyleneadenosine-5′-diphosphate ester derivative, 2-methylthioadenosine-5′-diphosphate ester derivative, 2′- A benzoyladenosine-5′-diphosphate derivative or a 3′-benzoyladenosine-5′-diphosphate derivative is preferred.
[0055]
Similarly, in terms of hair growth effect, the adenosine-5′-triphosphate derivative is α, β-methyleneadenosine-5′-triphosphate, 2-methylthioadenosine-5′-triphosphate, 2′-benzoyl. It may be adenosine-5′-triphosphate or 3′-benzoyladenosine-5′-triphosphate.
[0056]
2. Purine receptor indirectly stimulated hair restorer
ABC transporter is a generic term for similar proteins that have the effect of causing intracellular release of ATP to the outside of the cell. The protein is a part of the so-called ABC protein superfamily, and includes an ATP binding cassette and an ATP binding protein. , Also known as ABC binding transporter or ABC protein, MDR (P glycoprotein, multidrug resistance protein), MRP (MDR-related protein), CFTR (cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator), SUR (sulfonylurea receptor), etc. It has been shown that it plays an important role in the expression and regulation of various cell functions.
[0057]
For example, ABC transporters present in the pancreatic beta cell membrane control the opening and closing of adjacent ATP-dependent potassium channels to regulate the release of potassium ions and the subsequent influx of calcium ions, Controls extracellular secretion of insulin. Furthermore, myocardial ABC transporter is present in mitochondria and regulates the function of ATP-sensitive potassium channel, which is also present in mitochondria, and is involved in the expression of preconditioning effect (myocardial protective effect) during ischemia-reperfusion Has become clear. On the other hand, ABC transporters are known to exist in various tissues of the living body including myocardium and vascular smooth muscle, and the role as transporters, that is, extracellular ATP in the cell. It is presumed that the action that causes release into the body is also involved in various regulatory actions. It has also been clarified that ABC transporters present in pancreatic β cells, vascular smooth muscle and cardiac muscle are sulfonylurea receptors.
[0058]
The sulfonylurea receptor is known to function as a regulator of an ATP-sensitive potassium channel (Inagaki et al., “Sulfonylurea receptor” (Biochemistry 69, 9: 1067, 1997)).
[0059]
The present inventors have found that ABC transporter and ATP receptor or adenosine receptor are expressed in dermal papilla cells. And these compounds, i.e., compounds having the action of releasing purine receptor stimulating compounds from cells, particularly compounds that exert their actions by stimulating ABC transporters, are the conventional hair-growth ingredients. It was found to show excellent effectiveness that was not seen. The compound having a purine receptor stimulating action includes a compound having an ATP receptor and / or adenosine receptor stimulating action, specifically, ATP, an ATP derivative or an ATP metabolite, and / or adenosine, adenosine. Derivatives or adenosine metabolites are mentioned.
[0060]
With regard to the relationship between the action of releasing a compound having a purine receptor stimulating action from a cell and the hair-growth effect, the present inventors, as shown in FIG. 1, stimulated an ABC transporter such as a sulfonylurea receptor. Adenosine triphosphate (ATP) is released from the inside of the cell, which acts on the ATP receptor, or adenosine produced by the degradation of ATP acts on the adenosine receptor, causing an increase in intracellular calcium concentration, We believe that it governs the mechanism that regulates the growth rate and hair cycle. Alternatively, it is also conceivable that stimulation of a sulfonylurea receptor present in mitochondria acts on an ATP-sensitive potassium channel present in mitochondria, which releases ATP, adenosine, their derivatives or metabolites from cells.
[0061]
Therefore, still another form of the hair restorer of the present invention is based on the action of releasing a compound having a purine receptor stimulating action from cells. Specifically, examples of the active ingredient of this hair restorer include one or more compounds having an action of releasing ATP, adenosine, derivatives or metabolites thereof from cells. These compounds may be used alone, or a plurality of types may be mixed and used.
[0062]
Specific examples of the action of releasing a compound having a purine receptor stimulating action, such as adenosine and its derivatives or metabolites, from a cell include, for example, stimulating an ABC transporter present in the cell.
[0063]
In the present invention, adenosine and its derivatives or metabolites include adenosine, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, and the like.
[0064]
As a compound having a stimulating action on ABC transporter, a compound having a stimulating action on any of MDR, MRP, CFTR and sulfonylurea receptor can be used, but preferably a compound having a stimulating action on sulfonylurea receptor Is mentioned.
[0065]
Examples of the compound having a stimulating action on the sulfonylurea receptor include meglitinide, nicorandil, levochromacarim, cromakalim, pinacidil, diazoxide, disopyramide, chillisolol, apricam, bimacarim, MgATP, MnATP, CaATP, ZnATP, SrATP, MgADP, MnADP, and MADP A salt comprising a divalent cation of ZnADP, SrADP, MgAMP, MnAMP, CaAMP, ZnAMP, SrAMP, adenyl-5-ylimidodiphosphate, L-lysine, L-arginine, calcium, manganese, magnesium, zinc or strontium, and Following formula
R-S-CoA
[Wherein R is an optionally branched acyl group having 14 to 30 carbon atoms and containing 0 to 3 double bonds], among which oleoyl-CoA, palmitoyl- Examples include CoA, oleyl-CoA, myristoyl-CoA, pentadecanoyl-CoA, and stearyl-CoA.
[0066]
These substances are known as potassium channel openers (eg, Takahashi et al., “K Channel Openers”, Pharmaceutical Journal, vol. 34, S-1, P. 70-74 (1998), and Endo. Et al., “Potassium Channel Opener”, Pharmaceutical Journal, vol. 35, S-1, P. 112-119 (1999)). Sulfonylurea receptors function as regulators of ATP-sensitive potassium channels, and it is already known that potassium channel openers bind to sulfonylurea receptors (eg, Bray et al., Journal of Bailogical Chemistry, vol. .267, p.11689 (1992)). It has also been proposed that the sulfonylurea receptor is involved in the release of ATP from the inside of the cell to the outside of the cell (see Awqati et al., Science vol. 269, 805 (1995)).
[0067]
Thus, the above substances known as potassium channel openers are thought to bind to and stimulate sulfonylurea receptors. The present invention relates to a compound having a purine receptor stimulating action such as ATP, adenosine, derivatives or metabolites thereof, wherein the sulfonylurea stimulating action by binding of these substances to the sulfonylurea receptor, that is, the stimulating action on ABC transporter. It is the first focus on releasing hair from cells and exerting hair-growth effect.
[0068]
The hair restorer of the present invention is preferably an external preparation and can be used by applying an appropriate amount on the scalp and skin one to several times a day. Moreover, the compounding quantity of each active ingredient contained in the hair restorer of this invention becomes like this. Preferably it is 0.01 to 5 weight% in the whole preparation, More preferably, it is 0.1 to 5 weight%, Especially preferably, it is 1 to 5 weight%. 5% by weight. When the blending amount is less than 0.01% by weight, the hair-growth effect is not sufficient, and when it exceeds 5% by weight, the dissolution stability of the active ingredient in the preparation is often lowered. This is not preferred because there is a concern about adverse effects on quality, such as precipitation.
[0069]
The hair restorer of the present invention can be used as a dosage form usually used as an external preparation, for example, a lotion, emulsion, cream, tonic, ointment, gel, aerosol, etc. However, the dosage form is not limited to these. In addition, when using as an aerosol agent, a compounding quantity is set as mentioned above with respect to stock solution.
[0070]
The hair restorer of the present invention includes water, lower alcohol (methanol, ethanol, denatured ethanol, isopropyl alcohol, etc.), a solubilizer, a surfactant, an emulsion stabilizer, a gelling agent, and an adhesive, as necessary. In addition, other base ingredients commonly used to obtain the desired dosage form can be added. Depending on the intended use, vasodilators such as minoxidil and carpronium chloride, men such as spironolactone, flutamide, cyproterone acetate, and oxendron Hormone receptor inhibitors, steroid-5α-reductase inhibitors such as finasteride and episteride, anti-inflammatory agents such as glycyrrhetinic acid and azulene, corticosteroids such as hydrocortisone acetate and dexamethasone acetate, and keratolytic agents such as urea and salicylic acid , Propylene glycol, 1,3-butylene Glycerol, macrogol, glycerin, dipropylene glycol, alcohols such as ethanol and isopropanol, fatty acid glycerin esters such as glyceryl monopentadecanoate, antihistamines such as isopentyl hydrochloride and diphenhydramine hydrochloride, chlorhexidine gluconate, isopropyl petylphenol, Bactericides such as quaternary ammonium salts, hinokitiol, piroctone olamine, moisturizers such as sodium hyaluronate, glycerin, chondroitin sulfate, yew, button bean, licorice, hypericum, appendix, loquat, kawara mugi, comfree, ashitaba, saffron, Extracts of animals and plants such as sanshin, rosemary, sage, mokko, seimokko, hops, placenta, retinol acetate, pyridoxine hydrochloride, ascorbine , Vitamins such as thiamine nitrate, cyanocobalamin, biotin, tocophenol acetate, oils such as isopropyl myristate, isopropyl palmitate, squalane, liquid paraffin, lecithin, polyoxyethylene sorbidic fatty acid ester, sorbidian fatty acid ester, polyoxyethylene fatty acid Surfactants such as esters and polyoxyethylene hydrogenated castor oil, antioxidants such as dibutylhydroxytoluene and isopropyl gallate, chelating agents such as ethylenediaminetetraacetate, cooling agents such as menthol and camphor, dyes, fragrances, and percutaneous absorption Components such as an accelerator can be blended within a range that does not impair the effects of the present invention.
[0071]
Further, although depending on the application target or the degree of the required hair-growth effect, etc., the hair-growth agent of the present invention may contain both of the above-mentioned types of A and B, if necessary.
[0072]
Next, the method for screening a hair growth substance of the present invention will be described.
[0073]
As already explained with reference to FIG. 1, ABC transporter and ATP receptor or adenosine receptor are expressed in hair papilla cells, and these are considered to be closely related to each other and exhibit hair growth action. . In particular, a compound having a stimulating action on ABC transporter does not show a hair-growth effect with an increase in intracellular calcium concentration by stimulation of ATP receptor or adenosine receptor through the stimulating action on ABC transporter. It is thought.
[0074]
Therefore, although hair follicle cells were screened using dermal papilla cells, the targeted dermal papilla cells had extremely poor proliferation ability, and a large amount of hair tissue was required to secure the number of cells required for screening. The implementation required a great deal of labor and expense. Therefore, it has been desired to develop a simple method for finding a substance that acts on an ATP receptor or adenosine receptor via an ABC transporter and exhibits an effect.
[0075]
Therefore, as a result of intensive studies, the present inventors have made an ABC transporter gene and an ATP receptor gene or an adenosine receptor gene into a genetically modified cell by a gene recombinant technique using an appropriate host vector method, and the influx of calcium into this cell. The present invention has been completed by establishing a method for screening hair-growth substances by measuring.
[0076]
That is, the method for screening a hair-growth substance of the present invention uses a cell in which an ABC transporter gene and a receptor gene for a purine derivative are expressed by a host vector method, and uses calcium influx into the cell as an index. And
[0077]
As described above, ABC transporter is a general term for similar proteins that have the effect of causing intracellular release of ATP to the outside of the cell. The protein is a part of the so-called ABC protein superfamily, and includes an ATP binding cassette. , Also called ATP binding protein, ABC binding transporter or ABC protein. Examples of the ABC transporter include MDR (P glycoprotein, multidrug resistance protein), MRP (MDR-related protein), CFTR (cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator), SUR (sulfonylurea receptor) and the like. Among them, a sulfonylurea receptor gene (hereinafter also referred to as SUR gene) is particularly preferable as the ATP-binding transporter gene used in the present invention.
[0078]
The sulfonyl receptor gene includes information on the already known SUR gene sequence, for example, information on the hamster SUR gene sequence described in Y. Tokuyama et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 220, p. 532-538 (1996). It can be obtained by a well-known PCR method or a hybridization method from a cDNA library using an appropriate probe originally prepared from the sequence. The rat SUR cDNA sequence is also known (GenBank Accession No. L40624). The hamster SUR gene introduction is described in Aguilar-Bryan et al., Science, vol. 268, p.423 (1995). The amino acid sequences of rat and mouse SUR are described in Inagaki et al., “Sulphonylurea receptor” (Biochemistry 69, 9, 1067, 1997).
[0079]
Examples of the receptor gene for the adenosine derivative include a purine receptor gene and an adenosine receptor gene.
[0080]
A human cDNA gene sequence has already been known as an adenosine receptor gene (GenBank Accession No. X68485). Alternatively, similar to the sulfonyl receptor gene, it can be obtained by a known PCR method or a hybridization method from a cDNA library.
[0081]
A human cDNA gene sequence is also known for the ATP receptor gene (GenBank Accession No. X83688).
[0082]
There is no restriction | limiting in particular regarding the seed | species of these genes, For example, the thing derived from a human, a rat, a mouse | mouth, and a hamster is mentioned.
[0083]
As a method for cloning these genes, for example, general methods described in Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989 and the like can be used.
[0084]
As a receptor gene for the ABC transporter gene or purine derivative, the inside or part of the gene sequence is inserted within a range that functions as a receptor for the ABC transporter or purine derivative in the transformed cell after transformation. , Including those that have been replaced or deleted.
[0085]
In addition, the host used in the present invention is not particularly limited as long as the introduced gene is efficiently expressed and can be easily cultured. Various strains of Escherichia coli, which is an Escherichia bacterium, and Bacillus, a Bacillus species. As various strains of subtilis and yeast, various strains of Saccharomyces cerevisiae and animal cells are preferably COS-7 cells, CHO cells, PC12 cells, NIH3T3 cells, NRK cells, CV-1 cells, COS-1 cells and the like.
[0086]
The vector is not particularly limited as long as it is easy to prepare and can be introduced efficiently. Plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pUC118, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pC194, etc.), yeast-derived (Eg, pSH19), and animal viruses such as bacteriophages, retroviruses and vaccinia viruses are preferred. Furthermore, in order to express the gene of interest, an appropriate expression promoter is connected upstream of the gene. The promoter to be used may be selected according to the host. For example, when the host is Escherichia coli, the T7 promoter, lac promoter, trp promoter, γPL promoter, etc. are used. When the host is a Bacillus genus, the SPO promoter is used, and when the host is yeast, the PHO is used. A promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like can be used. When the host is an animal cell, an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, and the like can be used.
[0087]
Transformation means introducing DNA into a living body so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal element or by chromosomal integration.
[0088]
Methods for transforming host cells using the above recombinant vectors include transformation methods generally used for each host cell, such as calcium treatment using calcium chloride, transfection by the calcium phosphate method, electroporation, or lipofection. (Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989, etc.).
[0089]
The transformed cells thus obtained are cultured in an appropriate selective medium and subjected to screening. The culture for this screening is preferably performed by culturing cells on a cover glass. For example, transformant cells can be obtained at a cell concentration of 3 × 10⁷ _/Suspend in a culture medium to make a mL, place an appropriate amount on a cover glass, and incubate at about 37 ° C. for about 24 to 48 hours.
[0090]
As a screening method, a test substance solution is added to cultured cells, and the amount of calcium inflow into the cells is measured.
[0091]
As a method for measuring intracellular calcium concentration, a known fluorescent calcium indicator which is a calcium chelator and whose fluorescence characteristics change depending on the amount of calcium binding, such as fura-2, fura-2-AM, indo-1, quin2, fluo -3, rhod-2, etc., among which fura-2-AM (1- (2- (5′-carboxyoxazol-2′-yl) -6-aminobenzofuran-5-oxy)- Fluorescence intensity method using 2- (2'-amino-5'-methylphenoxy) -ethane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid pentaacetoxymethyl ester, Wako Pure Chemical (Tokyo)) It is preferable to use (Karaki, experimental medicine, 7 (6), 626 (1989)).
[0092]
For example, 1-20 μg / ml fura-2-AM is loaded for 20-40 minutes and Tyrode's solution (135 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgSO_Four ^,2.2 mM CaCl₂ ^,After washing with 10 mM glucose, 20 mM HEPES ([4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine] ethanesulfonic acid) / NaOH (pH 7.4)), fluorescence at 340 nm and 380 nm as an indicator of intracellular calcium concentration Find the intensity ratio. For this, for example, a fluorescence measuring apparatus with a circulating constant temperature chamber (ARGUS-50, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu) can be used.
[0093]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to formulation examples and test examples (Examples and Comparative Examples).
[0094]
Hair restorer
Formulation Example 1 (external lotion):

The above ingredients were stirred and dissolved uniformly to prepare an external lotion.
[0095]
Formulation Example 2 (External cream):
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
Adenosine 1.0
Medium chain triglyceride 18.0
Isopropyl myristate 1.0
2-hexyl decanol 4.0
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 5.0
Sorbitan monostearate 3.0
Glycerol monostearate 6.0
Cetanol 1.0
Stearyl alcohol 2.0
Propylene glycol 15.0
Methyl p-aminobenzoate 0.05
Propyl p-aminobenzoate 0.05
100g of purified water
About the said component, the cream for external use was prepared according to the normal manufacturing method of an emulsifier.
[0096]
Formulation Example 3 (External Gel):
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
N6- (L-2-phenylisopropyl) adenosine 0.5
Polyethylene glycol (10) monostearate 1.0
1,3-butylene glycol 7.0
Carboxyvinyl polymer 1.5
Diisopropanolamine appropriate amount
Ethanol 40.0
100g of purified water
About the said component, the gel for external use was prepared according to the normal manufacturing method of the gel.
[0097]
Formulation Example 4 (aerosol):
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
Pinacidil 0.1
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 1.0
Glycerin 3.0
Ethanol 20.0
Purified water 15.0
Isopentane 10.0
Liquefied petroleum gas 3.0
Dimethyl ether 48.0
About the said component, the aerosol agent for external use was prepared according to the normal manufacturing method of the aerosol agent.
[0098]
Test example:
The hair growth test of the hair growth agents of Examples 1 to 15 (Tables 1 and 2) was performed using C3H / HeNCrJ mice. The test method consists of 10 mice per group, divided into Examples 1 to 15, Comparative Examples 1 and 2, and 17 groups of the non-administration group, and the back of the mouse was shaved with a clipper and a razor. Was applied once a day at 100 μL per 8 cm 2 of the shaved back. The hair growth agents of Examples 1 to 15 and Comparative Examples 1 and 2 were prepared by stirring the components shown in Tables 1 and 2 until the whole was in a uniform state, as in Formulation Example 1. Tables 3 and 4 show the hair regeneration area (after 15 days) with respect to the application area of the hair growth agent of Examples 1 to 15 and the hair growth agent of Comparative Examples 1 and 2 and the non-administration group.
[0099]
[Table 1]

[0100]
[Table 2]

[0101]
[Table 3]

[0102]
[Table 4]

As is clear from the results in Tables 1 to 4, the hair restorer of the present invention has a high effect on hair regeneration.
[0103]
Formulation Example 5 (external lotion):
(Ingredient) Compounding amount (W / V%)
α, β-Methyleneadenosine-5'-triphosphoric acid 0.5
Propylene glycol 10.0
Ethanol 50.0
100 ml of purified water
The above ingredients were stirred and dissolved uniformly to prepare an external lotion.
[0104]
Formulation Example 6 (external cream):
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
2-Methylthioadenosine-5'-triphosphoric acid 1.0
Medium chain fatty acid triglycerides 20.0
Isopropyl myristate 1.0
2-hexyl decanol 4.0
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 5.0
Sorbitan monostearate 3.0
Glycerol monostearate 6.0
Cetanol 1.0
Stearyl alcohol 2.0
Propylene glycol 15.0
Methyl p-aminobenzoate 0.05
Propyl p-aminobenzoate 0.05
100g of purified water
About the said component, the cream for external use was prepared according to the normal manufacturing method of an emulsifier.
[0105]
Formulation Example 7 (external gel):
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
2'-benzoyladenosine-5'-diphosphate 5.0
Polyethylene glycol (10) monostearate 1.0
1,3-butylene glycol 7.0
Carboxyvinyl polymer 1.5
Diisopropanolamine appropriate amount
Ethanol 40.0
100g of purified water
About the said component, the gel for external use was prepared according to the normal manufacturing method of the gel.
[0106]
Formulation Example 8 (aerosol):
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
3'-benzoyladenosine-5'-diphosphate 0.1
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 1.0
Glycerin 3.0
Ethanol 20.0
Purified water 15.0
Isopentane 10.0
Liquefied petroleum gas 3.0
Dimethyl ether 48.0
About the said component, the aerosol agent for external use was prepared according to the normal manufacturing method of the aerosol agent.
[0107]
Formulation Example 9 (external lotion):
(Ingredient) Compounding amount (W / V%)
Methyl adenosine-5'-triphosphate 0.01
Propylene glycol 10.0
Ethanol 50.0
100 ml of purified water
[0108]
Test example:
The hair growth test of the hair restorer of Examples 16 to 22 (Table 5) was performed using C3H / HeNCrJ mice. The test method consists of 10 mice per group, divided into 9 groups, the hair growth agent administration group of Examples 16 to 22, the hair growth agent administration group of Comparative Example 3, and the non-administration group, and the back of the mouse is shaved with a clipper and a razor. Each sample was applied once per day by 100 μL per 8 cm 2 of the shaved back. The hair restoring agents of Examples 16 to 22 and Comparative Example 3 were prepared by stirring the components shown in Table 5 until the whole was in a uniform state, as in Preparation Example 5. Table 6 shows the hair regeneration area (after 15 days) with respect to the application area of the hair growth agent of Examples 16 to 22 and the hair growth agent of Comparative Example 3 and the non-administration group.
[0109]
[Table 5]

[0110]
[Table 6]

As is apparent from the results in Tables 5 and 6, the hair restorer of the present invention has a high effect on hair regeneration. Moreover, in the compound group of this invention, compared with adenosine-5'-diphosphoric acid (Example 21) or adenosine-5'-triphosphoric acid (Example 22), those derivatives have a higher hair-growth effect. It became clear to have.
[0111]
Formulation Example 10 (external cream)
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
Cromakalim 1.0
Medium chain triglyceride 18.0
Isopropyl myristate 1.0
2-hexyl decanol 4.0
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 5.0
Sorbitan monostearate 3.0
Glycerol monostearate 6.0
Cetanol 1.0
Stearyl alcohol 2.0
Propylene glycol 15.0
Methyl p-aminobenzoate 0.05
Propyl p-aminobenzoate 0.05
100g of purified water
About the said component, the cream for external use was prepared according to the manufacturing method of an emulsifier.
[0112]
Formulation Example 11 (Gel for external use)
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
MgATP 1.0
Polyethylene glycol (10) monostearate 1.0
1,3-butylene glycol 7.0
Carboxyvinyl polymer 1.5
Diisopropanolamine appropriate amount
Ethanol 40.0
100g of purified water
About the said component, the gel for external use was prepared according to the manufacturing method of a gel.
[0113]
Formulation Example 12 (aerosol)
(Ingredient) Compounding amount (W / W%)
Oleoyl-CoA 0.5
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 1.0
Glycerin 3.0
Ethanol 20.0
Purified water 15.0
Isopentane 10.0
Liquefied petroleum gas 3.0
Dimethyl ether 48.0
About the said component, the aerosol agent for external use was prepared according to the manufacturing method of the aerosol agent.
[0114]
Example 23 (external lotion)
(Ingredient) Compounding amount (W / V%)
Nicorandil 1.0
Propylene glycol 20.0
Ethanol 50.0
100 ml of purified water
The above ingredients were stirred and dissolved uniformly to prepare an external lotion.
[0115]
Examples 24-28
As shown in Table 7, nicorandil in Example 23 was replaced with pinacidil (Example 24), cromakalim (Example 25), MnATP (Example 26), megrotinide (Example 27), L-arginine (Example 28). A lotion preparation for external use was prepared in the same manner as in Example 23, except that
[0116]
Comparative Example 4
As shown in Table 7, an external lotion was prepared in the same manner as in Example 23 except that nicorandil in Example 23 was omitted.
[0117]
[Table 7]

[0118]
Test example
A hair growth test using the external lotion preparations of Examples 23 to 28 and Comparative Example 4 was performed using C3H / HeNCrJ mice as follows.
The test method consists of 10 mice per group, divided into 8 groups of sample administration group and non-administration group, the back of the mouse was shaved with clippers and razors, and each sample was shaved once a day. 100 μL was applied per 8 cm 2. Table 8 shows the hair regeneration area (after 15 days) relative to the application area of the sample administration group of Examples 23 to 28, the sample administration group of Comparative Example 4 and the non-administration group.
[0119]
[Table 8]

From the above test examples, it was confirmed that the hair restorer of the present invention has a high effect on hair regeneration.
[0120]
Screening method
<Transformation of target gene into cells>
COS-1 cells (3 × 10^Five5% CO in Dulbecco's modified MEM medium containing 10% fetal bovine serum.₂Culturing was performed at 37 ° C. in an atmosphere. Separately, human adenosine receptor cDNA (GenBank Accession No. X68485, reference: CAKollias-Baker et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 281 (2), 761-768 (1997)) and rat sulfonylurea receptor cDNA ( GenBank Accession No. L40624, reference: Y. Tokuyama et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 220, 532-538 (1996)) and pcDNA3.1 vector (Invitrogen, California, USA) and pcDNA3.1 / Hygro vector ( Introgen, California, USA) were respectively introduced according to a conventional method to obtain pcDNA3.1hAD and pcDNA3.1 / Hygro raSUR.
[0121]
pcDNA3.1hAD is obtained by inserting a HindIII / XbaI fragment (1.4 kb) of human adenosine receptor cDNA into the EcoRI / NotI site of pcDNA3.1 vector.
[0122]
pcDNA3.1 / Hygro raSUR is obtained by inserting a DNA fragment of nucleotide numbers 208-5086 of rat sulfonylurea receptor cDNA into the HindIII / XbaI site of pcDNA3.1 / Hygro vector.
[0123]
The pcDNA3.1hAD (1 μg) and pcDNA3.1 / Hygro raSUR (1 μg) thus obtained were added to Lipofectamine and Opti-MEMI reagent, Nobuya Inagaki et al., Science, 270 in COS-1 cells previously cultured. , 1166-1170 (1995).
[0124]
Thereafter, the cells were further cultured, and when they reached confluence, they were washed with phosphate buffered saline and treated with 0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA solution.
[0125]
Highly expressing cell lines were obtained using neomycin and hygromycin resistance as an index.
[0126]
Cells were cultured on a cover glass for screening. Moreover, the fluorescence intensity method using FURA-2 was used for the measurement of intracellular calcium concentration. Specifically, 5 μg / ml fura-2 am was loaded for 30 minutes and washed with Tyrode solution, and then the ratio of fluorescence intensity at 340 nm and 380 nm was determined as an index of intracellular calcium concentration.
[0127]
Test example
The following tests were performed using the cells obtained by the above operation.
[0128]
Test example 1
The effectiveness of the screening method of the present invention was confirmed using nicorandil known as a sulfonylurea receptor stimulant. As a result, as shown in FIG. 2, nicorandil 25 and 100 μM increase the intracellular calcium concentration, but this action can be suppressed by pretreatment with 1 μM 8-sulfophenyltheophylline, an adenosine receptor inhibitor. confirmed.
[0129]
Test example 2
When adenosine 1.0 and 10.0 μM were added as adenosine receptor stimulants, the intracellular calcium concentration increased in a concentration-dependent manner as shown in FIG. This effect was suppressed by pretreatment with 1 μM 8-sulfophenyltheophylline, which is an adenosine receptor inhibitor.
[0130]
From the results of Test Examples 1 and 2, it was confirmed that in the transduced cells of the present invention, the sulfonylurea receptor and the adenosine receptor were expressed and functioning.
[0131]
In the calcium-free medium, the effects of nicorandil and adenosine were not observed. From this, it is clear that the increase in intracellular calcium concentration is due to the influx of extracellular calcium. The transformed cells obtained in the present invention have a good proliferation ability and can be easily used for screening hair growth agents.
[0132]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a hair-growth agent having a higher hair-growth effect than conventional hair-growth agents.
[0133]
In particular, the hair-restoring agent of the present invention exhibits a hair-restoring effect by, for example, releasing ATP, ATP derivatives, adenosine, adenosine derivatives and the like from cells to stimulate ATP receptor and / or adenosine receptor. Based on the mechanism of action, it has a remarkable hair-growth effect.
[0134]
In addition, in the hair restorer which uses the compound which has an ATP receptor stimulating action as an active ingredient, when an adenosine-5'- diphosphate derivative or an adenosine-5'-triphosphate derivative is used as the said compound, especially high hair restorer effect is obtained. Obtainable.
[0135]
Further, according to the present invention, the hair-growth action having a novel action mechanism of exerting a hair-growth effect by purine receptor stimulation action, that is, ATP receptor and / or adenosine receptor stimulation action via stimulation action on ABC transporter. Substance screening can be easily performed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram showing the mechanism of action of a hair growth agent of the present invention and substances screened by the method of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the results of an example of the screening method of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the results of an example of the screening method of the present invention.

Claims (3)

N6-cyclohexyladenosine, 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine, 5′-N-ethylcarboxamide adenosine, N6-cyclohexyl-2′-O-methyladenosine, 2- [P- (2-carboxyethyl) phenylethylamino] -5'-N-ethylcarboxamide adenosine, 2-phenylaminoadenosine, 2-chloro-N6- (3-iodobenzyl) adenosine-5'-N-methyluronamide, N6-methyladenosine-5'-monophosphate, 8- Butylaminoadenosine, erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine, 3′-benzoyladenosine-5′-diphosphate, α, β-methyleneadenosine-5′-triphosphate, 2-methylthioadenosine-5 '-Triphosphoric acid or 2'-benzoyladenosine-5'- A hair restorer containing one or more triphosphates as an active ingredient. Hair-growing agent according to claim 1, wherein the external preparation. The hair restorer according to claim 1 or 2, wherein the content of the active ingredient is 0.01 to 5% by weight of the whole preparation.

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