JP4468304B2

JP4468304B2 - Screening method

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Publication number: JP4468304B2
Application number: JP2005517803A
Authority: JP
Inventors: 弾隆之飛; 矢智子関; 井徹澤; 木尚志生; 橋英機高; 笹美智子小; 田耕吉原; 井徹新
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-02-09
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2025-02-09
Also published as: US20070054850A1; AU2005210369A1; AU2005210369B2; US7638490B2; US20100168014A1; WO2005075641A1; CA2555469A1; EP1721971A1; EP1721971A4; KR20070004699A; KR100878959B1; JPWO2005075641A1

Description

本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、および該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などに関する。 The present invention relates to a polypeptide having useful feeding enhancing action, weight gain action and obesity action, a disease therapeutic agent containing the polypeptide, a compound, substance or substance that activates or suppresses the receptor of the polypeptide The present invention relates to a screening method for the salt, the kit for screening, an antifeedant, a therapeutic agent for obesity, a therapeutic agent for diabetes, and the like comprising a substance that inhibits the expression of the polypeptide.

摂食は動物が生きていくために欠かせない行動である。肥満は飽食時代の現代社会にあって、摂食量とエネルギー消費の調節・バランスが崩れた結果として生じたものであると考えられている。肥満は生活習慣病を始めとする各種疾病の危険因子でもあるため、社会的な関心が高まってきている。食事療法や運動療法など、摂食量とエネルギー消費のバランスを改善する基本的な治療法はあるものの、現状では肥満患者・その予備群は増加している。最近では末梢組織での栄養吸収を抑制する薬剤や中枢性に作用し摂食量を減少させる薬剤も開発されているが、肥満治療剤として摂食量を抑制する有効かつ安全な薬剤の開発は望まれている。 Feeding is an indispensable action for animals to live. Obesity is thought to have arisen as a result of the loss of regulation and balance between food intake and energy consumption in modern society in the age of satiation. Since obesity is also a risk factor for various diseases including lifestyle-related diseases, social interest is increasing. Although there are basic therapies that improve the balance between food intake and energy consumption, such as diet therapy and exercise therapy, obesity patients and their spare groups are increasing at present. Recently, drugs that suppress nutrient absorption in peripheral tissues and drugs that act centrally and reduce food intake have been developed, but the development of effective and safe drugs that suppress food intake is desirable as a treatment for obesity. ing.

摂食行動は脳中枢神経からの指令と、末梢組織からのフィードバックによって中枢神経がさらに指令を送る循環で制御されていることがわかりつつあり、その主体である脳での摂食制御機構に焦点を当てた研究が盛んに行なわれている。脳の特定領域を破壊した動物の研究や、神経ペプチドや神経伝達物質を用いた機能解析により、視床下部領域が摂食行動に重要な役割を果たしていることが分かってきている。また、視床下部には多くの神経伝達物質や神経ペプチドおよびそれらに対する受容体（レセプター）が発現しており、これらと摂食行動との関連が示されている。例えば摂食の亢進には視床下部弓状核に存在するニューロペプチドＹやアグーチ関連ペプチド等が関わること、さらに摂食の抑制には同所に存在するメラノコルチンや視床下部室傍核から放出されるコルチコトロピン放出ホルモンやサイロトロピン放出ホルモンが関わっていることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、摂食を制御する複雑な神経ネットワークには未だ不明な部分が多く、未だなお新規な神経伝達因子やその局在についての新たな知見が得られつつある状況である。 It is becoming clear that feeding behavior is controlled by a command from the brain central nervous system and a circulation in which the central nervous system sends further commands by feedback from peripheral tissues, focusing on the feeding control mechanism in the brain that is the subject There are a lot of researches on this topic. Studies on animals that have destroyed specific regions of the brain and functional analysis using neuropeptides and neurotransmitters have shown that the hypothalamus region plays an important role in feeding behavior. In addition, many neurotransmitters and neuropeptides and receptors for them are expressed in the hypothalamus, and their relation to feeding behavior has been shown. For example, enhanced feeding involves neuropeptide Y and agouti-related peptides that are present in the hypothalamic arcuate nucleus, and further suppression of feeding is released from the local melanocortin and the hypothalamic paraventricular nucleus It has been reported that corticotropin releasing hormone and thyrotropin releasing hormone are involved (Non-patent Document 1). However, there are still many unknown parts in the complex neural network that controls feeding, and new knowledge about new neurotransmitters and their localization is still being obtained.

摂食行動の制御に関わる神経伝達物質や神経ペプチドなどの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を７回貫通する構造を有し、細胞内で３量体Ｇタンパク質と共役するレセプターは特にＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と分類されている。ＧＰＣＲは特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器・器官での機能発現に重要な役割を担っている。それ故にＧＰＣＲを賦活化するアゴニストや抑制するアンタゴニストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。ＧＰＣＲに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはオーファンＧＰＣＲと呼ばれている。オーファンＧＰＣＲは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドや物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。 Physiologically active substances such as neurotransmitters and neuropeptides involved in the control of feeding behavior exert their functions via specific receptors present on the cell membrane. Among these receptors, receptors having a structure of penetrating the cell membrane seven times and coupling with the trimeric G protein in the cell are classified as G protein-coupled receptors (GPCRs). GPCR plays an important role in function expression in various organs / organs by transmitting a signal into a cell when a specific ligand is bound and activating or suppressing the cell. Therefore, substances called agonists or antagonists that activate GPCRs are used as pharmaceuticals. Many of the receptors classified into GPCRs whose specific ligands have not yet been identified are known, and they are called orphan GPCRs. Orphan GPCR has the potential as a target for new therapeutic agents, and research on substances that activate or suppress ligand identification and functions in vivo is underway. It is extremely important to elucidate the function of a receptor and its ligand by administering the ligand or substance thus identified to a living body in order to provide development of a pharmaceutical product.

近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質・ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、ＧＰＣＲの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン・リラキシン（Ｉｎｓｕｌｉｎ・Ｒｅｌａｘｉｎ）ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前から知られていた。それ以外の作用としては、例えばリラキシン−２のラット静脈内投与による摂水量の亢進という報告はなされているが（非特許文献２）、リラキシンの摂食行動との関連については知られていない。リラキシンをコードするＤＮＡの塩基配列を元に遺伝子配列データベースから新たに同定されたＤＮＡのコードするタンパク質が、リラキシン−３（Ｒｅｌａｘｉｎ−３）／ＩＮＳＬ７と名づけられたポリペプチドである（特許文献１）。見出されたリラキシン−３は、免疫細胞系であるＴＨＰ−１の細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の上昇をともなって細胞を賦活化することが報告された（特許文献２、非特許文献３）。その後リラキシン−３は、リラキシン−２と共に、ＧＰＣＲであるＬＧＲ７に結合するリガンドの一つであることが示された（非特許文献４）。ＬＧＲ７は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠・出産に関わることが示唆されているが、摂食との関連については良く分かっていない。 With recent enhancement of gene sequence information, it is possible to derive homology and law based on known protein / peptide sequences, predict unknown peptides and proteins, and identify them as new GPCR ligands. It became. Relaxin belonging to the Insulin / Relaxin family is a secretory peptide produced from the corpus luteum and placenta, and has been known for some time to have an effect on maintenance of pregnancy and childbirth. As other actions, for example, although it has been reported that the amount of water intake is increased by intravenous administration of relaxin-2 in rats (Non-patent Document 2), there is no known relationship with relaxin feeding behavior. A protein encoded by DNA newly identified from a gene sequence database based on the nucleotide sequence of DNA encoding relaxin is a polypeptide named relaxin-3 / INSL7 (Patent Document 1). . It was reported that relaxin-3 found to activate cells with an increase in intracellular cyclic AMP (cAMP) of THP-1 which is an immune cell system (Patent Document 2, Non-Patent Document 3). ). Subsequently, relaxin-3 was shown to be one of the ligands that bind to LGR7, which is a GPCR, together with relaxin-2 (Non-patent Document 4). LGR7 is expressed in the brain and peripheral tissues, and it has been suggested so far that it is involved in the development of reproductive organs, pregnancy and childbirth, but the relationship with feeding is not well understood.

最近、生体内のリガンドが未同定のＧＰＣＲであった、ＳＡＬＰＲ（ＧＰＣＲ１３５）と名づけられているレセプターや、ＧＰＲ１００（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２）と呼ばれるレセプターのリガンドがリラキシン−３であることが報告された（非特許文献５、６、特許文献３）。また、特許文献４〜７にもこれらのレセプターに関連する記載がある。ＳＡＬＰＲは脳に局在することが知られており（非特許文献７）、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された（特許文献３、非特許文献６）。一方、ＧＰＲ１００は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている（非特許文献８、９）が、その機能については不明なままである。
一方、リラキシン−３は脳内の橋と呼ばれる領域に存在することが報告されており（非特許文献６）、リラキシン−３が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮している可能性は考えられていたが、これまでにリラキシン−３が摂食を調節するか否かについても、リラキシン−３が体重調節に関与するか否かについても報告されていなかった。また、リラキシン−３が肥満と関連するかについても知られていなかった。Recently, it was reported that a receptor named SALPR (GPCR135) or a receptor called GPR100 (hGPCR11, GPCR142) was relaxin-3, whose ligand in vivo was an unidentified GPCR ( Non-Patent Documents 5 and 6, and Patent Document 3). Patent Documents 4 to 7 also have descriptions related to these receptors. It is known that SALPR is localized in the brain (Non-Patent Document 7), and in particular, it has been reported that it exists in the paraventricular nucleus and the supraoptic nucleus of the hypothalamus (Patent Document 3, Non-Patent Document 6). . On the other hand, GPR100 has been reported to be a receptor expressed systemically (Non-Patent Documents 8 and 9), but its function remains unknown.
On the other hand, relaxin-3 has been reported to exist in a region called a bridge in the brain (Non-patent Document 6), and the possibility that relaxin-3 exerts some function centrally as a peptide in the brain is not possible. It has been considered, but it has not been reported so far whether relaxin-3 regulates feeding or whether relaxin-3 is involved in body weight regulation. It was also unknown whether relaxin-3 is associated with obesity.

国際公開第０１／０６８８６２号パンフレットInternational Publication No. 01/068862 Pamphlet 特開２００２−３４５４６８号明細書JP 2002-345468 A 国際公開第２００４／０８２５９８号パンフレットInternational Publication No. 2004/082598 Pamphlet 国際公開第００／２４８９１号パンフレットInternational Publication No. 00/24891 Pamphlet 国際公開第０１／４８１８９号パンフレットInternational Publication No. 01/48189 Pamphlet 国際公開第０２／３１１１１号パンフレットInternational Publication No. 02/31111 Pamphlet 国際公開第０２／６１０８７号パンフレットInternational Publication No. 02/61087 Pamphlet Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎら、Ｃｅｌｌ，１０４，ｐ．５４１−５４３，２００１Spiegelman et al., Cell, 104, p. 541-543, 2001 Ｓｉｎｎａｙａｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，ｐ．５０８２−５０８６，１９９９Sinnayah et al., Endocrinology, 140, p. 5082-5086, 1999 Ｂａｔｈｇａｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，ｐ．１１４８−１１５７，２００２Bathgate et al., J. MoI. Biol. Chem. , 277, p. 1148-1157, 2002 Ｓｕｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，ｐ．７８５５−７８６２，２００３Sudo et al. Biol. Chem. , 278, p. 7855-7862, 2003 Ｔａｋｅｄａら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ，５２０，ｐ．９７−１０１，２００２Takeda et al., FEBS Letter, 520, p. 97-101, 2002 Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，ｐ．５０７５４−５０７６４，２００３Liu et al. Biol. Chem. , 278, p. 50754-50764, 2003 Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ，２４８，ｐ．１８３−１８９，２０００Matsumoto et al., Gene, 248, p. 183-189, 2000 Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，ｐ．５０７６５−５０７７０，２００３Liu et al. Biol. Chem. , 278, p. 50765-50770, 2003 Ｂｏｅｌｓら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．，１４０，ｐ．９３２−９３８，２００３Boels et al., Br. J. et al. Pharmacol. , 140, p. 932-938, 2003

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リラキシン−３をラット脳室内に投与し、投与後の摂食量を観察することにより、リラキシン−３が摂食亢進作用を有することを見出した。また、ラットにリラキシン−３を単回投与した後に、当該ラットから採取した血液を測定した結果、体脂肪増加の指標として知られるレプチン濃度が血液中で上昇していることを見出した。さらに、ラット脳室内へリラキシン−３の持続投与を行なったところ、リラキシン−３投与群では対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べて有意な摂餌量の増加と体重増加作用が認められた。リラキシン−３の持続投与によって両群において運動量に差はなかった。これらのことから、リラキシン−３は摂食亢進作用と共に体重増加作用も有することが初めて明らかとなった。さらに、リラキシン−３を投与し体重が増加したラットにおいては脂肪量の増加および、体脂肪含量と相関する血中レプチン濃度が上昇していた。また、糖尿病と関連するインスリン濃度も上昇していた。以上より、リラキシン−３は摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を有するポリペプチドであると考えられる。本発明はこれらの知見に基づいて達成されたものである。 As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventor administered relaxin-3 into the rat ventricle and observed the amount of food intake after administration. Found to have. Further, after a single administration of relaxin-3 to the rat, the blood collected from the rat was measured, and as a result, it was found that the leptin concentration known as an index for increasing body fat increased in the blood. Furthermore, when relaxin-3 was continuously administered into the rat ventricle, the relaxin-3 administration group showed a significant increase in food intake and weight gain compared to the control vehicle administration group. There was no difference in the amount of exercise in both groups by continuous administration of relaxin-3. From these facts, it was revealed for the first time that relaxin-3 has an effect of increasing body weight as well as an effect of increasing feeding. Furthermore, in rats that received relaxin-3 and gained weight, the amount of fat increased and the blood leptin concentration correlated with the body fat content increased. Insulin levels associated with diabetes have also increased. From the above, relaxin-3 is considered to be a polypeptide having an effect of enhancing feeding, an effect of increasing body weight, and an action of obesity. The present invention has been achieved based on these findings.

すなわち、本発明は、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる摂食亢進剤。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加剤。
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる脂肪量増加剤。
（４）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（５）次の工程；
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（６）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（５）に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（７）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（４）〜（６）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（８）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（７）に記載のスクリーニング方法。
（９）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（１０）次の工程；
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（１１）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（１０）に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（１２）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。
（１３）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（１２）に記載のスクリーニングキット。
（１４）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。
（１５）疾患が拒食症または悪疫質である前記（１４）に記載の治療剤。
（１６）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１７）次の工程；
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１８）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（１７）に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１９）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（１６）〜（１８）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（２０）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（１９）に記載のスクリーニング方法。
（２１）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（２２）次の工程；
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（２３）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（２２）に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（２４）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（２１）〜（２３）のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。
（２５）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（２４）に記載のスクリーニングキット。
（２６）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２７）次の工程；
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２８）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（２７）に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２９）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（２６）〜（２８）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（３０）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（２９）に記載のスクリーニング方法。
（３１）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（３２）次の工程；
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体、リラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（３３）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（３２）に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。
（３４）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。
（３５）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（３４）に記載のスクリーニングキット。
（３６）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。
（３７）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（７）または（８）に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（３６）に記載の剤。
（３８）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。
（３９）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（１９）または（２０）に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（３８）に記載の剤。
（４０）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。
（４１）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（２９）または（３０）に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（４０）に記載の剤。
（４２）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。
（４３）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（１９）、（２０）、（２９）または（３０）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（４２）に記載の剤。
（４４）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。
（４５）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（１９）、（２０）、（２９）または（３０）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（４４）に記載の剤。
（４６）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（３６）〜（４５）のいずれか一項に記載の剤。
（４７）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（４８）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（４）〜（８）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（４７）に記載の方法。
（４９）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（５０）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（１６）〜（２０）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（４９）に記載の方法。
（５１）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（５２）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（２６）〜（３０）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（５１）に記載の方法。
などに関する。That is, the present invention
(1) A homology of 70% or more with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its functionally equivalent modified polypeptide, or the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A food intake enhancer comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence having a salt thereof, or a salt thereof.
(2) A homology of 70% or more with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its functionally equivalent modified polypeptide or the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A weight gain agent comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence having a salt thereof, or a salt thereof.
(3) 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its functionally equivalent modified polypeptide, or the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An agent for increasing fat mass, comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence having a salt thereof, or a salt thereof.
(4) Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A method for screening a compound or a salt thereof that enhances feeding, comprising:
(5) Next step;
A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent modified polypeptide thereof, or an amino acid having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence, or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening method for a compound or a salt thereof that enhances or suppresses feeding.
(6) Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The method for screening a compound or a salt thereof according to (5), wherein the compound enhances or inhibits feeding.
(7) The screening method according to any one of (4) to (6), wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.
(8) The screening method according to (7), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(9) Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A screening kit for a compound or a salt thereof that enhances feeding.
(10) Next step;
A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent modified polypeptide thereof, or an amino acid having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence, or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening kit for a compound or a salt thereof that enhances or suppresses feeding.
(11) Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A screening kit for a compound or a salt thereof according to (10), which comprises enhancing or suppressing feeding.
(12) The screening kit according to any one of (9) to (11), wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.
(13) The screening kit according to (12), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(14) A homology of 70% or more with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its functionally equivalent modified polypeptide or the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A therapeutic agent for a disease requiring weight gain, comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence having the above or a salt thereof.
(15) The therapeutic agent according to the above (14), wherein the disease is anorexia nervosa or an epidemic.
(16) Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A screening method for a compound having a weight-increasing action or a salt thereof, comprising:
(17) Next step;
A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent modified polypeptide thereof, or an amino acid having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence, or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening method for a compound or a salt thereof that increases or decreases body weight, comprising:
(18) Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The screening method of the compound or its salt which increases or decreases the body weight as described in said (17) characterized by including these.
(19) The screening method according to any one of (16) to (18), wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.
(20) The screening method according to (19), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(21) Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A screening kit for a compound having a weight-increasing action or a salt thereof, comprising:
(22) Next step;
A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent modified polypeptide thereof, or an amino acid having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence, or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening kit for a compound or a salt thereof that increases or decreases body weight, comprising:
(23) Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The screening kit for a compound or a salt thereof for increasing or decreasing body weight according to the above (22), comprising:
(24) The screening kit according to any one of (21) to (23), wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.
(25) The screening kit according to (24), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(26) Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A method for screening a compound or a salt thereof for regulating obesity, comprising:
(27) Next step;
A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent modified polypeptide thereof, or an amino acid having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence, or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A method for screening a compound or a salt thereof for regulating obesity, comprising:
(28) Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The method for screening a compound or a salt thereof for regulating obesity according to the above (27), comprising:
(29) The screening method according to any one of (26) to (28), wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.
(30) The screening method according to (29), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(31) Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A screening kit for a compound for regulating obesity or a salt thereof, comprising:
(32) Next step;
A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent modified polypeptide thereof, or an amino acid having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence, or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening kit for a compound for regulating obesity or a salt thereof, comprising:
(33) Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The screening kit for a compound relating to obesity regulation or a salt thereof according to (32), which comprises:
(34) The screening kit according to any one of (31) to (33), wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.
(35) The screening kit according to (34), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(36) An antifeedant containing a compound having a SALPR inhibitory action.
(37) The agent according to (36) above, wherein the compound having a SALPR inhibitory action is a compound obtained by the screening method according to (7) or (8).
(38) A weight loss agent comprising a compound having a SALPR inhibitory action.
(39) The agent according to (38), wherein the compound having a SALPR inhibitory action is a compound obtained by the screening method according to (19) or (20).
(40) A fat amount reducing agent comprising a compound having a SALPR inhibitory action.
(41) The agent according to (40) above, wherein the compound having a SALPR inhibitory action is a compound obtained by the screening method according to (29) or (30).
(42) A therapeutic agent for obesity comprising a compound having a SALPR inhibitory action.
(43) The compound having a SALPR inhibitory action is a compound obtained by the screening method according to any one of (19), (20), (29) or (30), 42).
(44) A therapeutic agent for diabetes containing a compound having a SALPR inhibitory action.
(45) The compound having a SALPR inhibitory action is a compound obtained by the screening method according to any one of (19), (20), (29) or (30), 44).
(46) The agent according to any one of (36) to (45), wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(47) A compound that enhances or suppresses feeding, comprising a step of administering a compound that acts on a relaxin-3 receptor to a human or a non-human organism and measuring the amount of food intake after the administration, or a compound thereof Salt screening method.
(48) The method according to (47), wherein the compound that acts on relaxin-3 receptor is a compound obtained by the method according to any one of (4) to (8).
(49) A compound for increasing or decreasing body weight or a salt thereof, comprising a step of administering a compound acting on relaxin-3 receptor to a human or non-human organism and measuring the body weight after the administration. Screening method.
(50) The method according to (49) above, wherein the compound that acts on relaxin-3 receptor is a compound obtained by the method according to any one of (16) to (20).
(51) A compound or a salt thereof for regulating obesity, comprising a step of administering a compound acting on relaxin-3 receptor to a human or a non-human organism and measuring an indicator of obesity after administration. Screening method.
(52) The method according to (51) above, wherein the compound that acts on relaxin-3 receptor is a compound obtained by the method according to any one of (26) to (30).
And so on.

ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨの構築図を示す。The construction | assembly figure of pBabeCL (SALPR) IH is shown. ＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の構築図を示す。The construction diagram of CRE4VIP / pBluescriptIISK (+) is shown. ｐＢａｂｅＣＬＸの構築図を示す。The construction | assembly figure of pBabeCLX is shown. ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮの構築図を示す。The construction | assembly figure of pBabeCLcre4vPdNN is shown. ＳＡＬＰＲを発現させたＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリン添加によって上昇した転写活性のリラキシン−３による特異的な用量依存的抑制を示す。黒四角はリラキシン−３を添加した場合を示す。白四角はインスリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）を示す。縦軸はフォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を１００、フォルスコリンを添加していない細胞上清の活性を０として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値（Ｎ＝３）と標準偏差を示す。FIG. 5 shows specific dose-dependent suppression by relaxin-3 of transcriptional activity increased by addition of forskolin in SE302 cells expressing SALPR. A black square shows the case where relaxin-3 is added. White squares show the case where insulin is added. The numbers on the horizontal axis indicate the final concentration (nmol / L) of each ligand added. The vertical axis shows the ratio of each activity calculated with the activity of alkaline phosphatase in the cell supernatant added with 1 μmol / L of forskolin as 100 and the activity of the cell supernatant without added forskolin as 0. Each point shows an average value (N = 3) and a standard deviation. ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を用いたリラキシン−３拮抗化合物の評価（スクリーニング）を示す図である。Ａは、ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を使用し、Ｂは、ＳＥ３０２細胞を使用した。図中、ＦＫ（−）はフォルスコリン無処置群、ＦＫ（＋）は３μＭフォルスコリン処置群、ＦＫ（＋）&ＲＬＸ−３はフォルスコリンと３ｎＭリラキシン−３の処置群、ＦＫ（＋）&ＲＬＸ−３&化合物１はフォルスコリンとリラキシン−３と化合物１を共存させた処置群を示す。It is a figure which shows the evaluation (screening) of a relaxin-3 antagonistic compound using SALPR-SE302 cell. A used SALPR-SE302 cells and B used SE302 cells. In the figure, FK (−) is forskolin-untreated group, FK (+) is 3 μM forskolin-treated group, FK (+) & RLX-3 is forskolin and 3nM relaxin-3-treated group, FK (+) & RLX− 3 & Compound 1 represents a treatment group in which forskolin, relaxin-3 and Compound 1 coexist. 正常ラット脳室内へのリラキシン−３の単回投与による摂餌量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量（ｇ）の平均値と標準誤差を示す。The effect | action on the food intake by the single administration of relaxin-3 in a normal rat ventricle is shown. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. A vertical axis | shaft shows the average value and standard error of the food intake (g) per animal of each group. 正常ラット脳室内へのリラキシン−３の単回投与による血中レプチン濃度への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の血中のレプチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）の平均値と標準偏差を示す。The effect | action on the leptin level in blood by the single administration of relaxin-3 to a normal rat ventricle is shown. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. A vertical axis | shaft shows the average value and standard deviation of the leptin density | concentration (ng / mL) in the blood of each group. 正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン−３による体重増加量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。The effect | action on the weight gain by the relaxin-3 continuously administered to the ventricle of a normal rat is shown. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. A vertical axis | shaft shows the average value and standard deviation of the body weight gain (g) per animal of each group. 正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン−３による摂餌量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。The effect | action on the food intake by the relaxin-3 continuously administered in the ventricle of a normal rat is shown. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. A vertical axis | shaft shows the average value and standard deviation of the food intake (g) per animal of each group. 正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン−３による精巣周囲脂肪重量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの脂肪重量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。The effect | action on the testicular fat weight by the relaxin-3 continuously administered in the ventricle of a normal rat is shown. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. The vertical axis shows the mean value and standard deviation of fat weight (g) per animal in each group. 正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン−３による血中ホルモンの変動を示す。図１０Ａは血中レプチン濃度への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中レプチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）の平均値と標準偏差を示す。図１０Ｂは血中インスリン濃度への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）の平均値と標準偏差を示す。The fluctuation | variation of the blood hormone by the relaxin-3 continuously administered in the ventricle of a normal rat is shown. FIG. 10A shows the effect on blood leptin concentration. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. The vertical axis shows the mean value and standard deviation of the blood leptin concentration (ng / ml) per animal in each group. FIG. 10B shows the effect on blood insulin concentration. A white square shows a vehicle administration group, and a black square shows a relaxin-3 administration group. The vertical axis shows the mean value and standard deviation of blood insulin concentration (ng / ml) per animal in each group. 脳室内にリラキシン−３を持続投与した後、自発運動量を測定しながら飼育したラットの体重増加量の変化を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。図中の白三角は、明期の運動量測定日、黒三角は暗期の運動量測定日を示す。Fig. 2 shows changes in the weight gain of rats reared while continuously measuring relaxin-3 in the ventricle and measuring the amount of spontaneous exercise. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. A vertical axis | shaft shows the average value and standard deviation of the body weight gain (g) per animal of each group. The white triangles in the figure indicate the light momentum measurement date, and the black triangles indicate the dark momentum measurement date. 脳室内にリラキシン−３を持続投与したラットの自発運動量に対する作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はリラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの全活動量（カウント）の平均値と標準偏差を示す。The effect | action with respect to the locomotor activity of the rat which administered relaxin-3 continuously in the ventricle is shown. A white square shows a vehicle administration group (control), and a black square shows a relaxin-3 administration group. The vertical axis shows the average value and standard deviation of the total activity (count) per animal in each group.

リラキシン−３（ｒｅｌａｘｉｎ−３）
本発明で使用する「リラキシン−３」とは、遺伝子配列のデータベースから新たに同定されたリラキシン−３（Ｒｅｌａｘｉｎ−３）（ＩＮＳＬ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０８６４）とも称されている。）と称せられているポリペプチドであり（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１１４８−１１５７（２００２））、（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。また、リラキシン−３には、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる相同ポリペプチドが含まれる。本発明に使用するリラキシン−３としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。 Relaxin-3
"Relaxin-3" used in the present invention is referred to as relaxin-3 (Relaxin-3) (also referred to as INSL7 (GenBank accession number NM_080864)) newly identified from a gene sequence database. (I) means a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (J. Biol. Chem. 277, 1148-1157 (2002)). In addition, relaxin-3 includes (ii) a modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (iii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A homologous polypeptide consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence is included. As relaxin-3 used in the present invention, a “polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” is preferable. In addition, the polypeptide includes a salt of the polypeptide, and further includes both those having no sugar chain and those having a sugar chain.

ここで、機能的に等価な改変ポリペプチド（以下、「改変ポリペプチド」と称する）とは、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもリラキシン−３と実質的に同じ活性［例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用］を有するポリペプチドを意味する。 Here, the functionally equivalent modified polypeptide (hereinafter referred to as “modified polypeptide”) is one or a plurality (preferably a polypeptide whose amino acid sequence includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2). Is an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and have substantially the same activity as relaxin-3 [for example, the ability to bind relaxin-3 receptor and its Cell-stimulating activities (eg, intracellular calcium release, adenylate cyclase activation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phospholipid generation, cell membrane potential change, pH change in the vicinity of the cell membrane, intracellular protein) Phosphorylation, c-fos and c-jun induction activity, arachidonic acid release, etc.), food intake enhancement, weight gain It refers to a polypeptide having the activity or obesity action.

本明細書において「置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のリラキシン−３もしくはその変異体が含まれる。As used herein, “substitution” means substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the activity of the peptide. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specifically, examples of nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine and the like. Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
Here, the number of amino acids that may be deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Particularly preferably, the number is 1-2. The modified polypeptide includes a salt of the modified polypeptide, and further includes both those having no sugar chain and those having a sugar chain. Therefore, as long as these conditions are satisfied, the origin of the modified polypeptide is not limited to humans. For example, relaxin-3 derived from non-human organisms [eg, non-human mammals (eg, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc.), birds, reptiles, amphibians, fish, insects, etc.] or variants thereof are included.

上述の相同ポリペプチドとは、リラキシン−３のアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、リラキシン−３に関して、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもリラキシン−３と実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用）を有するポリペプチドを意味する。本明細書において、「相同性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のリラキシン−３もしくはその変異体が含まれる。 The above homologous polypeptide is not particularly limited as long as it consists of an amino acid sequence having 70% or more homology with respect to the amino acid sequence of relaxin-3, but with respect to relaxin-3, preferably 80% or more, more Preferably an amino acid sequence consisting of amino acid sequences having homology of 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, Furthermore, it means a polypeptide having substantially the same activity as relaxin-3 (for example, the ability to bind to relaxin-3 receptor and various cell stimulating activities resulting therefrom, feeding enhancement, weight gain or obesity) . In the present specification, any numerical value of “homology” may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, the homology algorithm BLAST of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Basic local alignment search tool) http: // www. ncbi. nlm. nih. It can be calculated by using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /. The homologous polypeptide includes salts of homologous polypeptides, and further includes both those having no sugar chain and those having a sugar chain. Therefore, as long as these conditions are satisfied, the origin of the homologous polypeptide is not limited to humans. For example, relaxin-3 derived from non-human organisms [eg, non-human mammals (eg, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc.), birds, reptiles, amphibians, fish, insects, etc.] or variants thereof are included.

なお、変異体とは、「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。 The variant means “variation”, that is, an individual difference found in the same polypeptide within the same species, or a difference found in several homologous polypeptides.

これら本発明に使用するリラキシン−３（すなわち、リラキシン−３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）は、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、リラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、使用するポリペプチドは配列番号２の全長および一部でも良く、システイン間の架橋や、Ｎ末端環状グルタミン化、Ｃ末端アミド化等、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドでも良い。 Relaxin-3 (that is, relaxin-3, modified polypeptide, homologous polypeptide) used in the present invention can be obtained by various known methods such as genetic engineering techniques and synthetic methods. Specifically, in the case of genetic engineering techniques, a polynucleotide encoding relaxin-3 is introduced into an appropriate host cell, cultured under conditions capable of expression from the obtained transformant, and separation of expressed protein and It can be prepared by separating and purifying the desired polypeptide from the culture by methods commonly used for purification. In the case of the synthesis method, it can be synthesized according to a conventional method such as a liquid phase method or a solid phase method, and an automatic synthesizer can be usually used. The synthesis of the chemically modified product can be performed by a conventional method. The polypeptide to be used may be the full length or a part of SEQ ID NO: 2, and may be a polypeptide that has undergone secretory protein processing such as cross-linking between cysteines, N-terminal cyclic glutamination, and C-terminal amidation.

リラキシン−３をコードするポリヌクレオチド
本発明に使用するリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のリラキシン−３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のリラキシン−３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のリラキシン−３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。 Polynucleotide encoding relaxin-3 The polynucleotide encoding relaxin-3 used in the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide used in the present invention.
The term “polynucleotide” in this specification includes both DNA and RNA. Specific examples of the polynucleotide used in the present invention include those selected from the group consisting of the following (a) to (e).
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding "a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2";
(C) a polynucleotide encoding “a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having substantially the same activity as relaxin-3”;
(D) “one or more (preferably one or several) amino acid sequence is deleted or substituted at one or more (preferably one or several) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A polynucleotide comprising an inserted and / or added amino acid sequence and encoding a polypeptide having substantially the same activity as relaxin-3, and (e) a base represented by SEQ ID NO: 1 The present invention relates to a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a sequence under stringent conditions and encodes a polypeptide having substantially the same activity as relaxin-3.

本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のリラキシン−３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。 According to one aspect of the present invention, the polynucleotide used in the present invention contains “one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 at one or more (preferably one or several) sites. A polypeptide comprising an amino acid sequence in which (preferably one or several) amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and having substantially the same activity as relaxin-3. It will be. Here, the number of amino acids that may be deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Particularly preferably, the number is 1-2.

本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のリラキシン−３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。 According to another aspect of the present invention, the polynucleotide used in the present invention is “hybridized with a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, It encodes a “polypeptide having substantially the same activity as relaxin-3”.

本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１６４，７６５（１９８８）〕等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。 In the present specification, the polynucleotide that hybridizes under stringent conditions specifically includes FASTA, BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym. , 164, 765 (1988)], etc., using the default (initial setting) parameters, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is at least 70% or more, preferably 80%. More preferred is a polynucleotide having a homology of 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more. In addition, “stringent conditions” means that the reaction is carried out at a temperature of 40 ° C. to 70 ° C., preferably 60 ° C. to 65 ° C. in a hybridization buffer that can be usually used by those skilled in the art. It can be carried out according to a method of washing in a washing solution of 15 to 300 mmol / L, preferably 15 to 60 mmol / L. The temperature and salt concentration can be appropriately adjusted according to the length of the probe used.

本発明に使用するポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列（例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列）の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。 The polynucleotide used in the present invention can be derived, for example, from a natural source or can be totally synthesized. Furthermore, it may be synthesized by using a part of naturally derived materials. A typical method for obtaining the polynucleotide used in the present invention is, for example, a method commonly used in the field of genetic engineering from a commercially available library or cDNA library, for example, a partial amino acid sequence (for example, represented by SEQ ID NO: 2). And a method of performing screening using an appropriate DNA probe prepared based on the information on the amino acid sequence.

本発明に使用するポリヌクレオチドとしては、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号１で表される塩基配列は、１番目〜３番目のＡＴＧで始まり、４２７番目〜４２９番目のＴＡＧで終了するオープンリーディングフレームを有する。 As the polynucleotide used in the present invention, a “polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1” is preferable. The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an open reading frame that starts with the first to third ATG and ends with the 427th to 429th TAG.

リラキシン−３を含有する医薬組成物
本発明に使用するリラキシン−３は、摂食亢進剤として食欲不振や摂食量が低下した栄養障害などの治療、体重増加剤、脂肪量増加剤として体重増加を必要とする疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常等に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症もしくは各種疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い減少した摂食（もしくは食欲）および／または体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記各種疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、摂食障害、拒食症、ＡＩＤＳ、癌、または悪液質などが挙げられる。好ましくは、拒食症、悪液質が挙げられる。 Relaxin-3 containing pharmaceutical composition Relaxin-3 used in the present invention is a dietary enhancer that treats anorexia and malnutrition with reduced food intake, a weight gain agent, a fat gain agent, and gains weight. It can be used as a medicament for treating a necessary disease, treating a disease caused by some abnormality in the regulation of obesity, and treating a disease caused by an abnormality of relaxin-3 or a polynucleotide encoding relaxin-3. Moreover, it can also be used as a medicament for treatment aimed at recovering body weight (or appetite) and / or body weight decreased with the onset of various diseases or treatment of various diseases (for example, during or after surgery). Examples of the various diseases include diseases related to movement or function of the gastrointestinal tract (for example, diarrhea, constipation, functional constipation, irritable bowel syndrome, promotion of defecation for intestinal contents at the time of gastrointestinal examination or before and after surgery) , Diseases related to immune function regulation (eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, kidney disease, scleroderma, atopic dermatitis, bronchial asthma, multiple sclerosis, rheumatic interstitial pneumonia, sarcoidosis, Crohn's disease Inflammatory colitis, cirrhosis, chronic hepatitis, fulminant hepatitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, etc.), eating disorders, anorexia, AIDS, cancer, or cachexia. Preferably, anorexia and cachexia are mentioned.

当該ポリペプチドまたはその塩を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。
本願明細書における「塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは塩酸塩、シュウ酸塩、などである。
この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のリラキシン−３を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。The polypeptide or a salt thereof can be used alone, but can also be used as a pharmaceutical composition by blending with a pharmaceutically acceptable carrier.
The “salt” in the present specification is not particularly limited as long as it forms a salt with the compound according to the present invention and is pharmaceutically acceptable, but is preferably a hydrohalide salt (for example, hydrofluoric acid). Salt, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, etc.), inorganic acid salt (eg sulfate, nitrate, perchlorate, phosphate, carbonate, bicarbonate, etc.) organic carboxylate (Eg acetate, trifluoroacetate, oxalate, maleate, tartrate, fumarate, citrate, etc.), organic sulfonates (eg methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, ethanesulfone) Acid salts, benzene sulfonate, toluene sulfonate, camphor sulfonate, etc.), amino acid salts (eg aspartate, glutamate, etc.), quaternary amine salts, alkali metal salts (eg Sodium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts (magnesium salts, calcium salts, etc.), etc., and the “pharmaceutically acceptable salts” are more preferably hydrochlorides, oxalates, etc. It is.
The ratio of the active ingredient to the carrier at this time can vary between 1 and 90% by weight. In addition, such drugs are used for human or non-human organisms [eg, non-human mammals (eg, cattle, monkeys, birds, cats, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc.), birds, reptiles, amphibians, fish, insects. Etc.] can be administered in various forms, oral or parenteral (eg intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration). Therefore, the pharmaceutical composition containing relaxin-3 of the present invention is in an appropriate dosage form according to the administration route, specifically, an oral preparation such as a tablet, capsule, granule, powder, or syrup, Alternatively, parenteral preparations such as injections, drops, liposomes, suppositories and the like can be mentioned. These preparations are usually used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surface active agents, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives. It can be produced by a conventional method using a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer and the like. Examples of the non-toxic additive that can be used include lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium stearate, methylcellulose, or a salt thereof, ethanol, citric acid, sodium chloride, sodium phosphate, and the like.

それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、ポリペプチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約０．１〜５００μｇ、好ましくは約０．１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。 For these dosage forms, the required dosage range also depends on the choice of polypeptide, the subject to be administered, the route of administration, the nature of the formulation, the condition of the patient, and the judgment of the physician. However, an appropriate dose is, for example, about 0.1 to 500 μg, preferably about 0.1 to 100 μg, more preferably about 1 to 50 μg per 1 kg body weight of the patient. Given the differing efficiencies of the routes of administration, the required dosage is expected to vary widely. For example, oral administration is expected to require a higher dose than administration by intravenous injection. These dosage level variations can be adjusted using standard empirical optimization procedures, as is well understood in the art.

リラキシン−３受容体を用いた摂食調節に係る化合物のスクリーニング方法
本発明に使用するリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものを使用することができる。 Methods for screening compounds related to food intake regulation using relaxin-3 receptor As a receptor for relaxin-3 used in the present invention, among various receptors, relaxin-3 used in the present invention has binding activity. Cell stimulating activity of cells expressing relaxin-3 receptor (for example, intracellular calcium release, adenylate cyclase activation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phospholipid generation, cell membrane potential change, cell membrane Those having a pH change in the vicinity, phosphorylation of intracellular proteins, c-fos and c-jun induction activity, arachidonic acid release, etc. can be used.

具体的には、リラキシン−３受容体として、報告されている公知の受容体、例えばＬＧＲ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１６３４）、ＳＡＬＰＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）（ＧＰＣＲ１３５とも称されている。）またはＧＰＲ１００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ＿０８３５９３）（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２とも称されている。）などを使用することが可能である。また、これら受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばリラキシン−３に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。 Specifically, as a relaxin-3 receptor, a known known receptor, for example, LGR7 (GenBank accession number NM — 021634), SALPR (GenBank accession number NM — 016568) (also referred to as GPCR135) or GPR100. (GenBank accession number AB_083593) (also referred to as hGPCR11 and GPCR142) can be used. Moreover, there is no particular limitation as long as it can be used in the screening method described later as a partial polypeptide of these receptors. For example, a partial polypeptide having a binding ability to relaxin-3, a partial polypeptide containing an amino acid sequence corresponding to the extracellular region Peptides can also be used.

以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、ＳＡＬＰＲを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、摂食調節（摂食を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、該被験物質に摂食を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。 Hereinafter, in the present specification, as a preferred example of the present invention, the contents of the present invention will be described in detail for a screening method using SALPR. That is, the present invention provides a screening method for a compound that binds to SALPR or a partial polypeptide thereof and is related to feeding regulation (promoting or suppressing feeding). In addition, by making a test substance act on SALPR or a partial polypeptide thereof and measuring the cell stimulating activity, it can be determined whether or not the test substance has an action of promoting or suppressing feeding.

ここで、本発明に使用するＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えばＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドは、ＳＡＬＰＲを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。 Here, SALPR or a partial polypeptide thereof used in the present invention can be obtained by various known methods. For example, a known genetic engineering technique using a polynucleotide encoding SALPR (GenBank accession number NM — 016568). Can be prepared. In another embodiment, the polypeptide can be obtained by a known polypeptide synthesis method. For example, the polypeptide can be synthesized according to a conventional method such as a liquid phase method or a solid phase method, and an automatic synthesizer can be usually used. . Furthermore, according to another embodiment, a partial polypeptide of SALPR can be prepared by cleaving SALPR with an appropriate proteolytic enzyme.

本発明に使用するＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。 The polypeptide encoding SALPR used in the present invention is a polypeptide comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, a modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, or a sequence Regarding the amino acid sequence represented by No. 4, 70% or more homology, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98%. And most preferably an amino acid sequence comprising an amino acid sequence having a homology of 99% or more, and having substantially the same activity as SALPR (for example, the ability to bind relaxin-3 and various cell stimulating activities caused thereby) , Or a feeding-regulating action).

ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。 Here, the modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 is one or more in the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. An amino acid sequence in which (preferably one or several) amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and substantially the same activity as SALPR (for example, binding ability to relaxin-3 and resulting therefrom) It means a polypeptide having various cell-stimulating activities or feeding regulation effects.

さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有する限り、使用することができる。 Furthermore, a partial polypeptide of SALPR can be used as long as it has substantially the same activity as SALPR (for example, the ability to bind relaxin-3 and various cell stimulating activities resulting therefrom, or feeding regulation effect). .

以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはＳＡＬＰＲを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。 Hereinafter, the genetic engineering method will be described in detail with respect to the case of using SALPR, but the partial polypeptide is not particularly limited as long as it can be used in the screening method described later.

ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥等を挙げることができる。 A polynucleotide encoding SALPR is introduced into an appropriate host cell, cultured under conditions capable of being expressed from the resulting transformant, and then cultured from the culture by a method generally used for separation and purification of the expressed protein. It can be prepared by separating and purifying the desired polypeptide. Examples of the separation and purification method include ammonium sulfate salting out, ion exchange column chromatography using ion exchange cellulose, molecular sieve column chromatography using molecular sieve gel, affinity column chromatography using protein A-bound polysaccharide, dialysis, or Freeze drying and the like can be mentioned.

本発明に使用するＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。The polynucleotide encoding SALPR used in the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide used in the present invention.
The term “polynucleotide” in this specification includes both DNA and RNA. Specific examples of the polynucleotide used in the present invention include those selected from the group consisting of the following (a) to (e).
(A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(B) a polynucleotide encoding "a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4";
(C) a polynucleotide encoding “a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having substantially the same activity as the SALPR”;
(D) “one or more (preferably one or several) amino acid sequence is deleted or substituted at one or more (preferably one or several) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; A polynucleotide comprising an inserted and / or added amino acid sequence and encoding a polypeptide having substantially the same activity as the SALPR; and (e) consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 The present invention relates to a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide under stringent conditions and encodes a polypeptide having substantially the same activity as that of the SALPR.

本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＬＰＲをコードする。 According to one aspect of the present invention, the polynucleotide used in the present invention is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. The polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3 encodes SALPR consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。 According to another aspect of the present invention, the polynucleotide used in the present invention is “one or more (preferably one or several) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4” A polypeptide comprising an amino acid sequence in which a plurality (preferably one or several) of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having substantially the same activity as the SALPR. Is. Here, the number of amino acids that may be deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Particularly preferably, the number is 1-2.

本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。 According to another aspect of the present invention, the polynucleotide used in the present invention is “hybridized with a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and further comprising the SALPR And “a polypeptide having substantially the same activity as the above”. Furthermore, according to another aspect of the present invention, the polynucleotide used in the present invention is "hybridized under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, It encodes a “polypeptide having substantially the same activity as the SALPR”.

前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。 The plasmid used for the transformation is not particularly limited as long as it contains a polynucleotide encoding SALPR as described above, and a known expression vector appropriately selected according to the host cell to be used. A plasmid obtained by inserting can be mentioned.

また、前記形質転換体も、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＳＡＬＰＲを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。 Further, the transformant is not particularly limited as long as it contains a polynucleotide encoding SALPR as described above. For example, the transformant may be a transformant in which the polynucleotide is integrated into the host cell chromosome. Or a transformant containing the polynucleotide containing the polynucleotide, or a transformant not expressing SALPR. The transformant can be obtained, for example, by transforming a desired host cell with the plasmid or with the polynucleotide itself.

前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。 Examples of the host cell include commonly used known microorganisms such as E. coli (eg Escherichia coli JM109 strain) or yeast (eg Saccharomyces cerevisiae W303 strain), or known cultured cells such as animal cells (eg CHO cells, HEK). -293 cells, or COS cells) or insect cells (eg BmN4 cells).

また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅＰｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。 Examples of the known expression vector include pUC, pTV, pGEX, pKK, or pTrcHis for E. coli; pEMBLY or pYES2 for yeast; CHO cells, HEK-293 cells, and COS cells. For pcDNA3, pMAMneo or pBabe Puro; for BmN4 cells, a vector having a polyhedrin promoter of silkworm nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) (eg, pBK283) can be mentioned.

ＳＡＬＰＲを含有する細胞は、ＳＡＬＰＲを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＳＡＬＰＲをコードするＲＮＡを注入し、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。 The cell containing SALPR is not particularly limited as long as SALPR is expressed on the cell membrane surface. For example, the transformant (that is, a cell transformed with a plasmid containing a polynucleotide encoding SALPR) Can be obtained by culturing under conditions capable of expressing SALPR, or by injecting RNA encoding SALPR into appropriate cells and culturing under conditions capable of expressing SALPR. It can also be obtained.

また、ＳＡＬＰＲを含有する本発明に使用する細胞膜画分は、例えば本発明によるＳＡＬＰＲを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。 Moreover, the cell membrane fraction used in the present invention containing SALPR can be obtained, for example, by crushing a cell expressing SALPR according to the present invention and then separating the fraction containing a large amount of cell membrane. Cell disruption methods include, for example, a method of crushing cells with a homogenizer (eg, Potter-Elveheim homogenizer), a disruption with a Waring blender or polytron (Kinematica), an ultrasonic disruption, or a fine pressurization with a French press. Examples include crushing by ejecting cells from a nozzle. Examples of the cell membrane fractionation method include a fractionation method using centrifugal force, such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method.

ＳＡＬＰＲを介する、本発明による摂食を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）、または前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）を用いることができる。 In the method for screening for a compound that promotes or inhibits feeding according to the present invention via SALPR, SALPR or the cell membrane fraction (ie, a cell membrane fraction containing SALPR) or the cell (ie, a cell containing SALPR) Can be used.

また、本発明によるスクリーニング方法においては、被験物質がＳＡＬＰＲに特異的に結合するか否かを調べる方法と、ＳＡＬＰＲに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。 Further, in the screening method according to the present invention, a method for examining whether or not a test substance specifically binds to SALPR, and a cell stimulating activity (for example, release of intracellular calcium, produced by binding of the test substance to SALPR, Activation of adenylate cyclase, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phospholipid generation, cell membrane potential change, pH change near cell membrane, phosphorylation of intracellular protein, c-fos and c-jun induction activity, arachidon A method for examining acid release and the like, which can be used.

本発明によるスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。 In the screening method according to the present invention, for example, SALPR or the cell membrane fraction or the cell is contacted with a test substance, and whether or not the test substance binds to the SALPR or the cell membrane fraction or the cell is analyzed. Makes it possible to screen compounds without distinguishing their ability to promote or suppress SALPR-mediated feeding.

具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、標識した天然のリガンド（すなわち、リラキシン−３）とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する天然リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。 Specifically, under each condition in the absence of the test substance and in the presence of the test substance, SALPR or the cell membrane fraction or the cell is contacted with a labeled natural ligand (ie relaxin-3), Screening for compounds without distinguishing the ability to promote or inhibit SALPR-mediated feeding by comparing SALPR under specific conditions or the amount of specific binding of the natural ligand through the cell membrane fraction or the cell it can. That is, when the test substance has the ability to promote or suppress feeding through SALPR, the SALPR or the cell membrane fraction in the absence of the test substance or the specific binding amount of the natural ligand through the cell Thus, the specific binding amount in the presence of the test substance decreases.

本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較する場合には、前記天然リガンドとして、標識した天然リガンドを用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［³Ｈ］、［¹⁴Ｃ］、［¹²⁵Ｉ］、［³⁵Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、天然リガンドと標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。In the screening method according to the present invention, when comparing the specific binding amount of the natural ligand via SALPR or the cell membrane fraction or the cell, a labeled natural ligand can be used as the natural ligand. As the index, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. As the radioisotope, for example, [ ³ H], [ ¹⁴ C], [ ¹²⁵ I], [ ³⁵ S] and the like can be used. As the enzyme, for example, β-galactosidase, alkaline phosphatase, peroxidase and the like can be used. As a fluorescent substance, fluoresce isothiocyanate, BODIPY, etc. can be used, for example. As the luminescent substance, luciferin, lucigenin, or the like can be used. In some cases, a biotin-avidin system can be used to bind the natural ligand and the labeling substance.

このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞に結合して、これらと天然リガンドとの結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。 Thus, in the screening method according to the present invention, a compound that binds to SALPR or the cell membrane fraction or the cell and inhibits the binding of these with a natural ligand has the ability to promote or suppress feeding via SALPR. Screening can be done without distinction.

本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した天然のリガンド（すなわち、リラキシン−３）とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における前記天然リガンドの特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。 In another aspect of the screening method according to the present invention, the cells are contacted with a labeled natural ligand (ie, relaxin-3) in the absence of the test substance and in the presence of the test substance, By comparing the specific binding amount of the natural ligand through the cell under the condition, and further comparing the specific cell stimulating activity of the natural ligand under the condition, the feeding through the SALPR is promoted or suppressed Compounds can be screened with distinct capabilities.

前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進する化合物として選択することができる。 In the above embodiment, a test substance that binds to the cell and has a cell stimulating activity via a receptor contained in the cell can be selected as a compound that promotes feeding via SALPR.

一方、前記態様において、前記細胞と天然リガンドとの結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する摂食を抑制する化合物として選択することができる。 On the other hand, in the above embodiment, a test substance that inhibits the binding between the cell and the natural ligand but does not have a cell stimulating activity can be selected as a compound that suppresses feeding through SALPR.

本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。 The screening method according to the present invention can be carried out by utilizing, for example, suppression of adenylate cyclase activity as the cell stimulating activity.

この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに天然リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに天然リガンドが結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。 In the screening method of this embodiment, for example, cAMP produced in cells by activation of adenylate cyclase may be measured by a known method, and compounds are screened by distinguishing the ability to promote or suppress feeding via SALPR. be able to. This embodiment utilizes intracellular signal transduction caused by binding of a natural ligand to SALPR, that is, suppression of the activity of adenylate cyclase, which is one of the cell stimulating activities of SALPR. Specifically, when a natural ligand binds to SALPR, the Gi family, one of the G protein families coupled to SALPR, suppresses adenylate cyclase, and cyclic AMP (cAMP: By reducing the amount (generated from ATP by adenylate cyclase).

例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にアデニル酸シクラーゼの活性化剤［例えばフォルスコリン（ＦＳＫ）］を添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する。 For example, an adenylate cyclase activator [for example, forskolin] is expressed in a mammal-derived cell (for example, HEK-293 cell or CHO cell) in which SALPR is expressed on a cell membrane (preferably, overexpressed by introducing an expression vector containing SALPR). When (FSK)] is added, the concentration of intracellular cAMP increases.

また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、ＳＡＬＰＲの天然リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する天然のリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。 Further, when a natural ligand of SALPR is added when the adenylate cyclase activator is added, in addition to the adenylate cyclase activity promotion caused by the adenylate cyclase activator, the natural ligand is added to the SALPR according to the present invention. Since the suppression of the activity of the adenylate cyclase produced by the action also occurs, as a result, the amount of cAMP produced is reduced as compared with the case where the adenylate cyclase activator is administered alone. Therefore, when screening for a compound having an action of promoting feeding, instead of the natural ligand via SALPR in this screening system, the test substance is contacted alone to reduce the amount of cAMP produced (ie, the natural ligand). It is preferable to select a compound having the same action as.

摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＳＡＬＰＲの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる。 When screening for a compound having an action of suppressing feeding, an adenylate cyclase activator, a natural ligand of SALPR, and a test substance may be added to the screening cells. Compared to the case where the adenylate cyclase activator is added alone, the amount of cAMP produced is reduced by the action of the natural ligand. Suppress. In this case, the test substance can be selected as a compound having an antifeedant action.

細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイ等があるが、例えば市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。 As a method for measuring the amount of intracellular cAMP, for example, there is an immunoassay or the like. For example, a commercially available cAMP quantification kit can also be used.

別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、またはＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。 In another embodiment of the screening method, for example, SALPR is expressed on a cell membrane (preferably, an expression vector containing SALPR is introduced and overexpressed), and a cAMP response element (CRE) is located 5 ′ upstream. Cells (eg, fluorescent protein genes such as alkaline phosphatase gene, luciferase gene, beta-lactamase gene, nitroreductase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, beta-galactosidase gene, or GFP (Green Fluorescent Protein)). In the following, compounds may be screened by distinguishing the ability to promote or suppress SALPR-mediated feeding by using “screening cells”) Can. This embodiment utilizes the fact that the transcription of a reporter gene having a CRE introduced into the screening cell as a promoter region is suppressed as a result of the decrease in the aforementioned cAMP production.

以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。Hereinafter, the procedure for screening a compound by distinguishing the ability to promote or suppress feeding through SALPR according to the above embodiment will be described more specifically.
That is, CRE introduced into the screening cell is a base sequence that is commonly present in the transcriptional regulatory region of a gene group (cAMP-inducible gene) whose expression increases when the intracellular cAMP concentration increases. Therefore, when an adenylate cyclase activator (for example, FSK) is added to the screening cells, the intracellular cAMP concentration increases, and as a result, the expression level of the reporter gene located downstream of the CRE increases. The expression level of the reporter gene product can be easily determined by measuring the luminescence derived from the amount of the luminescent substance produced from the substrate by reacting with the reporter gene product or by measuring the fluorescence derived from the fluorescent protein produced as the reporter gene. It is possible to measure.

また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、ＳＡＬＰＲの天然リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する天然のリガンドに代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。 In addition, when a natural ligand of SALPR is added when the adenylate cyclase activator is added, in addition to the promotion of the adenylate cyclase activity caused by the adenylate cyclase activator, the natural ligand is added to the SALPR according to the present invention. Since the suppression of the activity of the adenylate cyclase produced by the action also occurs, as a result, the expression level of the reporter gene product is reduced as compared with the case where the adenylate cyclase activator is administered alone. Therefore, when screening for a compound having an action of promoting feeding, in this screening system, a test substance is contacted alone instead of a natural ligand via SALPR to reduce the expression level of the reporter gene product (ie, A compound having the same action as the natural ligand) may be selected.

摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＳＡＬＰＲの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる。 When screening for a compound having an action of suppressing feeding, an adenylate cyclase activator, a natural ligand of SALPR, and a test substance may be added to the screening cells. Compared to the case where an adenylate cyclase activator is added alone, the expression level of the reporter gene product is reduced by the action of the natural ligand, but when the test substance antagonizes the action of the natural ligand, Suppresses decrease in expression. In this case, the test substance can be selected as a compound having an antifeedant action.

被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。 It can be easily confirmed whether or not the action by the test substance is an action through binding to SALPR. For example, in parallel with the above-described test using screening cells (that is, cells containing a reporter gene in which SALPR is expressed on the cell membrane and CRE is located 5 ′ upstream), control cells (for example, CRE 5 A similar test is carried out using a cell containing a reporter gene located upstream but not expressing SALPR on the cell membrane. As a result, when the action by the test substance is not the action by binding to SALPR, the same phenomenon is observed with respect to the expression level of the reporter gene product in the screening cell and the control cell, whereas the test substance When the action is an action due to binding to SALPR, different phenomena are observed regarding the expression level of the reporter gene product between the screening cell and the control cell.

また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の摂食量や血中パラメーターの変動等の指標を解析することにより摂食調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルであるｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒｆａｔｔｙラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングのための指標としては摂食量のほかにも、例えば体重、運動量、エネルギー代謝量、血中の糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量等を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食等の条件を課すこともできる。
被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。In another embodiment, the test substance selected by the above screening method is a human or non-human organism [eg, non-human mammals (eg, cows, monkeys, birds, cats, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc. ), Birds, reptiles, amphibians, fish, insects, etc.], and confirm and determine the test substances that affect feeding regulation by analyzing indicators such as changes in food intake and blood parameters after administration can do. The mammal is not limited to a normal animal, but may be a hereditary disease model animal (for example, ob / ob mouse, db / db mouse, Zucker fatty rat, etc., which are obesity models) or a genetically modified animal. The test substance is administered orally or parenterally. Examples of the parenteral route of administration include intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal, intratracheal, intrarectal, intracerebral, preferably intraventricular near the hypothalamus. As an index for screening, it is also effective to measure, for example, body weight, amount of exercise, energy metabolism, amount of sugar and lipid in blood, amount of hormone and secretory peptide, etc. in addition to food intake. In addition, conditions such as fasting or satiety, and an excessive lipid diet can be imposed upon administration.
The number of administrations of the test substance may be divided once or several times per day, and the period during which the test substance is administered or the period of observation may be from 1 day to several weeks.

リラキシン−３受容体を用いた体重調節に係る化合物のスクリーニング方法
本発明に使用するリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものを使用することができる。 Screening method for compounds related to body weight regulation using relaxin-3 receptor As a receptor for relaxin-3 used in the present invention, among various receptors, it has binding activity with relaxin-3 used in the present invention. Cell stimulation activity of relaxin-3 receptor expressing cells (for example, intracellular calcium release, adenylate cyclase activation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phospholipid generation, cell membrane potential change, cell membrane vicinity, Those having pH change, intracellular protein phosphorylation, c-fos and c-jun induction activity, arachidonic acid release, etc. can be used.

以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、ＳＡＬＰＲを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、体重調節（体重を増加または減少する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、該被験物質に体重を増加または減少する作用を有するか否かを決定することができる。 Hereinafter, in the present specification, as a preferred example of the present invention, the contents of the present invention will be described in detail for a screening method using SALPR. That is, the present invention provides a method for screening a compound that binds to SALPR or a partial polypeptide thereof and is related to body weight regulation (increases or decreases body weight). In addition, by making a test substance act on SALPR or a partial polypeptide thereof and measuring cell stimulating activity, it can be determined whether or not the test substance has an action of increasing or decreasing body weight.

本発明に使用するＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。 The polypeptide encoding SALPR used in the present invention is a polypeptide comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, a modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, or a sequence Regarding the amino acid sequence represented by No. 4, 70% or more homology, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98%. And most preferably an amino acid sequence comprising an amino acid sequence having a homology of 99% or more, and having substantially the same activity as SALPR (for example, the ability to bind relaxin-3 and various cell stimulating activities caused thereby) Or a body weight regulating action).

ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。 Here, the modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 is one or more in the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. An amino acid sequence in which (preferably one or several) amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and substantially the same activity as SALPR (for example, binding ability to relaxin-3 and resulting therefrom) It means a polypeptide having various cell stimulating activities or body weight regulating action.

さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有する限り、使用することができる。 Furthermore, a partial polypeptide of SALPR can also be used as long as it has substantially the same activity as SALPR (for example, the ability to bind relaxin-3 and the various cell stimulating activities caused thereby, or body weight regulating action).

以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはＳＡＬＰＲを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。 Hereinafter, the genetic engineering method will be described in detail with respect to the case of using SALPR, but the partial polypeptide is not particularly limited as long as it can be used in the screening method described later.

ＳＡＬＰＲを含有する細胞は、ＳＡＬＰＲを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＳＡＬＰＲをコードするＲＮＡを注入し、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。 The cell containing SALPR is not particularly limited as long as SALPR is expressed on the cell membrane surface. For example, the transformant (ie, a cell transformed with a plasmid containing a polynucleotide encoding SALPR) Can be obtained by culturing under conditions capable of expressing SALPR, or by injecting RNA encoding SALPR into appropriate cells and culturing under conditions capable of expressing SALPR. It can also be obtained.

ＳＡＬＰＲを介する、本発明による体重を増加または減少する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）、または前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）を用いることができる。 In the method for screening for a compound that increases or decreases body weight according to the present invention via SALPR, SALPR or the cell membrane fraction (that is, cell membrane fraction containing SALPR) or the cell (that is, cell containing SALPR) is used. Can be used.

本発明によるスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。 In the screening method according to the present invention, for example, SALPR or the cell membrane fraction or the cell is contacted with a test substance, and whether or not the test substance binds to the SALPR or the cell membrane fraction or the cell is analyzed. Allows screening of compounds without distinguishing the ability to increase or decrease body weight via SALPR.

具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、標識した天然のリガンド（すなわち、リラキシン−３）とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する天然リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。 Specifically, under each condition in the absence of the test substance and in the presence of the test substance, SALPR or the cell membrane fraction or the cell is contacted with a labeled natural ligand (ie relaxin-3), Compounds can be screened without distinguishing the ability to increase or decrease body weight via SALPR by comparing the specific binding amount of SALPR or the cell membrane fraction or the natural ligand through the cell under conditions . That is, when the test substance has the ability to increase or decrease the body weight via SALPR, the specific binding amount of the natural ligand through SALPR or the cell membrane fraction or the cells in the absence of the test substance The specific binding amount in the presence of the test substance decreases.

このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞に結合して、これらと天然リガンドとの結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。 Thus, in the screening method according to the present invention, a compound that binds to SALPR or the cell membrane fraction or the cell and inhibits the binding of these to a natural ligand is distinguished from the ability to increase or decrease body weight via SALPR. Can be screened without.

本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した天然のリガンド（すなわち、リラキシン−３）とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における前記天然リガンドの特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。 In another aspect of the screening method according to the present invention, the cells are contacted with a labeled natural ligand (ie, relaxin-3) in the absence of the test substance and in the presence of the test substance, Ability to increase or decrease body weight via SALPR by comparing the specific binding amount of the natural ligand through the cell under conditions and further comparing the specific cell stimulating activity of the natural ligand under the conditions The compounds can be screened with distinction.

前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加する化合物として選択することができる。 In the above embodiment, a test substance that binds to the cell and has a cell stimulating activity via a receptor contained in the cell can be selected as a compound that increases body weight via SALPR.

一方、前記態様において、前記細胞と天然リガンドとの結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する体重を減少する化合物として選択することができる。 On the other hand, in the above embodiment, a test substance that inhibits the binding between the cell and the natural ligand but does not have a cell stimulating activity can be selected as a compound that decreases body weight via SALPR.

この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに天然リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに天然リガンドが結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。 In the screening method of this embodiment, for example, cAMP produced in cells by activation of adenylate cyclase may be measured by a known method, and compounds are screened by distinguishing the ability to increase or decrease body weight via SALPR. Can do. This embodiment utilizes intracellular signal transduction caused by binding of a natural ligand to SALPR, that is, suppression of the activity of adenylate cyclase, which is one of the cell stimulating activities of SALPR. Specifically, when a natural ligand binds to SALPR, the Gi family, one of the G protein families coupled to SALPR, suppresses adenylate cyclase, and cyclic AMP (cAMP: By reducing the amount (generated from ATP by adenylate cyclase).

また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、ＳＡＬＰＲの天然リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する天然のリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。 Further, when a natural ligand of SALPR is added when the adenylate cyclase activator is added, in addition to the adenylate cyclase activity promotion caused by the adenylate cyclase activator, the natural ligand is added to the SALPR according to the present invention. Since the suppression of the activity of the adenylate cyclase produced by the action also occurs, as a result, the amount of cAMP produced is reduced as compared with the case where the adenylate cyclase activator is administered alone. Therefore, when screening for a compound having an effect of increasing body weight, instead of the natural ligand via SALPR in this screening system, the test substance is contacted alone to reduce the amount of cAMP produced (ie, with the natural ligand). It is preferable to select a compound having the same action.

体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＳＡＬＰＲの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる。 When screening for a compound having an effect of reducing body weight, an adenylate cyclase activator, a natural ligand of SALPR, and a test substance may be added to the screening cells. Compared to the case where the adenylate cyclase activator is added alone, the amount of cAMP produced is reduced by the action of the natural ligand. Suppress. In this case, the test substance can be selected as a compound having a weight-reducing action.

別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、またはＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。 In another embodiment of the screening method, for example, SALPR is expressed on a cell membrane (preferably, an expression vector containing SALPR is introduced and overexpressed), and a cAMP response element (CRE) is located 5 ′ upstream. Cells (eg, fluorescent protein genes such as alkaline phosphatase gene, luciferase gene, beta-lactamase gene, nitroreductase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, beta-galactosidase gene, or GFP (Green Fluorescent Protein)). (Hereinafter also referred to as “screening cells”) to screen for compounds distinguishing the ability to increase or decrease body weight via SALPR Can. This embodiment utilizes the fact that the transcription of a reporter gene having a CRE introduced into the screening cell as a promoter region is suppressed as a result of the decrease in the aforementioned cAMP production.

以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。Hereinafter, the procedure for screening a compound by distinguishing the ability to increase or decrease the body weight via SALPR according to the above embodiment will be described in more detail.
That is, CRE introduced into the screening cell is a base sequence that is commonly present in the transcriptional regulatory region of a gene group (cAMP-inducible gene) whose expression increases when the intracellular cAMP concentration increases. Therefore, when an adenylate cyclase activator (for example, FSK) is added to the screening cells, the intracellular cAMP concentration increases, and as a result, the expression level of the reporter gene located downstream of the CRE increases. The expression level of the reporter gene product can be easily determined by measuring the luminescence derived from the amount of the luminescent substance produced from the substrate by reacting with the reporter gene product or by measuring the fluorescence derived from the fluorescent protein produced as the reporter gene. It is possible to measure.

また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、ＳＡＬＰＲの天然リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する天然のリガンドに代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。 Further, when a natural ligand of SALPR is added when the adenylate cyclase activator is added, in addition to the adenylate cyclase activity promotion caused by the adenylate cyclase activator, the natural ligand is added to the SALPR according to the present invention. Since the suppression of the activity of the adenylate cyclase produced by the action also occurs, as a result, the expression level of the reporter gene product is reduced as compared with the case where the adenylate cyclase activator is administered alone. Therefore, when screening for a compound having an effect of increasing body weight, in this screening system, a test substance is contacted alone instead of a natural ligand via SALPR to reduce the expression level of the reporter gene product (i.e., natural A compound having the same action as the ligand) may be selected.

体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＳＡＬＰＲの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる。 When screening for a compound having an effect of reducing body weight, an adenylate cyclase activator, a natural ligand of SALPR, and a test substance may be added to the screening cells. Compared to the case where the adenylate cyclase activator is added alone, the expression level of the reporter gene product is reduced by the action of the natural ligand, but when the test substance antagonizes the action of the natural ligand, Suppresses decrease in expression. In this case, the test substance can be selected as a compound having a weight-reducing action.

また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標（例えば体脂肪率、ＢＭＩ(体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、ＢＭＲ(基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率（ＶＳＲ）、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量等）を測定することにより体重調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルであるｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒｆａｔｔｙラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングのための指標としては、体重の測定が挙げられ、さらに摂食量及び肥満の指標を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食等の条件を課すこともできる。
被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。In another embodiment, the test substance selected by the above screening method is a human or non-human organism [eg, non-human mammals (eg, cows, monkeys, birds, cats, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc. ), Birds, reptiles, amphibians, fish, insects, etc.], and the amount of food intake, body weight, obesity after administration (eg body fat percentage, BMI (physical index), obesity, body type, body age, impedance , Body fat mass, lean mass, body water mass, protein mass, muscle mass, inorganic mass, cell mass, site-specific muscle mass, site-specific water mass, BMR (basal metabolic rate), energy requirement, abdominal obesity rate ( VSR), visceral fat mass, subcutaneous fat mass, visceral fat mass level, organ weight, blood parameter fluctuation, blood leptin, sugar and lipid content, or hormone or secretory peptide content, etc.) Thus, a test substance that affects weight control can be confirmed and determined. The mammal is not limited to a normal animal, but may be a hereditary disease model animal (for example, ob / ob mouse, db / db mouse, Zucker fatty rat, etc., which are obesity models) or a genetically modified animal. The test substance is administered orally or parenterally. Examples of the parenteral route of administration include intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal, intratracheal, intrarectal, intracerebral, preferably intraventricular near the hypothalamus. As an index for screening, measurement of body weight can be mentioned, and it is also effective to measure an index of food intake and obesity. In addition, conditions such as fasting or satiety, and an excessive lipid diet can be imposed upon administration.
The number of administrations of the test substance may be divided once or several times per day, and the period during which the test substance is administered or the period of observation may be from 1 day to several weeks.

リラキシン−３受容体を用いた肥満調節に係る化合物のスクリーニング方法
本発明に使用するリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものを使用することができる。 Screening Method for Compounds Related to Obesity Control Using Relaxin-3 Receptor As a receptor for relaxin-3 used in the present invention, among various receptors, it has binding activity with relaxin-3 used in the present invention. Cell stimulation activity of relaxin-3 receptor expressing cells (for example, intracellular calcium release, adenylate cyclase activation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phospholipid generation, cell membrane potential change, cell membrane vicinity, Those having pH change, intracellular protein phosphorylation, c-fos and c-jun induction activity, arachidonic acid release, etc. can be used.

以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、ＳＡＬＰＲを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、肥満調節（肥満を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、該被験物質に肥満を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。 Hereinafter, in the present specification, as a preferred example of the present invention, the contents of the present invention will be described in detail for a screening method using SALPR. That is, the present invention provides a method for screening a compound that binds to SALPR or a partial polypeptide thereof and is involved in obesity regulation (promoting or suppressing obesity). In addition, by making a test substance act on SALPR or a partial polypeptide thereof and measuring the cell stimulating activity, it can be determined whether or not the test substance has an action of promoting or suppressing obesity.

本発明に使用するＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。 The polypeptide encoding SALPR used in the present invention is a polypeptide comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, a modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 4, or a sequence Regarding the amino acid sequence represented by No. 4, 70% or more homology, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98%. And most preferably an amino acid sequence comprising an amino acid sequence having a homology of 99% or more, and having substantially the same activity as SALPR (for example, the ability to bind relaxin-3 and various cell stimulating activities caused thereby) Or an obesity-regulating action).

ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。 Here, the modified polypeptide functionally equivalent to the polypeptide containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 is one or more in the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. An amino acid sequence in which (preferably one or several) amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and substantially the same activity as SALPR (for example, binding ability to relaxin-3 and resulting therefrom) It means a polypeptide having various cell stimulating activities or obesity-controlling effects.

さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有する限り、使用することができる。 Furthermore, a partial polypeptide of SALPR can be used as long as it has substantially the same activity as SALPR (for example, the ability to bind relaxin-3 and various cell stimulating activities caused thereby, or an obesity-regulating action).

ＳＡＬＰＲを介する、本発明による肥満を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）、または前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）を用いることができる。 In the method for screening a compound that promotes or suppresses obesity according to the present invention via SALPR, SALPR or the cell membrane fraction (that is, a cell membrane fraction containing SALPR) or the cell (that is, a cell containing SALPR) is used. Can be used.

本発明によるスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。 In the screening method according to the present invention, for example, SALPR or the cell membrane fraction or the cell is contacted with a test substance, and whether or not the test substance binds to the SALPR or the cell membrane fraction or the cell is analyzed. Makes it possible to screen compounds without distinguishing the ability to promote or suppress obesity via SALPR.

具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、標識した天然のリガンド（すなわち、リラキシン−３）とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する天然リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。 Specifically, under each condition in the absence of the test substance and in the presence of the test substance, SALPR or the cell membrane fraction or the cell is contacted with a labeled natural ligand (ie relaxin-3), A compound can be screened without distinguishing the ability to promote or suppress obesity via SALPR by comparing the specific binding amount of SALPR or the cell membrane fraction under the condition or the natural ligand via the cell. . That is, when the test substance has the ability to promote or suppress obesity via SALPR, the specific binding amount of SALPR or the cell membrane fraction in the absence of the test substance or the natural ligand via the cell The specific binding amount in the presence of the test substance decreases.

このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞に結合して、これらと天然リガンドとの結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。 Thus, in the screening method according to the present invention, a compound that binds to SALPR or the cell membrane fraction or the cell and inhibits the binding of these to a natural ligand is distinguished from the ability to promote or suppress obesity via SALPR. Can be screened without.

本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した天然のリガンド（すなわち、リラキシン−３）とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における前記天然リガンドの特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。 In another aspect of the screening method according to the present invention, the cells are contacted with a labeled natural ligand (ie, relaxin-3) in the absence of the test substance and in the presence of the test substance, Ability to promote or inhibit obesity via SALPR by comparing the specific binding amount of the natural ligand via the cell under conditions and further comparing the specific cell stimulating activity of the natural ligand under the conditions The compounds can be screened with distinction.

前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進する化合物として選択することができる。 In the above embodiment, a test substance that binds to the cell and has a cell stimulating activity via a receptor contained in the cell can be selected as a compound that promotes obesity via SALPR.

一方、前記態様において、前記細胞と天然リガンドとの結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する肥満を抑制する化合物として選択することができる。 On the other hand, in the above embodiment, a test substance that inhibits the binding between the cell and the natural ligand but does not have cell stimulating activity can be selected as a compound that suppresses obesity via SALPR.

この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに天然リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに天然リガンドが結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。 In the screening method of this embodiment, for example, cAMP produced in cells by activation of adenylate cyclase may be measured by a known technique, and compounds are screened by distinguishing the ability to promote or suppress obesity via SALPR. Can do. This embodiment utilizes intracellular signal transduction caused by binding of a natural ligand to SALPR, that is, suppression of the activity of adenylate cyclase, which is one of the cell stimulating activities of SALPR. Specifically, when a natural ligand binds to SALPR, the Gi family, one of the G protein families coupled to SALPR, suppresses adenylate cyclase, and cyclic AMP (cAMP: By reducing the amount (generated from ATP by adenylate cyclase).

また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、ＳＡＬＰＲの天然リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する天然のリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。 Further, when a natural ligand of SALPR is added when the adenylate cyclase activator is added, in addition to the adenylate cyclase activity promotion caused by the adenylate cyclase activator, the natural ligand is added to the SALPR according to the present invention. Since the suppression of the activity of the adenylate cyclase produced by the action also occurs, as a result, the amount of cAMP produced is reduced as compared with the case where the adenylate cyclase activator is administered alone. Therefore, when screening for a compound having an action to promote obesity, instead of the natural ligand via SALPR in this screening system, the test substance is contacted alone to reduce the amount of cAMP produced (ie, with the natural ligand). It is preferable to select a compound having the same action.

肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＳＡＬＰＲの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる。 When screening for a compound having an action to suppress obesity, an adenylate cyclase activator, a natural ligand of SALPR, and a test substance may be added to the screening cells. Compared to the case where the adenylate cyclase activator is added alone, the amount of cAMP produced is reduced by the action of the natural ligand. Suppress. In this case, the test substance can be selected as a compound having an obesity suppressing action.

別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、またはＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。 In another embodiment of the screening method, for example, SALPR is expressed on a cell membrane (preferably, an expression vector containing SALPR is introduced and overexpressed), and a cAMP response element (CRE) is located 5 ′ upstream. Cells (eg, fluorescent protein genes such as alkaline phosphatase gene, luciferase gene, beta-lactamase gene, nitroreductase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, beta-galactosidase gene, or GFP (Green Fluorescent Protein)). Hereinafter, compounds may be screened by distinguishing the ability to promote or suppress obesity via SALPR by using “cells for screening”) Can. This embodiment utilizes the fact that the transcription of a reporter gene having a CRE introduced into the screening cell as a promoter region is suppressed as a result of the decrease in the aforementioned cAMP production.

以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。Hereinafter, the procedure for screening a compound by distinguishing the ability to promote or suppress obesity via SALPR according to the above embodiment will be described more specifically.
That is, CRE introduced into the screening cell is a base sequence that is commonly present in the transcriptional regulatory region of a gene group (cAMP-inducible gene) whose expression increases when the intracellular cAMP concentration increases. Therefore, when an adenylate cyclase activator (for example, FSK) is added to the screening cells, the intracellular cAMP concentration increases, and as a result, the expression level of the reporter gene located downstream of the CRE increases. The expression level of the reporter gene product can be easily determined by measuring the luminescence derived from the amount of the luminescent substance produced from the substrate by reacting with the reporter gene product or by measuring the fluorescence derived from the fluorescent protein produced as the reporter gene. It is possible to measure.

また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、ＳＡＬＰＲの天然リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する天然のリガンドに代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。 Further, when a natural ligand of SALPR is added when the adenylate cyclase activator is added, in addition to the adenylate cyclase activity promotion caused by the adenylate cyclase activator, the natural ligand is added to the SALPR according to the present invention. Since the suppression of the activity of the adenylate cyclase produced by the action also occurs, as a result, the expression level of the reporter gene product is reduced as compared with the case where the adenylate cyclase activator is administered alone. Therefore, when screening for a compound having an effect of promoting obesity, the expression level of the reporter gene product is reduced by contacting a test substance alone in place of the natural ligand via SALPR in this screening system (ie, natural expression). A compound having the same action as the ligand) may be selected.

肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＳＡＬＰＲの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる。 When screening for a compound having an action to suppress obesity, an adenylate cyclase activator, a natural ligand of SALPR, and a test substance may be added to the screening cells. Compared to the case where an adenylate cyclase activator is added alone, the expression level of the reporter gene product is reduced by the action of the natural ligand, but when the test substance antagonizes the action of the natural ligand, Suppresses decrease in expression. In this case, the test substance can be selected as a compound having an obesity suppressing action.

被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。 It can be easily confirmed whether or not the action of the test substance is an action through binding to SALPR. For example, in parallel with the above-described test using screening cells (that is, cells containing a reporter gene in which SALPR is expressed on the cell membrane and CRE is located 5 ′ upstream), control cells (for example, CRE 5 'A similar test is carried out using a cell containing a reporter gene located upstream but not expressing SALPR on the cell membrane). As a result, when the action by the test substance is not the action by binding to SALPR, the same phenomenon is observed with respect to the expression level of the reporter gene product in the screening cell and the control cell, whereas the test substance When the action is an action due to binding to SALPR, different phenomena are observed regarding the expression level of the reporter gene product between the screening cell and the control cell.

また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標（例えば体脂肪率、ＢＭＩ(体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、ＢＭＲ(基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率（ＶＳＲ）、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量等）を測定することにより肥満作用に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルであるｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒｆａｔｔｙラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングのための指標としては、肥満の指標を測定することが挙げられ、さらに摂食量及び体重を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食等の条件を課すこともできる。
被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。In another embodiment, the test substance selected by the above screening method is a human or non-human organism [eg, non-human mammals (eg, cows, monkeys, birds, cats, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc. ), Birds, reptiles, amphibians, fish, insects, etc.], and the amount of food intake, body weight, obesity after administration (eg body fat percentage, BMI (physical index), obesity, body type, body age, impedance , Body fat mass, lean mass, body water mass, protein mass, muscle mass, inorganic mass, cell mass, site-specific muscle mass, site-specific water mass, BMR (basal metabolic rate), energy requirement, abdominal obesity rate ( VSR), visceral fat mass, subcutaneous fat mass, visceral fat mass level, organ weight, blood parameter fluctuation, blood leptin, sugar and lipid content, or hormone or secretory peptide content, etc.) Thus, a test substance that affects obesity can be confirmed and determined. The mammal is not limited to a normal animal, but may be a hereditary disease model animal (for example, ob / ob mouse, db / db mouse, Zucker fatty rat, etc., which are obesity models) or a genetically modified animal. The test substance is administered orally or parenterally. Examples of the parenteral route of administration include intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal, intratracheal, intrarectal, intracerebral, preferably intraventricular near the hypothalamus. An index for screening includes measuring an index of obesity, and it is also effective to measure food intake and body weight. In addition, conditions such as fasting or satiety, and an excessive lipid diet can be imposed upon administration.
The number of administrations of the test substance may be divided once or several times per day, and the period during which the test substance is administered or the period of observation may be from 1 day to several weeks.

ここで、本発明に使用する被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。 Here, the test substance used in the present invention may be any compound. For example, an expression product of a gene library, a synthetic low molecular compound library, a nucleic acid (oligo DNA, oligo RNA), a synthetic peptide library , Antibody, bacterial release material, cell (microbe, plant cell, animal cell) extract, cell (microbe, plant cell, animal cell) culture supernatant, purified or partially purified polypeptide, marine organism, plant or animal Examples include extracts, soils, and random phage peptide display libraries.

スクリーニングキット
本発明のスクリーニングキットは、リラキシン−３受容体、好ましくはＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）、または前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）を含む。前記スクリーニングキットは、所望により、種々の試薬、例えば標識したリラキシン−３、非標識のリラキシン−３、結合反応用緩衝液、および／または洗浄用緩衝液、説明書、器具をさらに含むことができる。 Screening kit The screening kit of the present invention comprises relaxin-3 receptor, preferably SALPR or the cell membrane fraction (ie, a cell membrane fraction containing SALPR), or the cell (ie, a cell containing SALPR). The screening kit may further include various reagents, for example, labeled relaxin-3, unlabeled relaxin-3, binding reaction buffer, and / or wash buffer, instructions, and instruments, if desired. .

具体的には、前記スクリーニングキットは、ＳＡＬＰＲもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を含み、所望により、標識した天然リガンド（すなわち、リラキシン−３）、非標識の天然リガンド、および／または結合反応用緩衝液、説明書、器具を含むことができる。 Specifically, the screening kit comprises SALPR or the cell membrane fraction or the cells, optionally labeled natural ligand (ie relaxin-3), unlabeled natural ligand, and / or binding reaction buffer. Liquids, instructions, instruments can be included.

本発明の別の態様のスクリーニングキットは、リラキシン−３受容体、好ましくはＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞を含み、所望により、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼ等の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばＦＳＫ）、天然リガンド（すなわち、リラキシン−３）、および／または結合反応用緩衝液、説明書、器具を含むことができる。 The screening kit of another aspect of the present invention expresses a relaxin-3 receptor, preferably SALPR, on a cell membrane (preferably, overexpressed by introducing an expression vector containing SALPR), and a cAMP response element ( CRE) comprises a cell containing a reporter gene located 5 ′ upstream, optionally with a substrate such as alkaline phosphatase or luciferase, an adenylate cyclase activator (eg FSK), a natural ligand (ie relaxin-3), And / or binding reaction buffers, instructions, instruments.

本発明のさらに別の態様のスクリーニングキットは、リラキシン−３受容体、好ましくはＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞と、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞とを含み、所望により、レポーター遺伝子産物の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばＦＳＫ）、および／または結合反応用緩衝液、説明書、器具を含むことができる。 The screening kit of yet another aspect of the present invention expresses a relaxin-3 receptor, preferably SALPR, on a cell membrane (preferably, overexpressed by introducing an expression vector containing SALPR), and a cAMP response element (CRE) containing a reporter gene located 5 ′ upstream and cells containing a reporter gene located 5 ′ upstream CRE but not expressing SALPR on the cell membrane, if desired, It may include a reporter gene product substrate, an adenylate cyclase activator (eg, FSK), and / or a binding reaction buffer, instructions, instruments.

本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、摂食を促進もしくは抑制する化合物、体重を増加もしくは減少させる化合物、または肥満を促進もしくは抑制する化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩は、摂食（もしくは食欲）調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症または各種疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い増加もしくは減少した摂食（もしくは食欲）および／または体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、エネルギー代謝に係る疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症など）、ＡＩＤＳ、癌、または悪液質などが挙げられる。
本発明によるスクリーニング方法によって、リラキシン−３受容体、好ましくはＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドを介した細胞刺激活性、より具体的には、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに天然リガンドが結合すると引き起こされる細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）の阻害作用（ＳＡＬＰＲ阻害作用）を有する化合物が提供される。このような化合物を含有する薬剤として、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが挙げられる。 The pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method of the present invention The compound obtained by the screening method of the present invention is a compound that promotes or suppresses eating, a compound that increases or decreases body weight, or a compound that promotes or suppresses obesity. is there. The compound may form a salt, and includes a pharmaceutically acceptable salt. Therefore, the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof can be used to treat a disease caused by any abnormality in feeding (or appetite) regulation, treatment of a disease caused by any abnormality in body weight regulation, or any abnormality in regulation of obesity. It can be used as a medicament for the treatment of diseases caused by, and the treatment of diseases caused by abnormalities of relaxin-3 or a polynucleotide encoding relaxin-3. Moreover, it can also be used as a medicine for treatment aimed at recovery of body weight (or appetite) and / or body weight increased or decreased with the onset of various diseases or treatment of various diseases (for example, during or after surgery). Examples of the diseases include diseases relating to gastrointestinal motility or function (for example, diarrhea, constipation, functional constipation, irritable bowel syndrome, promotion of defecation for intestinal contents at the time of gastrointestinal examination or before and after surgery), Diseases related to immune function regulation (eg rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, kidney disease, scleroderma, atopic dermatitis, bronchial asthma, multiple sclerosis, rheumatic interstitial pneumonia, sarcoidosis, Crohn's disease, Inflammatory colitis, cirrhosis, chronic hepatitis, fulminant hepatitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, etc., diseases related to energy metabolism (eg diabetes, obesity diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy) Diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, arteriosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, obesity, obesity, eating disorders, anorexia, etc.), AIDS, cancer, or evil Examples include liquid quality.
Cell-stimulating activity via a relaxin-3 receptor, preferably SALPR or a partial polypeptide thereof, more specifically cell stimulation caused by binding of a natural ligand to SALPR or a partial polypeptide by the screening method according to the present invention Activity (eg, intracellular calcium release, adenylate cyclase activation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phospholipid production, cell membrane potential change, pH change in the vicinity of cell membrane, phosphorylation of intracellular protein, c- A compound having an inhibitory action (SALPR inhibitory action) of fos and c-jun induction activity, arachidonic acid release and the like is provided. Examples of drugs containing such compounds include antifeedants, weight loss agents, fat loss agents, obesity treatment agents, and diabetes treatment agents.

得られた化合物またはその塩を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。 The obtained compound or a salt thereof can be used alone, but can also be used as a pharmaceutical composition by blending with a pharmaceutically acceptable carrier. The ratio of the active ingredient to the carrier at this time can vary between 1 and 90% by weight. In addition, such drugs are used for human or non-human organisms [eg, non-human mammals (eg, cattle, monkeys, birds, cats, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc.), birds, reptiles, amphibians, fish, insects. Etc.] can be administered in various forms, oral or parenteral (eg intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration). Therefore, the pharmaceutical composition containing the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof is in an appropriate dosage form according to the administration route, specifically, tablet, capsule, granule, powder, or syrup. Oral preparations such as injections, or parenteral preparations such as injections, drops, liposomes, suppositories and the like. These preparations are usually used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surface active agents, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives. It can be produced by a conventional method using a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer and the like. Examples of the non-toxic additive that can be used include lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium stearate, methylcellulose, or a salt thereof, ethanol, citric acid, sodium chloride, sodium phosphate, and the like.

それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇ、好ましくは約１０〜５００μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。 As for the dosage form, the necessary dosage range depends on the selection of the compound or its salt obtained by the screening method of the present invention, the subject to be administered, the route of administration, the nature of the preparation, the condition of the patient, and the judgment of the doctor. It depends. However, an appropriate dose is, for example, about 1.0 to 1,500 μg, preferably about 10 to 500 μg, per kg of the patient's body weight. Given the differing efficiencies of the routes of administration, the required dosage is expected to vary widely. For example, oral administration is expected to require a higher dose than administration by intravenous injection. These dosage level variations can be adjusted using standard empirical optimization procedures, as is well understood in the art.

リラキシン−３の活性を阻害する物質およびその使用
本発明に使用するリラキシン−３（すなわち、リラキシン−３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の活性を阻害する物質によれば、摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を抑制または阻害することができる。そこで、リラキシン−３の発現を阻害するものは、リラキシン−３のｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏにおける摂食制御および体重制御に伴う機能（例えばエネルギー代謝調節、成長など）、肥満を制限するのに利用できる可能性がある。 Substance that inhibits the activity of relaxin-3 and use thereof According to the substance that inhibits the activity of relaxin-3 (that is, relaxin-3, modified polypeptide, homologous polypeptide) used in the present invention, It can suppress or inhibit the body weight gain action and obesity action. Thus, those that inhibit relaxin-3 expression limit relaxin-3 in vivo, ex vivo and in vitro functions associated with feeding and body weight control (eg, energy metabolism regulation, growth, etc.), obesity May be available.

本発明に使用するリラキシン−３の活性を阻害する物質には、該活性を有する限り特に制限はないが、例えばリラキシン−３をコードする塩基配列のアンチセンス配列を有するＤＮＡや、リラキシン−３をコードする塩基配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、リボザイム等リラキシン−３の発現を阻害するもの、あるいはリラキシン−３の抗体や糖タンパク質、さらには上記スクリーニング方法により得られる化合物等のリラキシン−３もしくはリラキシン−３受容体（好ましくは、ＳＡＬＰＲ）と相互作用してリラキシン−３が有する活性を阻害する物質等が挙げられる。
当該物質は塩を形成してもよく、薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、リラキシン−３（すなわち、リラキシン−３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の活性を阻害する物質またはその塩は、摂食（もしくは食欲）調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、疾患の発症または疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い増加した摂食（もしくは食欲）および／または体重の減少を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、またはエネルギー代謝に係る疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害など）などが挙げられる。好ましくは、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などとして使用することができる。The substance that inhibits the activity of relaxin-3 used in the present invention is not particularly limited as long as it has the activity. For example, DNA having an antisense sequence encoding relaxin-3, relaxin-3 Double interfering RNA (siRNA) having a base sequence to be encoded, one that inhibits the expression of relaxin-3 such as ribozyme, relaxin-3 antibody or glycoprotein, and compounds obtained by the above screening method, etc. And substances that interact with relaxin-3 or relaxin-3 receptor (preferably SALPR) and inhibit the activity of relaxin-3.
The substance may form a salt, including a pharmaceutically acceptable salt. Therefore, a substance or a salt thereof that inhibits the activity of relaxin-3 (ie, relaxin-3, a modified polypeptide, a homologous polypeptide) or treatment of a disease caused by any abnormality in feeding (or appetite) regulation, weight regulation It can be used as a medicament for the treatment of diseases caused by some abnormality in obesity, the treatment of diseases caused by some abnormality in the regulation of obesity, and the treatment of diseases caused by abnormality of relaxin-3 or a polynucleotide encoding relaxin-3 . It can also be used as a medicine for treatment aimed at increasing eating (or appetite) and / or reducing body weight with the onset of disease or treatment of disease (for example, during or after surgery). Examples of the diseases include diseases relating to gastrointestinal motility or function (for example, diarrhea, constipation, functional constipation, irritable bowel syndrome, promotion of defecation for intestinal contents at the time of gastrointestinal examination or before and after surgery), Diseases related to immune function regulation (eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, kidney disease, scleroderma, atopic dermatitis, bronchial asthma, multiple sclerosis, rheumatic interstitial pneumonia, sarcoidosis, Crohn's disease, Inflammatory bowel disease, cirrhosis, chronic hepatitis, fulminant hepatitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, or diseases related to energy metabolism (eg, diabetes, obesity diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic nerves) Disorders, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, arteriosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, obesity, obesity, eating disorders, etc.). Preferably, it can be used as an antifeedant, weight loss agent, fat loss agent, obesity treatment agent, diabetes treatment agent, and the like.

アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する機構としては、（１）３重鎖形成による転写開始阻害、（２）ＲＮＡポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（３）合成中のＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、（４）イントロン−エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（５）スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（６）ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による、ｍＲＮＡの細胞質への移行抑制、（７）キャッピング部位またはポリＡ付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（８）翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（９）リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（１０）ｍＲＮＡ翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（１１）核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島および井上『新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７（１９９３））。 Antisense nucleic acid suppresses target gene expression as follows: (1) Transcription initiation inhibition by triple chain formation, (2) Transcription suppression by hybridization with a local open loop structure site formed by RNA polymerase (3) Transcriptional inhibition by hybridization with RNA during synthesis, (4) Splicing suppression by hybridization at intron-exon junction, (5) Splicing suppression by hybridization with spliceosome formation site, (6) mRNA (7) Suppression suppression by hybridization with capping site or poly A addition site, (8) Suppression of translation initiation by hybridization with translation initiation factor binding site, (7) 9) High with ribosome binding site (10) Inhibition of peptide chain elongation by hybridization with an mRNA translation region or polysome binding site, and (11) Inhibition of gene expression by hybridization between a nucleic acid and a protein interaction site ( Hirashima and Inoue, “Seminar of Experimental Chemistry 2 Nucleic Acid IV Gene Replication and Expression”, edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, pp. 319-347 (1993)

本発明に使用するリラキシン−３のアンチセンス核酸は、上述の（１）〜（１１）のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。すなわち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードするＤＮＡは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなく、効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上であり、通常３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内、より好ましくは１０００ｂｐ以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、リラキシン−３の配列情報を基に、ホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ（１９８８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：３２０９−２１）等により調製することができる。 The relaxin-3 antisense nucleic acid used in the present invention may be a nucleic acid that suppresses gene expression by any of the mechanisms (1) to (11) described above. That is, it may contain an antisense sequence for the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene of interest. The DNA encoding the antisense nucleic acid can be used by ligating under an appropriate control sequence that allows its expression. The antisense nucleic acid does not need to be completely complementary to the translated region or untranslated region of the target gene, and may be any nucleic acid that effectively inhibits the expression of the gene. Such an antisense nucleic acid has a chain length of at least 15 bp or more, preferably 100 bp or more, more preferably 500 bp or more, and usually within 3000 bp, preferably within 2000 bp, more preferably within 1000 bp, and transcription of the target gene. It is preferably 90% or more, more preferably 95% or more identical to the complementary strand of the product. Such an antisense nucleic acid can be prepared by the phosphorothioate method (Stein (1988) Nucleic Acids Res. 16: 3209-21) based on the sequence information of relaxin-3.

リボザイムとは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザイム（ｌａｒｇｅｒｉｂｏｚｙｍｅ）およびスモールリボザイム（ｓｍａｌｌｌｉｂｏｙｍｅ）に分類される。ラージリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に５’−リン酸と３’−ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザイムは、さらに（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのトランスエステル化反応を行なうグループＩイントロンＲＮＡ、（２）ラリアット構造を経る二段階反応により自己スプライシングを行なうグループＩＩイントロンＲＮＡ、および（３）加水分解反応によるｔＲＮＡ前駆体を５’側で切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ成分に分類される。それに対して、スモールリボザイムは、比較的小さな構造単位（４０ｂｐ程度）であり、ＲＮＡを切断して、５’−ヒドロキシル基と２’−３’環状リン酸を生じさせる。スモールリボザイムには、ハンマーヘッド型（Ｋｏｉｚｕｍｉｅｔａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２２８：２２５）、ヘアピン型（Ｂｕｚａｙａｎ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２３：３４９；ＫｉｋｕｃｈｉａｎｄＳａｓａｋｉ（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物３０：１１２）等のリボザイムが含まれる。リボザイムは、改変および合成が容易なため多様な改良方法が公知であり、例えばリボザイムの基質結合部を標的部位近くのＲＮＡ配列と相補的となるように設計することにより、標的ＲＮＡ中の塩基配列ＵＣ、ＵＵまたはＵＡを認識して切断するハンマーヘッド型リボザイムを作ることができる（Ｋｏｉｚｕｍｉｅｔａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２２８：２２５；小泉誠および大塚栄子（１９９０）蛋白質核酸酵素３５：２１９１；Ｋｏｉｚｕｍｉｅｔａｌ．（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７０５９）。ヘアピン型のリボザイムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である（ＫｉｋｕｃｈｉａｎｄＳａｓａｋｉ（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物３０：１１２）。 Ribozyme is a general term for catalysts having RNA as a component, and is roughly classified into large ribozyme and small ribozyme. A large ribozyme is an enzyme that cleaves the phosphate ester bond of a nucleic acid and leaves a 5'-phosphate and 3'-hydroxyl group at the reaction site after the reaction. Large ribozymes are further divided into (1) a group I intron RNA that undergoes transesterification reaction at the 5′-splice site with guanosine, (2) a group II intron RNA that undergoes self-splicing through a two-step reaction via a lariat structure, and ( 3) It is classified as an RNA component of ribonuclease P that cleaves the tRNA precursor by hydrolysis reaction on the 5 ′ side. In contrast, small ribozymes are relatively small structural units (about 40 bp) that cleave RNAs to produce 5'-hydroxyl groups and 2'-3 'cyclic phosphates. Small ribozymes include hammerhead type (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225), hairpin type (Buzyan (1986) Nature 323: 349; Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acid. 1992; Ribozymes such as Hiroshi Kikuchi (1992) Chemistry and Biology 30: 112) are included. Since ribozymes are easy to modify and synthesize, various improved methods are known. For example, by designing the ribozyme substrate binding part to be complementary to the RNA sequence near the target site, the nucleotide sequence in the target RNA A hammerhead ribozyme that recognizes and cleaves UC, UU or UA can be made (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225; Makoto Koizumi and Eiko Otsuka (1990) Protein Nucleic Acid Enzyme 35: 2191; Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7059). A hairpin ribozyme can also be designed and manufactured according to a known method (Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751; Hiroshi Kikuchi (1992) Chemistry and Biology 30: 112).

１９９８年に、線虫においてＲＮＡ同士が邪魔し合い働きを失う現象（ＲＮＡ干渉）が観察された（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：８０６−１１）。ＲＮＡ干渉とは、二本鎖の人工ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有するＲＮＡが分解される現象である。その後の研究により、ＲＮＡ干渉等のＲＮＡサイレンシングの現象は、欠陥を持つｍＲＮＡの排除、並びにトランスポゾン、ウイルス等の寄生体に対する防御のための細胞機構であることが示唆されている。現在では、多くの遺伝子の発現を抑制するためのツールとして、二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が利用されており、病気の原因遺伝子等の発現抑制をｓｉＲＮＡを用いて行なうことにより病気を治療・予防する方法も検討されている。本発明のｓｉＲＮＡは、リラキシン−３のｍＲＮＡの転写を阻害する限り、特に限定されない。通常、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの配列に対するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組合せであり、少なくとも１０個から標的ｍＲＮＡと同じ個数までのヌクレオチド長を有する。好ましくは、１５〜７５個、より好ましくは１８〜５０個、さらに好ましくは２０〜２５個のヌクレオチド長である。リラキシン−３の発現を抑制するために、ｓｉＲＮＡは公知の方法により細胞に導入することができる。例えばｓｉＲＮＡを構成する二本のＲＮＡ鎖を、一本鎖上にコードするＤＮＡを設計し、該ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を該発現ベクターで形質転換し、ｓｉＲＮＡをヘアピン構造を有する二本鎖ＲＮＡとして細胞内で発現させることができる。トランスフェクションにより持続的にｓｉＲＮＡを産生するプラスミド発現ベクターも設計されている（例えばＲＮＡｉ−ＲｅａｄｙｐＳＩＲＥＮＶｅｃｔｏｒ、ＲＮＡｉ−ＲｅａｄｙｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱＶｅｃｔｏｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ社））。ｓｉＲＮＡの塩基配列は、例えばＡｍｂｉｏｎｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的ｓｉＲＮＡをスクリーニングするためのキット（例えばＢＤＫｎｏｃｋｏｕｔＲＮＡｉＳｙｓｔｅｍ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ社））等も市販されており利用可能である。 In 1998, a phenomenon (RNA interference) was observed in which C. elegans interfered with RNA and lost its function (Fire et al. (1998) Nature 391: 806-11). RNA interference is a phenomenon in which RNA having the same base sequence is degraded by introducing double-stranded artificial RNA into a cell. Subsequent research suggests that RNA silencing phenomena such as RNA interference are cellular mechanisms for the elimination of defective mRNAs and protection against parasites such as transposons and viruses. At present, double-stranded RNA (siRNA) is used as a tool for suppressing the expression of many genes, and the disease is suppressed by using siRNA to suppress the expression of the causative gene of the disease. Methods for treating and preventing the disease are also being studied. The siRNA of the present invention is not particularly limited as long as it inhibits the transcription of relaxin-3 mRNA. The siRNA is usually a combination of a sense strand and an antisense strand with respect to the target mRNA sequence, and has a nucleotide length of at least 10 up to the same number as the target mRNA. The length is preferably 15 to 75, more preferably 18 to 50, and still more preferably 20 to 25 nucleotides. In order to suppress the expression of relaxin-3, siRNA can be introduced into cells by a known method. For example, a DNA that codes two RNA strands constituting siRNA on a single strand is designed, the DNA is incorporated into an expression vector, a cell is transformed with the expression vector, and the siRNA has two hairpin structures. It can be expressed in a cell as a strand RNA. Plasmid expression vectors that continuously produce siRNA by transfection have also been designed (eg, RNAi-Ready pSIREN Vector, RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector (BD Biosciences Clontech)). The base sequence of siRNA can be designed, for example, using a computer program of Ambion website (http://www.amion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Kits for screening functional siRNA (for example, BD Knockout RNAi System (BD Biosciences Clontech)) and the like are also commercially available.

患者の細胞内における遺伝子の発現を制御するための遺伝子治療において、本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡを、直接組織に投与してもよく、またはこれらを発現するように作成された構築物を有する任意のベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス由来のベクター、リポソーム等を利用した非ウイルスベクター）を、直接組織に投与してもよい（ｉｎｖｉｖｏ法）。これらは、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射等によって、組織部位へ注入することができる。
または、予め体外で、細胞に、本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡを発現するように作成された構築物を有するベクターを導入してもよい。得られた細胞を、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射等により患者の組織に注入する（ｅｘｖｉｖｏ法）。使用細胞は、患者の細胞と異種または同種であってよいが、好ましくは同種、より好ましくは患者から採取した細胞である。In gene therapy for controlling gene expression in a patient's cells, the antisense nucleic acids, ribozymes and siRNAs of the present invention may be administered directly to tissue or constructs made to express them. Arbitrary vectors (for example, vectors derived from viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, non-viral vectors using liposomes, etc.) may be directly administered to tissues (in vivo method). These can be injected into the tissue site by, for example, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraarterial injection, intravenous injection, and the like.
Or you may introduce | transduce the vector which has the construct produced so that the antisense nucleic acid, ribozyme, and siRNA of this invention may be expressed beforehand in a cell in vitro. The obtained cells are injected into a patient's tissue by, for example, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraarterial injection, intravenous injection, etc. (ex vivo method). The cells used may be xenogeneic or allogeneic with the patient's cells, but are preferably allogeneic, more preferably cells taken from the patient.

本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ、またはこれらを発現するように作成された任意のベクターは、単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合されて、医薬品組成物（例えば摂食抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤）として使用され得る。例えば、注射剤の形態で投与する場合には、医薬品組成物は、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等を含んでもよい。
これらの投与量は、患者の体重、年齢、症状、投与形態等により変動するが、当業者であれば、必要に応じて適当な投与量を選択することができる。The antisense nucleic acid, ribozyme and siRNA of the present invention, or any vector prepared to express them can be used alone, but can be used in combination with a pharmaceutically acceptable carrier to produce a pharmaceutical composition. It can be used as a product (for example, an antifeedant, a therapeutic agent for obesity, a therapeutic agent for diabetes). For example, when administered in the form of an injection, the pharmaceutical composition comprises a salt solution such as distilled water, sodium chloride or a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, a sugar solution such as mannitol, lactose, dextran, glucose, glycine An amino acid solution such as arginine, an organic acid solution, or a mixed solution of a salt solution and a glucose solution may be included.
These dosages vary depending on the weight, age, symptoms, dosage form, etc. of the patient, but those skilled in the art can select appropriate dosages as necessary.

本発明に使用する抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体フラグメントが含まれる。
本発明に使用するモノクローナル抗体は、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、リラキシン−３（すなわち、リラキシン−３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の手段により得ることができる。例えば前記免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））、または電気細胞融合法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，１００，１８１−１８９（１９８７））を用いて細胞融合し、前記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、本発明に使用するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。Antibodies used in the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and antibody fragments.
The monoclonal antibody used in the present invention is itself, except that relaxin-3 (that is, relaxin-3, modified polypeptide, homologous polypeptide) or a partial fragment thereof is used as an immunizing antigen and a screening antigen. It can be obtained by known means. For example, a mouse is immunized with the antigen for immunization, and a spleen cell obtained from the mouse and a mouse myeloma cell are combined with a cell fusion method (Nature, 256, 495 (1975)) or an electric cell fusion method (J Immunol. Method, 100, 181-189 (1987)) and screening using the screening antigen, a hybridoma producing the monoclonal antibody used in the present invention can be obtained.

前記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好ましくはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥｅａｇｌｅ'ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧおよびストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、５％ＣＯ₂濃度、３７℃の条件下で約３日間行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約１４日間で行なうことができる。The medium for culturing the hybridoma may be any medium suitable for culturing hybridomas, preferably Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium, fetal bovine serum, L -A medium containing glutamine, L-pyruvic acid and antibiotics (penicillin G and streptomycin) is used. When the hybridoma is cultured in a medium, the hybridoma can be cultured under conditions of 5% CO ₂ concentration and 37 ° C. for about 3 days. Moreover, when culturing in the abdominal cavity of a mouse | mouth, it can carry out in about 14 days.

このようにして得られた培養液またはマウスの腹水から、タンパク質の分離および精製常法に従って、前記モノクローナル抗体を分離および精製することが可能である。このような方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析または凍結乾燥などを挙げることができる。 The monoclonal antibody can be separated and purified from the thus obtained culture solution or mouse ascites according to a conventional method for protein separation and purification. Examples of such methods include ammonium sulfate salting out, ion exchange column chromatography using ion-exchange cellulose, molecular sieve column chromatography using molecular sieve gel, affinity column chromatography using protein A-binding polysaccharide, dialysis or freeze-drying, etc. Can be mentioned.

また、本発明に使用するポリクローナル抗体も、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、リラキシン−３（すなわち、リラキシン−３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の方法、例えば以下に示す方法により調製することができる。すなわち、抗原を含む生理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンドもしくは不完全アジュバンド、またはその等価物、例えばＨｕｎｔｅｒ'ｓＴｉｔｅｒＭａｘ^TM（フナコシ社）と乳化混合して、哺乳動物（特にはウサギまたはヤギなど）の皮下、腹腔内または筋肉内などのいずれかに投与する（初回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から１〜２週間後に哺乳動物の頚動脈または心臓から血液を採取して血清を硫酸アンモニウムによって塩析することにより調製することができる。In addition, the polyclonal antibody used in the present invention also uses relaxin-3 (that is, relaxin-3, modified polypeptide, homologous polypeptide) or a partial fragment thereof as an immunizing antigen and a screening antigen, It can be prepared by a method known per se, for example, the method shown below. That is, a physiological saline containing an antigen is emulsified and mixed with an equal amount of Freund's complete or incomplete adjuvant, or an equivalent thereof, such as Hunter's TiterMax ^™ (Funakoshi), and a mammal (particularly a rabbit). Or goat, etc. (subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular) (primary immunization). Thereafter, the same operation is performed at intervals of 2 to 4 weeks and immunized several times. One to two weeks after the final immunization, blood can be collected from the carotid artery or heart of a mammal and serum can be prepared by salting out with ammonium sulfate.

本発明に使用する抗体フラグメントは、前記抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む）の部分断片であって、しかも、元の抗体と同じ反応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。本発明による抗体フラグメントとしては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂ またはＦｖを挙げることができる。本発明に使用する抗体フラグメントは、例えば前記によって得られることができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）によって消化し、続いて、タンパク質の分離および精製の常法に従って得ることができる。The antibody fragment used in the present invention is not particularly limited as long as it is a partial fragment of the antibody (including monoclonal antibody and polyclonal antibody) and has the same reaction specificity as the original antibody. Examples of antibody fragments according to the present invention include Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ or Fv. The antibody fragment used in the present invention is obtained by, for example, digesting a monoclonal antibody or a polyclonal antibody that can be obtained as described above with a proteolytic enzyme (for example, trypsin) by a conventional method, followed by a conventional method for protein separation and purification. Obtainable.

また別の態様によれば、本発明に使用する抗体は、国際公開第０１／０６８８６２号パンフレット、特開２００２−３４５４６８号明細書に記載の方法により得ることができる。また。公知となったリラキシン-３の抗体を使用することができ、例えば特開２００２−３４５４６８号明細書の実施例に記載された抗体（モノクローナル抗体：ＨＫ４−１４４−１０）を挙げることができる。 According to another embodiment, the antibody used in the present invention can be obtained by the methods described in WO 01/068862 and JP-A 2002-345468. Also. A known antibody of relaxin-3 can be used, and examples thereof include an antibody (monoclonal antibody: HK4-144-10) described in Examples of JP-A-2002-345468.

本発明に使用する抗体は、医薬品組成物として用いることもでき、例えば摂食（もしくは食欲）抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤として使用することができる。本発明に使用する抗体は、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることができる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明の抗体を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。 The antibody used in the present invention can also be used as a pharmaceutical composition. For example, it can be used as an antifeedant (or appetite) inhibitor, a therapeutic agent for obesity, or a therapeutic agent for diabetes. The antibody used in the present invention can be used as a pharmaceutical composition by blending with a pharmaceutically acceptable carrier. The ratio of the active ingredient to the carrier at this time can vary between 1 and 90% by weight. In addition, such drugs are used for human or non-human organisms [eg, non-human mammals (eg, cattle, monkeys, birds, cats, mice, rats, hamsters, pigs, dogs, etc.), birds, reptiles, amphibians, fish, insects. Etc.] can be administered in various forms, oral or parenteral (eg intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration). Therefore, the pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention is in an appropriate dosage form according to the administration route, specifically, an oral preparation such as a tablet, capsule, granule, powder or syrup, or injection. And parenteral preparations such as pills, drops, liposomes, suppositories and the like. These preparations are usually used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surface active agents, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives. It can be produced by a conventional method using a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer and the like. Examples of the non-toxic additive that can be used include lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium stearate, methylcellulose, or a salt thereof, ethanol, citric acid, sodium chloride, sodium phosphate, and the like.

それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、抗体の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。 For these dosage forms, the required dosage range also depends on the choice of antibody, the subject to be administered, the route of administration, the nature of the formulation, the condition of the patient, and the judgment of the physician. However, an appropriate dose is, for example, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 10 mg, per kg of the patient's body weight. Given the differing efficiencies of the routes of administration, the required dosage is expected to vary widely. For example, oral administration is expected to require a higher dose than administration by intravenous injection. These dosage level variations can be adjusted using standard empirical optimization procedures, as is well understood in the art.

リラキシン−３もしくはリラキシン−３受容体（好ましくはＳＡＬＰＲ）と相互作用し、リラキシン−３の活性を阻害する物質は、本発明のスクリーニング法によって得ることができる。前記スクリーニング方法によって得られる化合物の好適例として、後述する実施例に記載された1,2,5-oxadiazolo[3,4-a]1,2,5-oxadiazolo[3,4-e]1,2,5-oxadiazolo[3,4-i]1,2,5-oxadiazolo[3,4-m][16]annulene（以下、「化合物１」と称する場合もある。）を挙げることができる。当該化合物の投与形態は、前記本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬に関する記載を参照すればよい。 A substance that interacts with relaxin-3 or relaxin-3 receptor (preferably SALPR) and inhibits the activity of relaxin-3 can be obtained by the screening method of the present invention. As preferable examples of the compound obtained by the screening method, 1,2,5-oxadiazolo [3,4-a] 1,2,5-oxadiazolo [3,4-e] 1, described in Examples described later, are used. 2,5-oxadiazolo [3,4-i] 1,2,5-oxadiazolo [3,4-m] [16] annulene (hereinafter sometimes referred to as “compound 1”). The dosage form of the compound may be referred to the description relating to the pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method of the present invention.

本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a）〜(c)の治療を含む：
（a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（b）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（c）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。As used herein, “treatment” generally means obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect. The effect is prophylactic in terms of completely or partially preventing the disease and / or symptoms and therapeutic in terms of partial or complete cure of the adverse effects caused by the disease and / or disease. As used herein, “treatment” includes any treatment of diseases of mammals, particularly humans, and includes, for example, the following treatments (a) to (c):
(A) prevent the occurrence of a disease or symptom in a patient who may have a predisposition to the disease or symptom but has not yet been diagnosed;
(B) inhibit disease symptoms, ie prevent or delay its progression;
(C) To alleviate disease symptoms, i.e., cause a regression of the disease or symptoms, or reverse the progression of symptoms.

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。 In addition, all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.

以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited at all by these Examples.

［実施例１］ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドの調製
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号３で表される核酸配列を基にして、以下のように行った。配列番号３では１８５７塩基対が示されており、ＳＡＬＰＲをコードする領域は、３６１番目から１７７０番目（１４１０塩基対，４７０アミノ酸残基）とされている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）により遺伝子を単離するために、配列番号５および配列番号６で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作製した。[Example 1] Preparation of polynucleotide encoding SALPR The isolation of a polynucleotide encoding SALPR was carried out as follows based on the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 shows 1857 base pairs, and the region encoding SALPR is from the 361st to the 1770th (1410 base pairs, 470 amino acid residues) (GenBank accession number NM_016568). In order to isolate a gene by PCR (polymerase chain reaction), PCR primers represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 were prepared according to a conventional method.

ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型として、配列番号５および配列番号６の組合せからなるＰＣＲプライマーと、ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、（９８℃ １分−５７℃ １分−７２℃ ３分）を添付の操作方法に従い、３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。その結果、約１，４００塩基対のＤＮＡ断片を得た。 Using human genomic DNA (Roche Diagnostics) as a template, PCR primer comprising a combination of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics) (98 ° C. 1 min-57 ° C. PCR was performed by repeating 30 times at −72 ° C. for 3 minutes according to the attached operation method. As a result, a DNA fragment of about 1,400 base pairs was obtained.

このＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ＡＢＩｐｒｉｓｍＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により配列を確認した。その結果、配列番号５および６からなるプライマーの組合せによって得られたｐＣＲ２．１−ＳＡＬＰＲに挿入された１４１０塩基対の配列は、配列番号３における３６１番目から１７７０番目と長さは同一であったが、配列中には１つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列から翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであり、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。 This DNA fragment was inserted into pCR2.1 (Invitrogen), and the sequence was confirmed with ABI prism DNA sequencing kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems). As a result, the length of the 1410 base pair sequence inserted into pCR2.1-SALPR obtained by the combination of primers consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6 was the same as the 361st to 1770th sequences in SEQ ID NO: 3. However, one mutation was found in the sequence. It was clear that this mutation had no effect on the amino acid translated from the nucleic acid sequence at the relevant site, and a polynucleotide encoding SALPR could be obtained.

［実施例２］レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄＬａｎｄ，Ｈ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．ｖｏｌ．１８３５８７−３５９６（１９９０））（配列番号７）からＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）領域を除き、末端をＫｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）領域を切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＨを得た。[Example 2] Preparation of retroviral vector plasmid Cleaved from pBabe Puro (Morgenstern, JP and Land, H. Nucleic Acids Res. Vol. 18 3587-3596 (1990)) (SEQ ID NO: 7) As a result, the SV40 promoter-puro (r) region was removed, and the ends were smoothed by Klenow fragment. Here, the IRES-hyg (r) region was excised from pIREShyg (Clontech) with NsiI and XbaI, and the ends blunted with T4 polymerase were inserted to obtain pBabeXIH.

ｐＢａｂｅＸＩＨからＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）からＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た。 The 5'-LTR-packaging signal was removed from pBabeXIH by digestion with SspI and BamHI. 5′LTR-CMV promoter-packaging signal cut by cutting with SspI and BamHI from pCLXSN (IMGENEX) was inserted into pBabeCLXIH.

［実施例３］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
前記実施例２に記載のレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ前記実施例１で得たｐＣＲ２．１−ＳＡＬＰＲからＥｃｏＲＶで切断することによりＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨを得た（図１）。[Example 3] Preparation of retroviral vector plasmid for SALPR gene introduction The retroviral expression plasmid pBabeCLXIH described in Example 2 above was digested with the restriction enzyme HpaI. Here, the polynucleotide encoding SALPR was cut out from pCR2.1-SALPR obtained in Example 1 by cutting with EcoRV, and its end was blunted with T4 polymerase to obtain pBabeCL (SALPR) IH. (FIG. 1).

［実施例４］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０⁶個の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）でＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）−１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）１００μｇ／ｍｌ（ＰＳ）（以下、「ＥＢＮＡ培養液」と称する）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、および実施例３で得たＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨ）それぞれ３．３μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ社）を用いて、前記２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。その６〜１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。[Example 4] Preparation of retroviral vector for SALPR gene introduction 2 × 10 ⁶ 293-EBNA cells (Invitrogen) were placed in a 10 cm collagen coated dish (IWAKI) with DMEM (Sigma) -10% fetal bovine serum ( FCS) -penicillin 100 units / ml Streptomycin 100 μg / ml (PS) (hereinafter referred to as “EBNA culture medium”) 10 ml was used for culture. The next day, pV-gp (pVPack-GP (Stratagene) was cut by NsiI and XbaI to remove IRES-hisD, and then was self-cyclized after T4 polymerase), pVPack-VSV-G (Stratagene) , And 3.3 μg of the SALPR gene introduction retrovirus vector plasmid (pBabeCL (SALPR) IH) obtained in Example 3 were transfected into the 293-EBNA cells using TransIT (Panvera) as a lipofection reagent. . After 6 to 12 hours, the EBNA culture medium was changed and the culture was continued at 37 ° C.

トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００×ｇで１０分間遠心した。
その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ５０Ｕｌｔｒａ−ＣｌｅａｒＴｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ社）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使って１９，５００ｒｐｍ１００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。１時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。Two days after transfection, the culture solution was collected and centrifuged at 1,200 × g for 10 minutes.
The supernatant was filtered through a 0.45 μm filter (Millipore) as a non-concentrated retrovirus vector, and the virus vector was further concentrated as follows.
Ultracentrifugation tube 50 Ultra-Clear Tubes (Beckman) was disinfected with 70% ethanol, rinsed with distilled water, and about 35 ml of non-concentrated virus vector was put therein. This was put into an ultracentrifugal rotor SW28 (Beckman) and centrifuged at 19,500 rpm for 100 minutes using an ultracentrifuge XL-90 (Beckman). After centrifugation, the tube from which the supernatant was discarded was placed in ice and allowed to stand. After 1 hour, a concentrated virus vector solution of about 100 μl of the culture solution remaining on the tube wall was obtained.

［実施例５］サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の構築
（１）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーターＤＮＡの作成
公表された論文（Ｄｕｒｏｃｈｅｒｅｔａｌ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２０００２８４（２）：３１６−２６）を参考にｃＡＭＰに応じた転写がみられるｕｎｉｔを以下のように構築した。
ｃＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）を含むｕｎｉｔの作成のために、ＣＲＥｘ２ｈｂ用として配列番号８および配列番号９、ＣＲＥｘ２ｂｐ用として配列番号１０および配列番号１１で表されるオリゴＤＮＡを常法に従い作成した。
それぞれの組合せからなるオリゴＤＮＡを９５℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ）を形成させた。ＣＲＥｘ２ｈｂをＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩ、ＣＲＥｘ２ｂｐをＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで消化するとともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつＤＮＡを精製した後、これら３つのＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋））を一度に連結し（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、得られたプラスミドの配列を解析して、ＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫを作成した。[Example 5] Construction of reporter system-introduced cell SE302 containing a cyclic AMP response element
(1) Preparation of a reporter DNA containing a cyclic AMP responsive element Reference is made to a published paper (Durocher et al. Anal Biochem 2000 284 (2): 316-26). Constructed as follows.
In order to create a unit containing cAMP responding element (CRE), oligo DNAs represented by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 for CREX2hb and SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 for CRex2bp were prepared according to a conventional method.
Double-stranded DNAs (CREx2hb, CREx2bp) were formed by heat-treating the oligo DNA consisting of each combination at 95 ° C. and then gradually lowering the temperature to room temperature. CRex2hb was digested with HindIII, BamHI, and CREx2bp was digested with BamHI and PstI, and pBluescriptIISK (+) (Stratagene) was digested with HindIII and PstI. After the digested DNA was electrophoresed to purify the DNA having restriction enzyme digestion sites at both ends, these three DNAs (CREx2hb, CREx2bp, pBluescriptIISK (+)) were ligated at once, and the resulting plasmid was The sequence was analyzed to create CRE4 / pBluescriptIISK.

次にＶＩＰ（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）プロモーターを含むＤＮＡを得るために配列番号１２および配列番号１３で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作成した。
ＨｕｍａｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型とし、配列番号１２および配列番号１３の組合せからなるＰＣＲプライマーと、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて（９４℃ ３０秒−５５℃ ３０秒−７２℃ １分）を３５回繰り返すことによりＰＣＲしたところ、２６４塩基対のＤＮＡ（配列番号１４）が得られた。この２６４塩基対のＤＮＡをＰｓｔＩで消化するとともにＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＰｓｔＩサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した（図２Ａ）。得られたＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）からＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化した後、得られたＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片の末端平滑化を行なった。Next, PCR primers represented by SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 were prepared according to a conventional method in order to obtain a DNA containing a VIP (vasoactive intestinal peptide) promoter.
Using human genomic DNA (Roche Diagnostics) as a template, PCR primer comprising a combination of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, and recombinant Taq polymerase (Takara) (94 ° C 30 sec-55 ° C 30 sec-72 ° C) When PCR was performed by repeating 1 minute) 35 times, DNA of 264 base pairs (SEQ ID NO: 14) was obtained. This 264 base pair DNA was digested with PstI and inserted into the PstI site of CRE4 / pBluescriptIISK (+), and the resulting plasmid was confirmed to produce CRE4VIP / pBluescriptIISK (+) (FIG. 2A). After digesting with HindIII and SmaI from the obtained CRE4VIP / pBluescriptIISK (+), the resulting CRE4VIP promoter fragment was blunt-ended.

前述の発現用ウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨよりＩＲＥＳ〜ｈｙｇｒｏ（ｒ）領域を除去したｐＢａｂｅＣＬＸを作成した（図２Ｂ）。ｐＢａｂｅＣＬＸよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性（ＬＴＲ）中のＮｈｅＩ〜ＮａｒＩ領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、ＣＲＥとＶＩＰプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）（Ｇｏｔｏら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４９，ｐ．８６０−８７３，１９９６）を導入し、ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを得た（図２Ｃ）。 PBabeCLX was prepared by removing the IRES to hygro (r) region from the aforementioned viral vector plasmid for expression pBabeCLXIH (FIG. 2B). A retroviral vector plasmid for introducing an exogenous promoter obtained by removing the NheI to NarI region in the enhancer activity (LTR) inherent in retrovirus from pBabeCLX, a sequence containing CRE and VIP promoter, and a placenta which is a reporter gene Origin alkaline phosphatase (PLAP) (Goto et al., Molecular Pharmacology, 49, p.860-873, 1996) was introduced to obtain pBabeCLcre4vPdNN (FIG. 2C).

（２）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の樹立
サイクリックＡＭＰ応答配列によりレポーター遺伝子ＰＬＡＰが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを用い、実施例４に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、ＰＬＡＰ誘導の反応性が最も良かったクローン（以下、「ＳＥ３０２細胞」と称する）を以下の実験に供した。 (2) Establishment of a reporter system-introduced cell SE302 containing a cyclic AMP response element The retrovirus vector plasmid pBabeCLcre4vPdNN in which the reporter gene PLAP is induced by the cyclic AMP response element is used according to the method described in Example 4 Vector was prepared. The prepared retroviral vector was introduced into HEK293 cells, the cells were cloned by limiting dilution, and the clone with the best reactivity of PLAP induction (hereinafter referred to as “SE302 cell”) was subjected to the following experiment.

［実施例６］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるＳＡＬＰＲ発現細胞の調製
前記の実施例４で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのＳＡＬＰＲ遺伝子導入を以下のように行った。
前記実施例５で構築した３×１０³個のＳＥ３０２細胞を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（旭テクノガラス社）にＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）−１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）−ＰＳ（以下、「培養液」と称する）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例４で調製したレトロウイルスベクターを適宜希釈し、その１００μｌを培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（別名ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅｂｒｏｍｉｄｅＳｉｇｍａ社）とともにＳＥ３０２細胞に加えた。その翌日、培養液を５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有の培養液２００μｌと交換し培養した。この条件で増殖してきたＳＡＬＰＲ遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、「ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。[Example 6] Preparation of SALPR-expressing cells using a retroviral vector for SALPR gene introduction SALPR gene introduction into cells using the retroviral vector prepared in Example 4 was performed as follows.
3 × 10 ³ SE302 cells constructed in Example 5 were added to 96 well plate (Asahi Techno Glass) DMEM (SIGMA) -10% fetal bovine serum (FCS) -PS (hereinafter referred to as “culture medium”). ) Incubated with 100 μl. On the next day, the retroviral vector prepared in Example 4 was appropriately diluted, and 100 μl thereof was added to SE302 cells together with polybrene (final concentration 8 μg / ml) prepared in culture (also known as hexadimethine bromide Sigma). On the next day, the culture solution was exchanged with 200 µl of a culture solution containing 500 µg / ml Hygromycin (Invitrogen) and cultured. SALPR gene-introduced SE302 cells (hereinafter referred to as “SALPR-SE302 cells”) that had proliferated under these conditions were subcultured at appropriate times for use in experiments.

［実施例７］ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活性のリラキシン−３による抑制
前記実施例６で構築したＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（６５℃にて３０分非働化）を加えたもの）にて縣濁した後、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｓｏｎ社）に１穴あたり１×１０⁴細胞となるようにまいた。翌日、アッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを加えたもの）で希釈した各濃度のリラキシン−３（Ｒｅｌａｘｉｎ−３）（ＰｈｏｅｎｉｘＰｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）またはインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、その後フォルスコリン（ＣａｒｂｉｏＣｈｅｍ社）を最終濃度１μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を１５μｌ回収して化学発光測定用の９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（住友ベークライト社）に移し、アッセイ用緩衝液（２８０ｍｍｏｌ／ＬＮａ₂ＣＯ₃−ＮａＨＣＯ₃、８ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ₄、ｐＨ１０）を６０μｌ、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）７０μｌを添加して、室温にて１時間反応させた後、各ｗｅｌｌの化学発光をＦｕｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清の転写活性を１００％ととし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を０％として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した（図３）。[Example 7] Inhibition of transcriptional activity increased by addition of forskolin in SALPR-SE302 cells by relaxin-3 The SALPR-SE302 cells constructed in Example 6 were treated with a medium for measuring transcriptional activity (DMEM-10% FBS ( The mixture was suspended at 65 ° C. for 30 minutes), and then dispersed in a 96-well plate (Beckton Dickison) at 1 × 10 ⁴ cells per well. The next day, relaxin-3 (Relaxin-3) (Phoenix Pharmaceuticals) or insulin (Invitrogen) diluted in assay medium (DMEM plus 0.1% bovine serum albumin) was added, then Forskolin (Carbio Chem) was added to a final concentration of 1 μmol / L. Further, after culturing for one day, 15 μl of cell supernatant was collected and transferred to a 96-well plate (Sumitomo Bakelite) for chemiluminescence measurement, and assay buffer (280 mmol / L Na ₂ CO ₃ —NaHCO ₃ , 8 mmol / L MgSO _4). , PH 10) 60 μl and Lumiphos 530 (Lumigen) 70 μl were added and allowed to react at room temperature for 1 hour, then the chemiluminescence of each well was measured with a Fusion plate reader (Perkin Elmer) and used as the amount of transcriptional activity. . The transcriptional activity of the cell supernatant to which 1 μmol / L of forskolin was added was assumed to be 100%, the activity of the supernatant of the cell to which forskolin was not added was assumed to be 0%, and the activity in the cell supernatant to which each test sample was added was % (FIG. 3).

その結果、フォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン−３はＳＡＬＰＲの活性化を介して抑制することが分かった。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がなかったので、リラキシン−３特異的な反応であることが分かった。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン−３によるＳＡＬＰＲの活性化に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。 As a result, it was found that relaxin-3 suppresses the increase in transcriptional activity caused by forskolin through activation of SALPR. This increase in transcriptional activity was not affected by the related peptide insulin, and thus was found to be a relaxin-3 specific reaction. That is, by using this experimental system, it was shown that compounds and substances that affect the activation of SALPR by relaxin-3 can be distinguished.

［実施例８］ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を用いたリラキシン−３拮抗物質のスクリーニング
実施例７で示した実験系を用いて、リラキシン−３の作用を拮抗する化合物のスクリーニングを実施し、拮抗作用を持つ化合物を見出した。
ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−１０％ＦＢＳ（６５℃にて３０分非働化）を加えたもの）にて縣濁した後、３８４ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に１穴当たり５０００細胞となるようにまいた。翌日、フォルスコリン（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｋ社）溶液に被験化合物（1,2,5-oxadiazolo[3,4-a]1,2,5-oxadiazolo[3,4-e]1,2,5-oxadiazolo[3,4-i]1,2,5-oxadiazolo[3,4-m][16]annulene（化合物１））を溶解し、細胞上清に添加した（最終濃度：フォルスコリン３μｍｏｌ／Ｌ、被験化合物２０μｇ／ｍＬ，ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｒｆｏｘｉｄｅ）０．５％）。その後、アッセイ用培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２に０．１％ウシ血清アルブミンを加えたもの）で希釈したリラキシン−３（株式会社ペプチド研究所）を最終濃度３ｎｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清５μｌを回収して化学発光測定用の３８４ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、アッセイ用緩衝液を２０μＬ、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０を２５μＬ添加して、室温にて２時間反応させた後、各ｗｅｌｌの化学発光をＡＲＶＯｓｘ３プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）にて測定し転写活性量とした。ＳＡＬＰＲを発現していないＳＥ３０２細胞についても同様に操作し、被験物質の特異性を確認した。[Example 8] Screening of relaxin-3 antagonist using SALPR-SE302 cells Using the experimental system shown in Example 7, screening for a compound that antagonizes the action of relaxin-3 was carried out, and it has an antagonistic action. The compound was found.
After suspending SALPR-SE302 cells in a medium for measuring transcriptional activity (DMEM-F12-10% FBS (inactivated at 65 ° C. for 30 minutes)), 1 was added to 384 well plate (Greiner). It was arranged to have 5000 cells per hole. The next day, test compound (1,2,5-oxadiazolo [3,4-a] 1,2,5-oxadiazolo [3,4-e] 1,2,5-oxadiazolo [3] is added to forskolin (Fermentek) solution. , 4-i] 1,2,5-oxadiazolo [3,4-m] [16] annulene (compound 1)) was added to the cell supernatant (final concentration: forskolin 3 μmol / L, test compound) 20 μg / mL, DMSO (dimethylsulfoxide) 0.5%). Thereafter, relaxin-3 (Peptide Institute, Inc.) diluted with assay medium (DMEM-F12 plus 0.1% bovine serum albumin) was added to a final concentration of 3 nmol / L. Furthermore, after culturing for one day, 5 μl of cell supernatant was collected and transferred to a 384 well plate (Corning) for chemiluminescence measurement, 20 μL of assay buffer and 25 μL of Lumiphos 530 were added, and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, the chemiluminescence of each well was measured with an ARVOsx3 plate reader (Perkin Elmer) to determine the amount of transcription activity. The same procedure was performed on SE302 cells not expressing SALPR, and the specificity of the test substance was confirmed.

その結果、ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン−３が抑制し、被験物質である化合物１がリラキシン−３による転写活性の抑制に拮抗した（図４Ａ）。また、ＳＡＬＰＲを発現していないＳＥ３０２細胞における検討では、化合物１は、転写活性を上昇させることはなかった（図４Ｂ）。したがって被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲのリラキシン−３による活性化を特異的に抑制する化合物であることが確認できた。 As a result, relaxin-3 suppressed the increase in transcriptional activity by forskolin in SALPR-SE302 cells, and compound 1 as a test substance antagonized the suppression of transcriptional activity by relaxin-3 (FIG. 4A). In addition, in studies on SE302 cells that do not express SALPR, Compound 1 did not increase transcriptional activity (FIG. 4B). Therefore, it was confirmed that the action of the test substance is a compound that specifically suppresses activation of SALPR by relaxin-3.

［実施例９］リラキシン−３脳室内投与による摂食量亢進作用
（１）実験動物と脳室内投与のための前処置
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（７週齢、日本チャールズリバー社）に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与えて馴化した。ラット（２５０〜３００ｇ）を麻酔下で、側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上飼育した後に投与実験を行った。
（２）リラキシン−３溶液の調製
６０μｇのリラキシン−３（ＰｈｏｅｎｉｘＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）をＤＭＳＯにて溶解した後、最終濃度が２００μｍｏｌ／Ｌとなるように人工的脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ）を添加して調製した。析出した沈殿は遠心操作をして取り除き、上清をリラキシン−３投与液として用いた。ラットへの投与量（投与液中のリラキシン−３濃度）は実施例７に示された実験系にて、リラキシン−３による標準曲線を用いて算出したところ、約５０ｐｍｏｌ／ラットであった。
（３）リラキシン−３溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着したラットを２群に分け（１群６匹）、リラキシン−３投与液もしくはｖｅｈｉｃｌｅ（リラキシン−３を除いた前記（２）と同じ組成の溶液）を５μＬ／２分の速度でインフュージョンポンプを用いてラットに投与した。
（４）摂餌量の測定
投与液の脳室内投与後すぐに、ラットは予め重量を測定した餌を入れてあるケージに入れ自由摂食させた。２時間後に餌の減少量を測定することで摂餌量を算出した。各群の平均摂餌量と標準偏差を図５に示す。その結果、投与後２時間の摂餌量は、リラキシン−３を約５０ｐｍｏｌ投与したラットでは対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与のラットに比べて有意に増加していた（ｔ−検定、ｐ<０．０１）。従って、リラキシン−３は摂食行動を増加させることが分かった。[Example 9] Increase in food intake by relaxin-3 intraventricular administration
(1) Experimental animals and pretreatment for intraventricular administration Wistar male rats (7 weeks old, Charles River Japan, Inc.) were fed with experimental animal feed MF (Oriental Yeast Co., Ltd.) and acclimated. Rats (250-300 g) were cannulated into the lateral ventricle under anesthesia. Thereafter, the animals were reared for one week or longer, and administration experiments were conducted.
(2) Preparation of relaxin-3 solution After dissolving 60 μg relaxin-3 (Phoenix Pharmaceutical) in DMSO, artificial cerebral spinal fluid was added so that the final concentration was 200 μmol / L. Prepared. The deposited precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was used as a relaxin-3 administration solution. The dose to rats (relaxin-3 concentration in the administration solution) was about 50 pmol / rat when calculated using the standard curve of relaxin-3 in the experimental system shown in Example 7.
(3) Rats equipped with intracerebroventricular guide cannula of relaxin-3 solution were divided into 2 groups (6 mice per group), and relaxin-3 administration solution or vehicle (same composition as (2) above except relaxin-3) Was administered to rats using an infusion pump at a rate of 5 μL / 2 minutes.
(4) Measurement of food intake Immediately after intracerebroventricular administration of the administration solution, the rats were placed in a cage containing pre-weighed food and allowed to eat freely. The amount of food intake was calculated by measuring the amount of food decrease after 2 hours. The average food intake and standard deviation of each group are shown in FIG. As a result, the amount of food consumed 2 hours after administration was significantly increased in rats administered with about 50 pmol of relaxin-3 as compared to control vehicle-treated rats (t-test, p <0.01). Thus, relaxin-3 was found to increase feeding behavior.

［実施例１０］リラキシン−３の単回脳室内投与時の血中レプチン濃度上昇
血中レプチン濃度の測定
摂餌量測定後（投与後約３時間後）に前記ラットをネンブタールにて麻酔し、その腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を１，７５０×ｇで１５分間遠心し、その上清を−８０℃にて保存した。後日、上清中のレプチン量をラットレプチン定量ＥＬＩＳＡキット（アマシャムバイオサイエンス社）により定量した。
その結果、単回のリラキシン−３投与ラットでは対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与のラットより血中のレプチン濃度が有意に上昇することが明らかとなった（ｔ−検定、ｐ<０．０５、図６）。[Example 10] Increase in blood leptin concentration after single intraventricular administration of relaxin-3
Measurement of blood leptin concentration After measuring the amount of food intake (about 3 hours after administration), the rats were anesthetized with Nembutal, and blood was collected from the abdominal aorta. The collected blood was centrifuged at 1,750 × g for 15 minutes, and the supernatant was stored at −80 ° C. Later, the amount of leptin in the supernatant was quantified using a rat leptin quantification ELISA kit (Amersham Bioscience).
As a result, it was clarified that the leptin concentration in the blood was significantly increased in the single relaxin-3 administered rat as compared to the control vehicle administered rat (t-test, p <0.05, FIG. 6).

［実施例１１］リラキシン−３持続投与による体重増加・肥満作用の亢進
（１）リラキシン−３溶液の調製
リラキシン−３（ペプチド研究所社）を生理食塩水にて１００μｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、ｖｅｈｉｃｌｅ（生理食塩水）またはリラキシン−３溶液を浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔｏｓｍｏｔｉｃｐｕｍｐｍｏｄｅｌ１００２（ＤＵＲＥＣＴ社）投与量６μＬ／日）とチューブ・投与用カニューレに注入しそれらを接続した。
（２）実験動物と脳室内投与のための処置
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（６週齢、日本チャールズリバー社）に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与え、個別飼育で４日間馴化した。前記ラット（２５０〜２７０ｇ）を麻酔下で、側脳室にガイドカニューレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。
（３）体重増加作用および摂餌量の測定
手術日を０日目として自由摂食下で飼育し、毎朝、体重と餌量を測定した。０日目からの体重の増加量を図７に示した。また、摂餌量は、手術前日から手術日までを０日目とし、一日当たりの餌の減少量を摂餌量として示した（図８）。
手術後１日目よりリラキシン−３投与ラット群では有意な体重の増加が確認された。また、リラキシン−３投与群の摂餌量も１日目より有意に増加した（ｔ−検定、＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５）。
（４）脂肪量、血中レプチン量およびインスリン量の定量
実験終了日（１４日目）に体重と餌量を測定した後、ラットをネンブタールにて麻酔し、精巣周囲の脂肪を取り出し両精巣周囲の脂肪重量を合わせて測定した（図９）。さらに、腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を１，７５０×ｇで１５分間遠心し、その上清を−８０℃にて保存した。後日、上清中のレプチン量をラットレプチン測定キット（Ｌ）（ＩＢＬ社）により定量した（図１０Ａ）。また上清中のインスリン量を超高感度ラットインスリン測定キット（森永生化学研究所社）により定量した（図１０Ｂ）。
その結果、精巣周囲脂肪量は対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与のラットに比較し、リラキシン−３持続投与群で有意に増加していた。また血中のレプチン濃度とインスリン濃度も、リラキシン−３を持続投与したラットで有意に上昇していることが明らかとなった（ｔ−検定、＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５）。従って、リラキシン−３投与により脂肪蓄積を伴う肥満作用が亢進するとともに、インスリン量が増加することが明らかとなった。[Example 11] Increased body weight and obesity by continuous administration of relaxin-3
(1) Preparation of relaxin-3 solution Relaxin-3 (Peptide Institute, Inc.) is dissolved in physiological saline to a concentration of 100 μmol / L, and vehicle (physiological saline) or relaxin-3 solution is osmotic pumped ( Alzet osmotic pump model 1002 (DURECT) (dose 6 μL / day) was injected into a tube / dose cannula and connected.
(2) Experimental animals and treatment for intraventricular administration Wistar male rats (6-week-old, Charles River Japan) were given experimental animal feed MF (Oriental Yeast) and acclimated for 4 days in individual breeding. Under anesthesia, the rat (250-270 g) was inserted with a guide cannula into the lateral ventricle and an osmotic pump was placed subcutaneously.
(3) Measurement of body weight increasing action and food intake The operation day was set as day 0 and the animals were reared under free feeding, and body weight and food consumption were measured every morning. The amount of increase in body weight from day 0 is shown in FIG. In addition, regarding the amount of food intake, the day before the operation to the day of operation was defined as day 0, and the amount of decrease in food per day was shown as the amount of food intake (FIG. 8).
From the first day after the surgery, a significant increase in body weight was confirmed in the relaxin-3 administered rat group. Moreover, the food intake of the relaxin-3 administration group also increased significantly from the first day (t-test, ** p <0.01, * p <0.05).
(4) Quantitative determination of fat amount, blood leptin amount, and insulin amount After measuring the body weight and the amount of food on the end of the experiment (day 14), the rat was anesthetized with Nembutal, and the fat around the testis was taken out and around both testis The fat weight was measured together (FIG. 9). In addition, blood was collected from the abdominal aorta. The collected blood was centrifuged at 1,750 × g for 15 minutes, and the supernatant was stored at −80 ° C. Later, the amount of leptin in the supernatant was quantified using a rat leptin measurement kit (L) (IBL) (FIG. 10A). In addition, the amount of insulin in the supernatant was quantified with an ultrasensitive rat insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Laboratories) (FIG. 10B).
As a result, the testicular fat amount was significantly increased in the relaxin-3 continuous administration group as compared to the control vehicle-administered rat. It was also clarified that the leptin concentration and insulin concentration in the blood were significantly increased in rats continuously administered with relaxin-3 (t-test, ** p <0.01, * p <0. 05). Therefore, it was clarified that relaxin-3 administration enhances obesity with fat accumulation and increases the amount of insulin.

［実施例１２］リラキシン−３持続投与による体重増加、運動量への作用
（１）リラキシン−３溶液の調製
リラキシン−３（ペプチド研究所社）を生理食塩水にて１００μｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、ｖｅｈｉｃｌｅ（生理食塩水）またはリラキシン−３溶液を浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔｏｓｍｏｔｉｃｐｕｍｐｍｏｄｅｌ１００２（ＤＵＲＥＣＴ社）投与量６μＬ／日）とチューブ・投与用カニューレに注入しそれらを接続した。
（２）実験動物と脳室内投与のための処置
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（５週齢、日本チャールズリバー社）に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与え、個別飼育で５日間馴化した。前記ラット（１７０〜２００ｇ）を麻酔下で、側脳室にガイドカニューレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。手術日を０日として運動量の測定日以外は自由摂食・飲水下で飼育し、毎朝体重を測定した（図１１）。
前記実施例１１と同様に、投与後１日後からリラキシン−３投与ラット群では有意な体重の増加が確認された（ｔ−検定、＊＊ｐ<０．０１、＊ｐ<０．０５）。
（３）自発運動量の測定
前記（２）にて、リラキシン−３投与ラットの体重増加作用に有意な差が認められた日の明期および暗期の自発運動量を、Ｖｅｒｓａｍａｘ（Ａｃｃｕｓｃａｎ社）を用いて測定した。明期（投与開始後２、７日後）、暗期（投与開始後３、８日後）のラットを実験開始の１時間以上前に個別飼育台から実験室へ移動して馴化した後、Ｖｅｒｓａｍａｘケージ内にラットを入れ直後から９０分間の行動量を記録した。９０分間の全活動量を図１２に示した。
いずれの日においても各群のラットで運動量には有意な変化は認められなかった。すなわち、リラキシン−３による体重増加作用は自発運動量の変化が作用しているのではないことが明らかとなった。[Example 12] Effect on body weight gain and exercise by continuous administration of relaxin-3
(1) Preparation of relaxin-3 solution Relaxin-3 (Peptide Institute, Inc.) is dissolved in physiological saline to a concentration of 100 μmol / L, and vehicle (physiological saline) or relaxin-3 solution is osmotic pumped ( Alzet osmotic pump model 1002 (DURECT) (dose 6 μL / day) was injected into a tube / dose cannula and connected.
(2) Experimental animals and treatment for intracerebroventricular administration Wistar male rats (5-week-old, Charles River Japan) were given experimental animal feed MF (Oriental Yeast) and habituated for 5 days in individual breeding. Under anesthesia, the rat (170-200 g) was inserted with a guide cannula into the lateral ventricle and an osmotic pump was placed subcutaneously. The day of surgery was defined as day 0, and the animals were reared under free consumption and drinking water on days other than the day of measurement of exercise, and body weight was measured every morning (FIG. 11).
Similar to Example 11, a significant increase in body weight was confirmed in the relaxin-3 administered rat group 1 day after administration (t-test, ** p <0.01, * p <0.05).
(3) Measurement of Spontaneous Momentum Versamax (Accuscan) was used to determine the spontaneous momentum during the light period and dark period of the day in which a significant difference was observed in the weight-increasing action of relaxin-3 administered rats in (2). Measured. Rats in the light period (2, 7 days after the start of administration) and dark period (3, 8 days after the start of administration) were acclimated from the individual platform to the laboratory at least 1 hour before the start of the experiment, and then the Versamax cage The amount of action for 90 minutes was recorded immediately after the rat was placed inside. The total amount of activity for 90 minutes is shown in FIG.
There was no significant change in the amount of exercise in each group of rats on any day. That is, it became clear that the increase in body weight by relaxin-3 is not due to a change in spontaneous exercise amount.

本発明により、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、あるいは該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などが提供される。 According to the present invention, a polypeptide having a useful feeding enhancing action, weight gain action and obesity action, a disease therapeutic agent containing the polypeptide, a compound, substance or substance that activates or suppresses a receptor of the polypeptide A screening method for the salt, a kit for screening, or an antifeedant, a therapeutic agent for obesity, a therapeutic agent for diabetes, and the like, containing a substance that inhibits the expression of the polypeptide, and the like are provided.

Claims

A feeding enhancer comprising relaxin-3 or a salt thereof.

A weight gain agent comprising relaxin-3 or a salt thereof.

A fat mass increasing agent comprising relaxin-3 or a salt thereof.

Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A method for screening a compound or a salt thereof that enhances feeding, comprising:

Next step;
Relaxin-3 or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening method for a compound or a salt thereof that enhances or suppresses feeding.

Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The screening method of the compound or its salt which enhances or suppresses the feeding of Claim 5 characterized by including these.

The relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof, The screening method according to any one of claims 4 to 6.

The screening method according to claim 7, wherein the SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

A therapeutic agent for a disease requiring weight gain, comprising relaxin-3 or a salt thereof.

The therapeutic agent according to claim 9 , wherein the disease is anorexia nervosa or an epidemic.

Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A screening method for a compound having a weight-increasing action or a salt thereof, comprising:

Next step;
Relaxin-3 or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A screening method for a compound or a salt thereof that increases or decreases body weight, comprising:

Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The screening method of the compound or its salt which increases or decreases the body weight of Claim 12 characterized by including these.

The relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof, The screening method according to any one of claims 11 to 13 .

The screening method according to claim 14 , wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

Next step;
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
A method for screening a compound or a salt thereof for regulating obesity, comprising:

Next step;
Relaxin-3 or a salt thereof, and a test substance,
(A) a step of contacting relaxin-3 receptor, a cell containing relaxin-3 receptor or a cell membrane fraction thereof,
A method for screening a compound or a salt thereof for regulating obesity, comprising:

Next step;
(B) a step of measuring cell stimulating activity via relaxin-3 receptor,
The screening method of the compound or its salt which concerns on obesity regulation of Claim 17 characterized by the above-mentioned.

19. The screening method according to any one of claims 16 to 18 , wherein the relaxin-3 receptor is SALPR or a partial polypeptide thereof.

The screening method according to claim 19 , wherein SALPR is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.