JP4484556B2

JP4484556B2 - 乾癬及び扁平上皮細胞癌の治療のための方法及び医薬組成物

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Publication number: JP4484556B2
Application number: JP2004087300A
Authority: JP
Inventors: 千華片桐; 利彦日比野; 城太郎仲西
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Filing date: 2004-03-24
Publication date: 2010-06-16
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Description

本発明は、細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（Squamous Cell Carcinoma Antigen、以下「ＳＣＣＡ」と称す)の発現を抑制することで、乾癬及び扁平上皮細胞癌から成る群から選ばれる疾患を治療及び／又は予防する方法、医薬組成物を提供する。

ＳＣＣＡは扁平上皮癌細胞から抽出される抗原であり、子宮頚部、肺、食道、皮膚の扁平上皮細胞癌で高い血中濃度を示し、扁平上皮細胞癌の診断によく利用されている（H. Kato et al. Cancer 40:1621-1628 (1977); N．Mino et al. Cancer 62: 730-734 (1988)）。特に、ＳＣＣＡの血中レベルは扁平上皮細胞癌の進行段階、悪性度、腫瘍の大きさなどに良好に相関するため、癌の早期発見のみならず、癌治療効果の評価や再発のおそれの診断などにおいて特に有効な癌マーカーである。

ＳＣＣＡはまた、乾癬表皮の上層において発現の亢進が認められることでも知られる（Takeda A.ら、 J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154）。乾癬は皮膚病の一つであり、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症である乾癬がある。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる（Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85）。

ＳＣＣＡは染色体18ｑ21.3上にタンデムに並んでいる二つの遺伝子ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２遺伝子によりコードされる。それらによりコードされるタンパク質、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２は共に分子量約45,000のタンパク質であり、非常に相同性が高いが、反応部位のアミノ酸配列が異なり、異なる機能を有していると考えられている（Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55）。扁平包皮細胞癌や乾癬などの疾患においてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２が高発現することはわかっていたが、それらが疾患細胞においてどのような機能を果たしているかは不明であった。

Cancer 40:1621-1628 (1977) Cancer 62: 730-734 (1988) J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154 British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85 J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55

本発明者はＳＣＣＡが関与する表皮の生理学的メカニズムの解明を目的とする研究を行っていたところ、ＳＣＣＡが細胞のアポトーシスを抑制する作用を有する抗アポトーシス因子であることを驚くべきことに見出した。

簡単に説明すると、本発明者は皮膚ＵＶ防御メカニズムの検討を行い、ヒト皮膚へのＵＶ照射により有棘層及び顆粒層においてＳＣＣＡの発現が強力に亢進することを明らかにした。そこで、ＳＣＣＡ発現の認められない３Ｔ３細胞にヒトＳＣＣＡ−１及びＳＣＡＡ−２遺伝子を導入して安定発現系を確立し、ＳＣＣＡ安定発現系細胞のＵＶ照射によるアポトーシスを調べたところ、いずれのＳＣＣＡ安定発現系においてもＵＶ照射によるアポトーシスが有意に減少することが明らかになった。
さらに、ＳＣＣＡを高発現するＨａＣａｔ細胞にｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターで恒常的にｓｉＲＮＡを発現させるＲＮＡ干渉法によりＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のノックダウン（ｓｉＳＣＣＡ）細胞株を樹立し、その細胞株にＵＶ照射をした結果、コントロール株と比べ、ＳＣＣＡノックダウン細胞のアポトーシス率が有意に高いことが示された。以上から、本発明者はＳＣＣＡがアポトーシスを抑制する作用を有するタンパク質であると結論づけることができた。

癌や乾癬など、細胞の増殖・分化異常を伴う疾患においては、癌細胞などはアポトーシスの抑制により細胞死から免れ、異常増殖し続けるものと考えられる。従って、ＳＣＣＡの高発現性を示す細胞においては、抗アポトーシス作用を有するＳＣＣＡがその細胞死を抑え、結果としてその細胞の異常増殖につながることが明らかである。よって、アポトーシス抑制作用を有するＳＣＣＡの発現を抑えれば、扁平上皮細胞癌や乾癬など、細胞の増殖異常等を伴う疾患を治療・予防できることが明らかである。

本発明は、上記見地に鑑み、ＳＣＣＡ高発現細胞の増殖異常を伴う疾患、例えば癌、特に扁平上皮細胞癌、さらには乾癬などの治療・予防のための方法、医薬組成物の提供を課題とする。

第１の観点において、本発明は細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を抑制することで、乾癬及び扁平上皮細胞癌から成る群から選ばれる疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。好ましくは、細胞のＳＣＣＡの発現の抑制は、ＳＣＣＡをコードする遺伝子のＲＮＡ干渉により実施する。より好適な態様において、ＲＮＡ干渉には、配列番号１のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号２のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖ＲＮＡを利用する。ここで、上記配列番号１のオリゴヌクレオチドの変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有し、そして上記配列番号２のオリゴヌクレオチドの変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位の相補鎖に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する。

別の観点において、本発明は細胞のＳＣＣＡの発現を抑制することで、乾癬及び扁平上皮細胞癌から成る群から選ばれる疾患を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、ＳＣＣＡをコードする遺伝子に対してＲＮＡ干渉する短鎖ＲＮＡを供する二本鎖ＲＮＡ含有する。より好適な態様において、上記医薬組成物は、配列番号１のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号２のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖ＲＮＡを含有する。ここで、上記配列番号１のオリゴヌクレオチドの変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有し、そして上記配列番号２のオリゴヌクレオチドの変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位の相補鎖に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する。

好適な態様において、上記二本鎖ＲＮＡはベクター、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターの中に含有された形態にある。

本発明はさらに、ＳＣＣＡの発現の抑制された細胞を調製するための方法を提供する。好ましくは、ＳＣＣＡの発現の抑制は、ＳＣＣＡをコードする遺伝子のＲＮＡ干渉により行われる。より好適な態様において、ＲＮＡ干渉には、配列番号１のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号２のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖ＲＮＡを利用する。ここで、上記配列番号１のオリゴヌクレオチドの変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有し、そして上記配列番号２のオリゴヌクレオチドの変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位の相補鎖に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する。本発明はさらに、上記方法によりＳＣＣＡの発現の抑制された細胞及びそのような細胞を含有する哺乳動物も提供する。

本発明により、扁平上皮細胞癌及び乾癬から成る群から選ばれる疾患の治療・予防のための方法、医薬組成物が提供される。

本発明者は、ＳＣＣＡがアポトーシスを抑制する作用を有するタンパク質であることを解明した。従って、ＳＣＣＡの発現を抑制することで、癌や乾癬など、扁平上皮細胞癌抗原を発現する細胞の増殖・分化異常を伴う疾患を治療・予防することができることが明らかである。扁平上皮細胞癌としては、例えば子宮頚、肺、食道、上顎、皮膚などの器官における扁平上皮細胞癌が挙げられる。

ＳＣＣＡは上述のとおり扁平上皮癌細胞や乾癬表皮に存在する分子量約45,000のタンパク質である。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のアミノ酸配列並びにそれらをコードする核酸配列はTakeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)（前掲）に記載されている。

細胞のＳＣＣＡの発現の抑制は、様々な遺伝学的技術、例えばＲＮＡ干渉法、アンチセンスＲＮＡ・ＤＮＡ法、ペプチド及びＲＮＡ・ＤＮＡアプタマー、部位特異的欠失、相同組換え、ドミナントネガティブ対立遺伝子、イントラボディーなど、様々な技術により達成できるが、ＲＮＡ干渉法によるのが特に好ましい。

ＲＮＡ干渉法は、標的遺伝子の一部をコードするｍＲＮＡの一部に対し相補性な２１〜２３塩基対程度のセンスオリゴヌクレオチドを含む鎖と上記ｍＲＮＡの一部に対し相同な２１〜２３塩基対程度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む鎖とから構成される二本鎖ＲＮＡを細胞へ導入することで標的遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法は、遺伝子のコード領域に由来する二本鎖ＲＮＡの干渉特性に基づくもので、線虫の遺伝学的研究において優れた有用性を持つことが証明されており（Fire等, Nature (1998)391:806-811）、ショウジョウバエや哺乳動物においても機能欠損表現型を産出するために利用することができる。

本方法では、ＳＣＣＡ遺伝子の適当な標的領域、好ましくはヌクレオチド長さが約１８〜２３個の領域に相補的な配列（センスオリゴヌクレオチド）と該センス配列に相補性のヌクレオチド長さ約１８〜２３個の配列（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とから構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をインビトロ合成する。好ましくは、二本鎖ＲＮＡはＳＣＣＡ遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位の配列に相補性の配列（ACATGAACTT GGTGTTGGCT T：配列番号１）を含むセンスオリゴヌクレオチドと、上記ヌクレオチド番号４６〜６６位の配列と相同の配列（AAGCCAACAC CAAGTTCATG T；配列番号２）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとから構成される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド全体の長さは特に限定されるものではないが、例えば２５ヌクレオチド以上１００ヌクレオチド以下、好ましくは４０ヌクレオチド以上８０ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以上７０ヌクレオチド以下程度である。

センスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のオリゴヌクレオチドの変異体を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。この変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するものが好ましい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２のオリゴヌクレオチドの変異体を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。この変異体はＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位の相補鎖に対し高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するものが好ましい。ここで高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃であることを含む条件をいう。

得られた二本鎖ＲＮＡは、標的細胞の直接導入するか、又はｄｓＲＮＡをプロモーター、ターミネーターなどの転写に必要な要素をもつベクターに予め連結してから標的細胞に導入してよい。ベクターとしては、当業者周知の様々なものを使用することができるが、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター（Ambion）が好ましい。上記二本鎖ＲＮＡを含有するベクターを細胞に導入することで、細胞内での転写により、配列番号１（又はその変異体）のセンス鎖と配列番号２（又はその変異体）のアンチセンス鎖及びそのセンス鎖とアンチセンス鎖とをつなぐショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成される。ｓｈＲＮＡは次に細胞内のヌクレアーゼ、ダイサーにより２１〜２３塩基対程度の短鎖ＲＮＡ(short interfering RNA）へと切断され、複合体ＲＩＳＣを形成してＳＣＣＡのｍＲＮＡを切断するＲＮＡ干渉を起こし、結果として導入細胞によるＳＣＣＡの発現が抑制される。

好適には、本発明において、ＳＣＣＡの発現を抑制する遺伝子、例えば上記二本鎖ＲＮＡやその他のＳＣＣＡの発現を抑制する遺伝子、例えばアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ又はＤＮＡなど（以下、単に「ＳＣＣＡ発現抑制遺伝子」と称す）を、ＳＣＣＡの発現を抑制し、その結果乾癬や扁平上皮細胞癌の予防・治療のための医薬組成物の活性成分として使用される。上記ＳＣＣＡ発現抑制遺伝子は注射により直接投与するか、該遺伝子が組込まれたベクター又はプラスミドを投与する方法により、患部に投与してよい。

上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よくＳＣＣＡ発現抑制遺伝子を投与することができる。また、ＳＣＣＡ発現抑制遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用することもできる。リポソームは、生分解性材料を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水層や脂質二分子層に遺伝子を保持させる（リポソーム-遺伝子複合体）。次に、該複合体を細胞とともに培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下の投与方法で投与してよい。

上記医薬組成物の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、腫瘍や乾癬が存在する各組織に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することもできる。本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なり、医師などにより適宜決定されるであろう。

プラスミドＤＮＡを直接静脈内に投与すると、ＤＮＡが血中のＤＮａｓｅなどによって即座に分解されてしまうため、遺伝子を発現させることは困難である。そこで、プラスミドＤＮＡを用いる場合は、プラスミドの直接注射法を採用することが好ましい。この方法は、ウイルス性ベクターを用いた方法に比べ、ベクターの精製が簡単であるため、短時間で大量に調製することができ、導入遺伝子の大きさおよび注入時の濃度に制限がないなど、さまざまなメリットを有する（Verma I M et al., Nature 389: 239-242, 1997）。

ＤＮＡ直接注射方法は、精製したプラスミドＤＮＡを生理食塩水などに溶解し、それを直接筋肉内に注射するだけでよい。その結果、注射部位周辺の細胞にプラスミドＤＮＡが取り込まれ、プラスミド上の真核生物の発現ユニットに組み込まれた遺伝子の発現が起こり、その遺伝子産物が作られる。ＤＮＡ直接注射法は、現在筋肉内注射が主流となっているが、腫瘍内（Yang J P et al., Gene. Ther. 3: 542-548, 1996 ）、皮内（Hengge U R et al., J. Clin. Invest. 97: 2911-2916, 1996; Choate K A et al., Hum. Gene. Ther. 8: 1659-1665,1997）などへのプラスミドＤＮＡ直接注射をすることが可能である。

筋肉内注射するプラスミドＤＮＡは、例えば1μg〜1mg、好ましくは25μg〜100μgのＤＮＡを50μlの生理食塩水に溶解し、注射する。これにより、4〜7日後に発現の最高値を得ることができる。

ＳＣＣＡの発現の抑制の確認は、例えば細胞中のＳＣＣＡの量を直接測定することにより行うことができる。好ましくは、細胞からＲＮＡを抽出し、ＳＣＣＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定する。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により行われる。他に、ＳＣＣＡの測定はＳＣＣＡに特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。以上の他、ＳＣＣＡの既知の生物活性を測定することによりＳＣＣＡの発現量を測定することもできる。他に、ＳＣＣＡの発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。

本発明によりＳＣＣＡの発現の抑制される細胞は好ましくは表皮細胞、例えば顆粒細胞、有棘細胞などであってよい。また、そのような細胞を有する哺乳動物としては、ヒト以外に、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サルなどの非ヒト哺乳動物であってよい。本発明に係る動物及び細胞は、例えば表皮のＵＶ防御機構の解明や、ＵＶによる皮膚傷害を予防又は抑制する薬剤の研究・開発やスクリーニングに利用されるモデル動物や細胞としても使用することができる。

以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。

免疫組織化学的検査
表皮生検をＡＭｅＸ手順（Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986)）に従い、冷却アセトンで固定してからパラフィンの中に包埋した。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、アセトン、次いでＰＢＳで洗浄した。次にその切片の非特異的結合部位を１０％正常ウサギ血清(Histofine, Tokyo, Japan)でブロックした。
表皮切片を抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）（1：500に希釈）、抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）（1：500に希釈）又は抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体（Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)に記載のとおりにして精製）のそれぞれとインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をヘマトキシリンでカウンター染色し、ＤＡＫＯＥｎｖｉｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ(DAKO Corp., CA, USA)で観察を行った。

図１は、表皮検体として、非露光部位である上腕部（ヒト24歳）、臀部（ヒト46歳）、太腿部（ヒト75歳）由来の表皮、及び露光部位である頬部（ヒト20歳、76歳）、目瞼（ヒト82歳）由来の表皮を採取し、抗体としてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の両者に結合する抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体を用い、顕微鏡観察した結果である。図１から、非露光部位と比べ、露光部位の表皮上層でＳＣＣＡが顕著に亢進していることがわかる。しかしながら、露光部位でも、基底層ではＳＣＣＡの発現の亢進は認められなかった。

図２は、表皮検体として、ＵＶ照射（トランスルミネーターＴＯＲＥＸＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を施したヒト表皮及び照射を施していないコントロール表皮におけるＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のそれぞれの発現の顕微鏡観察結果である。抗体として、抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体及び抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体それぞれを使用した。図２から、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に、ヒト表皮にＵＶを照射することで発現が亢進されることが明らかとなった。また、発現の亢進は皮膚有棘層及び顆粒層において顕著であった。

以上により、表皮にＵＶが照射されると、表皮、特にその有棘層及び顆粒層においてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現が亢進されることが明らかとなった。

定量ＰＣＲ実験
次に、表皮におけるＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現がＵＶ照射により亢進されることを遺伝子レベルで確認する実験を行った。
ヒト角化細胞をケラチノサイト−ＳＦＭ培地（GIBCO, Invitrogen)中、Ｌ−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、ＣＯ₂５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを０〜４８時間にわたり、照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ²の強度で行った。コントロール細胞にはＵＶＢ照射を施さなかった。

上記培養細胞から総ＲＮＡを、Ｉｓｏｇｅｎ（Nippon Gene)を用い、添付の説明書に従い、単離精製した。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２それぞれの発現レベルを定量リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により決定した。簡単には、総ＲＮＡをSuperscript II（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、ｃＤＮＡへと変換させた。その試料をＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、２−ステップＰＣＲを４０サイクル行い、増幅させた。内部標準としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を用いた。

使用したプライマーは下記のとおりである。
ＳＣＣＡ−１：
順方向プライマー
5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'（配列番号３）
逆方向プライマー
5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'（配列番号４）
Taq Man プローブ
5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(配列番号５）

ＳＣＣＡ−２：
順方向プライマー
5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'（配列番号６）
逆方向プライマー
5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'（配列番号７）
Taq Man プローブ
5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(配列番号８）

ＧＡＰＤＨ：
順方向プライマー
5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（配列番号９）
逆方向プライマー
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（配列番号１０）
Taq Man プローブ
5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(配列番号１１）

リポーター色素（６−カルボキシ−フルオレセイン）をＴａｑＭａｎプローブ配列の５’末端に結合させ、そしてクエンチャー色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）をその３’末端に組み込ませた。

図３に培養ヒト角化細胞におけるＳＣＣＡの発現についてのＵＶＢ照射の影響の結果を示す。ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２、共にＵＶ照射により発現が亢進されることが明らかとなった。従って、表皮細胞はＵＶ照射により、遺伝子レベルでＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２の発現が亢進されることが明らかとなった。

ＵＶ照射におけるＳＣＣＡの役割の検討
以上により、表皮細胞では、ＵＶ照射を受けることでＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現が亢進することが解明された。次に、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２がＵＶ照射を受けた表皮細胞においてどのような役割を担っているかを検討した。

ＳＣＣＡ−１及び２高発現細胞の樹立
３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣより入手）はＳＣＣＡ−１及び２を発現しないマウス胎児由来の細胞である。この細胞に、下記のとおりにしてＳＣＣＡ−１又は２をコードする遺伝子を導入した。
ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のｃＤＮＡ（Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)）をBam HI及びKpn Iで二重消化した。それらをｐＴａｒｇｅｔベクターの中にサブクローニングし、次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（GIBCO, Invitrogen Corp.）を用い、３Ｔ３細胞に導入した。簡単に述べると、無血清ＤＭＥＭ培地（Invitrogen Corp.) ６７５μｌ中のｃＤＮＡ２０μｇを７５μｌのＰｌｕｓ試薬と混合し、２５℃にて１５分放置した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（１００μｌ）を６５０μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、次いでそれを上記ｃＤＮＡ−Ｐｌｕｓ混合物に加え、そして２５℃にて１５分放置した。このｃＤＮＡ混合物を１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、そして３Ｔ３細胞をその中で３７℃にて４時間、５％のＣＯ₂雰囲気下でインキュベーションした。その培地を１０％のＦＣＳ（Invitrogen Corp.）含有のＤＭＥＭ培地と交換し、そして一晩インキュベーションした。翌日、Ｇ４１８（Calbiochem）を最終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように添加した。Ｇ４１８は培養期間中この濃度に保っておいた。培地は２〜３日ごとに交換した。培養４週間後、いくつかのＧ４１８耐性コロニーを単することができ、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２発現細胞系が樹立された。

ＳＣＣＡ−１をコードするｃＤＮＡが導入された細胞（ＳＣＣＡ−１導入細胞）はＳＣＣＡ−１を特異的且つ安定的に発現し、そしてＳＣＣＡ−２をコードするｃＤＮＡが導入された細胞（ＳＣＣＡ−２導入細胞）はＳＣＣＡ−２を特異的且つ安定的に発現することが確認された。また、同様の操作で非特異的な配列の導入された３Ｔ３細胞（コントロール細胞）はＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２のいずれも発現しなかった。

上記ＳＣＣＡ−１導入細胞、ＳＣＣＡ−２導入細胞及びコントロール細胞を用い、表皮細胞にＵＶ照射を与えたときのＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２が果たす役割について検討した。詳しくは、表皮細胞におけるＵＶ誘導アポトーシスに対するＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２の役割について検討した。

上記各種細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で高湿、ＣＯ₂５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを０〜４８時間にわたり、照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ²の強度で行った。

これらの細胞についてのアポトーシス評価はＦＡＣＳＣＯＵＬＴＥＲ（EPIX XL-MCL, Becjman Coulter）を用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech）を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行った。

その結果を図４に示す。図４から明らかなとおり、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２導入細胞のいずれもＵＶ照射によるアポトーシスが有意に減少することが認められた。従って、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に、ＵＶによる誘導されるアポトーシスを抑制できるものと推定された。
このことを確認するため、本発明者は次にＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２ノックダウン細胞株をＲＮＡ干渉法により樹立し、ＵＶ照射における表皮細胞内でのＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の役割についてさらに検討した。

ＳＣＣＡノックダウン細胞の樹立
ＨａＣａｔ細胞（H. Hans. et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998)）はＳＣＣＡを高発現するヒト角化細胞である。この細胞に、ＲＮＡ干渉法に従い、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター（Ambion）で恒常的にｓｉＲＮＡ（short interference RNA）を発現させることにより、ＳＣＣＡ−１及び２のノックダウン細胞株を樹立した。
ｓｉＲＮＡはｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターを用い、添付の説明書に従い、構築した。詳しくは、ＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に相補性な２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ACATGAACTT GGTGTTGGCT T：配列番号１）を含む６５ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１２）と、ヌクレオチド番号４６〜６６位に相同な２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（AAGCCAACAC CAAGTTCATG T；配列番号２）を含む６５ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３）とから成る二本鎖オリゴヌクレオチドをｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＨａＣａｔ細胞へのトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen)を用い、添付の説明書に従って行った。コントロール細胞は、哺乳動物の遺伝子配列と有意な相同性、相補性をもたない二本のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖オリゴヌクレオチドを用い、作製した。安定な細胞系はトランスフェクション細胞をハイグロマイシン−Ｂ選択培地の中で４〜６週間培養して選択を行うことにより獲得した。ＳＣＣＡの発現が抑制されていることを確認するため、上述のとおりにして、リアルタイムＰＣＲによりＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現を測定した。
センスオリゴヌクレオチド（配列番号１２）
GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA
（下線部が相同領域）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３）
AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG
（下線部が相補性領域）

その結果を図５に示す。上記ｓｉＲＮＡの導入された細胞では、コントロールに比べ、ＳＣＣＡ−１及び２ともには発現が９０％以上抑制（ノックダウン）されていることが確認された。

上記ノックダウン細胞及びコントロール細胞を用い、表皮細胞におけるＵＶ誘導アポトーシスに対するＳＣＣＡ−１、２の役割について検討した。
上記各種細胞をケラチノサイト−ＳＦＭ培地（GIBCO, Invitrogen)中、Ｌ−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、ＣＯ₂５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ²の強度で行った。

これらの細胞についてのアポトーシス評価をＦＡＣＳＣＯＵＬＴＥＲを用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行った。
その結果を図６に示す。ノックダウン細胞にＵＶ照射を行った結果、コントロール細胞では３８％の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ノックダウン細胞では約８０％もの細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。従って、ＳＣＣＡはＵＶ照射により誘導される表皮細胞のアポトーシスを有意に抑制することがわかった。よって、ＳＣＣＡは表皮細胞のＵＶ防御機構を担い、またアポトーシスを抑制する作用を有するタンパク質であることが明らかとなった。

露光及び非露光部位の表皮におけるＳＣＣＡの発現。ＵＶ照射による表皮におけるＳＣＣＡの発現の変動。培養ヒト角化細胞におけるＳＳＣＡ発現に対するＵＶ照射の影響。ＳＣＣＡ高発現細胞とＳＣＣＡ非発現細胞との、ＵＶ照射により誘導されるアポトーシス率の比較。ＳＳＣＡノックダウン細胞株の樹立を示す。ＳＣＣＡノックダウン細胞とコントロール細胞との、ＵＶ照射により誘導されるアポトーシス率の比較。

Claims

扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現の抑制された細胞を調製するための方法であって、ＳＣＣＡの発現の抑制がＳＣＣＡをコードする遺伝子のＲＮＡ干渉により行われ、ＲＮＡ干渉に、配列番号１のオリゴヌクレオチドからなるセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号２のオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖ＲＮＡを利用することを特徴とする、方法。
請求項１記載の方法によりＳＣＣＡの発現の抑制された細胞。
請求項２記載の細胞を有する、ヒトを除く動物。