JP4493899B2 - Cells with modified cell membranes - Google Patents

Description

（式中、Ｚは２〜１０個の水酸基を有する化合物の残基を示し；ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基を示し；Ｒ¹は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基を示し；Ｒ²は炭素数７〜２２の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基を示し；Ｘはコハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、及びチオール基からなる群から選ばれる反応性官能基を１個以上含有する基を示し；ａは０又は１を示し；ｎ1、ｎ2、及びｎ3は炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、かつｎ1、ｎ2、ｎ3、k1、k2、及びk3は下記の条件：
０≦ｎ1、ｎ2≦５００、２≦ｎ3≦５００であり、かつ
２≦ｎ1＋ｎ2＋ｎ3≦５００
０≦k1≦８、１≦k2≦４、１≦k3≦４であり、かつ
２≦k1＋k2＋k3≦１０
を満足する数である）
で表される化合物である上記の細胞が提供される。
【００１１】
上記発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ²が炭素数１１〜１８の直鎖の脂肪族炭化水素基を１個以上含有する化合物の残基である上記の細胞；Ｒ²がオレイル基または炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である上記の細胞；及びＲ²が下記の一般式（２）：
【化４】

（Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に炭素数７〜２１の炭化水素基を示し；Ｒ⁵は炭素数２〜４の炭化水素基を示し、ｂは０または１である）で表される基である上記の細胞が提供される。
【００１２】
別の観点からは、本発明により、生理活性物質又はプローブとの反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させるために用いる上記の両親媒性化合物；及び細胞膜の修飾のための上記両親媒性化合物の使用が提供される。また、本発明により、細胞膜の修飾方法であって、下記の工程：(1)生理活性物質又はプローブと上記の両親媒性化合物とを反応させる工程；及び(2)上記工程(1)で得られた反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させる工程を含む方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞は、修飾対象物質を共有結合しうる反応性官能基を有する両親媒性化合物と修飾対象物質との反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合していることを特徴としている。細胞としては、リン脂質種から構成される細胞膜を持つものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、動物細胞、プロトプラスト化された植物細胞、及び微生物などが挙げられる。好ましくは動物細胞が挙げられる。例えば、免疫細胞の表面を生理活性物質で修飾することにより免疫活性化作用を誘導することができる。
【００１４】
細胞に結合させるべき修飾対象物質の種類は特に限定されず、両親媒性化合物と共有結合可能な官能基を少なくとも１つ有するものであれば、いかなるものを用いてもよい。共有結合可能な官能基としては、例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基などを挙げることができる。修飾対象化合物としては、好ましくは生理活性物質又はプローブなどを用いることができる。本発明の細胞には２種類以上の修飾対象物質を結合させることが可能である。例えば、生理活性物質とプローブとを組み合わせて細胞に結合させてもよい。
【００１５】
生理活性物質の種類は特に限定されないが、例えば、酵素阻害剤やレセプター・アンタゴニスト又はアゴニストなどの医薬の有効成分である化合物のほか、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖蛋白質、単糖類、多糖類、及びビタミン類など、低分子物質から高分子物質まで種々の物質を用いることができる。好ましい生理活性物質として、例えば、ゼラチンなどのポリペプチド、抗体、接着分子、レセプター、増殖因子などのサイトカイン等が挙げられる。本明細書において用いられる「生理活性物質」の用語は、少なくとも１つの生体反応を惹起できる物質や、生体内で利用可能な生体関連物質などを含めて最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００１６】
プローブとしては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、酵素基質、金属イオンなどの検出のためのプローブを用いることができ、蛍光プローブ、発光プローブ、磁性プローブ、放射性プローブ、及び金コロイド等の微粒子プローブ等が用いられる。もっとも、利用可能なプローブは上記の物質を対象としたもの及び上記の検出手段を備えたプローブに限定されることはない。
【００１７】
該両親媒性化合物は、下記の特徴：
(1)１つの末端に脂肪族炭化水素基を１個以上含有し、
(2)分子中に親水性基を含む部分を１個以上有し、及び
(3)修飾対象物質を共有結合しうる反応性官能基を上記(1)とは異なる末端に１個以上有する
を有する化合物である。
【００１８】
親水性基としては、合成及び天然の水溶性化合物、好ましくは水溶性高分子化合物の残基を用いることができる。親水性基を与える水溶性化合物としては、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びポリアクリルアミド等が挙げられ、好ましくはポリアルキレングリコール、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、より好ましくはポリアルキレングリコールである。
【００１９】
脂肪族炭化水素基としては合成又は天然の脂肪族炭化水素由来の基でもよく、好ましくは炭素数６〜２４の飽和又は不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基（本明細書において「不飽和」という場合には分子又は官能基に存在する二重結合又は三重結合の数は特に限定されず、二重結合及び三重結合を組み合わせて含んでいてもよい）、さらに好ましくは炭素数１１〜１８の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を含有する基であり、より好ましくはオレイル基または炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する基である。この炭化水素基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよい。２種以上を組み合わせる場合には、その組み合わせ方に制限はない。
【００２０】
両親媒性化合物中の反応性官能基は、好ましくは親水性部の末端に配置される。反応性官能基としては、生理活性物質のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、及び水酸基などの官能基と反応しうるものならいかなる反応性官能基を用いてもよい。例えば、コハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基又はチオール基等が挙げられる。
【００２１】
両親媒性化合物として、式（１）で表される化合物を用いることができる。Ｚが示す２〜１０個の水酸基を有する化合物の残基としては、具体的には、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ペンタエリスリトール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、及びオクタグリセリンなどの化合物の残基を挙げることができる。Ｚとしては好ましくは２〜８の水酸基を有する化合物の残基を用いることができる。
【００２２】
ＡＯは炭素数２〜４、好ましくは炭素数２又は３のオキシアルキレン基であり、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。これらの中で特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよく、あるいは２種以上が組み合わされていてもよい。２種以上が組み合わされる場合には、その組み合わせ方に制限はない。またオキシアルキレン基はブロック状であってもランダム状であってもよい。ただし、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率が低いと水溶性が低下する場合があるので、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率は５０〜１００モル％であることが好ましい。
【００２３】
式（１）においてｎ１＋ｎ２＋ｎ３はオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、この総和は例えば２〜５００の範囲であり、好ましくは８〜３００、より好ましくは１２〜２００である。付加モル数は、例えばＲ¹あるいはＲ²の疎水性基との親水性及び疎水性のバランスによって決めることが可能である。ｋ２が２以上であるか、あるいはＲ²がリン脂質化合物残基である場合には、疎水性を示す脂肪族炭化水素基が２鎖以上存在し、オキシアルキレン基の平均付加モル数ｎ１＋ｎ２＋ｎ３が２０〜５００であることが好ましく、３０〜２００であることがさらに好ましい。
【００２４】
前記式（１）で示されるｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値はＺの分岐数に対応しており、２〜１０、好ましくは２〜４の整数である。ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値が２より小さい場合には、一末端に脂肪族炭化水素基である疎水性基、他の一末端に反応性官能基を有する化合物が得られないため、細胞の表面修飾には不利になる場合がある。また、ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値が１０より大きい場合には、分子の三次元的な広がりが大きく嵩高くなるために、立体障害により安定な表面修飾を行うことができない場合がある。
【００２５】
前記式（１）において、ｋ１はポリアルキレンオキシドの分岐した末端の残基が水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基（具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又はイソプロピル基）である残基の合計数であり、０〜８の範囲の整数である。前記式（１）において、ｋ２はポリアルキレンオキシドの末端の残基に炭素数７〜２２の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基の結合数であり、１〜４の範囲の整数である。ｋ２が０の場合は疎水基が存在しないため細胞膜の修飾が達成できない場合があり、５以上の場合は、嵩高く細胞膜にアンカーリングされない場合がある。
【００２６】
前記式（１）においてａは０又は１であり、ａが０の場合には、Ｒ²で表される脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基がポリアルキレンオキシド残基の末端にエーテル結合していることを意味し、ａが１の場合はＲ²で表される脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基がポリアルキレンオキシド残基の末端にカルボニル基を介してエステル結合していることを意味している。
【００２７】
前記式（１）において、ｋ３はＸで示される反応性基を含有する基が末端残基に結合したポリアルキレンオキシド残基であり、１〜４の範囲の整数であり、好ましくは１〜３である。ｋ３が２以上の場合は、Ｘに含有される反応性基は一種単独でもよいし、２種以上組み合わされてもよい。２種以上の場合は同種あるいは異種の生理活性物質を結合させ、細胞膜に導入することができる。
【００２８】
前記式（１）においてＲ¹は水素原子、メチル基、エチル基、あるいは直鎖又は分枝鎖のプロピル基である。ｋ２が１以上の場合には、Ｒ²の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基が式（１）の化合物の疎水性基として作用する。
前記式（１）において、Ｒ²は炭素数７〜２２の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基である。好ましくは炭素数７〜２２の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、あるいは炭素数７〜２２の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物の残基である。
【００２９】
Ｒ²の具体例としては、ａが０の場合、カプリル基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、ミリストレイル基、パルミチル基、パルミトレイル基、ステアリル基、イソステアリル基、オレイル基、リノレイル基、アラキル基、アラキドニル基、ベヘニル基、エルカイル基などの飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の炭化水素基が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基あるいは炭素数１０〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基を有するリン脂質残基、より好ましくは炭素数１１〜１８の飽和若しくは不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基あるいは炭素数１１〜１８の飽和若しくは不飽和の直鎖の炭化水素基を有するリン脂質残基、最も好ましくは炭素数１８の飽和若しくは不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基あるいは炭素数１７の飽和若しくは不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基を有するリン脂質残基である。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン等が挙げられる。また、ａが１の場合、Ｒ²ＣＯの具体例としては、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸などの飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができ、好ましくはオレイン酸由来のアシル基である。
【００３０】
前記式（１）において、Ｘはコハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、又はチオール基等の反応性官能基を含有する基である。ポリアルキレンオキシド残基の末端へのＸの結合様式については特に限定はなくJMS-REV. MACROMOL. CHEM. PHYS., C25(3), 325-372(1985)等に報告されているような一般的な結合様式を用いることができるが、上記反応基を簡便に導入するためには２価の炭化水素基、エステルあるいはアミド結合を介して導入を行うことが好ましい。この目的に用いられる炭化水素基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基及びヘキシレン基等、又はフェニレン基等の環状化合物基が挙げられ、エステル結合はモノカルボン酸又はジカルボン酸由来のエステル結合でもよいが、ジカルボン酸としてはコハク酸、グルタル酸、及びマレイン酸等が挙げられ、アミド結合としてはエチルアミド及びプロピルアミド等由来のアミド結合が挙げられる。
【００３１】
前記式（２）は炭素数７〜２１の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物残基、すなわちホスファチジルエタノールアミン含有残基である。前記式（２）において、Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に炭素数７〜２１の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、好ましくは炭素数１１〜１７の飽和若しくは不飽和の直鎖の炭化水素基、より好ましくは炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基である。Ｒ³及びＲ⁴は通常Ｒ³ＣＯ及びＲ⁴ＣＯとして脂肪酸に由来するアシル基を用いることができる。Ｒ³ＣＯ及びＲ⁴ＣＯの具体的なものとしては、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸などの飽和若しくは不飽和の直鎖又は分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができ、より好ましくはオレイン酸由来のアシル基である。
【００３２】
Ｒ³及びＲ⁴は同一であっても異なっていてもよい。Ｒ³及びＲ⁴の炭素数がそれぞれ２１を越える場合、疎水性が強く柔軟性が小さいため細胞膜への結合が困難になる場合があり、また炭素数が７より少ない場合には、細胞膜への結合後、疎水性が弱いために細胞膜から抜け落ちる場合がある。Ｒ²が式（２）で示されるリン脂質含有化合物の残基の場合には、アシル基が２本あるために細胞膜の修飾後の安定性が一本鎖より高く、細胞膜にアンカーリングした状態で分子の脱落が生じにくい。
【００３３】
前記式（２）において、Ｒ⁵は炭素数２〜４の２価の炭化水素基であり、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、飽和又は不飽和のいずれでもよい。具体的には−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−(ＣＨ₂)₃−、又は−(ＣＨ₂)₄−基などが挙げられる。
ｂは０または１を示す。
【００３４】
本発明の細胞において、両親媒性化合物が１個以上の不斉炭素を有する場合には、両親媒性化合物として、任意の光学活性体又はジアステレオ異性体などの純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などの任意の物質を用いることができる。また、オレフィン性の二重結合を含む場合には、純粋な形態のＥ体又はＺ体、あるいはそれらの混合物のいずれを用いてもよい。
【００３５】
本発明により提供される細胞膜の修飾方法は、下記の工程：(1)生理活性物質又はプローブと上記の両親媒性化合物とを反応させる工程；及び(2)上記工程(1)で得られた反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させる工程を含むことを特徴としている。
【００３６】
前記工程(1)の反応工程で用いる溶媒の種類は、反応に関与しない溶媒であれば特に制限されないが、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝液あるいはその等張液、あるいは有機溶剤又は上記の水性媒体と有機溶剤との混合物などを用いることができ、これらは単独溶媒系でも混合溶媒系でもどちらでもよい。生理活性物質などの修飾対象物質が変性ないし失活することがないように、反応に関与しないアセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の有機溶剤を使用することが好ましい。反応温度は、生理活性物質などの修飾対象物質が変性ないし失活しない温度であれば特に限定されないが、例えば、０〜１００℃、さらに０〜４０℃が好ましい。反応時間は通常は１分〜４８時間程度であり、０．５〜３時間が好ましい。反応後は、透析、限外ろ過、ゲルろ過等の通常の蛋白質精製法などを応用して反応生成物を精製することができるが、反応生成物の精製を行わずに工程(2)に用いてもよい。
【００３７】
工程(2)においては工程(1)で得られた反応生成物を培養細胞に添加すればよいが、細胞培養液または等張液で用いる上記工程(1)で得られた反応生成物は臨界ミセル形成濃度（以下ＣＭＣと略す）の０．１〜１０００倍、好ましくはそのＣＭＣの１〜５００倍、より好ましくはそのＣＭＣの１０〜１００倍に希釈して添加することができる。工程(1)で得られた反応生成物の細胞への結合は通常は０〜４０℃で行い、１秒間〜１２０分間、好ましくは２５〜３７℃で１０秒間〜２０分間行う。この工程において、工程(1)で得られた反応生成物以外の添加剤を添加してもよい。細胞膜に上記反応生成物を結合させた後、細胞に等張液を添加して洗浄することが好ましい。用いる等張液としては細胞に傷害を与えない溶媒であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液生理食塩水、細胞培養液等の等張液を用いることができる。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。以下、修飾対象物質と両親媒性化合物との反応生成物を「コンジュゲート」と呼び、該コンジュゲートによる細胞膜修飾を「アンカーリング」と呼び、ポリエチレンオキシド末端のサクシンイミジルサクシネートを「活性化ポリエチレンオキシド」あるいは「ポリエチレンオキシドの活性体」と呼ぶ場合がある。
【００３９】
例１
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲートの調製
合成例１ 活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテルの合成
４ｇ(１mmol)のポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)に酢酸ナトリウムを0.1mol%添加し、無水コハク酸を０．１２g（１．２mmol）加えて100℃で5時間反応を行い、その後ジメチルホルムアミドを５mL加えてN-ヒドロキシコハク酸イミド(NHSI)を０．１４g（1.2mmol）添加して４０℃で攪拌し、０．２１g（２mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて活性化体とした。反応終了後冷イソプロピルアルコール２５mLおよびヘキサン５０mLを用いて晶析を行い精製し３．５ｇの結晶を得た。
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲートの調製
【００４０】
４．４ｍｇ（１nmol）の活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）を0.1 mLのジメチルスルホキシドに溶解し、活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）溶液とした。1nmolのEZ-Link^TM Biotin-PEO-Amine (PIERCE社製；Cat# 21346)を0.1 mLのジメチルスルホキシドに溶解しBiotin-PEO-Amine溶液とし、そこにポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）溶液を添加し反応液とした。反応液を室温（約２５℃）で撹拌した後、１時間放置した。反応液に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.02 mL及び組織培養用 リン酸緩衝液生理食塩水（ダルベッコPBS(-) 組織培養用「ニッスイ」粉末（日水製薬（株）；Cat# 05913）より調製）を0.78 mL添加して、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲート溶液を得た。
【００４１】
例２：ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
マウス線維芽細胞株NIH3T3の培養
マウス線維芽細胞 NIH3T3はGlass bottom Microwell Dishes（35mm dish, Uncoated, No.0 Coverslip）容器を用いて10％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地を用い37℃、5％二酸化炭素濃度で培養した。約80％コンフルエントになるまで20時間から45時間培養した。例１で得られたポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲート原液を、ダルベッコ変法イーグル培地で1/100倍に希釈し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲート液を調製した。NIH3T3細胞の付着したGlass bottom Microwell Dishes容器を濾過滅菌処理したリン酸緩衝液生理食塩水（同上）2 mLでリンスした後、ガラス表面に付着しているNIH3T3に0.1 mL のポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート液を添加し、37℃で５分間反応させた。反応後、リン酸緩衝液生理食塩水2 mLで2回細胞を洗浄し、6.7 nM Streptavidine, fluorescein conjugate (Molecular Probes; Cat# S-869) （以後、フルオレセイン標識ストレプトアビジンと称す）リン酸緩衝液生理食塩水溶液 0.1 mLを細胞に添加後37℃で20分間インキュベートした。
【００４２】
リン酸緩衝液生理食塩水2 mLで3回細胞を洗浄した後、リン酸緩衝液生理食塩水1 mLを細胞に添加し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾した細胞を得た。細胞膜修飾については、細胞を共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ライカ(Leica)社製）で観察することにより確認した。結果を表１及び図１に示す。その結果、視野（1000倍）中すべての細胞の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察された。ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートは５分間ですべての細胞膜にアンカーリングされることが確認された。またビオチンのストレプトアビジンへの結合も阻害されなかった。
細胞の３次元的観察
【００４３】
例２と同様にポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートで処理したNIH3T3をフルオレセイン標識ストレプトアビシンで染色し共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて高さ方向（Z軸方向）に2.3μm間隔で0.86μm幅の光学的切片を撮り観察した。その結果を図２に示す。すべての細胞において細胞膜のみ特異的にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、３次元的細胞観察によって液相に露出している細胞膜のすべての部分にポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートが結合していることが確認された。
【００４４】
例３
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- 緑色蛍光蛋白質EGFPコンジュゲートの調製
合成例１と同様にして得られた1.5μmolの活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(分子量４０００)に0.1 mLのジメチルスルホキシドを添加して活性化体溶液とした。75μMの精製された緑色蛍光蛋白質EGFP（精製タグとしてproteinGの抗体結合ドメインの一部を含む融合蛋白質）リン酸緩衝液生理食塩水の溶液0.3 mLに活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(分子量４０００)溶液0.015 mLを添加して反応液とした。反応液を撹拌した後、室温（約２５℃）で１時間放置した。反応液に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.016 mL添加して、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- EGFPコンジュゲート原液を得た。
【００４５】
例４
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-EGFPコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- EGFPコンジュゲート原液をダルベッコ変法イーグル培地で1/20倍に希釈し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- EGFPコンジュゲート液を調製した。例２と同様にNIH3T3細胞膜にポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートをアンカーリングし、共焦点レーザースキャニング顕微鏡でEGFP由来の蛍光を観察することにより確認した。結果を表１に示す。その結果、緑色蛍光蛋白質EGFPもポリエチレンオキシドオレイルエーテルを用いて細胞膜にアンカーリングされることが確認された。
【００４６】
例５
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートのチャイニーズハムスター卵胞細胞株ＣＨＯへのアンカーリング
CHO細胞の培養
チャイニーズハムスター卵胞細胞株ＣＨＯはGlass bottom Microwell Dishes（35mm dish, Uncoated, No.0 Coverslip）容器と10％ウシ胎児血清を添加したF-12培地（F-12 Nutrient Mixture (GIBCO.BRL; Cat# 21700-075)を用い37℃、5％二酸化炭素濃度でほぼ100％コンフルエントになるまで培養した。
例４と同様にCHO細胞とポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートをインキュベートし共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。その結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-EGFPコンジュゲート液で処理されたすべてのCHO細胞の細胞膜にEGFP由来の蛍光が観察され、マウス細胞以外の細胞にもアンカーリングできることが確認された。
【００４７】
例６
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートの浮遊細胞へのアンカーリング
32D、Ba/F3及び9E10細胞の培養
マウスミエロイド 細胞株32D及びマウスプロB 細胞株 Ba/F3は終濃度2ng/mLのインターロイキン-3及び10％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地を用い37℃、5%二酸化炭素濃度で培養した。マウスハイブリドーマ 9E10は10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地（「ニッスイ」粉末、日水製薬、cat.#05918）を用い37℃、5%二酸化炭素濃度で培養した。ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲート原液をRPMI1640培地で1/20倍に希釈し、E290-EGFPコンジュゲート液を調製した。32D、Ba/F3及び9E10細胞（以下、「浮遊細胞」と総称する）を遠心して1×10⁶ 個の細胞をそれぞれ集めた。それぞれの細胞を13 mLのリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄遠心した後、それぞれの細胞ペレットに0.1 mL のポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-EGFPコンジュゲート液を添加後37℃で５分間インキュベートし、その後リン酸緩衝液生理食塩水13 mLで1回細胞を洗浄遠心した後、リン酸緩衝液生理食塩水1 mLをそれぞれの細胞ペレットに添加した。
【００４８】
それぞれの処理された細胞懸濁液をフローサイトメーター（コールター社、EPICS-C）で観察した。その結果を表２及び図３に示す。その結果、EGFPのみで処理された浮遊細胞に比較して、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-EGFPコンジュゲートで処理された場合は、より蛍光強度が強い細胞の数が増加していることが観察された。このことより、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-EGFPコンジュゲート処理によりすべての浮遊細胞膜にEGFPが付与されたことが分かり、浮遊細胞にポリエチレンオキシドオレイルエーテル-EGFPがアンカーリングできることが確認された。
【００４９】
例７
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１５：平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例１と同様にしてそれぞれのポリエチレンオキシドオレイルエーテル活性化体を得て、例１と同様にしてそれぞれのポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート原液を得た。さらに例２と同様にして、それぞれのポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲートをNIH3T3細胞に反応させ、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。その結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート液で処理されたすべてのNIH3T3の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察された。
【００５０】
例８
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝４０：平均分子量２２５０）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
例７と同様にしてポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝４０：平均分子量２２５０）-ビオチンコンジュゲートを得て、同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。
【００５１】
例９
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１８０：平均分子量８４００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
例７と同様にしてポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１８０：平均分子量８４００）-ビオチンコンジュゲート得て、同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。
例７から例９の結果を表１に示す。また、例９の結果を図４に示す。ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート液で処理されたすべてのNIH3T3細胞の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、ポリエチレンオキシドのエチレンオキサイドの付加モル数を１５から１８０まで変えてもいずれも細胞膜にアンカーリングできることが確認された。
【００５２】
例１０
ポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例１と同様にポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）の活性化体を得て、実施例１と同様にしてポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲート原液を得た。さらに例２と同様にして、ポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲートをNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。その結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドステアリルエーテル-ビオチンコンジュゲート液で処理されたNIH3T3細胞の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、脂肪族炭化水素基の不飽和のオレイル基を飽和のステアリル基に変更しても細胞膜にアンカーリングすることが確認された。しかし、オレイル基化合物の方がステアリル基化合物に比べてより強い蛍光が観察されたことより、使用した細胞株にはオレイル基化合物の方がより好ましいことが分かった。
合成例２ 蛍光標識（フルオレセイン）ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの合成
【００５３】
合成例１と同様の方法にて蛍光標識（フルオレセイン）−ポリエチレンオキシド（ｎ＝１１３、平均分子量５０００）の末端活性化体５g（１mmol）を得て、クロロホルム１０ｍLに溶解し蛍光標識（フルオレセイン）−ポリエチレンオキシド活性化体溶液を得た。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン０．８g（１．１mmol）とトリエチルアミン０．１g(１．１mmol)とをクロロホルム１０ｍLに溶解し、蛍光標識（フルオレセイン）−ポリエチレンオキシド活性化体溶液に添加し４０℃にて反応を行った。反応後ろ過して未反応のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを除去し、酢酸エチル１００ｍLおよびヘキサン１００ｍLを用いて晶析を行い、結晶４．８ｇを得た。
【００５４】
例１１
蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド（ｎ＝１１３、平均分子量５０００）修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
例２と同様にして、蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン溶液をNIH3T3とインキュベートし、共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。その結果を表１及び図５に示す。蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンで処理されたすべてのNIH3T3の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、細胞膜にアンカーリングできることが確認された。また、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲートを用いた場合に比べて、細胞膜へのアンカーリングの保持時間が長いことより、脂肪族炭化水素基が２本鎖であるポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン化合物を用いた方がより安定に細胞膜に保持されることが確認された。
【００５５】
例１２
アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)を用いて合成例１と同様の方法にて活性化アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテルを得た。得られた活性化アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテルを用いて例４と同様にしてアミノポリエチレンオキシドオレイルエーテル- ビオチンコンジュゲート原液を調製し、NIH3T3細胞膜にアンカーリングし、フルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させ細胞を共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察することにより確認した。結果を表１に示す。その結果、アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテルを用いてビオチンとの結合様式をアミド結合としても細胞膜へのアンカーリングの効果は変わりなく良好であることが確認された。
【００５６】
例１３（比較例）
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)に対するフルオレセイン標識ストレプトアビジンの非特異的結合の有無の確認
合成例１で得られた活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル溶液に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.02 mL及び組織培養用 リン酸緩衝液生理食塩水（同上）を0.78 mL添加し反応液とした。反応液を撹拌した後、室温（約２５℃）で１時間放置した。放置後、この反応液をポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート原液とした。例２と同様にポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート原液をダルベッコ変法イーグル培地で1/100倍に希釈し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート溶液およびビオチン-NH₂溶液を調製し、NIH3T3細胞を同様に処理してフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させ共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。このことよりポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネートで処理した細胞に非特異的にフルオレセイン標識ストレプトアビジンが結合しないことが確認された。
【００５７】
例１４（比較例）
ビオチン-NH₂の細胞膜への非特異的結合の有無の確認
1 nmolのEZ-Link(登録商標) Biotin-PEO-Amineを0.2 mLのジメチルスルホキシドに溶解し、Biotin-PEO-Amine溶液とした。Biotin-PEO-Amine溶液全量に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.02 mL及び組織培養用 リン酸緩衝液生理食塩水（同上）を0.78 mL添加し混合液とした。混合液を撹拌した後、室温（約２５℃）で１時間放置した。放置後、この混合液をビオチン-NH₂原液とした。例２と同様にビオチン-NH₂原液をダルベッコ変法イーグル培地で1/100倍に希釈し、ビオチン-NH₂溶液を調製し、NIH3T3細胞を同様に処理してフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させ共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。結果を表１に示す。
その結果、ビオチン-NH₂溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。このことよりビオチンそのものも細胞に結合しないことが確認された。
【００５８】
例１５（比較例）
オレイン酸-ビオチンのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例３ オレイン酸-ビオチン溶液およびポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチン液の調製
合成例１と同様にオレイン酸（分子量３７９）の活性化体を得た。得られた活性化オレイン酸（分子量３７９）及び活性化ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)を用いて実施例１と同様に、オレイン酸-ビオチン液及びポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチン液を調製した。得られた活性化オレイン酸（分子量379）溶液および活性化ポリエチレンオキシド溶液を用いて例２と同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。結果を表１に示す。その結果、オレイン酸-ビオチン溶液および活性化ポリエチレンオキシド溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。
【００５９】
例１６（比較例）
ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチンのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
ポリエチレンオキシド（ｎ＝１１４、平均分子量５０００）については、合成例１と同様に合成した後、イオン交換カラムにて精製し、その活性体を得た。
得られた活性化ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)を用いて例２と同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。結果を表１及び図６に示す。その結果、ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチン溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。例１５および例１６の結果より、細胞膜修飾には脂肪族炭化水素基のみ、また親水性基のみ含有する化合物を用いることは困難であり、疎水性基と親水性基の両方の存在が必要であることが確認された。
【００６０】
例１７
ポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル（ｎ＝４０、平均分子量２１６０）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例１と同様して活性化ポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル溶液を得て、例１と同様にしてポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル（ｎ＝４０、平均分子量２１６０）-ビオチンコンジュゲートを調製し、例２と同様にNIH3T3細胞に反応させ、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル（ｎ＝４０、平均分子量２１６０）-ビオチン溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。その結果、ノニルフェニル基に代表されるバルキーな置換基を脂肪族炭化水素基に含有する化合物は細胞膜に安定に導入されないことが確認された。
【００６１】
【表１】

【００６２】
表中、++は視野（１０００倍）中すべての細胞の細胞膜にかなり強い蛍光活性が観察されたことを示し；+は視野（１０００倍）中すべての細胞の細胞膜に蛍光活性が観察されたことを示し；-は視野（１０００倍）中すべての細胞の細胞膜に蛍光活性がほとんど観察されなかったことを示す。
【００６３】
【表２】

【００６４】
【発明の効果】
本発明の細胞は、生理活性物質又はプローブなどの修飾対象物質で安定に細胞膜修飾されており、細胞膜修飾にあたって細胞への傷害も生じていないので、細胞膜修飾による所望の特性を安定かつ長期に発現できるという特徴がある。また、本発明により提供される細胞膜の修飾方法は、上記の特徴を有する細胞を効率的かつ安定に提供できるという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例２）の顕微鏡写真である。
【図２】 ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例２）の切片の顕微鏡写真である。
【図３】 ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートにより膜修飾された浮遊細胞（例６）をフローサイトメーターで観察した結果を示した図である。
【図４】 ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１８０：平均分子量８４００）-ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例９）の顕微鏡写真である。
【図５】 蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例１１）の顕微鏡写真である。
【図６】 ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチンにより膜修飾を試みたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例１６：比較例）の顕微鏡写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell modified with a physiologically active substance or a probe. More specifically, the present invention relates to a cell in which a reaction product of a physiologically active substance or probe and an amphiphilic compound is bound to a cell membrane by noncovalent bonding.
[0002]
[Prior art]
The layer consisting of sugar chains and proteins on the surface of the cell membrane is a place for expressing responses to the external environment such as recognition between cells. Since molecular recognition and information conversion are performed here, it is considered that cell recognition can be diversified by modifying the cell membrane surface. For example, research is being conducted to modify the cell membrane surface with a synthetic polymer to make the cells unindividual.
[0003]
Japanese Patent Publication No. 2000-507849 reports a method in which a biocompatible polymer is reacted with a functional group present on the cell surface and the surface is modified by covalent bonding. The FASEB Journal, 10, 574-586, 1996 reports a method for modifying the cell surface using GPI-anchored protein. Furthermore, Polymer Preprints, Japan, 47, 10, 2499-2500, 1998 and Protein / Nucleic Acid / Enzyme, 45, 11, 1859-1864, 2000 use polyacrylamide as a water-soluble polymer, A method for modifying a cell surface comprising a step of reacting a reactive group with a membrane protein or sugar chain, a method for modifying a cell surface through binding of a ligand to a receptor on the cell membrane, and a cell surface using a hydrophobic anchor A method of modifying is disclosed.
[0004]
As described above, several methods for modifying cell surfaces by binding to cell membrane proteins and sugar chains using a reactive group at the end of the polymer are known. Such chemical modification is directly applied to the cell membrane. Doing may change the properties of the cell surface material and damage the cells. In addition, in the method using GPI-anchored protein, it is difficult to obtain GPI-anchored protein itself, and there is a problem that the application range is limited. Furthermore, the method using a hydrophobic anchor is a surface modification of only the polyacrylamide chain, and although suppression of cell aggregation can be achieved, the stability after modification is poor and the polyacrylamide chain can be immobilized on the cell membrane surface. There is no demonstration of this. In addition, this method cannot bind a physiologically active substance to the cell surface.
[0005]
Furthermore, The Journal of Immunology, 2433-2443, 2000 discloses a method in which a chelating compound containing a hydrocarbon group is used, the chelating compound is anchored to the cell membrane, and then a physiologically active substance is ionically bonded to the chelating compound. Has been. However, in this method, since the binding between the physiologically active substance and the cell membrane is an ionic bond, there is a problem that the binding is easily affected by the salt concentration or pH and is unstable, and the application range to the cell is limited. In addition, since this chelate compound does not contain a hydrophilic group, it is highly lipophilic and difficult to add to cells. Therefore, means for incorporating cells into cells by cell fusion by liposome formation have been adopted. Cell membrane modification by means is not convenient.
As described above, there is no known method for modifying a cell membrane by covalently binding a physiologically active substance or the like to the cell membrane without damaging the cell.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a cell whose membrane has been modified with a physiologically active substance or a substance to be modified such as a probe. Another object of the present invention is to provide means for efficiently modifying cells without damaging the cells, avoiding the above-mentioned conventional problems.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted extensive research to solve the above-mentioned problems. As a result, non-covalent bonding is performed using a reaction product obtained by reacting a bioactive substance or a substance to be modified such as a probe with an amphiphilic compound. The present inventors have found that cell membranes can be modified, and that specific amphiphilic compounds having an aliphatic hydrocarbon group can be used to perform modification very efficiently without damaging cells. The present invention has been completed based on these findings.
[0008]
That is, the present invention has the following features:
(1) containing one or more aliphatic hydrocarbon groups at one end,
(2) having at least one portion containing a hydrophilic group in the molecule, and
(3) At least one reactive functional group capable of covalently binding the substance to be modified at the end different from the above (1)
It is intended to provide a cell in which a reaction product of an amphiphilic compound having a compound and a substance to be modified is bound to a cell membrane by a non-covalent bond. According to a preferred aspect of the present invention, there are provided the above-mentioned cells in which the substance to be modified is a physiologically active substance or a probe; and the above-mentioned cells in which the cells are animal cells.
[0009]
According to a further preferred aspect of the present invention, the above-mentioned cell wherein the aliphatic hydrocarbon group is the residue of a compound containing one or more aliphatic hydrocarbon groups having 11 to 18 carbon atoms; the aliphatic hydrocarbon group is oleyl A cell or a residue of a compound having one or more unsaturated aliphatic hydrocarbon groups having 17 carbon atoms; and a cell whose hydrophilic group is a residue of a compound containing a polyoxyalkylene group. Provided.
[0010]
According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the amphiphilic compound is represented by the following general formula (1):
[Chemical 3]

(In the formula, Z represents a residue of a compound having 2 to 10 hydroxyl groups; AO represents an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms; R ¹ Represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms; R ² Represents a residue of a compound containing an aliphatic hydrocarbon group having 7 to 22 carbon atoms; X represents a group consisting of a succinimide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group, and a thiol group A group containing one or more reactive functional groups selected from: a represents 0 or 1; n1, n2 and n3 represent the average number of moles of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms; and n1, n2, n3, k1, k2, and k3 are the following conditions:
0 ≦ n1, n2 ≦ 500, 2 ≦ n3 ≦ 500, and
2 ≦ n1 + n2 + n3 ≦ 500
0 ≦ k1 ≦ 8, 1 ≦ k2 ≦ 4, 1 ≦ k3 ≦ 4, and
2 ≦ k1 + k2 + k3 ≦ 10
Is a number that satisfies
The above-mentioned cell which is a compound represented by these is provided.
[0011]
According to a further preferred aspect of the invention, R ² R is a residue of a compound containing one or more linear aliphatic hydrocarbon groups having 11 to 18 carbon atoms; R ² A cell as defined above wherein R is the residue of a compound having one or more oleyl groups or unsaturated aliphatic hydrocarbon groups having 17 carbon atoms; and R ² Is the following general formula (2):
[Formula 4]

(R ^Three And R ^Four Each independently represents a hydrocarbon group having 7 to 21 carbon atoms; R ^Five Represents a hydrocarbon group having 2 to 4 carbon atoms, and b is 0 or 1).
[0012]
From another point of view, according to the present invention, the amphiphilic compound used for binding a reaction product with a physiologically active substance or a probe to a cell membrane by non-covalent bonding; and the amphiphilic property for modifying the cell membrane; Use of the compounds is provided. Further, according to the present invention, there is provided a method for modifying a cell membrane comprising the following steps: (1) a step of reacting a physiologically active substance or probe with the above amphiphilic compound; and (2) obtained in the above step (1). There is provided a method comprising the step of binding the resulting reaction product to the cell membrane non-covalently.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The cell of the present invention is characterized in that a reaction product of an amphiphilic compound having a reactive functional group capable of covalently binding the substance to be modified and the substance to be modified is bound to the cell membrane by noncovalent bonding. Any cell may be used as long as it has a cell membrane composed of phospholipid species, and examples thereof include animal cells, plant cells converted to protoplasts, and microorganisms. Preferably, animal cells are used. For example, the immune activation effect can be induced by modifying the surface of immune cells with a physiologically active substance.
[0014]
The type of the substance to be modified to be bound to the cell is not particularly limited, and any substance may be used as long as it has at least one functional group capable of covalently bonding to the amphiphilic compound. Examples of the functional group capable of covalent bonding include an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, and a carboxyl group. As the compound to be modified, a physiologically active substance or a probe can be preferably used. Two or more kinds of substances to be modified can be bound to the cells of the present invention. For example, a physiologically active substance and a probe may be combined and bound to a cell.
[0015]
The type of physiologically active substance is not particularly limited. For example, in addition to compounds that are active pharmaceutical ingredients such as enzyme inhibitors, receptors, antagonists or agonists, amino acids, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleotides, oligonucleotides, Various substances from low molecular weight substances to high molecular weight substances such as nucleotides, glycoproteins, monosaccharides, polysaccharides, and vitamins can be used. Preferred physiologically active substances include, for example, polypeptides such as gelatin, antibodies, adhesion molecules, receptors, cytokines such as growth factors, and the like. As used herein, the term “physiologically active substance” should be interpreted in the broadest sense including any substance that can elicit at least one biological response, or a biologically relevant substance that can be used in vivo. However, it should not be interpreted in a limited way.
[0016]
As the probe, for example, probes for detection of amino acids, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, enzyme substrates, metal ions, etc. can be used, fluorescent probes, luminescent probes, magnetic probes , Radioactive probes, and fine particle probes such as gold colloid are used. However, usable probes are not limited to probes targeting the above substances and probes provided with the above detection means.
[0017]
The amphiphilic compound has the following characteristics:
(1) containing one or more aliphatic hydrocarbon groups at one end,
(2) having at least one portion containing a hydrophilic group in the molecule, and
(3) At least one reactive functional group capable of covalently binding the substance to be modified at the end different from the above (1)
It is a compound which has this.
[0018]
As the hydrophilic group, a residue of a synthetic or natural water-soluble compound, preferably a water-soluble polymer compound can be used. Examples of the water-soluble compound that gives a hydrophilic group include polyalkylene glycol, polysaccharide, polylactic acid, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, and polyacrylamide, and preferably polyalkylene glycol, polysaccharide, polylactic acid, and polyvinyl. Alcohol, more preferably polyalkylene glycol.
[0019]
The aliphatic hydrocarbon group may be a group derived from a synthetic or natural aliphatic hydrocarbon, and is preferably a saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 6 to 24 carbon atoms (in the present specification, In the case of “unsaturated”, the number of double bonds or triple bonds present in the molecule or functional group is not particularly limited, and may include a combination of double bonds and triple bonds), more preferably carbon number It is a group containing a 11-18 saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, more preferably an oleyl group or a group containing a C17 unsaturated aliphatic hydrocarbon group. This hydrocarbon group may be one kind alone, or two or more kinds may be combined. When two or more types are combined, there is no limitation on how to combine them.
[0020]
The reactive functional group in the amphiphilic compound is preferably arranged at the end of the hydrophilic part. As the reactive functional group, any reactive functional group may be used as long as it can react with a functional group such as an amino group, a carboxyl group, a thiol group, and a hydroxyl group of a physiologically active substance. Examples thereof include a succinimide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group, or a thiol group.
[0021]
As the amphiphilic compound, a compound represented by the formula (1) can be used. Specific examples of the residue of the compound having 2 to 10 hydroxyl groups represented by Z include ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, diglycerin, pentaerythritol, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, hepta. The residue of compounds, such as glycerol and octaglycerol, can be mentioned. Z is preferably a residue of a compound having 2 to 8 hydroxyl groups.
[0022]
AO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, preferably 2 or 3 carbon atoms, and examples thereof include an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group, an oxybutylene group, and an oxytetramethylene group. Of these, an oxyethylene group is particularly preferred. There are as many oxyalkylene groups in the molecule as n, but these oxyalkylene groups may be used alone or in combination of two or more. When two or more kinds are combined, there is no restriction on the combination. The oxyalkylene group may be in a block form or a random form. However, if the ratio of oxyethylene groups to all oxyalkylene groups is low, the water solubility may decrease. Therefore, the ratio of oxyethylene groups to all oxyalkylene groups is preferably 50 to 100 mol%.
[0023]
In formula (1), n1 + n2 + n3 represents the average number of added moles of the oxyalkylene group, and the total is, for example, in the range of 2-500, preferably 8-300, more preferably 12-200. The added mole number is, for example, R ¹ Or R ² It can be determined by the balance of hydrophilicity and hydrophobicity with the hydrophobic group. k2 is 2 or more, or R ² Is a phospholipid compound residue, two or more aliphatic hydrocarbon groups exhibiting hydrophobicity are present, and the average number of added moles n1 + n2 + n3 of the oxyalkylene group is preferably 20 to 500, preferably 30 to 200 More preferably.
[0024]
The value of k1 + k2 + k3 represented by the formula (1) corresponds to the number of branches of Z, and is an integer of 2 to 10, preferably 2 to 4. When the value of k1 + k2 + k3 is smaller than 2, a compound having an aliphatic hydrocarbon group at one end and a reactive functional group at the other end cannot be obtained, which is disadvantageous for cell surface modification. It may become. Further, when the value of k1 + k2 + k3 is larger than 10, since the three-dimensional spread of the molecule becomes large and bulky, stable surface modification may not be performed due to steric hindrance.
[0025]
In the formula (1), k1 is a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms (specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, or an isopropyl group). Group) is the total number of residues, and is an integer in the range of 0-8. In the formula (1), k2 is the number of bonds of the residue of the compound containing an aliphatic hydrocarbon group having 7 to 22 carbon atoms at the terminal residue of the polyalkylene oxide, and is an integer in the range of 1 to 4. is there. When k2 is 0, modification of the cell membrane may not be achieved because there is no hydrophobic group, and when it is 5 or more, it may be bulky and not anchored to the cell membrane.
[0026]
In the formula (1), a is 0 or 1, and when a is 0, R ² It means that the residue of the compound containing an aliphatic hydrocarbon group represented by the formula (1) is ether-bonded to the terminal of the polyalkylene oxide residue, and when a is 1, R ² It means that the residue of the compound containing an aliphatic hydrocarbon group represented by the formula (I) is ester-bonded to the terminal of the polyalkylene oxide residue via a carbonyl group.
[0027]
In the formula (1), k3 is a polyalkylene oxide residue in which a group containing a reactive group represented by X is bonded to a terminal residue, and is an integer in the range of 1 to 4, preferably 1 to 3. It is. When k3 is 2 or more, the reactive group contained in X may be one kind alone, or two or more kinds may be combined. In the case of two or more species, the same or different physiologically active substances can be bound and introduced into the cell membrane.
[0028]
In the formula (1), R ¹ Is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, or a linear or branched propyl group. When k2 is 1 or more, R ² The residue of the compound containing an aliphatic hydrocarbon group of the compound acts as a hydrophobic group of the compound of the formula (1).
In the formula (1), R ² Is a residue of a compound containing an aliphatic hydrocarbon group having 7 to 22 carbon atoms. Preferably, a saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 7 to 22 carbon atoms, or a saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 7 to 22 carbon atoms is 1 It is a residue of a phosphate group-containing compound having at least one.
[0029]
R ² As a specific example, when a is 0, a capryl group, a decyl group, a lauryl group, a myristyl group, a myristolyl group, a palmityl group, a palmitoleyl group, a stearyl group, an isostearyl group, an oleyl group, a linoleyl group, an aralkyl group , Saturated or unsaturated linear or branched hydrocarbon groups such as arachidonyl group, behenyl group, erkyle group and the like. Preferably a phospholipid residue having a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 10 to 20 carbon atoms or a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 10 to 20 carbon atoms, more preferably 11 to 18 carbon atoms. Phospholipid residues having a saturated or unsaturated linear aliphatic hydrocarbon group or a saturated or unsaturated linear hydrocarbon group having 11 to 18 carbon atoms, most preferably a saturated or unsaturated group having 18 carbon atoms A phospholipid residue having a straight-chain aliphatic hydrocarbon group or a saturated or unsaturated straight-chain aliphatic hydrocarbon group having 17 carbon atoms. Examples of phospholipids include phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, and phosphatidylserine. When a is 1, R ² Specific examples of CO include, for example, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, myristoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidic acid, behenic acid, elca An acyl group derived from a saturated or unsaturated linear or branched fatty acid such as an acid can be mentioned, and an acyl group derived from oleic acid is preferred.
[0030]
In the formula (1), X is a group containing a reactive functional group such as a succinimide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group, or a thiol group. There is no particular limitation on the mode of X bonding to the end of the polyalkylene oxide residue. As reported in JMS-REV. MACROMOL. CHEM. PHYS., C25 (3), 325-372 (1985), etc. However, in order to easily introduce the reactive group, it is preferable to introduce the reactive group via a divalent hydrocarbon group, ester or amide bond. Examples of the hydrocarbon group used for this purpose include methylene group, ethylene group, propylene group, butylene group, pentylene group and hexylene group, or cyclic compound groups such as phenylene group, and ester bond is monocarboxylic acid Alternatively, an ester bond derived from a dicarboxylic acid may be used. Examples of the dicarboxylic acid include succinic acid, glutaric acid, and maleic acid, and examples of the amide bond include amide bonds derived from ethylamide, propylamide, and the like.
[0031]
The formula (2) is a phosphate group-containing compound residue having one or more saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbon groups having 7 to 21 carbon atoms, that is, a phosphatidylethanolamine-containing residue. In the formula (2), R ^Three And R ^Four Are each independently a saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 7 to 21 carbon atoms, preferably a saturated or unsaturated linear hydrocarbon group having 11 to 17 carbon atoms, more preferably It is a C17 unsaturated aliphatic hydrocarbon group. R ^Three And R ^Four Is usually R ^Three CO and R ^Four An acyl group derived from a fatty acid can be used as CO. R ^Three CO and R ^Four Specific examples of CO include, for example, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, myristoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachic acid, behenic acid, An acyl group derived from a saturated or unsaturated linear or branched fatty acid such as erucic acid can be mentioned, and an acyl group derived from oleic acid is more preferable.
[0032]
R ^Three And R ^Four May be the same or different. R ^Three And R ^Four When the number of carbons exceeds 21, the binding to the cell membrane may be difficult due to the strong hydrophobicity and low flexibility, and when the number of carbons is less than 7, the hydrophobicity may occur after binding to the cell membrane. May fall off the cell membrane due to its weakness. R ² In the case of the residue of the phospholipid-containing compound represented by the formula (2), since there are two acyl groups, the stability after modification of the cell membrane is higher than that of the single chain, and the molecule is anchored to the cell membrane. Is less likely to drop out.
[0033]
In the formula (2), R ^Five Is a divalent hydrocarbon group having 2 to 4 carbon atoms, which may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof, and may be either saturated or unsaturated. Specifically, -CH ₂ CH ₂ -,-(CH ₂ ) _Three -Or-(CH ₂ ) _Four -Groups and the like.
b represents 0 or 1;
[0034]
In the cell of the present invention, when the amphiphilic compound has one or more asymmetric carbons, as the amphiphilic compound, a stereoisomer in a pure form such as any optically active substance or diastereoisomer, Any substance such as an arbitrary mixture of stereoisomers and racemates can be used. Further, when an olefinic double bond is contained, any of pure E form or Z form or a mixture thereof may be used.
[0035]
The cell membrane modification method provided by the present invention is obtained by the following steps: (1) a step of reacting a bioactive substance or probe with the above amphiphilic compound; and (2) the above step (1). It includes a step of binding the reaction product to the cell membrane by noncovalent bonding.
[0036]
The type of solvent used in the reaction step of the step (1) is not particularly limited as long as it is a solvent that does not participate in the reaction, but phosphate buffer, borate buffer, Tris buffer, acetate buffer, carbonate buffer, A buffer solution such as Good's buffer solution or an isotonic solution thereof, or an organic solvent or a mixture of the above aqueous medium and an organic solvent may be used. These may be either a single solvent system or a mixed solvent system. It is preferable to use an organic solvent such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, or dimethylformamide that does not participate in the reaction so that the substance to be modified such as a physiologically active substance is not denatured or deactivated. The reaction temperature is not particularly limited as long as the substance to be modified such as a physiologically active substance is not denatured or deactivated. For example, the reaction temperature is preferably 0 to 100 ° C, more preferably 0 to 40 ° C. The reaction time is usually about 1 minute to 48 hours, preferably 0.5 to 3 hours. After the reaction, the reaction product can be purified by applying ordinary protein purification methods such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, etc., but it is used in step (2) without purifying the reaction product. May be.
[0037]
In step (2), the reaction product obtained in step (1) may be added to the cultured cells, but the reaction product obtained in step (1) used in the cell culture medium or isotonic solution is critical. It can be added diluted to 0.1 to 1000 times the micelle formation concentration (hereinafter abbreviated as CMC), preferably 1 to 500 times the CMC, more preferably 10 to 100 times the CMC. The reaction product obtained in step (1) is usually bound to cells at 0 to 40 ° C. for 1 second to 120 minutes, preferably at 25 to 37 ° C. for 10 seconds to 20 minutes. In this step, additives other than the reaction product obtained in step (1) may be added. It is preferable that after the reaction product is bound to the cell membrane, an isotonic solution is added to the cells and washed. The isotonic solution used is not particularly limited as long as it is a solvent that does not damage cells, but isotonic solutions such as phosphate buffered saline, cell culture solution and the like can be used.
[0038]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples. Hereinafter, the reaction product of the substance to be modified and the amphiphilic compound is referred to as “conjugate”, the cell membrane modification by the conjugate is referred to as “anchoring”, and the succinimidyl succinate at the end of polyethylene oxide is “activated” It may be called “polyethylene oxide” or “active body of polyethylene oxide”.
[0039]
Example 1
Preparation of polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate
Synthesis Example 1 Synthesis of activated polyethylene oxide oleyl ether
0.1 mol% of sodium acetate was added to 4 g (1 mmol) of polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400), 0.12 g (1.2 mmol) of succinic anhydride was added, and the reaction was performed at 100 ° C. for 5 hours. Then, 5 mL of dimethylformamide was added, 0.14 g (1.2 mmol) of N-hydroxysuccinimide (NHSI) was added and stirred at 40 ° C., and 0.21 g (2 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide was added to the activated product. did. After completion of the reaction, crystallization was carried out using 25 mL of cold isopropyl alcohol and 50 mL of hexane to obtain 3.5 g of crystals.
Preparation of polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate
[0040]
4.4 mg (1 nmol) of activated polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) was dissolved in 0.1 mL of dimethyl sulfoxide to obtain an activated polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) solution. . 1 nmol EZ-Link ^TM Biotin-PEO-Amine (manufactured by PIERCE; Cat # 21346) is dissolved in 0.1 mL of dimethyl sulfoxide to obtain a Biotin-PEO-Amine solution, and a polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) solution is added thereto. It was set as the reaction liquid. The reaction solution was stirred at room temperature (about 25 ° C.) and then allowed to stand for 1 hour. 0.02 mL of 1 M Tris buffer (pH 8.0) and phosphate buffered saline for tissue culture (Dulbecco PBS (-) “Nissui” powder for tissue culture (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd .; Cat # 05913) ) Was added 0.78 mL to obtain a polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate solution.
[0041]
Example 2: Polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)-Anchoring of biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
Culture of mouse fibroblast cell line NIH3T3
Mouse fibroblasts NIH3T3 was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal calf serum using a glass bottom microwell dishes (35mm dish, Uncoated, No.0 Coverslip) container at 37 ° C and 5% carbon dioxide concentration. did. The cells were cultured for 20 to 45 hours until they became about 80% confluent. The polyethylene oxide oleyl ether obtained in Example 1 (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate stock solution was diluted 1/100 times with Dulbecco's modified Eagle's medium to obtain polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average (Molecular weight 4400) -Biotin conjugate solution was prepared. After rinsing the Glass bottom Microwell Dishes container with NIH3T3 cells attached with 2 mL of phosphate buffered saline (same as above) with filtration sterilization, 0.1 mL of polyethylene oxide oleyl ether-biotin is added to NIH3T3 attached to the glass surface. The conjugate solution was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. After the reaction, the cells were washed twice with 2 mL of phosphate buffered saline, and 6.7 nM Streptavidine, fluorescein conjugate (Molecular Probes; Cat # S-869) (hereinafter referred to as fluorescein-labeled streptavidin) phosphate buffer After adding 0.1 mL of physiological saline solution to the cells, the cells were incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
[0042]
After washing the cells three times with 2 mL of phosphate buffered saline, 1 mL of phosphate buffered saline is added to the cells, and polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate Cells that were membrane-modified with fluorescein-labeled streptavidin bound to. Cell membrane modification was confirmed by observing the cells with a confocal laser scanning microscope (Leica). The results are shown in Table 1 and FIG. As a result, fluorescence derived from fluorescein was observed in the cell membrane of all cells in the visual field (1000 times). Polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate was confirmed to be anchored to all cell membranes in 5 minutes. Also, the binding of biotin to streptavidin was not inhibited.
Three-dimensional observation of cells
[0043]
Like Example 2, polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)-NIH3T3 treated with biotin conjugate was stained with fluorescein-labeled streptavicin, and height direction (Z-axis direction) was measured using a confocal laser scanning microscope. ), Optical sections with a width of 0.86 μm were taken at intervals of 2.3 μm and observed. The result is shown in FIG. Fluorescence derived from fluorescein was observed specifically only in the cell membrane in all cells, and polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) in all parts of the cell membrane exposed to the liquid phase by three-dimensional cell observation- It was confirmed that the biotin conjugate was bound.
[0044]
Example 3
Preparation of polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -green fluorescent protein EGFP conjugate
To 1.5 μmol of activated polyethylene oxide oleyl ether (molecular weight 4000) obtained in the same manner as in Synthesis Example 1, 0.1 mL of dimethyl sulfoxide was added to obtain an activated product solution. 75 μM of purified green fluorescent protein EGFP (a fusion protein containing a part of the antibody binding domain of proteinG as a purification tag) phosphate buffered saline solution 0.3 mL in activated polyethylene oxide oleyl ether (molecular weight 4000) solution 0.015 mL was added to make a reaction solution. The reaction mixture was stirred and allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for 1 hour. To the reaction solution, 0.016 mL of 1M Tris buffer (pH 8.0) was added to obtain a polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate stock solution.
[0045]
Example 4
Anchoring of polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
Polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)-EGFP conjugate stock solution is diluted 1/20 times with Dulbecco's modified Eagle's medium, and polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)-EGFP conjugate A liquid was prepared. In the same manner as in Example 2, polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate was anchored to the NIH3T3 cell membrane and confirmed by observing the fluorescence derived from EGFP with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in Table 1. As a result, it was confirmed that the green fluorescent protein EGFP was also anchored to the cell membrane using polyethylene oxide oleyl ether.
[0046]
Example 5
Polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)-anchoring of EGFP conjugate to Chinese hamster follicular cell line CHO
CHO cell culture
The Chinese hamster follicle cell line CHO is a F-12 Nutrient Mixture (GIBCO.BRL; Cat # 21700) supplemented with a Glass bottom Microwell Dishes (35 mm dish, Uncoated, No. 0 Coverslip) container and 10% fetal bovine serum. -075) and cultured at 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration until almost 100% confluent.
As in Example 4, CHO cells and polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate were incubated and observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in Table 1. As a result, EGFP-derived fluorescence is observed in the cell membrane of all CHO cells treated with polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate solution, and can be anchored to cells other than mouse cells. Was confirmed.
[0047]
Example 6
Polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)-anchoring of EGFP conjugate to floating cells
Culture of 32D, Ba / F3 and 9E10 cells
Mouse myeloid cell line 32D and mouse pro B cell line Ba / F3 were cultured at 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration using RPMI medium supplemented with interleukin-3 and 10% fetal bovine serum at a final concentration of 2 ng / mL. Mouse hybridoma 9E10 was cultured in RPMI1640 medium (“Nissui” powder, Nissui Pharmaceutical, cat. # 05918) supplemented with 10% fetal bovine serum at 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration. Polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate stock solution was diluted 1/20 times with RPMI1640 medium to prepare an E290-EGFP conjugate solution. Centrifuge 32D, Ba / F3 and 9E10 cells (hereinafter collectively referred to as “floating cells”) to 1 × 10 ⁶ Individual cells were collected. After each cell was washed and centrifuged with 13 mL of phosphate buffered saline, 0.1 mL of polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate solution was added to each cell pellet. After incubating at 5 ° C. for 5 minutes, the cells were washed and centrifuged once with 13 mL of phosphate buffered saline, and then 1 mL of phosphate buffered saline was added to each cell pellet.
[0048]
Each treated cell suspension was observed with a flow cytometer (Coulter, EPICS-C). The results are shown in Table 2 and FIG. As a result, it was observed that the number of cells with stronger fluorescence intensity was increased when treated with polyethylene oxide oleyl ether-EGFP conjugate as compared to floating cells treated with EGFP alone. From this, it was found that EGFP was imparted to all the floating cell membranes by the polyethylene oxide oleyl ether-EGFP conjugate treatment, and it was confirmed that polyethylene oxide oleyl ether-EGFP could be anchored to the floating cells.
[0049]
Example 7
Anchoring of polyethylene oxide oleyl ether (n = 15: average molecular weight 1100) -biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
Each activated product of polyethylene oxide oleyl ether was obtained in the same manner as in Synthesis Example 1, and each polyethylene oxide oleyl ether-biotin conjugate stock solution was obtained in the same manner as in Example 1. Further, in the same manner as in Example 2, each polyethylene oxide oleyl ether-biotin conjugate was reacted with NIH3T3 cells, further reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope to confirm cell membrane modification. The results are shown in Table 1. As a result, fluorescence derived from fluorescein was observed in the cell membranes of all NIH3T3 treated with the polyethylene oxide oleyl ether-biotin conjugate solution.
[0050]
Example 8
Anchoring of polyethylene oxide oleyl ether (n = 40: average molecular weight 2250) -biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
In the same manner as in Example 7, a polyethylene oxide oleyl ether (n = 40: average molecular weight 2250) -biotin conjugate was obtained, similarly incubated with NIH3T3, further reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope. The cell membrane modification was confirmed.
[0051]
Example 9
Anchoring of polyethylene oxide oleyl ether (n = 180: average molecular weight 8400) -biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
In the same manner as in Example 7, a polyethylene oxide oleyl ether (n = 180: average molecular weight 8400) -biotin conjugate was obtained, similarly incubated with NIH3T3, further reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope. The cell membrane modification was confirmed.
The results of Examples 7 to 9 are shown in Table 1. The results of Example 9 are shown in FIG. Fluorescein-derived fluorescence was observed in the cell membranes of all NIH3T3 cells treated with the polyethylene oxide oleyl ether-biotin conjugate solution, and both were anchored to the cell membrane even when the number of moles of polyethylene oxide added to ethylene oxide was changed from 15 to 180 It was confirmed that it could be ringed.
[0052]
Example 10
Anchoring of polyethylene oxide stearyl ether (n = 15, average molecular weight 1100) -biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
An activated product of polyethylene oxide stearyl ether (n = 15, average molecular weight 1100) was obtained in the same manner as in Synthesis Example 1, and polyethylene oxide stearyl ether (n = 15, average molecular weight 1100) -biotin conjugate was obtained in the same manner as in Example 1. A gate stock solution was obtained. Further, in the same manner as in Example 2, polyethylene oxide stearyl ether (n = 15, average molecular weight 1100) -biotin conjugate was incubated with NIH3T3, further reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope to modify the cell membrane. Confirmed about. The results are shown in Table 1. As a result, fluorescence derived from fluorescein was observed on the cell membrane of NIH3T3 cells treated with the polyethylene oxide stearyl ether-biotin conjugate solution, and the unsaturated oleyl group of the aliphatic hydrocarbon group was changed to a saturated stearyl group. Anchoring to the cell membrane was confirmed. However, it was found that the oleyl group compound was more preferable for the cell line used since the oleyl group compound was observed to have stronger fluorescence than the stearyl group compound.
Synthesis Example 2 Synthesis of fluorescently labeled (fluorescein) polyethylene oxide modified dioleoylphosphatidylethanolamine
[0053]
In the same manner as in Synthesis Example 1, fluorescently labeled (fluorescein) -polyethylene oxide (n = 113, average molecular weight 5000) end-activated form 5 g (1 mmol) was obtained, dissolved in 10 mL of chloroform, and fluorescently labeled (fluorescein)- A polyethylene oxide activated product solution was obtained. Dioleoylphosphatidylethanolamine 0.8 g (1.1 mmol) and triethylamine 0.1 g (1.1 mmol) are dissolved in 10 mL of chloroform and added to a fluorescently labeled (fluorescein) -polyethylene oxide activated solution to 40 ° C. The reaction was performed. After the reaction, filtration was performed to remove unreacted dioleoylphosphatidylethanolamine, and crystallization was performed using 100 mL of ethyl acetate and 100 mL of hexane to obtain 4.8 g of crystals.
[0054]
Example 11
Anchoring of fluorescently labeled (fluorescein) -polyethylene oxide (n = 113, average molecular weight 5000) modified dioleoylphosphatidylethanolamine to mouse fibroblast cell line NIH3T3
In the same manner as in Example 2, a fluorescently labeled (fluorescein) -polyethylene oxide modified dioleoylphosphatidylethanolamine solution was incubated with NIH3T3 and observed with a confocal laser scanning microscope to confirm cell membrane modification. The results are shown in Table 1 and FIG. Fluorescein-derived fluorescence was observed in the cell membranes of all NIH3T3 treated with fluorescently labeled (fluorescein) -polyethylene oxide-modified dioleoylphosphatidylethanolamine, confirming that they could be anchored to the cell membrane. In addition, since the retention time of anchoring to the cell membrane is longer than when using a polyethylene oxide oleyl ether-biotin conjugate, the polyethylene oxide-modified dioleoylphosphatidylethanol having two aliphatic hydrocarbon groups It was confirmed that the amine compound was more stably retained on the cell membrane.
[0055]
Example 12
Anchoring aminopolyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
Activated amino polyethylene oxide oleyl ether was obtained in the same manner as in Synthesis Example 1 using amino polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400). Using the obtained activated aminopolyethylene oxide oleyl ether, an aminopolyethylene oxide oleyl ether-biotin conjugate stock solution was prepared in the same manner as in Example 4, anchored to the NIH3T3 cell membrane, reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and the cells were combined. This was confirmed by observing with a focused laser scanning microscope. The results are shown in Table 1. As a result, it was confirmed that the effect of anchoring to the cell membrane remained unchanged even when aminopolyethylene oxide oleyl ether was used and the binding mode with biotin was changed to an amide bond.
[0056]
Example 13 (comparative example)
Confirmation of non-specific binding of fluorescein-labeled streptavidin to polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400)
To the activated polyethylene oxide oleyl ether solution obtained in Synthesis Example 1, 0.02 mL of 1M Tris buffer (pH 8.0) and 0.78 mL of phosphate buffered saline for tissue culture (same as above) were added to obtain a reaction solution. . The reaction mixture was stirred and allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for 1 hour. After standing, this reaction solution was used as a polyethylene oxide oleyl ether succinate stock solution. As in Example 2, the polyethylene oxide oleyl ether succinate stock solution was diluted 1 / 100-fold with Dulbecco's modified Eagle's medium to obtain a polyethylene oxide oleyl ether succinate solution and biotin-NH. ₂ A solution was prepared, NIH3T3 cells were treated in the same manner, reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in Table 1. As a result, no fluorescein-derived fluorescence was observed in all cells treated with the polyethylene oxide oleyl ether succinate solution. This confirmed that fluorescein-labeled streptavidin did not bind nonspecifically to cells treated with polyethylene oxide oleyl ether succinate.
[0057]
Example 14 (comparative example)
Biotin-NH ₂ Of non-specific binding to the cell membrane
1 nmol of EZ-Link (registered trademark) Biotin-PEO-Amine was dissolved in 0.2 mL of dimethyl sulfoxide to obtain a Biotin-PEO-Amine solution. To the total amount of Biotin-PEO-Amine solution, 0.02 mL of 1M Tris buffer (pH 8.0) and 0.78 mL of phosphate buffered saline for tissue culture (same as above) were added to prepare a mixed solution. The mixture was stirred and allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for 1 hour. After standing, mix this mixture with biotin-NH ₂ The stock solution was used. Biotin-NH as in Example 2 ₂ Dilute the stock solution 1/100 times with Dulbecco's modified Eagle's medium, and biotin-NH ₂ A solution was prepared, NIH3T3 cells were treated in the same manner, reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in Table 1.
As a result, biotin-NH ₂ No fluorescence from fluorescein was observed in all cells treated with the solution. This confirms that biotin itself does not bind to the cells.
[0058]
Example 15 (comparative example)
Anchoring of oleic acid-biotin to mouse fibroblast cell line NIH3T3
Synthesis Example 3 Preparation of oleic acid-biotin solution and polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000) -biotin solution
In the same manner as in Synthesis Example 1, an activated form of oleic acid (molecular weight 379) was obtained. Using the obtained activated oleic acid (molecular weight 379) and activated polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000), in the same manner as in Example 1, oleic acid-biotin solution and polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight) 5000) -biotin solution was prepared. The obtained activated oleic acid (molecular weight 379) solution and activated polyethylene oxide solution were used to incubate with NIH3T3 in the same manner as in Example 2, and further reacted with fluorescein-labeled streptavidin and observed with a confocal laser scanning microscope to modify the cell membrane. Confirmed about. The results are shown in Table 1. As a result, no fluorescein-derived fluorescence was observed in all cells treated with oleic acid-biotin solution and activated polyethylene oxide solution.
[0059]
Example 16 (comparative example)
Polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000) -biotin anchoring to mouse fibroblast cell line NIH3T3
Polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000) was synthesized in the same manner as in Synthesis Example 1, and then purified by an ion exchange column to obtain an active form thereof.
The obtained activated polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000) was incubated with NIH3T3 in the same manner as in Example 2, reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope to confirm cell membrane modification. did. The results are shown in Table 1 and FIG. As a result, no fluorescein-derived fluorescence was observed in all cells treated with polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000) -biotin solution. From the results of Examples 15 and 16, it is difficult to use a compound containing only an aliphatic hydrocarbon group or only a hydrophilic group for cell membrane modification, and it is necessary to have both a hydrophobic group and a hydrophilic group. It was confirmed that there was.
[0060]
Example 17
Anchoring polyethylene oxide nonyl phenyl ether (n = 40, average molecular weight 2160) -biotin conjugate to mouse fibroblast cell line NIH3T3
An activated polyethylene oxide nonyl phenyl ether solution was obtained in the same manner as in Synthesis Example 1, and a polyethylene oxide nonyl phenyl ether (n = 40, average molecular weight 2160) -biotin conjugate was prepared in the same manner as in Example 1. Similarly, it was reacted with NIH3T3 cells, further reacted with fluorescein-labeled streptavidin, and observed with a confocal laser scanning microscope to confirm cell membrane modification. The results are shown in Table 1. As a result, no fluorescence derived from fluorescein was observed in all cells treated with polyethylene oxide nonylphenyl ether (n = 40, average molecular weight 2160) -biotin solution. As a result, it was confirmed that a compound containing a bulky substituent represented by a nonylphenyl group in an aliphatic hydrocarbon group was not stably introduced into the cell membrane.
[0061]
[Table 1]

[0062]
In the table, ++ indicates that fairly strong fluorescence activity was observed in the cell membrane of all cells in the field of view (1000 times); + indicates that fluorescence activity was observed in the cell membrane of all cells in the field of view (1000 times) -Indicates that almost no fluorescence activity was observed in the cell membrane of all cells in the visual field (1000 times).
[0063]
[Table 2]

[0064]
【The invention's effect】
The cells of the present invention are stably modified with a physiologically active substance or a substance to be modified such as a probe, and no damage is caused to the cells during the modification of the cell membrane. There is a feature that can be done. The cell membrane modification method provided by the present invention is characterized in that cells having the above characteristics can be provided efficiently and stably.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photomicrograph of a mouse fibroblast cell line NIH3T3 (Example 2) membrane modified with fluorescein labeled streptavidin conjugated to polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate.
FIG. 2 is a photomicrograph of a section of a mouse fibroblast cell line NIH3T3 (Example 2) membrane modified with fluorescein-labeled streptavidin conjugated to polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -biotin conjugate. .
FIG. 3 is a diagram showing the results of observation of floating cells (Example 6) membrane-modified with polyethylene oxide oleyl ether (n = 90, average molecular weight 4400) -EGFP conjugate using a flow cytometer.
FIG. 4 is a photomicrograph of mouse fibroblast cell line NIH3T3 (Example 9) membrane modified with fluorescein-labeled streptavidin conjugated to polyethylene oxide oleyl ether (n = 180: average molecular weight 8400) -biotin conjugate.
FIG. 5 is a photomicrograph of mouse fibroblast cell line NIH3T3 (Example 11) membrane-modified with fluorescently labeled (fluorescein) -polyethylene oxide modified dioleoylphosphatidylethanolamine.
FIG. 6 is a photomicrograph of a mouse fibroblast cell line NIH3T3 (Example 16: Comparative Example) in which membrane modification was attempted with polyethylene oxide (n = 114, average molecular weight 5000) -biotin.

Claims (5)

The following general formula (1):

(In the formula, Z represents a residue of a compound selected from any of ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, diglycerin, pentaerythritol, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, and octaglycerin. AO represents an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms; R ¹ represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms; R ² represents a saturated or unsaturated straight chain having 7 to 22 carbon atoms Or a branched aliphatic hydrocarbon group, or the following general formula (2):

(R ³ and R ⁴ each independently represents a hydrocarbon group having 7 to 21 carbon atoms; R ⁵ represents a hydrocarbon group having 2 to 4 carbon atoms, and b is 0 or 1) X represents a group containing one or more reactive functional groups selected from the group consisting of a succinimide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group, and a thiol group; N, n2, and n3 represent the average number of moles of the oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n1, n2, n3, k1, k2, and k3 represent the following conditions:
0≤n1, n2≤500, 2≤n3≤500, and 2≤n1 + n2 + n3≤500
0 ≦ k1 ≦ 8, 1 ≦ k2 ≦ 4, 1 ≦ k3 ≦ 4, and 2 ≦ k1 + k2 + k3 ≦ 10
Is a number that satisfies
A cell in which a reaction product of an amphiphilic compound represented by the following formula and a physiologically active substance or a probe is bound to a cell membrane by non-covalent bonding by anchoring.   The cell according to claim 1, wherein the cell is an animal cell. The cell according to claim 1 or 2, wherein R ² is a residue of a compound containing one or more straight-chain aliphatic hydrocarbon groups having 11 to 18 carbon atoms. The cell according to claim 1 or 2, wherein R ² is a residue of a compound having one or more oleyl groups or one or more unsaturated aliphatic hydrocarbon groups having 17 carbon atoms. The modifying agent comprising an amphiphilic compound according to any one of claims 1 to 4 , which is used for binding a reaction product with a physiologically active substance or a probe to a cell membrane by noncovalent bonding.

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