JP4497566B2

JP4497566B2 - アルドース還元酵素阻害剤並びに新規サポニン及び新規サポゲノール

Info

Publication number: JP4497566B2
Application number: JP24861098A
Authority: JP
Inventors: 敏之村上; 久司松田; 裕樹上田; 雅之吉川; 條二山原
Original assignee: Nihon Medicinal & Dietary Products Lab.of Yoshikawa Brothers Ltd.
Current assignee: Nihon Medicinal & Dietary Products Lab.of Yoshikawa Brothers Ltd.
Priority date: 1998-09-02
Filing date: 1998-09-02
Publication date: 2010-07-07
Anticipated expiration: 2018-09-02
Also published as: JP2000080044A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルドース還元酵素阻害剤に関する。
また、本発明は、新規サポニン及び新規サポゲノール、特にツボクサ抽出物に含まれる新規サポニン及び新規サポゲノールに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、我国において糖尿病患者数は、急激に増加しており、潜在的患者数を含めると、約６００万人と推定されている。最近、糖尿病性末梢神経障害や糖尿病性白内障とポリオール代謝異常との関連性が明らかになりつつある。すなわち、グルコースをソルビトールに変える酵素（アルドース還元酵素、以下、本明細書中で「ＡＲ」ということもある。）は、正常血糖値ではほとんど活性を示さないが、高血糖になると急激に活性が上昇し、細胞内にソルビトールが蓄積する。ソルビトールは、代謝されにくく、かつ細胞膜を殆ど通過できないので、細胞内にソルビトールが蓄積すると、細胞内の浸透圧が高まり、細胞の障害を引き起こすことになる。従って、糖尿病性末梢神経障害に伴う症状や糖尿病性白内障の予防や改善を図るためには、ＡＲを阻害する必要がある。
【０００３】
ＡＲを阻害する薬剤として、エパルレスタットのような合成ＡＲ阻害剤が開発され、臨床的に用いられている。しかし、合成ＡＲ阻害剤は、発疹、吐き気、倦怠感、めまいなどの副作用があるという問題がある。
【０００４】
一方、天然物由来のＡＲを阻害する化合物としては、ケルセチン（quercetin ）などのフラボノイド（Varma S.D. and Kinoshita J.H., Biochem. Pharmacol., 25, 1976, 2505）やイソリクイリチゲニン（isoliqiritigenin）などのカルコン類（Aida et al., Planta Med., 55, 1989, 22）などが知られているが、実用性に問題がある。
【０００５】
従って、安全で有効で、実用性のあるＡＲ阻害剤の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、容易にＡＲを阻害することができ、それにより糖尿病性末梢神経障害に伴う症状や糖尿病性白内障の予防や改善をもたらすことのできるアルドース還元酵素阻害剤を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、新規サポニン及び新規サポゲノールを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねてきたところ、従来中国で、下痢、腹痛、黄疸の治療に用いられており、またツボクサに含まれるサポニン類に創傷治癒促進効果が知られているツボクサ抽出物を使用すると、容易にＡＲを阻害することができ、それにより糖尿病性末梢神経障害に伴う症状や糖尿病性白内障の予防や改善をもたらすことができることを見い出して本発明を完成した。
また、ツボクサ抽出物中に、新規サポニン及び新規サポゲノールを含有することを見い出して本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
▲１▼ ツボクサの低級アルコール抽出物を有効成分とするアルドース還元酵素阻害剤。
▲２▼ ツボクサの低級アルコール抽出物を、さらに酢酸エチル抽出した抽出物を有効成分とするアルドース還元酵素阻害剤。
▲３▼ 少なくともペツレチン、ケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシド、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸、センテラサポゲノールＡから選ばれる少なくとも一種を含有するアルドース還元酵素阻害剤。
▲４▼ 一般式
【０００９】
【化２】

【００１０】
で示される化合物。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に使用できるツボクサ（Centella asiatica (L.) URBAN）は、セリ科植物であり、アジア各地に広く分布する多年性の草木である。
本発明に使用できるツボクサは、ＡＲ阻害活性化合物を有するものであれば、特に制限されない。好ましくは、強いＡＲ阻害活性を有するベトナム産ツボクサである。
【００１２】
新規サポニンであるセンテラサポニンＡおよび新規サポゲノールであるセンテラサポゲノールＡは、ツボクサの全草中に含まれているので、当該植物から単離・精製することによって取得することができる。
【００１３】
本発明においてツボクサの低級アルコール抽出物は、例えばメタノール、エタノールなどの低級アルコールで抽出することで得られる。アルコール抽出は、例えば上記ツボクサの細切あるいは粗切に抽出溶媒を加えて浸漬し、２〜４時間浸出させた後に、残渣を除去して得る。アルコール抽出は、１回でもよく、複数回（例えば３回）行ってもよい。アルコール抽出は、７５〜８５℃で行うのが通常である。得られたアルコール抽出液の溶媒は、例えば減圧留去等の手段等によって除去して抽出物を得る。
ツボクサと低級アルコールの混合比（体積）は、抽出工程全体で、通常１：１０程度である。
【００１４】
このようにして得られたツボクサの低級アルコール抽出物は、さらに、水に分散させ、例えば酢酸エチルのような有機溶媒を加えて、有機溶媒可溶性分画を得てもよい。このような有機溶媒可溶性分画は、ＡＲ阻害活性物質を多く含有しているので、好ましい。
【００１５】
ツボクサの低級アルコール抽出物には、少なくとも、次式で示されるペツレチン（petuletin ）
【００１６】
【化３】

【００１７】
、次式で示されるケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシド（kaempferol-3-O- β-D-glucuropyranoside）
【００１８】
【化４】

【００１９】
、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸、次式で示されるセンテラサポゲノールＡ（centellasapogenol A ）
【００２０】
【化５】

【００２１】
から選ばれる少なくとも一種を含んでいればよい。これらの化合物は、ＡＲ阻害活性を有するからである。好ましい含有物は、ペツレチン、ケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシドである。これらの化合物は、特に強いＡＲ阻害活性を有しているからである。
【００２２】
これらの化合物は、上記有機溶媒可溶性分画に多く含まれるが、この有機溶媒可溶性分画をさらに、カラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーに供することで単離できる。このように有機溶媒可溶性分画をカラムクロマトグラフィーなどに供することで、新規サポゲノールであるセンテラサポゲノールＡを得ることができる。使用できる吸着剤は、特に制限されないが、例えば、シリカゲル、オクタデシルシリル化したシリカゲル（ＯＤＳ）などが使用できる。
【００２３】
ツボクサの低級アルコール抽出物を有効成分とするアルドース還元酵素阻害剤は、ヒト、ウシ、ウマ等の哺乳動物に対してアルドース還元酵素の活性を抑制・阻害する作用を有する。従って、これを摂取することにより、アルドース還元酵素の活性が抑制ないし阻害され、細胞内でグルコースからソルビトールへの変化が抑制ないし阻害されるため、細胞内のソルビトールの蓄積を抑制でき、細胞内の浸透圧を低く維持でき、その結果糖尿病性末梢神経障害に伴う症状や糖尿病性白内障の予防や改善をすることができる。
【００２４】
上記のようにして得られたツボクサの低級アルコール抽出物を本発明のアルドース還元酵素阻害剤として用いる場合、医薬上許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤など）などを適宜配合し、公知の方法を用いて粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤などの投与に適した態様で製剤化し、経口的または非経口的に投与することができる。
【００２５】
上記製剤中には、ツボクサ低級アルコール抽出物の有効量が配合される。投与量は、投与ルート、症状、患者の体重あるいは年齢などによって適宜選択されるが、例えば、成人患者に経口投与する場合、酢酸エチル可溶性分画を用いる場合、１回当たり約０．５ｇを１日１〜４回投与するのが望ましい。
【００２６】
また、新規サポニンである下式で表されるセンテラサポニンＡ（centellasaponin A ）
【００２７】
【化６】

【００２８】
は、水可溶性分画に多く含まれている。従って、センテラサポニンＡは、この水可溶性分画から単離することで得られる。センテラサポニンＡを水可溶性分画から単離する方法は、特に制限されないが、例えば、カラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを使用してもよい。使用できる吸着剤は、特に制限されないが、例えば、シリカゲル、ＯＤＳなどが使用できる。
【００２９】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明し、試験例によって本発明の効果を明らかにするが、これらは単なる例示であり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
ツボクサの低級アルコール抽出物の抽出方法
ツボクサの低級アルコール抽出物の抽出および後述する試験例２の各ＡＲ阻害活性物質の単離は、図１に示す手順で行った。
【００３１】
ベトナム産ツボクサ３ｋｇにメタノール１０Ｌを加え、熱時（８０℃、３時間）抽出を行い、濾過し、抽出液を得た。同様の操作を全部で３回繰り返した。抽出液を合わせ、メタノールを減圧留去し、メタノール抽出物５４６ｇを得た。このメタノール抽出物を３Ｌの水に分散させた後、酢酸エチル３Ｌを用いて酢酸エチルに可溶なツボクサ成分を抽出した。この抽出液から、酢酸エチルを減圧留去し、酢酸エチル可溶性分画１６８ｇを得た。また、水相も減圧下、水を留去し、凍結乾燥後水可溶性分画４８３ｇを得た。
酢酸エチル可溶性分画を図１に示した方法で分離し、マデカシックアシッド（madecassic acid ）（０．０３４％）、センテラサポゲノールＡ（０．０００７３％）、ケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシド（０．００１７％）、ペツレチン（０．０００６０％）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（０．０００４１％）を単離した。
また、水可溶性分画を図２に示した方法で分離し、マデカソシド（madecassoside ）（０．６６％）、アジアチコシド（asiaticoside）（０．０７８％）、シェフォレオシドＡ（scheffoleoside A）（０．０１４％）、センテラサポニンＡ（０．００９２％）、アジアテックアシッド（asiatic acid）（０．００８７％）、マデカシックアシッド（madecassic acid ）（０．１１％）を単離した。
【００３２】
試験例１
アルドース還元酵素阻害効果評価試験
Dufranらの方法[Biochem. Med. 32, 99(1984) 〕を一部改変した実験を行った。
【００３３】
酵素液としては、ウィスター系雄性ラット（体重約１５０〜３００ｇ）の２０匹分の水晶体を１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（１３５ｍＭ、ｐＨ７．０）５０ｍＬ中でホモジネートした後、１０００００×ｇで３０分間遠心分離し、上清液を用いた。この酵素液は、−２０℃以下で凍結保存し、用時解凍し、リン酸緩衝液にて５〜２０倍に希釈して用いた。
【００３４】
反応液は、リン酸緩衝液（１３５ｍＭ、ｐＨ７．０）０．５ｍＬ中に、硫酸リチウム（１００ｍＭ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）（０．０３ｍＭ）、基質としてＤＬ−グリセルアルデヒド（１ｍＭ）、酵素液（０．１ｍＬ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した被験物を含む液（０．０２５ｍＬ）を含むように調整した。
【００３５】
反応は、ＮＡＤＰＨを上記濃度になるように反応液に加えることで開始した。反応液を３０℃に保った状態でＮＡＤＰＨを反応液に加えて、反応を開始させた。３０分後に０．５Ｎの塩酸０．１５ｍＬを加えて、反応を停止させた。次に、１０ｍＭのイミダゾールを含む６Ｎの水酸化ナトリウム溶液０．５ｍＬを加え、６０℃で１０分間加熱して、ＤＬ−グリセルアルデヒドの還元化物であるグリセロールとともに生成したＮＡＤＰを蛍光物質に変え、蛍光強度を測定した（励起波長３６０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）。
【００３６】
ツボクサメタノール抽出物、酢酸エチル可溶性分画、および水可溶性分画のそれぞれの濃度−阻害曲線から、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀値）を算出した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】

【００３８】
以上の結果から、ツボクサメタノール抽出物、および酢酸エチル可溶性分画が高いＡＲ阻害活性を示すことがわかった。
【００３９】
試験例２
実施例１で得られた酢酸エチル可溶性分画（原料の５．６重量％）をシリカゲルを吸着剤として、カラムクロマトグラフィーに供した。移動相は、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル混液〔（３０：１）→（１０：１）→（１：１）〕→酢酸エチル→クロロホルム−メタノール−水混液〔（１０：３：１）→（６：４：１）〕→メタノールを用いた。得られた各フラクションのうち、フラクション８（原料の０．６３重量％）の５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀値）は、０．２４μｇ／ｍＬであった。このフラクション８を、シリカゲルを吸着剤として、カラムクロマトグラフィーに供した。移動相は、クロロホルム−メタノール−水混液〔（３０：３：１）→（１０：３：１）→（６：４：１）〕→メタノールを用いた。得られた各フラクションのうち、フラクション８−５（原料の０．０９４重量％）、８−９（原料の０．０８２重量％）、８−１０（原料の０．０５２重量％）をそれぞれＯＤＳ（富士シリシア化学（株）製、Chromatorex ODS ）を吸着剤としたカラムクロマトグラフィーに供した。移動相は、メタノール−水混液〔（７０：３０）→（９０：１０）〕→メタノールを用いた。得られた各フラクションをさらに、ＯＤＳカラム（YMC Co., ltd製 YMC-Pack R&D）を使用したＨＰＬＣに供した。移動相は、メタノール−水混液（７０：３０）を使用した。フラクション８−５からセンテラサポゲノールＡ（原料の０．０００７３重量％）を、フラクション８−９からペツレチン（原料の０．０００６０重量％）、ケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシド（原料の０．００１７重量％）を、フラクション８−１０から２，５−ジヒドロキシ−安息香酸（原料の０．０００４１重量％）をそれぞれ単離、精製し、各物質のアルドース還元酵素の阻害効果を試験例１と同様に評価し、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀値）を算出した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】

【００４１】
以上の結果から、ペツレチン、ケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシド、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸、センテラサポゲノールＡは、アルドース還元酵素を阻害できることがわかった。また、ペツレチンとケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシドは、高いアルドース還元酵素の阻害能を有することが判った。
【００４２】
センテラサポゲノールＡの物性
上記抽出方法により得られたセンテラサポゲノールＡは、無色微細結晶であり、その物理化学性は次の通りである。
mp. 247.1 〜251.3 ℃
¹H-MNR(500MHz, pyridine-d₅) δ 0.84, 0.96, 1.06,
1.08, 1.17, 1.18(3H each all s, 29, 30, 24, 25, 27, 26-H₃),
4.26(1H, m, 2-H), 4.18(1H, d, J=11.0, 3-H), 3.72(1H, m, 23-H),
4.19(1H, m, 23-H).
¹³C-MNR(500MHz, pyridine-d₅) δc 14.2, 18.2, 18.5,
18.6, 21.3, 22.3, 24.5, 25.6, 27.9, 32.4, 33.0, 33.7,
35.1, 36.5, 37.5, 38.8, 41.6, 42.0, 43.6, 44.9, 48.2,
48.3, 49.2, 51.3, 66.8, 69.2, 78.5, 128.0, 137.8, 165.3.
〔α〕_D ²⁸-26.6 °(MeOH)
IR(KBr, cm^-1) : 3431, 1698, 1046
HRMS Calcd for C₃₀H₄₈O₅Na(M+Na) ⁺: 511.3420
Found : 511.3399
【００４３】
試験例３
センテラサポニンＡの単離は、図２に示す手順で行った。
【００４４】
実施例１で得られた水可溶性分画（原料の１２．６重量％）をＯＤＳ（富士シリシア化学（株）製、Chromatorex ODS ）を吸着剤として、カラムクロマトグラフィーに供した。移動相は、水→メタノール→クロロホルム−メタノール−水混液（６：４：１）を用いた。得られた各フラクションのうち、フラクション３（原料の１．６６重量％）をＯＤＳ（富士シリシア化学（株）製、Chromatorex ODS ）を吸着剤として、カラムクロマトグラフィーに供した。移動相は、メタノール−水混液〔（５０：５０）→（６０：４０）→（７０：３０）→（８０：２０）〕→メタノールを使用した。得られた各フラクションのうち、フラクション３−２（原料の０．８８重量％）をＯＤＳカラム（YMC Co., ltd製 YMC-Pack R&D）を使用したＨＰＬＣに供した。移動相は、メタノール−水混液（６０：４０）を用いた。得られた各フラクションのうち、フラクション３−２からセンテラサポニンＡ（原料の０．００９２重量％）を単離した。
得られたセンテラサポニンＡは、無色微細結晶であり、その物理化学性は次の通りである。
mp. 197.9 〜200.9 ℃
¹H-MNR(500MHz, pyridine-d₅) δ 0.77, 0.94, 1.01,
1.06, 1.09, 1.17(3H, each all s, 29, 30, 24, 25, 27, 26-H₃),
1.68(3H, d, J=5.96‘’‘-H), 4.98(1H, d, J=7.91''-H),
5.79(1H, s, 1‘’‘-H), 6.24(1H, d, J=7.91'-H).
¹³C-MNR(500MHz, pyridine-d₅) δc 14.4, 18.3, 18.7, 18.7,
18.8, 21.4, 22.4, 24.7, 25.7, 27.8, 32.5, 33.1, 33.6, 35.1,
36.3, 37.3, 38.9, 41.6, 42.2, 43.8, 45.0, 48.3, 48.4, 49.2,
51.3, 61.7, 66.8, 69.4, 69.8, 70.6, 71.7, 72.8, 73.0, 74.1,
74.2, 75.5, 76.8, 77.4, 78.4, 78.6, 79.0, 79.0, 96.1, 103.0,
105.1, 128.4, 139.0, 176.1.
〔α〕_D ²⁴-33.4 °(pyridine)
IR(KBr, cm^-1) : 3436, 1655, 1070
HRMS Calcd for C₄₈H₇₈O₁₉Na(M+Na)⁺ : 981.5035
Found : 981.5048
【００４５】
【発明の効果】
本発明のツボクサの低級アルコール抽出物は、アルドース還元酵素阻害活性を有し、それにより糖尿病性末梢神経障害に伴う症状や糖尿病性白内障の予防や改善をもたらすことができる。
また、本発明のツボクサ抽出物中に、新規サポニン及び新規サポゲノールを含有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ツボクサの低級アルコール抽出物の抽出および各ＡＲ阻害活性物質の単離の手順を示す図である。
【図２】センテラサポニンＡの単離の手順を示す図である。

Claims

次の一般式：

で示される化合物。
請求項１に記載のセンテラサポゲノールＡを有効成分として含むアルドース還元酵素阻害剤。
さらに、ペツレチンを有効成分として含む請求項２に記載のアルドース還元酵素阻害剤。
さらに、ケンフェロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロピラノシドを有効成分として含む請求項２または３に記載のアルドース還元酵素阻害剤。