JP4500494B2

JP4500494B2 - 第ｖｉｉｉ因子の抗原エピトープ、当該エピトープに対して向けられたインヒビターおよびそれらの使用

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Publication number: JP4500494B2
Application number: JP2002587603A
Authority: JP
Inventors: ルスローブ，; ジャムバチスタ，マリオディ
Original assignee: デパートメントセントラルドゥフラクショヌモントドゥラクロワ−ルージュエス．セ．エール．エル．
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2022-05-06
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Description

発明の詳細な説明

発明の主題
本発明は、抗第ＶＩＩＩ因子インヒビターに対する第ＶＩＩＩ因子の抗原性ポリペプチド配列（エピトープ）に関し、この抗第ＶＩＩＩ因子インヒビターはこれらのポリペプチド配列に向けられたものである。そして本発明は、当該抗第ＶＩＩＩ因子インヒビターに向けられた抗インヒビターに関する。

本発明はまた、少なくとも一つの上記分子を含有する医薬組成物および診断用デバイスに関する。

発明の技術的背景
第ＶＩＩＩ因子は、三つの構造ドメインＡ、ＢおよびＣから形成され、２，３３２のアミノ酸から成る巨大な複数ドメインタンパク質であり、これらのドメインはＡ１：ａ１：Ａ２：ａ２：Ｂ：ａ３：Ａ３：Ｃ１：Ｃ２の順番に配置されている。Ａドメインには４０％を超えるホモロジーがあり、そしてセルロプラスミンともホモロジーを有する（最近の総説であるプラット（２０００）およびサエンコ（１９９９）を参照すること）。第Ｖ因子のＡドメインおよび第ＶＩＩＩ因子のＡドメインとの間にも３０％のホモロジーが存在する。Ｃドメインは二回現れ、そして複合糖質および最終的に負電荷を帯びたリン脂質と結合することが可能であると報告されている。Ｃドメインには、負電荷を帯びたリン脂質と結合することが可能なレクチンとのホモロジーも見られる。血小板付着部位もこの領域（Ｃ２ドメイン）内に位置する（フォスターら（１９９０））。

これらの抗原決定基は、フラグメント３５１−３６５（Ａ１ドメイン重鎖）、フラグメント７１３−７４０（Ａ２ドメイン）、フラグメント１６７０−１６８４（Ａ３ドメイン軽鎖）（軽鎖のＮＨ_２末端）から成るか、そうでなければ、フラグメント２３０３−２３３２（Ｃ２ドメイン軽鎖）（フォスターシー、（１９９０））、フラグメント７０１−７５０、フラグメント１６６３−１６８９、フラグメント３３０−４７２、フラグメント１６９４−１７８２（ＥＰ−０２０２８５３）、フラグメント３２２−７４０およびフラグメント２１７０−２３２２から成る。

米国特許第５，７４４，４４６号には、ブタの第ＶＩＩＩ因子またはネズミの第ＶＩＩＩ因子の対応する配列を伴った、Ａ２ドメインのフラグメント３７３−５４０、フラグメント３７３−５０８、フラグメント４４５−５０８、フラグメント４８４−５０８、フラグメント４０４−５０８、フラグメント４８９−５０８およびフラグメント４８４−４８９から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するヒト／動物のハイブリッド第ＶＩＩＩ因子が記載されており、当該ハイブリッドは第ＶＩＩＩ因子欠乏症の治療に用いられる。

これらの種々の部位を認識する抗体は、第ＶＩＩＩ因子の活性化や、ｖＷｆ、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣまたはリン脂質の結合を妨害する。第ＶＩＩＩ因子に応答する特異的な抗体は、個体間でかなりのばらつきがあり、そしてインヒビター抗体についてのエピトープを、第ＶＩＩＩ因子のすべてのドメインについて確定する必要がある（最近の総説であるスキャンデラ、２０００；ローラー、２０００を参照すること）。

その他の抗体−インビトロでの標準的な活性試験を阻害しないもの−は、分子中の活性部位から実質的に少し離れた位置の部位にそれらの抗体が接触している間に、血液凝固カスケードのその他の構成成分と共に、第ＶＩＩＩ因子の挙動に影響を与えることが可能である。これらの抗体は、第ＶＩＩＩ因子の自然の状態のフォールディングを、いくつかの特性を変化させることによって、妨害することが可能である。

注入された第ＶＩＩＩ因子活性を中和する同種異系抗体（インヒビター）が出現することによって、第ＶＩＩＩ因子の代償療法が著しく困難になるかもしれない。報告されているインヒビターの血友病患者における発生率には、相当程度のばらつきがある。発生率は６−３５％前後の範囲に分布している（バーミレンら、１９９８）。たとえば大規模な欠失およびイントロン２２の逆位などのような遺伝的素因を有していそうな者は、インヒビターならびにＭＨＣクラスＩ遺伝子およびクラスＩＩ遺伝子として免疫応答に関与する遺伝子が合同して高頻度で見られる（タッデンハムおよびマックベイ、１９９８）。ある第ＶＩＩＩ因子の産物から別の産物に繰り返し切り替わること、およびいくつかの第ＶＩＩＩ因子濃縮物の免疫原性がより強いという可能性があることも、インヒビターが出現することの説明となるかもしれない（バーミレンら、１９９８）。第ＶＩＩＩ因子を調製するための方法が異なることが、その構造、物理化学的特性または本来の微小環境に影響を与えるかもしれない；ラウブら、（１９９９）；ラウトら、（１９９８）。臨床上の関連性を有する抗第ＶＩＩＩ因子の自己抗体は、非血友病患者の間ではまれである（集団における一年間の頻度：１−５／１０^６）（モリソンおよびルドラム）（１９９５）。これらは多数の自己免疫疾患と関連性を有し、そして多くの場合、生命に関わる出血を特徴とする。他方、抗第ＶＩＩＩ因子抗体は健康な被験者中でも記載されており（エイルジマン（Ａｌｇｉｍａｎ）ら、１９９２；モロー（Ｍｏｒｅａｕ）ら、２０００）、ここでは、被験者における循環する第ＶＩＩＩ因子のレベルに何らの明白な影響も見られない。

炎症部位において、プロフェッショナル抗原提示細胞によってＣＤ４Ｔ細胞に提示される場合、自己タンパク質または誘導されたペプチドは免疫応答を導き出すかもしれない。個々の第ＶＩＩＩ因子ドメインの配列をまたぐ、重なり合った合成ペプチドのプールを用いて、レディングら（２０００）は、健康な被験者および血友病患者において、第ＶＩＩＩ因子反応性ＣＤ４^＋を示した。いくつかの第ＶＩＩＩ因子ドメインが認められた：Ａ３ドメインがより強くかつ高頻度で認められ、そして各ドメインはいくつかのエピトープを形成する。

第ＶＩＩＩ因子の明確なタンパク質分解フラグメント、多数の組み換えペプチドライブラリー、または合成ペプチドアレイを用いての、たとえばウエスタンブロッティング、免疫沈降、および酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの技術を利用して、主にＡ２ドメインおよびＣ２ドメイン中に位置する、異なる第ＶＩＩＩ因子−インヒビター結合部位のマッピングを行った。しかしながら、これらの技術はどれもインヒビターエピトープおよび非インヒビターエピトープを特定するためのモデルを構築することができなかった。わずかに数個のエピトープが別個の配列（＜２０アミノ酸残基）に対してマッピングされている。この問題を解決するために、パルマーら（１９９７）は、第ＶＩＩＩ因子の完全な配列の残基の８０％を表す９６種のウンデカマーペプチド（１１アミノ酸残基）を合成した。彼らは、９人の患者の阻害性抗体のエピトープ特異性を決定することに成功した。他の有用な技術は、第ＶＩＩＩ因子の遺伝子突然変異を分析することであり、そしてそのような突然変異による第ＶＩＩＩ因子分子ならびにファージディスプレイ技術（ファンデンブリンクら、２０００）への影響を分析することである。しかしながら、これらのすべての方法論は時間を要し、費用が高くつく傾向があり、そして患者を確保できるかどうかに大きく依存する。第ＶＩＩＩ因子分子のある特定の領域は、一般的に認識されているインヒビターエピトープのかたまり、たとえばＡ２ドメイン、Ａ３ドメイン、およびＣ２ドメイン内の領域などを含有する「ホットスポット」かもしれない。インヒビターの反応を引き起こす際のこれらの「ホットスポット」の理由には、まだ完全に理解されていない点が残っている（ライスナーら、１９９５）。

現在のところ、血友病患者、臨床医および「分離屋」の間で有力な考えは、すべての病原性の血漿汚染物質および二次作用が除かれた、利用可能な精製第ＶＩＩＩ因子を持つことである。

血友病の犬、重篤複合免疫不全マウス、血友病のマウスなどの異なる動物モデルを用いることは可能であった。しかし、現在までのところ、第ＶＩＩＩ因子調製品の免疫原性もしくは免疫調節効果を、または臨床的に宿主に投与する前にその宿主の感受性を予測することが可能な、満足できる実験モデルは存在しない。

抗第ＶＩＩＩ因子免疫応答が現れる患者は、危険で、攻撃的でかつ極めて高価な手段を講じることが必要な、深刻な状態にあることが分かる。

高い頻度で行われる治療の一つに、プロトロンビン複合体濃縮物と共同してまたは共同せずに、第ＶＩＩＩ因子を非常に多い投与量で投与すること（１５０ＩＵ／ｋｇ、一日に二回）によって免疫トレランスを誘導することがあり、「ボンプロトコール」とされる。治療の選択の余地としては、ＰＣＣ（好ましくは活性化ＰＣＣ〔ＡＰＣＣ〕）または第ＶＩＩａ因子を用いて、第ＶＩＩＩ因子インヒビター活性を回避することもある。これらの代替的な作用物質を注入した結果としての特異的抗体が産生されたが、治療を弱めるものであった。治療前または治療中に、ブタの第ＶＩＩＩ因子と実質的に交差反応を起こさない抗体を有する患者の止血を、代替的な作用物質としてブタの第ＶＩＩＩ因子を用いて実施できるかもしれない（ローラー、２０００）。

インヒビターの産生を阻害するための見込みのある代替的な研究手法としては、レセプター・リガンド結合シグナル事象（エベンスタインら、２０００）を経由して媒介されるＴ細胞／Ｂ細胞の協力を妨害することである。ヒトＴ細胞ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）に対するヒト化マウスモノクローナル抗体を用いて、予備的な臨床試験を実施した。

インヒビターのレベルを下げるための有利な戦略は、総ＩｇＧの固相への吸着が可能となる体外循環に患者をさらすことにある。

免疫吸着は、総ヒト免疫グロブリンに対するセファロース結合スタフィロコッカスのプロテインＡまたはセファロース結合ポリクローナルヒツジ抗体となるかもしれない（クノッフおよびデルフラー、１９９９）。外来タンパク質（プロテインＡ、ヒツジ抗ヒトＩｇ）はカラムから漏出することもあり、そして臓器移植者の免疫機構を引き起こした；その上、衛生面（ＩＣＨトピックＱ５Ａ、指示書９２／７９／ＥＣ）での問題が生じるかもしれない。

多価の静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の注入−ここでは免疫抑制療法と適切に組み合わせている−は、比較的有効であることが分かった。しかしながら、この有効性の理由はまだ完全には明らかにはなっていない。ＩｇＧ合成のフィードバック阻害、ＩｇＧクリアランスの刺激またはサプレッサーＴ細胞の活性化などの種々の仮説が提唱されてきた。一つの興味深い解釈は、これらの市販の静注用免疫グロブリンは、抗第ＶＩＩＩ因子抗体の種々の部分（イディオタイプ）と反応することができ、そしてこれらの抗体を中和することができる抗体を含んでいるのかもしれない、というものである（ディートリッヒら（１９９２））。

残念なことに、これらの研究手法のいずれも安全性、有効性、能力およびコストの点で満足できるものではないことが分かっている。

エピトープの構造の予測についての最新技術は、不連続なアミノ酸残基が最も重要なエピトープを構成しているらしいこと、および多くの場合、エピトープの構造予測を複雑な四次元の難問にせしめるエピトープの予測式に、結合の動力学を組み入れることができないこと（バンレゲンモーテル、方法：メソッズインエンザイモロジーの手引書、９、第４６５−４７２頁、１９９６）といった事実に制限されていた。

著者によれば、未処理のタンパク質に対して産生された抗体のほとんどは、親タンパク質に由来するあらゆるペプチドフラグメントとも反応せず、そしてこのことは、このような抗体が不連続のエピトープ（立体配置的なエピトープ）に対して向けられていることを示唆しているという。

この著者はさらに、抗原性の予測の成功率が低いのは、予測は連続的なエピトープだけを対象としているという事実が原因であり、そして立体的な特徴を常に一次元の直鎖ペプチドモデルに帰着させてエピトープの複雑さを緩和することは現実的ではないと述べている。

同様に、合成ペプチドアレイを用いて新規第ＶＩＩＩ因子インヒビターエピトープを特定しているパルマーら（１９９７）は、それぞれの患者の抗第ＶＩＩＩ因子抗体反応性のパターンがポリクローナルのように思われ、タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端の範囲に位置する複数の部位に対して向けられており、そして調査されたそれぞれの血漿についてユニークであるらしいことを言及している（上記も参照すること）。さらに、この著者は、合成ペプチドアッセイだけでの結果に基づく第ＶＩＩＩ因子凝固活性に関して、あらゆる所定の抗体：エピトープ相互作用の持つ重要性を予測することは困難であることを言及している。（異なる第ＶＩＩＩ因子ドメインの構造と機能との間の関係について不完全な理解と、インヒビターおよび非阻害性抗体の両者が患者の血漿内に存在するかもしれないという可能性が原因である。）

したがって、最新技術の文献には、巨大分子（たとえば第ＶＩＩＩ因子など）上で抗原性直鎖ペプチドを特定することが示されておらず、第ＶＩＩＩ因子に対して向けられたインヒビターによって引き起こされる免疫障害の診断および／または治療に線状エピトープを用いることができるかもしれない。

国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７２号には、第ＶＩＩＩ因子の抗原性フラグメントおよびエピトープ配列ならびにこれらの配列のいくつかに対して向けられたインヒビターが記載されている。

発明の目的
本発明は、免疫障害（特に第ＶＩＩＩ因子のインヒビター、とりわけ第ＶＩＩＩ因子の、フォンウィルブランド因子（ｖＷｆ）、第ＩＸ因子および／または膜のリン脂質（ＰＬ）との結合のインヒビターによって引き起こされる障害）の診断および／または（予防を含む）治療を改良するために、第ＶＩＩＩ因子の新規抗原エピトープを得ることを目的とし、当該エピトープによって、非阻害性のおよび阻害性の抗第ＶＩＩＩ因子同種異系抗体または自己抗体（同種異系免疫グロブリンまたは自己免疫グロブリン）の間でのスクリーニングが可能となる。

本発明の別の目的は、これらの抗原エピトープとの免疫親和性を示すインヒビターを得ること、および抗インヒビター、特に抗体または（Ｔ）細胞レセプターを得ることであり、この抗インヒビターは上記の当該インヒビターに対して向けられたものであり、その目的は、免疫障害の診断および／または治療（または予防）を改良することである。

本発明のさらなる目的は、治療および診断の分野でのＧＭＰ基準（ＩＣＨトピックＱＳＡ、指示書９２／７９／ＥＣなど）にしたがって、汚染物質（ウイルス、プリオンなど）がない高純度の当該分子を工業レベルで得ることである。

発明の概要
本発明は第ＶＩＩＩ因子の抗原性ポリペプチド配列（エピトープ）に関する。この因子の完全な配列はベルハーら（１９８４）によって記載され、そしてこの因子は、完全な第ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸番号の付与の基準を提供する。

「第ＶＩＩＩ因子の完全なポリペプチド配列」とは、自然なままのヒトの配列または動物の配列と理解され、これらのものはグリコシル化されていてもよく、そして血漿のプールから、特に寒冷沈降物内からの精製によって、合成によっておよび／または第ＶＩＩＩ因子の遺伝子操作によって得られたものである（血液凝固メカニズムには関与しない部分の配列は削除されていてもよい）。

本発明は特に− 次のものから成る群より選択される第ＶＩＩＩ因子の抗原エピトープ配列に関する：
− 次の配列によって規定される、セリン２０１８からヒスチジン２０３１までを含有してなるエピトープ：
配列番号：１０：

− 次の配列によって規定される、チロシン５５５からグルタミン５６５までのエピトープ：
配列番号：１７：

− 次の配列（Ｐ４）によって規定される、ロイシン７３０からセリン７４１までのエピトープ：
配列番号：２０：

末端のアミノ酸セリン（Ｐ４）がおよび／または最初のアミノ酸ロイシンが欠失しているかもしれない
− 次の配列（Ｐ５）によって規定される、セリン８１７からセリン８３０までのエピトープ：
配列番号：２１：

− 次の配列によって規定される、アスパラギン２１２８からアスパラギン２１３８までのエピトープ：
配列番号：２４：

− 次の配列（Ｐ１２）によって規定される、セリン２２０４からグルタミン２２２２までのエピトープ：
配列番号：２７：

− 次の配列によって規定される、イソロイシン２２６２からグルタミン２２７０までのエピトープ：
配列番号：３０：

− 次の配列（Ｐ１４）によって規定される、ロイシン２２７３からセリン２２８９までのエピトープ：
配列番号：３１：

− 次の配列（Ｐ１５）によって規定される、プロリン２２９２からチロシン２３０５までのエピトープ：
配列番号：３２：

リン脂質のフォンウィルブランド因子結合部位に関わる末端のトリペプチドＴｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列（Ｐ１６）によって規定される、グルタミン酸２３２２からチロシン２３３２までのエピトープ：
配列番号：３３：

本発明はさらに、当該エピトープの主要な部分に関する。当該エピトープからは一つ以上の末端のアミノ酸、好ましくは一つ、二つまたは三つのアミノ酸を削除することが可能であり、または、親水性、柔軟性および接近可能性といった特性と同じ特性を示す一つ以上のアミノ酸によって、当該エピトープを置換することが可能である。

本発明のエピトープのいくつかが、ヒトインヒビターエピトープまたはいくつかの因子結合部位もしくは既知のモノクローナル抗体の結合部位、特にモノクローナル抗体Ｍａｓ５３１Ｐの結合部位として知られているＣ２部位もしくは結合部位ＥＳＨ８、ならびにリン脂質、第Ｘａ因子もしくはフォンウィルブランド因子結合部位の主な決定基内に含まれていることも知られている。しかしながら、本発明の特異的エピトープまたはそれらの主要な部分が、当該結合部位の好ましい部分として選択されるか、または当該結合部位との潜在的な重なり合いを含んでいてもよい。

これらのエピトープ配列は、パーカーおよびホッジズ（１９８６）によって規定される高い親水性、カープラスおよびシュルツ（１９８５）によって規定される高い柔軟性、およびジャニン（１９７９）によって規定される高い接近可能性という特に有利な特徴を有する。

これらのエピトープは、特に第ＶＩＩＩ因子タンパク質の表面上に露出しており、そして明白な抗原性および免疫原性の特性を示す。

本発明の別の側面は修飾（組み換えまたはトランスジェニック）第ＶＩＩＩ因子に関し、遺伝子工学によって得られ、そして上記に確認されたエピトープまたは当該エピトープの主要部分の一つ以上のものを削除されるかもしれない。

都合が良いことに、当該第ＶＩＩＩ因子はなお単数（または複数）の凝固因子の結合を許容するものの、免疫原性はより小さくなり、当該修飾第ＶＩＩＩ因子または天然第ＶＩＩＩ因子に対して向けられたインヒビターの形成を誘導しないかまたは誘導の程度がより小さくなるだろう。

当該エピトープはさらに独立して免疫原性を有し（すなわち、たとえばＢＳＡ、ＫＬＨ、ヘモシアニンなどのサイズが大きなタンパク質と複合化しなくても、これらのエピトープは免疫原性を有する）、そして好ましくは、たとえば抗第ＶＩＩＩ因子抗体などの第ＶＩＩＩ因子のインヒビターの内部での免疫親和性を示し、および／またはＴリンパ球およびおそらくＢリンパ球のレセプターについての免疫親和性を示す、という点も好都合である。

これらのエピトープおよび／または当該エピトープの主要部分は、これらがウサギの中に注入された場合、免疫反応（抗体の合成）を誘導する。

当該配列が、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体に対して実質的に免疫原性を有するという特徴は予想外であるものの、合成によって容易にかつ都合良く得るには、この配列は十分短い。

本発明はさらに、本発明の上記に特定された少なくとも二つの異なる配列のエピトープおよび／または少なくとも二つの当該エピトープの主要部分を含有する立体配置的なエピトープに関する。

この立体配置的なエピトープは二つ以上の異なるポリペプチド配列の部分から構成され、この部分は、タンパク質がその三次構造または四次構造にてフォールディングする場合、互いの近傍に位置する。

これらのエピトープは、第ＶＩＩＩ因子のインヒビターによって、特に（主要組織適合遺伝子座（ＭＨＣＩおよび／またはＭＨＣＩＩ）を経由して）Ｂリンパ球およびＴリンパ球および／または抗第ＶＩＩＩ因子抗体（スキャンデラら（２０００）；レディングら、（２０００））によって、好ましくは同時に「認識される」（すなわち、免疫親和性を示す）という能力を有する。

より強力な免疫原性を示す複合体を形成するように、当該エピトープおよび／または当該エピトープの主要部分が、キャリアタンパク質またはキャリアペプチド、たとえばＢＳＡ、またはＫＬＨ、ヘモシアニンなどと複合体化することが好ましい。

本発明はさらに、上記の線状エピトープ（配列番号：１０、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３）のエピトープ混合物を含有する第ＶＩＩＩ因子の抗原エピトープのプールに、または当該エピトープもしくは最新技術として既に記載されている少なくとも一つの当該エピトープおよび一つ以上のさらなる第ＶＩＩＩ因子の抗原エピトープを含有してもよいプールから作られる立体配置的なエピトープを含有する第ＶＩＩＩ因子の抗原エピトープのプールに関し、そして好ましくは、以下のものから成る群から選択されるものに関する：
− 次の配列によって規定される、アルギニン１６４８からチロシン１６６４までのエピトープ：
配列番号：１：

テトラペプチドＡｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（Ｐ７）の一つ以上のアミノ酸が、またはジペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒの最後の一つまたは二つのアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、アスパラギン酸１６８１からアルギニン１６９６（Ｐ８）までのエピトープ：
配列番号：２：

エピトープのＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、スレオニン１７３９からチロシン１７４８までのエピトープ：
配列番号：３：

− 次の配列によって規定される、アスパラギン１７７７からフェニルアラニン１７８５までのエピトープ：
配列番号：４：

末端のジペプチドＳｅｒ−ＰｈｅまたはテトラペプチドＰｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、グルタミン酸１７９４からチロシン１８１５までのエピトープ：
配列番号：５：

最初のトリペプチドＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ（Ｐ９）または最初のノナペプチドＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、メチオニン１８２３からアスパラギン酸１８３１までのエピトープ：
配列番号：６：

− 次の配列によって規定される、グルタミン酸１８８５からフェニルアラニン１８９１までのエピトープ：
配列番号：７：

− 次の配列によって規定される、グルタミン酸１８８５からアラニン１９０１までのエピトープ：
配列番号：８：

ヘプタペプチドＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＴｈｒのまたはトリペプチドＣｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、アスパラギン酸１９０９からアルギニン１９１７までのエピトープ：
配列番号：９：

− 次の配列によって規定される、アラニン１０８からバリン１２８までのエピトープ：
配列番号：１１：

末端のアミノ酸アラニンおよびバリン（Ｐ１）が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、グルタミン酸１８１からロイシン１９２までのエピトープ：
配列番号：１２：

末端のジペプチドＴｈｒ−Ｌｅｕの一つまたは二つのアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、アスパラギン酸２０３からアラニン２２７までのエピトープ：
配列番号：１３：

ノナペプチドＡｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、アスパラギン酸３２７からメチオニン３５５までのエピトープ：
配列番号：１４：

末端のジペプチドＡｓｐ−Ｓｅｒの一つ以上のアミノ酸がまたはオクタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｐ２）の一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、アスパラギン酸４０３からリジン４２５までのエピトープ：
配列番号：１５：

テトラペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ（Ｐ３）の一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、バリン５１７からアルギニン５２７までのエピトープ：
配列番号：１６：

ジペプチドＰｒｏ−Ａｒｇの一つまたは二つのアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、ヒスチジン６９３からグリシン７０１までのエピトープ：
配列番号：１８：

− 次の配列（Ｐ４）によって規定される、セリン７１０からアスパラギン酸７２５までのエピトープ：
配列番号：１９：

− 次の配列によって規定される、イソロイシン２０８１からセリン２０９５までのエピトープ：
配列番号：２２：

テトラペプチドＩｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、チロシン２１０５からグリシン２１２１までのエピトープ：
配列番号：２３：

トリペプチドＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（Ｐ１０）の一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列（Ｐ１３）によって規定される、グルタミン２２３５からロイシン２２５１までのエピトープ：
配列番号：２８：

末端のジペプチドＳｅｒ−Ｌｅｕの一つまたは二つのアミノ酸がまたはテトラペプチドＶａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕの一つ以上のアミノ酸が欠失しているかもしれない
− 次の配列によって規定される、グリシン２２４２からロイシン２２５１までのエピトープ：
配列番号：２９：

末端のジペプチドＳｅｒ−Ｌｅｕの一つまたは二つのアミノ酸が欠失しているかもしれず、当該エピトープは既知のモノクローナル抗体結合部位ＥＳＨ８２２４８−２２８５と部分的に重なり合っている可能性を示している。

本発明の別の側面は、抗原エピトープとの、当該エピトープの主要部分とのおよび／または本発明の複合体との免疫親和性を示す第ＶＩＩＩ因子のインヒビターに関する。

インヒビターとは、当該第ＶＩＩＩ因子に結合し、そして（当該第ＶＩＩＩ因子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を特徴とする）免疫障害を引き起こす能力を有する、あらゆる生体分子または細胞（たとえばＴリンパ球など）を意味すると理解される。

特に、このようなインヒビターは、当該第ＶＩＩＩ因子を不活性化する、および／またはフォンウィルブランド因子へのおよび／または膜のリン脂質への第ＶＩＩＩ因子の結合を阻害する抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体もしくは抗体フラグメント（たとえば当該抗体の超可変性Ｆａｂ部分）である可能性がある。

ヒトの免疫機構を含む「キメラ」動物−たとえば、ヒト抗体を産生するｈｕ−ＳＣＩＤマウスまたはトランスジェニックマウスなど−によって、またはファージディスプレイ技術または特にＥＰＶによる不死化Ｂ細胞のようなその他の抗体産生技術によって当該インヒビターが合成されることは好都合である。

本発明の別の側面は、既に記載されている当該第ＶＩＩＩ因子インヒビターに対して向けられた抗インヒビターに関する。

第ＶＩＩＩ因子インヒビターに対して向けられた抗インヒビターは、確実に不活性化するか、または第ＶＩＩＩ因子への結合を防止するもしくは弱めるというような方法によって当該インヒビターを妨害する能力を有する、あらゆる化学物質または生体分子、細胞および／または細胞フラグメント（レセプター）を意味すると理解される。

このような抗インヒビターは、天然のまたは遺伝子工学によって得られる、抗−抗第ＶＩＩＩ因子のイディオタイプ（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体または抗体フラグメントであることが好ましい。

本発明の別の側面は、適切な製薬学上の担体または希釈剤および当該エピトープまたはそのプール、それらエピトープに対して向けられた第ＶＩＩＩ因子のインヒビター、当該インヒビターに対して向けられた抗インヒビター、および／またはこれらの混合物から成る群より選択される成分を含む医薬組成物に関する。

当該医薬組成物中に存在する適切な製薬学上の担体または希釈剤（そしてもしかすると補助剤または賦形剤）のタイプおよび量は投与方法にしたがって変化してもよく、そして本発明の医薬組成物の治療上の特性を改良するために、または起こり得る副作用を減少させるために、補助剤を組み合わせることもあり得る。本発明の医薬組成物において用いられる適切な製薬学的に許容される担体は、当業者によって周知のものであり、薬剤師によって一般的に用いられる方法にしたがって選択され、そして固体、液体または気体の無害の製薬学的に許容される担体が挙げられる。活性成分／製薬学的に許容される担体のパーセンテージについては、極めて大きな範囲内で変更してもよいが、（ヒトを含む）患者の耐性および患者への考えられる副作用、ならびに投与の頻度および／または投与様式によってのみ制限される。

これらのエピトープおよび／または当該エピトープの主要部分、本発明の複合体またはそれらのプール、それらに対して向けられたインヒビター、当該インヒビターに対して向けられた抗インヒビター、および／またはそれらの混合物から成る群より選択される成分を含む、診断用装置および／または精製用装置、たとえば診断キット、アフィニティーフィルター、またはクロマトグラフィーカラムに関する。当該装置は、患者のスクリーニングを可能とし、当該患者において存在する最も重要なインヒビターを検出でき、そして十分な特異性および感度を伴う陽性試験を可能とする当該エピトープのプールを含む点で都合が良い。

したがって、精製用装置は、これらのエピトープおよび／またはエピトープの主要部分を含み、クロマトグラフィーカラムの固相に付着しているクロマトグラフィーカラムで構成されることも可能である。

患者に由来し、そして第ＶＩＩＩ因子のインヒビターを含有する体液（たとえば血清など）が、当該インヒビター（たとえば抗体など）が当該エピトープもしくは当該主要部分またはそのプールに特異的に付着しながら固体担体（クロマトグラフィーカラム）を通過する。溶出の後に、抗インヒビター（抗−抗第ＶＩＩＩ因子のイディオタイプ抗体）と反応させることによって、当該インヒビターを集めることが可能である。

第ＶＩＩＩ因子のインヒビターがその固相上に付着している固体担体（クロマトグラフィーカラム）を通過したこれらの抗インヒビターによって、血清中に存在する抗−抗第ＶＩＩＩ因子のイディオタイプ抗体をキャラクタライズすることも可能である。

当該エピトープまたはそのプールと結合させることによって第ＶＩＩＩ因子のインヒビターを除去した後で、当該患者に体液（血液または血清もしくは得られる画分）を再注入すること（生体外での治療）も可能である；当該インヒビターは、ヒト患者に適用される透析法に推奨されているのと同様に、体液（血液または血清）から取り除かれる。

本発明はさらに、第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビターによって引き起こされる病状を示す患者を治療する方法（生体外での治療）であって、患者から当該体液（血液または血清）を抽出する工程、本発明のエピトープまたはそのプールが結合している固体担体上で反応を行う工程、そして当該エピトープ、主要部分またはそのプールが固定されたインヒビターを除去した後で当該体液を患者に再注入する工程を含む方法に関する。

本発明の最後の側面は、免疫障害、特に第ＶＩＩＩ因子のインヒビターによって、第ＶＩＩＩ因子の第ＩＸ因子および／または第Ｘ因子および／またはフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）への結合のインヒビターによって、および／または第ＶＩＩＩ因子の膜のリン脂質への結合のインヒビターによって引き起こされる免疫障害を予防するおよび／または治療するために用いられる薬剤を調製するための本発明の医薬組成物の使用に関する。

添付された図を参照しつつ次の非限定的な実施例において、本発明を具体的に説明する。

図面の簡単な説明
図１は、第ＶＩＩＩ因子のＡ３配列の１から３７１に番号を付け替えられたアミノ酸の親水性、柔軟性および接近可能性の（それぞれのアミノ酸についての表面値の）グラフを表す。

図２ａは、ペプチド−セファロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる、ヒト抗−配列番号：３２抗体の精製に関する溶出プロファイルを表す。コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩ溶液（５０ｍｌ）をカラム（１ｍｌのゲル）上に添加し流速を１ｍｌ／分とした。実施例に記載されたようにして、特異的抗体の分離を実施した。矢印は、特異的ヒト抗−配列番号：３２抗体の位置を示す。

図２ｂは、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩから精製された抗−（配列番号：３２）ＩｇＧの存在下での第ＶＩＩＩ因子凝固活性を表す。実施例に記載されたようにして、その量が増加する抗−配列番号：３２の存在下で、第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を測定した。第ＶＩＩＩ因子活性の％＝（抗体存在下での第ＶＩＩＩ因子活性／抗体非存在下での第ＶＩＩＩ因子活性）×１００。

図３は、ウエスタンブロッティング後の、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに対するヒト抗ペプチド抗体の免疫反応を表す（パネルＡの左側から右側への方向：ＨＡＰ１からＨＡＰ４までのヒト抗体であり、第ＶＩＩＩ因子ＨＣ内で見られた異なる第ＶＩＩＩ因子エピトープ配列について特異的である−表２も参照すること、そしてパネルＢ：Ｐ５ペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子ＬＣ配列、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９について特異的なヒト抗体−表２も参照すること）。ＲＡＰ９のレーンは、ペプチド配列Ａｒｇ^１７９７−Ｔｙｒ^１８１５について特異的な精製ウサギ抗体に対する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの反応性を示す（表２も参照すること）。

図４は、４種のインヒビター血漿の、異なるペプチド配列とのＥＬＩＳＡでの反応性を表す。４人の患者の血漿中に存在するインヒビターを、選択された異なる第ＶＩＩＩ因子エピトープ合成ペプチドを被覆抗原として用いるＥＬＩＳＡ試験によって、縦軸で表されているように分析した。

実施例
材料と方法
試薬
ＭＡＳ５３０ｐ（ハーラン−セララブ社、インディアナポリス、インディアナ州）は、第ＶＩＩＩ因子重鎖の４４ｋＤａのＡ２ドメインに対して特異的なマウスモノクローナル抗体である。ビオチン標識化ウサギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧをダコパッツ社（コペンハーゲン、デンマーク）から購入した。ビオチン標識化ヤギＩｇＧ−抗ヒトＩｇＧおよびビオチン標識化マウスＩｇＧ−抗ウサギＩｇＧをシグマケミカルズ社（セントルイス、ミズーリ州）から入手し、精製α−トロンビン（３０００ＩＵ／ｍｇ）、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）をシグマケミカルズ社（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。カゼインをメルク社（ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。４−クロロ−１−ナフトールおよびビオチン化分子量マーカーをバイオ−ラッドラボラトリーズ社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）から入手した。フロイントのアジュバントはディフコ社（デトロイト、ミシガン州）からのものであった。

第ＶＩＩＩ因子濃縮物
血漿第ＶＩＩＩ因子（ｐ−ＦＶＩＩＩ）は、イオン交換クロマトグラフィーで精製した溶媒／界面活性剤処理済み第ＶＩＩＩ因子濃縮物（タンパク質１ｍｇあたり１００ＩＵ）（ＦＶＩＩＩＣｏｎｃ．ＳＤ、シーエーエフ−ディーシーエフ赤十字社、ブリュッセル、ベルギー）であった。アルブミンを含まない組み換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を、ハイランド社（グレンデール、カリフォルニア州）から入手した。

血漿画分免疫グロブリン
４，８００人の無給の提供者由来の多量の血漿プールを、徐々にエタノール濃度を高めて沈殿させた後のものから、コーン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＩ＋ＩＩＩを得た。この画分は、すべてのＩｇクラスおよびサブクラスを含有する。比濁法によってＩｇＧの組成を測定した。各サブクラスの相対的なパーセントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４についてそれぞれ６３．７；３０．１；３．４および２．８であった（画分ＩＩ＋ＩＩＩの三つの異なるバッチについての平均値）。

第ＶＩＩＩ因子濃縮物、第ＶＩＩＩ因子の活性および活性の阻害
コアグロメーターＫＣ４Ａ（シグマダイアグノスティックス社）上で用いるように適合化させたワンステージ凝固アッセイにて、第ＶＩＩＩ因子の活性を測定した。このアッセイでは、危険な血友病Ａ血漿（オラガノンテクニカ社、ケンブリッジ、イギリス）とインスツルメンテイションラボラトリー社（ウォリントン、イギリス）のＡＰＰＴ試薬とを用いる。第５国際標準第ＶＩＩＩ因子濃縮物８８／６４０（５．４ＩＵ／ｍｌ）（エヌアイビーエスシー（ＮＩＢＳＣ）社、ポッターズバー、イギリス）と相対化することによって、有効性を算出した。ベセズダアッセイの変法にしたがって、精製ウサギＩｇＧ調製品および精製ヒトＩｇＧ調製品にて第ＶＩＩＩ因子阻害活性を測定した。簡単に言えば、アフィニティー精製されたＩｇＧを連続的に希釈し、そして第ＶＩＩＩ因子濃縮物８８／６４０（１ＩＵ／ｍｌ）の存在下、３７℃にて１時間インキュベートした。残りの第ＶＩＩＩ因子の活性を、上記のようにして測定した。

α−トロンビンによる第ＶＩＩＩ因子の活性化およびイムノブロッティングは、他の箇所に記載した（ピールリンクら、１９９７）。

ペプチドの合成、ペプチドのキャリアタンパク質への複合化およびウサギ抗ペプチド抗血清の作製は、ネオシステム社（ストラスブール、フランス）によって行われた。

アフィニティークロマトグラフィーによるウサギ抗体およびヒト抗体の精製
ウサギ抗体およびヒト抗体を精製するために、製造メーカーの取扱説明書にしたがって、５ｍｇの異なるペプチドをそれぞれ１ｍｌのプレパックのＮＨＳ−活性化セファロース（ファルマシアバイオテック社、ウプサラ、スウェーデン）に結合させた。自動液体クロマトグラフィーシステム（ＡＥＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００Ａ、ファルマシア社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、５０ｍｌのウサギ抗血清、またはコーン分画（画分ＩＩ＋ＩＩＩ；１３ｍｇタンパク質／ｍｌ）の後に得られた１００ｍｌのヒト血漿画分のいずれか一方から、特異的な抗ペプチド抗体を精製した。簡単に言えば、５倍の体積のＴＥ緩衝液（２０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のＮａＮ_３）に対してサンプルを３回透析し、そして１ｍｌ／分の流速にてカラム上に添加した。２ｍｌ／分にて、５０ｍｌのＴＥ緩衝液および１ＭのＮａＣｌを含有する３０ｍｌのＴＥを用いて、このカラムを順次洗浄した。吸着後に、５ｍｌの０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．５によって物質を（１ｍｌ／分で）溶出し、そして５ｍｌの１Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ９．０中に直接回収した。最後に、サンプルを１０倍の体積の平衡化緩衝液に対して透析し、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０（アミコン社、ビバリー、マサチューセッツ州）で濃縮した。バイオラッドタンパク質アッセイによって、Ｉｇの回収を測定した。

結果
第ＶＩＩＩ因子の線状エピトープの可能性があるものの選択
８から２５残基の範囲の、３０を超える表面領域（線状エピトープ）−高い親水性、高い柔軟性および高い接近可能性に特徴を有する−が第ＶＩＩＩ因子分子上で特定された。これらが外側の位置にある可能性が高いことに基づいて（Ａ３について図１を参照すること）、特定された、１３個またはそれを超える鎖長のアミノ酸残基と適合する１６種の直鎖ペプチド（Ｐ１からＰ１６）を選択した。これらのペプチドを合成し、そして特異的抗血清を作製するためにオボアルブミンと結合させた（以下では表１）。Ｐ８は、シマら（１９８８）に記載されたエピトープを含み、外部コントロールとして用いた。

ウサギモデルを用いて当該合成線状エピトープから得られた実験結果
ウサギ抗第ＶＩＩＩ因子−ペプチド抗血清および回収されたアフィニティー精製免疫グロブリンの特性に関する結果を、表１に要約している。

Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインの中から、１６種の合成ペプチド（１０から２０アミノ酸）を選択した。オボアルブミンとの複合化の後に、ＯＶＡ−ペプチド複合体をウサギの中に注入し、そして第ＶＩＩＩ因子抗ペプチド抗血清のＲＡＰ１からＲＡＰ１６について調査した。

より正確に言えば、二羽のウサギをそれぞれ第ＶＩＩＩ因子−ペプチド−オボアルブミン調製品を用いて免疫化した。特異的抗血清のＲＡＰ１からＲＡＰ１６（カラムｂ、表１）を調製し、そしてｒＦＶＩＩＩまたは第ＶＩＩＩ因子−ペプチド−ＫＬＨを抗原として用いるＥＬＩＳＡ（カラムｃ、表１）にてアッセイを行った。５０％が結合する血清の希釈率の逆数の対数に負号をつけたものとして、ＥＬＩＳＡの力価を表現する。次いで、ペプチド結合セファロースでのクロマトグラフィーによって、免疫グロブリンを精製した。イムノブロッティングの後に抗第ＶＩＩＩ因子ペプチドＩｇによって認識された第ＶＩＩＩ因子のドメインを（カラムｄ、表１に）示し、そしてＩｇタンパク質の回収の程度を、免疫グロブリンを標準として用いて測定した（カラムｅ、表１）。ＢＵ／ｍｇタンパク質で表示される阻害活性を、第ＶＩＩＩ因子中和活性アッセイにて測定した（カラムｆ、表１）。

第ＶＩＩＩ因子ペプチドの免疫原性およびウサギ抗第ＶＩＩＩ因子ペプチド抗血清のキャラクタライゼイション
ＫＬＨタンパク質に結合する第ＶＩＩＩ因子−ペプチドであって、対応する異なる第ＶＩＩＩ因子−ペプチド、または精製ｒＦＶＩＩＩのいずれか一方を抗原として用いるＥＬＩＳＡによって、第ＶＩＩＩ因子抗ペプチド抗血清の反応性を測定した。それぞれの抗第ＶＩＩＩ因子−ペプチド抗血清の結合反応は、ウサギでの免疫応答を導くために用いられる第ＶＩＩＩ因子ペプチド、およびｒＦＶＩＩＩの両者について特異的であった（表１を参照すること）。

ウサギ抗ペプチド抗体の第ＶＩＩＩ因子エピトープの特異性を明らかにするために、ｒＦＶＩＩＩおよびトロンビンにて処理した後に得られるｒＦＶＩＩＩのフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてウサギＩｇＧの異なる調製品を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。予想された通り、選択された線状エピトープを含有する、対応する第ＶＩＩＩ因子フラグメントに対して、ほとんどの抗血清（１４／１６、８７％）が強く反応することが示された（表１を参照すること）。

ウサギ抗第ＶＩＩＩ因子ペプチド抗体の精製
下記の方法に記載の通りに、ペプチド−セファロースにてのアフィニティークロマトグラフィーによって特異的ウサギＩｇＧを精製した。ワンステージ凝固アッセイにて第ＶＩＩＩ因子中和活性を測定した場合、二種のウサギＩｇＧ精製調製品：配列番号：１４について特異的なＩｇＧに対応するＲＡＰ２および配列番号：０１について特異的なＩｇＧに対応するＲＡＰ７による顕著な阻害が見られた。

ヒトｒＦＶＩＩＩを用いるイムノブロッティングによる、ウサギ抗第ＶＩＩＩ因子ペプチド抗体のエピトープマッピング
ウサギ抗ペプチド抗体の第ＶＩＩＩ因子エピトープの特異性を明らかにするために、ｒＦＶＩＩＩおよびトロンビンにて処理した後に得られるｒＦＶＩＩＩのフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてウサギＩｇＧの異なる調製品（ＲＡＰ１からＲＡＰ１７のＩｇ）を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。

それぞれ重鎖および軽鎖について特異的な二種のモノクローナル抗体であるＭｏＡｂ５３０ｐおよびＭｏＡｂｌ８の混合物を用いて、それぞれのレーンにおいて、ｒＦＶＩＩＩの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）ならびにそれらのトロンビンによるタンパク質分解産物（４４ｋＤａおよび７２ｋＤａ）を特定した。ＭｏＡｂ１８は、トロンビンによる活性化後に得られる、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖フラグメントのＮＨ_２末端を認識し、このフラグメントはあまりにも小さいため、電気泳動後のゲルに残っていることを検証することができなかった。１７種のウサギ免疫グロブリン調製品のうちの１４種が、ｒＦＶＩＩＩおよびｐＦＶＩＩＩの両者と強く反応した。抗血清のＲＡＰ１、ＲＡＰ２、ＲＡＰ３、ＲＡＰ４は、（２００ｋＤａから９２ｋＤａの）重鎖を独占的に認識した。抗血清のＲＡＰ１およびＲＡＰ２は５０−ｋＤａのＡ１ドメインフラグメントと反応し；ＲＡＰ３およびＲＡＰ４は４４−ｋＤａのフラグメント（ドメインＡ２）と結合し；（Ｂドメインについて特異的な）ＲＡＰ５は高分子量の第ＶＩＩＩ因子重鎖（約２００−ｋＤａ）と結合した。

ＲＡＰ７、ＲＡＰ８、およびＲＡＰ９は、８０−ｋＤａの軽鎖のダブレットと反応した。ＲＡＰ９およびＲＡＰ１２からＲＡＰ１７の抗体は、７２−ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子軽鎖フラグメントも検出した。予想された通り、それぞれの反応性抗血清は、対応する、選択された線状エピトープを含有する第ＶＩＩＩ因子フラグメントと強く反応することが示された。ＲＡＰ６またはＲＡＰ１０と、ＨＣ第ＶＩＩＩ因子フラグメントまたはＬＣの第ＶＩＩＩ因子フラグメントとの間の反応は、ゲル中では検出できなかった。

ヒト自己抗体を精製し、キャラクタライズするための当該合成線状エピトープから得られた実験結果
表２は、健康な被験者のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩに由来するヒト抗第ＶＩＩＩ因子抗体のキャラクタライゼイションに関する。

今までのところ、１３種の異なる第ＶＩＩＩ因子ペプチドに結合したセファロースにて、ヒト抗ペプチドＩｇＧ調製品（ＨＡＰ１からＨＡＰ１７まで）を精製した（カラムａ、表２）。これらのＩｇ（カラムｂ、表２）をイムノブロッティングによって分析した。ｒＦＶＩＩＩのＨＣ鎖またはＬＣ鎖への結合、そしてｒＦＶＩＩＩのトロンビンフラグメントへの結合を、それぞれ表２のカラムｃおよびｄに示す。第ＶＩＩＩ因子−ドメイン反応性を表２のカラムｅに示す。矢印は、８０−ｋＤａのバンドの強度が低下したことを意味する。アフィニティー精製後のＩｇの回収の程度（カラムｆ、表２）を、μｇ／１０ｍｇの添加された画分ＩＩ＋ＩＩＩで表現する（材料と方法を参照すること）。１３種のＩｇ調製品のそれぞれの存在下でのインキュベートの後で、凝固アッセイの阻害をベセズダアッセイにて測定した（カラムｇ、表２）。

健康な提供者におけるヒト抗第ＶＩＩＩ因子抗体を免疫精製するための第ＶＩＩＩ因子ペプチドの使用
健康な被験者中に存在するヒト抗第ＶＩＩＩ因子抗体の調製およびキャラクタライゼイションを行うために、我々は、選択された特異的抗ペプチド抗体の存在を示すための免疫グロブリンに富むコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩを分析した。適切なペプチド（表２を参照すること）に結合したセファロースにてのアフィニティークロマトグラフィーによって、ヒト抗第ＶＩＩＩ因子−ペプチド抗体（ＨＡＰ１からＨＡＰ１１、ＨＡＰ１６およびＨＡＰ１７）を精製した。典型的な例として、図２に、Ｃ２ドメインで見られる配列である配列番号：３２によって得られたクロマトグラフを示す。表２には、それぞれの第ＶＩＩＩ因子ドメイン（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１およびＣ２）において選択された１７種のエピトープ配列によって得られた結果が要約されている。用いられた１３種の第ＶＩＩＩ因子ペプチドのそれぞれについて特異的な免疫グロブリンのかなりの量が、出発血漿画分ＩＩ＋ＩＩＩから得られた。得られた精製ヒト抗体の特異性について、血漿第ＶＩＩＩ因子、組み換え第ＶＩＩＩ因子、およびトロンビンによるタンパク質分解後に得られたフラグメントを用いてのイムノブロッティングによって直接テストした（表２を参照すること）。

ヒト精製抗体調製品におけるＩｇＧのアイソタイプの分布は、極めて不均一であることが分かった。興味深い点としては、回収されたＩｇＧのうちの４０から７９％のものが、ＩｇＧ２サブクラスに属していたことであった。ほとんどの調製品において、ＩｇＧ４は過剰に（最大で２５％まで）表示されているように思われた。

ヒト抗第ＶＩＩＩ因子−ペプチド抗体調製品のすべてについての第ＶＩＩＩ因子活性を阻害する能力を、ワンステージ凝固アッセイによってテストした。表２には、テストを行った１３種の調製品のうちの７種（５４％）、それぞれ配列番号：１４、配列番号：１９、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：２２、配列番号：３２および配列番号：３３が阻害活性を示したことが記載されている。典型的な例として、抗−配列番号：３２のＩｇ濃度の第ＶＩＩＩ因子活性の阻害を関数の形として図２に示す。

第ＶＩＩＩ因子に対するヒト抗第ＶＩＩＩ因子ペプチドＩｇ免疫特異性
得られた精製ヒト抗体の特異性について、血漿第ＶＩＩＩ因子、組み換え第ＶＩＩＩ因子、およびトロンビンによるタンパク質分解後に得られたフラグメントを用いてのイムノブロッティングによってテストした。第ＶＩＩＩ因子−ＨＣ−もしくは第ＶＩＩＩ因子−ＬＣ−特異的マウスモノクローナル抗体または第ＶＩＩＩ因子−ペプチド−特異的ウサギポリクローナル抗体のいずれか一方を用いて、第ＶＩＩＩ因子フラグメントを再度特定した。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧの結合後に、ヒト抗体を特定した。図３には、第ＶＩＩＩ因子ペプチド配列番号：１１（Ｓｅｒ^１０９−Ｌｙｓ^１２７）、配列番号：１４（Ｃｙｓ^３２９−Ａｓｐ^３４８）、配列番号：１５（Ｔｙｒ^４０７−Ｌｙｓ^４２５）または配列番号：１９（Ｃｙｓ^７１１−Ａｓｐ^７２５）に結合したセファロースにて精製された４種のヒト抗体調製品との、高分子量の第ＶＩＩＩ因子（≧９２−ｋＤａ）の免疫反応が示されている。Ｓｅｒ^１０９−Ｌｙｓ^１２７−セファロースまたはＣｙｓ^３２９−Ａｓｐ^３４８−セファロースにて精製されたヒト抗体によって、５０−ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子フラグメント（ドメインＡ１）が認められ、そしてＴｙｒ^４０７−Ｌｙｓ^４２５−セファロースおよびＣｙｓ^７１１−Ａｓｐ^７２５−セファロースにて精製された免疫グロブリンによって、４４−ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子フラグメント（Ａ２）が認められた。抗−（Ｓｅｒ^８１７−Ｓｅｒ^８３０）免疫グロブリン調製品（ＨＡＰ５）が第ＶＩＩＩ因子フラグメントに対して反応しないことから、このエピトープがドメインＢのアミノ末端に位置することが確認される（図３）。配列番号：１（Ａｒｇ^１６５２−Ｔｙｒ^１６６４）のペプチドまたは配列番号：２（Ａｓｐ^１６８１−Ａｒｇ^１６９６）のペプチドに結合したセファロースにて精製されたヒト抗体は、８０−ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子軽鎖（図３）と強く反応した。両調製品について、８０−ｋＤａのものと反応したバンドがトロンビンによるタンパク質分解後に消失したことは、エピトープが、予想された通りに、第ＶＩＩＩ因子Ａ３ドメインのＮＨ_２末端の部分にあるａ３酸性ペプチド内に位置していることを示す。配列番号：５（Ａ３ドメイン内にあるＡｒｇ^１７９７−Ｔｙｒ^１８１５）のペプチドについて特異的なヒト抗体をイムノブロッティングによって分析したところ、ｒＦＶＩＩＩについてのそれらの抗体の特異性は、８０−ｋＤａの第ＶＩＩＩ因子軽鎖およびその７２−ｋＤａのトロンビンフラグメントに制限されているように思われた。

ｒＦＶＩＩＩを用いてのＥＬＩＳＡにて陽性反応が得られたのにも関わらず、第ＶＩＩＩ因子ペプチドの配列Ｃおよび配列番号：２３について特異的な抗体調製品を用いても、ｒＦＶＩＩＩ鎖またはフラグメントとの免疫反応は検出されなかった。このことは、これらの免疫グロブリン調製品は立体配置的なエピトープを認識することを意味するのかもしれない。

血友病Ａ患者の血漿におけるヒト抗第ＶＩＩＩ因子抗体をキャラクタライズするための第ＶＩＩＩ因子合成ペプチドの使用
ＥＬＩＳＡ実験にて選択されたペプチドを使用し、血友病Ａの血漿において抗第ＶＩＩＩ因子抗体の特異性が存在するかどうかを測定した。これらのペプチドをマイクロプレート上で被覆した（ＰＢＳ緩衝液１ｍｌあたり２５μｇ、４℃で１６時間）。患者血漿をトリス−カゼイン緩衝液で１／１０から１／１０００に希釈したものを、被覆されたペプチドと３７℃で２時間反応させた。結合したヒトＩｇＧを、方法の欄に記載されたようにして測定した。コントロールのサンプルを健康な提供者の血漿プールとした。図４は、４人の血友病Ａ患者の血漿を用いて得られた結果を示している。光学濃度は、二つの独立した実験の平均値（患者のＯＤ−健常者の血漿プールのＯＤ）を補正したものである。

分子モデルでのエピトープの予測
ペンバートンら（１９９７）は第ＶＩＩＩ因子のＡドメインの分子モデルを構築した。この三次元モデルから、第ＶＩＩＩ因子の活性の重要な領域について予測し検討することが可能となる。このモデルを用いて、パーカーおよびホッジのアルゴリズムによって特性された第ＶＩＩＩ因子ペプチドエピトープの位置を決定した。これらのアルゴリズムによって予測された通り、Ａドメイン内に位置するすべてのペプチドは第ＶＩＩＩ因子表面上で見出され、そして細部に至るまで完全に利用可能なものであった。

エピトープと第ＩＸａ因子結合ループとの間の重なり合い（Ｇｌｕ^１８１１−Ｔｙｒ^１８１５にまたがった共通する５残基）から、フィブリンクロット形成時の、対応する抗−（Ａｒｇ^１７９７−Ｔｙｒ^１８１５）抗体の阻害作用を明らかにすることができるかもしれない。

結果の分析
凝固試験において、ウサギの抗−（Ｃｙｓ^３２９−Ａｓｐ^３４８）抗体および抗−（Ａｒｇ^１６５３−Ｔｙｒ^１６６４）抗体の存在下では第ＶＩＩＩ因子活性の顕著な阻害が記録された。しかし、異なる阻害様式が観察された。抗−（Ａｒｇ^１６５３−Ｔｙｒ^１６６４）による阻害は、第ＶＩＩＩ因子活性の激しい低下を伴う二次反応速度式に従う。抗−（Ｃｙｓ^３２９−Ａｓｐ^３４８）Ｉｇの有効性はより小さく、そして、抗体の濃度に非線形的な依存性を伴ったさらに複雑なタイプの反応を示す。エピトープのＡｒｇ^１６５２−Ｔｙｒ^１６６４およびそれに近接する主な結合部位のｖＷＦ（Ｇｌｕ^１６７５−Ｇｌｕ^１６８４の残基）は、酸性軽鎖ペプチドａ３内に位置する。ウエスタンブロッティングによって示されるとおり、トロンビン処理の後にＡ３ドメインからａ３が遊離し、抗−（Ａｒｇ^１６５２−Ｔｙｒ^１６６４）Ｉｇが活性化第ＶＩＩＩ因子にさらに結合することを妨害する。同様の結果がシマら（１９９１）によって報告されており、彼らは、第ＶＩＩＩ因子活性を中和するウサギポリクローナル抗体の結合部位として、第ＶＩＩＩ因子の配列Ａｓｐ^１６６３−Ｓｅｒ^１６６９を記載していた。エピトープのＣｙｓ^３２９−Ａｓｐ^３４８は、活性化されたプロテインＣの切断部位（Ａｒｇ^３３６）およびトロンビンの切断部位（Ａｒｇ^３７２）に近接するものとして記載されている（ａ１中の）酸性のＡｓｐ^３４８−Ｌｙｓ^３６２配列と重なり合っていた。これはヒト血友病インヒビターのターゲットである。抗−（Ａｓｐ^３４８−Ｌｙｓ^３６２）抗体は、タンパク質分解または第Ｘ因子相互作用部位（Ｍｅｔ^３３７−Ａｒｇ^３７２）（サエンコら、１９９９およびスキャンデラら、２０００）を妨害するかもしれない。

１３種のＩｇ調製品のすべてについて、第ＶＩＩＩ因子−中和活性を測定した。７種のヒトＩｇ調製品は、凝血促進活性を阻害することを示した。これらはそれぞれアミノ酸残基Ｃｙｓ^７１１−Ａｓｐ^７２５、Ｔｙｒ^１６８１−Ａｒｇ^１６９６、およびＡｒｇ^１７９７−Ｔｙｒ^１８１５について特異的であった。Ｃｙｓ^７１１−Ａｓｐ^７２５配列は、Ｔｙｒ^７１８、Ｔｙｒ^７１９、およびＴｙｒ^７２３において硫酸化チロシンを含有し、そして活性化とＨＣのタンパク質分解との両方を促進するものとして記載された第ＶＩＩＩ因子ＨＣ領域のＬｙｓ^７１３−Ａｒｇ^７４０と重なり合う。添加された硫酸化群は、トロンビンまたは第Ｘ因子−活性化複合体において見られるような他の成分と適切に相互作用を行うために必要なのかもしれない。この配列もさらに領域Ｇｌｙ^７０１−Ｓｅｒ^７５０と重なり合っており、阻害性マウスモノクローナル抗体によってかすかに認められる。ペプチドＰ８（Ｔｙｒ^１６８１−Ａｒｇ^１６９６）（第ＶＩＩＩ因子ＬＣ）は、シマら、１９９１によって既に記載されている配列Ｇｌｕ^１６８４−Ａｒｇ^１６８９を含有する。これはトロンビン活性化部位のＡｒｇ^１６８９−Ｓｅｒ^１６９０を含む。Ｐ４（Ｃｙｓ^７１１−Ａｓｐ^７２５）はさらに、患者抗体のレパートリーをジーンファージディスプレイ技術にて分析することによって検出されたＡｓｐ^７１２−Ａｌａ^７３６配列に含有される。これは、患者における潜在的な補助的インヒビターとして提案されている（ファンデンブリンクら、２０００）。ペプチドＰ９（Ａｒｇ^１７９７−Ｔｙｒ^１８１５）は第Ｘａ因子結合部位を含有する（下記を参照すること）。

ヒトから精製されたかまたはウサギ内で産生された１６種の抗第ＶＩＩＩ因子−ペプチド免疫グロブリンのうち、７種は試験の条件下で第ＶＩＩＩ因子活性を中和した。小さなペプチドの配列と免疫結合アッセイを用いて、我々はさらなる新規エピトープの証拠を提供した。我々は、新規エピトープがＡ１ドメイン（Ｓｅｒ^１０９−Ｃｙｓ^１２７残基）内、Ａ２ドメイン（Ｃｙｓ^４０７−Ｌｙｓ^４２５）内、およびＢドメイン（Ｓｅｒ^８１７−Ｓｅｒ^８３０およびＧｌｕ^１０７８−Ｐｒｏ^１０９２）内に位置することを見出した。

変性第ＶＩＩＩ因子を用いて免疫精製された自己抗体が、健康な被験者内および正常ヒト免疫グロブリンのプール（画分ＩＩを処理したもの、上記を参照すること）内で報告されている（エイルジマンら、１９９２およびモローら、２０００）。血流からの変性第ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントのクリアランスにおけるおよび／または免疫トレランスにおける、考えられる役割が示唆された。

第ＶＩＩＩ因子の治療および治療用第ＶＩＩＩ因子濃縮物の質を改善するために、第ＶＩＩＩ因子エピトープを特定することは達成されるべき主な課題である。第ＶＩＩＩ因子エピトープ配列は、患者ポリクローナル抗第ＶＩＩＩ因子Ｉｇが、全体的な阻害活性および活性の調節に寄与しているかどうかを決定することの助けになる。これらエピトープ配列はさらに、治療中の患者における抗第ＶＩＩＩ因子の特異性がいつものように転換することを監視することにも用いることが可能かもしれない。第ＶＩＩＩ因子エピトープのこのようなキャラクタライゼイションと、フォールディングしている分子上でのこれらエピトープの位置のモデルによって、血友病患者および非血友病患者の両者におけるインヒビターの取り扱い（検出、フォローアップおよび第ＶＩＩＩ因子エピトープペプチドの治療目的の使用など）が改善される。

図１は、第ＶＩＩＩ因子のＡ３配列の１から３７１に番号を付け替えられたアミノ酸の親水性、柔軟性および接近可能性の（それぞれのアミノ酸についての表面値の）グラフを表す。図２ａは、ペプチド−セファロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる、ヒト抗−配列番号：３２抗体の精製に関する溶出プロファイルを表す。図２ｂは、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩから精製された抗−（配列番号：３２）ＩｇＧの存在下での第ＶＩＩＩ因子凝固活性を表す。図３は、ウエスタンブロッティング後の、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに対するヒト抗ペプチド抗体の免疫反応を表す。図４は、４種のインヒビター血漿の、異なるペプチド配列とのＥＬＩＳＡでの反応性を表す。

配列表

Claims

配列番号３２によって規定されるエピトープからなる、単離されたまたは精製されたヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原フラグメントを含む、サンプル中の阻害性のおよび非阻害性の抗第ＶＩＩＩ因子抗体の存在または非存在を決定するためのキット。
配列番号３２によって規定されるエピトープからなる、単離されたまたは精製されたヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原フラグメントに結合されるキャリアタンパク質またはキャリアペプチドを含む複合体。
配列番号３２によって規定されるエピトープからなる、単離されたまたは精製されたヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原フラグメントとの免疫親和性を示す阻害性の抗第ＶＩＩＩ因子抗体または抗体フラグメント。
請求項３に記載の抗体またはフラグメントに向けられた抗−抗第ＶＩＩＩ因子のイディオタイプ抗体または抗体フラグメント。