JP4501346B2 - Method for detecting chemical substances using microorganisms - Google Patents

Description

出典：酵母ラボマニュアル 酵母分子細胞生物学実験法 シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社 1998 pp.5-6
【００１０】
本発明では、微生物として酵母Saccharomyces cerevisiae W303株 (American Type Culture Collection ATCC 2001239) にLEU2遺伝子を挿入しさらにURA3遺伝子を有するプラスミドで形質転換したものを用いる場合、SD培地にアデニン、ヒスチジン、トリプトファンを添加した培地を基本とし、これに種々のアミノ酸を添加するのが、好ましい。
この態様における、本発明に用いられる培地の具体例を以下に示す。
ａ）合成選択培地にアミノ酸を添加する例
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、ウラシル）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-アルギニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-アスパラギン酸）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-グルタミン酸）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-ロイシン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-リシン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-メチオニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-フェニルアラニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-セリン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-トレオニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-トリプトファン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-チロシン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-バリン）
ｂ）SD培地の糖組成としてグルコースの代わりにガラクトース、もしくはラフィノースを加えたもの
・SD培地＋ガラクトース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン）
・SD培地＋ラフィノース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン）
【００１１】
ｃ） 富栄養培地
・YPD培地
【００１２】
データベース作成に当たり、上記組成の培地のなかから、好ましくは５から１０個程度を選択する。
【００１３】
データベース作成に用いる培養培地に添加する「毒性物質」は、農薬、医薬品、染料、塗料、接着剤等の産業用途を有し環境に放出され可能性の高い化学物質および消毒・焼却の過程により非意図的に生成される化学物質であり、毒性を有することが懸念されるものである。これらの物質の毒性作用として、内分泌撹乱物作用、変異原性、発がん性、遺伝毒性、生態毒性、免疫毒性、細胞機能障害毒性等が知られている。
【００１４】
具体的な「毒性物質」としては例えば、表２に示すものが挙げられる。
【表２】

【表３】

【００１５】
他の具体例として、以下の表３に示すものが挙げられる。
【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【００１６】
データベース作成の際には、添加に際し選択する毒性物質は多ければ多い方が良いが、好ましくは２０から３０個程度、上記毒性物質のなかから選択する。
用いる毒性物質の濃度は、用いる微生物の生育を阻害するが、死滅に至らない濃度であり、通常個々の毒性物質のＩＣ５０値を用いる。生物を用いた実験はその結果がばらつく。よって、ＩＣ５０値を求める場合も３回以上の実験を行いその平均値を算出する。そこで、生物由来の実験誤差を無くする為に、データーベース作成時に細胞の生育に影響を与える濃度条件を決定するという方法が考えられる。
微生物が酵母の場合、毒性物質の濃度は次のようにして決定することもできる。毒性物質の希釈系列を作成し、初期の対数増殖期にある細胞（OD660=0.2〜0.5）に負荷し、さらに25℃で４時間培養する。この時、毒性物質を負荷しない細胞も同様に培養し対照区とする。２時間後、各濃度の毒性物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定する（毒性物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料のCFUをCFU-contと呼ぶ）。試料の残りはデータベース作成用の計測に供し、事後に決定した最適条件のもののみをデータとして用いる。
毒性物質添加直前に培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種する。同様に、２時間後に各濃度の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定する（化学物質負荷直前の試料のCFUをCFU-before、毒性物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料のCFUをCFU-contと呼ぶ）。酵母の倍加時間（doubling time）は2時間程度なので、CFU-contは通常CFU-beforeの２倍程度になる。異なる濃度の毒性物質を負荷した場合、細胞の増殖に影響を与える程度のCFU、すなわちCFU-contの50%以上の濃度、望ましくは75.5%に近くなる濃度を毒性物質の濃度として選択する（細胞が死滅する濃度ではCFUは0%であり、生育に影響を与えない濃度ではCFUは対照区と等しく100%となる）。
【００１７】
データベース作成に用いる「培養培地」の調製は当業者に周知である。例えば、上記のとおり種々選択した組成の溶液を、121℃、20分間オートクレーブすることにより滅菌する。アミノ酸は個々に高濃度の水溶液を作成し滅菌したものを用意し、必要に応じて最終濃度が上記表１となるように添加する。毒性物質は水またはジメチルスルホキシドに溶解し、最終濃度は前述の様に希釈系列を作成して実験を行う、もしくは事前に測定したIC50濃度になるように培地に添加する。
【００１８】
データベース作成に用いる「微生物の培養」は通常、４時間、２５℃にて行う。
【００１９】
データベース作成に用いる「微生物」は、天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良い。ここに、野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物であり、例えばW303は栄養要求性等について組換えされているが、それ以上の組換えはされていない。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。
天然に存在する細胞もしくは樹立された細胞株を形質転換せずに用いた場合、データベース作成に用いる「微生物が示す応答」は毒性物質の存在下に変動する遺伝子のｍＲＮＡレベルである。ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック 改定第２版、羊土社、2000, pp299-301）、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊 Tipsシリーズ 改定PCR Tips, 秀潤社、1999, pp25-43）等によって測定できる。
ここに、「毒性物質の存在下に変動する遺伝子」は、酵母細胞の場合、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されている酵母遺伝子の中から適宜選択し、これらはインターネットを介して知ることができる。好ましい遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子である。例えば、YKL071W、YCR102C、YOR382W、YLL057C、YLR303W等である。
【００２０】
データベース作成に用いる「微生物」はまた、上記天然に存在する細胞の組換え体、即ち形質転換体とすることができる。本発明に用いる形質転換体は、上記「毒性物質の存在下に変動する遺伝子」のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して得られるポリヌクレオチド構築物を含むベクターを上記天然に存在する細胞に導入することにより調製できる。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は周知である（例えばR.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp138-165, pp.234-263, 2000を参照）。
【００２１】
プロモーターの配列に関連し、例えば酵母を用いる場合、酵母の全DNA配列は明らかにされているので、公共のデータベース（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae）を用いることにより、プロモーターを含む酵母遺伝子配列を得ることができる。
マーカータンパク質の例としてはGFP（Green Fluorescence Protein）（Heim, R., Cubitt, A. B. and Tsien, R. Y.（1995） Nature 373, 663-664；Heim, R., Prasher DC. and Tsien, R. Y.（1994） Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504；Warg, S. and Hazerigg, T.（1994）Nature 639, 400-403；Youvan, D.C. and Michel-Beyerle, M.E.（1996）Nature Biotechnology 14 1219-1220；Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. and Prasher, D.C.（1994）Science 263, 802-805）、β-ガラクトシダーゼ（Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211(3):154-6）、ルシフェラーゼ（Arch Toxicol 2002 Jun;76(5-6):257-61、Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.)、及びアセチルトランスフェラーゼ（J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb;21(1):71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors. Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M.)等が挙げられる。
【００２２】
ベクターの調製は、例えば酵母細胞の場合、酵母において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、次いでプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをマーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより行うことができる。
形質転換体は周知の手法により調製できる。例えば、酵母細胞を形質転換する方法は、Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp.133-134,1994に記載されている。
形質転換体を用いた場合、本発明のデータベース作成に用いる「微生物が示す応答」はマーカータンパク質の発現レベルである。マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定することにより得られる。例えばマーカータンパク質がＧＦＰの場合、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しなくても直接、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による画像処理、フローサイトメトリーによる計測、エバネッセント光による計測、さらに比色計などを用いた検出方法により、細胞の蛍光（GFP）もしくは発色（β-gal）を測定できる場合もある。
【００２３】
好ましい形質転換体は、酵母遺伝子のプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母、または染色体のORFをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドで置換するように形質転換されている酵母であり、さらに好ましくは、その酵母遺伝子がミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子のなかから選ばれるものである。
【００２４】
データベース作成に用いる「微生物が示す応答の差異の指標化」を、マーカータンパク質としてGFPを用いた場合を例として以下に説明する。
毒性物質と接触後、マーカータンパク質の発現レベルを上記のようにして測定する。酵母細胞を生理食塩水で洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行い、フローサイトメトリー（例えばEPICS XL：ベックマンコールター）を用いて一回の実験につき10000個の酵母細胞の蛍光を計測し、これらの細胞の蛍光強度の平均値を得る。対照区の蛍光強度の平均値との比を求め、例えばその比が１．５以下であれば「−」、１．５−２．０であれば「＋」、２以上であれば「＋＋」などと指標化する。
【００２５】
上記の通り、得られたデータは、表または電子情報化された形式としてまとめ、データベースとすることができる。
【００２６】
本発明は、上記のようにして作成された本発明データベースの使用方法であって、微生物を生育させる培養培地におけるアミノ酸組成および／または糖組成の違いにより、微生物が化学物質に対して示す応答の差異を指標に用いることを特徴とする化学物質を検出するための方法において、指標化された応答に対して照合する、該データベースの使用方法をも提供する。
【００２７】
２）化学物質の検出方法
本発明はさらに、微生物を生育させる培養培地におけるアミノ酸組成および／または糖組成の違いにより、微生物が化学物質に対して示す応答の差異を指標に用いることを特徴とする、化学物質を検出するための方法に関する。詳細には、被検試料中の化学物質を検出するための微生物を用いる方法であって、
（１）本発明のデータベースを作成するのに用いた培養培地におけるアミノ酸組成および糖組成と同じ組成を有する複数の培養培地にて、該被検試料の存在下、微生物を培養し、
（２）個々の培養培地における微生物が示す応答の差異をそれぞれ指標化し、
（３）指標化された応答の差異を、該データベースの指標と照合し、
それにより、該データベースにおける指標と同じ指標を示す該被検試料中の化学物質を検出する方法に関する。
【００２８】
本発明はまた、被検試料中の化学物質を検出するための微生物を用いる方法であって、
（１）種々のアミノ酸組成および種々の糖組成を有する培養培地それぞれに特定の毒性物質を添加した複数の培養培地を調製し、
（２）個々の得られた培養培地にて、該被検試料の存在下、微生物を一定期間培養し、
（３）個々の培養培地における微生物が示す応答の差異をそれぞれ指標化し、
（４）指標化された応答の差異を基準として、該被検試料中の化学物質を検出する、ことを特徴とする方法に関する。
【００２９】
本発明の化学物質の検出方法において「培養培地のアミノ酸組成および調製」、「毒性物質」、「微生物およびその培養」、「微生物が示す応答の差異およびその指標化」は、上記本発明のデータベース作成の説明と同様である。
【００３０】
上記の通り、本発明は、微生物の生育に用いる培養培地の組成の違いにより化学物質に対する微生物の応答が異なるという発見を基本とする。本発明の化学物質検出方法は、培養培地の組成を変えることにより、検出可能な化学物質の種類を増やすことが可能である。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３２】
参考例１
レポーター・ジーン・アッセイ
酵母遺伝子YBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiaeにて開示）をPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，Sequencher_Iマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCA （配列番号１）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
GGGGTACCCCGTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG （配列番号２）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い、試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invitrogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドはベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分（配列番号３）を用いた。まず、ｐYES2の多重クローニング部位（multiple cloning site）の中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクターを作成した。次いで、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を酵母遺伝子であるYBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドと置換し、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【００３３】
次に、このプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303（American Type Culture Collection ATCC 2001239）を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303をYPD培地200mlにてOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferに懸濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μｌずつ分注し10μlの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μｌの５０％PEG4000を添加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地（SD培地に必要なアミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）を加えたもの）で作成した寒天プレートに播種する。
【００３４】
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
得られた形質転換体はＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）上にて４８時間まで安定に当該プラスミドを保持していることを確認した。
【００３５】
実施例１
化学物質負荷実験
参考例１にて調製した形質転換体を以下の表４に示す濃度の各化合物と、下記の培養条件下にて接触させる。
【表１４】
表４
酵母Ｗ３０３の生育能に対する化学物質の効果（ＩＣ５０）
化学物質 濃度
（１）２−アミノアントラセン 33.3 mM
（２）ベンゾ（ａ）ピレン 0.2 mM
（３）ビスフェノールＡ 0.4 mM
（４）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル） 83.3 mM
（５）２，４−ジクロロフェノール 0.3 mM
（６）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸 0.3 mM
（７）ホルムアルデヒド 0.2 mM
（８）塩化メチル水銀 0.2 μM
（９）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド 0.6 μM
（１０）ｐ−ノニルフェノール 10 μM
（１１）ペンタクロロフェノール 50 μM
（１２）亜ヒ酸ナトリウム 0.3 mM
（１３）チウラム 20 μM
（１４）トリブチルスズクロライド 0.4 μM
（１５）２，４，５−トリクロロフェノール 30 mM
（１６）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩） 0.2 mM
（１７）パラコート 16.7 mM
（１８）塩化カドミウム 40 μM
（１９）リンダン 6.7 mM
（２０）マラチオン 22.2 mM
（２１）マネブ 0.8 mM
（２２）塩化ニッケル（ＩＩ） 3.3 mM
（２３）重クロム酸カリウム（ＶＩ） 0.3 mM
（２４）トリフェニルスズクロライド（ＩＶ） 10 μM
（２５）フェノール 5.6 mM
（２６）チオベンカルブ 0.7 mM
（２７）ヘキサクロロフェン 30 μM
（２８）トリクロサン 730 μM
（２９）塩化水銀（ＩＩ） 50 μM
（３０）硫酸銅（ＩＩ） 3.3 mM
（３１）シアン化カリウム 16.7 mM
（３２）ジメチルスルホキシド 3.7 %
ＩＣ５０はYPD培地およびSD培地にて測定し、それらはほとんど等しいことを確認した。
【００３６】
培養条件
培養培地の組成
１．ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）；
２．ＳＤ培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル）
３．ＳＤ培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）
４．ＳＤ培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）
５．ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）；および
６．ＳＤ培地＋ガラクトース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）；
【００３７】
必要なアミノ酸を加えたSD培地10mlに凍結保存した形質転換体を白金耳で掻き取り、２５℃で振とう培養し、フルグロース（(定常状態まで増殖されそれ以上細胞数が増えない状態）させる。各培地１０mlにフルグロースさせた細胞けん濁液を50ul加え、２５℃で振とう培養し、OD660が0.2から0.5になった時点で化学物質を負荷する。化学物質負荷から４時間後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）を用いて一回の実験につき10000個の酵母細胞の蛍光を計測し、これらの細胞の蛍光強度の平均値を得た。対照区の蛍光強度の平均値との比を求め、指標化した。
得られた結果を表５に示す。表中、対照区に対し、蛍光強度が1.5倍以下を−、1.5倍以上2.0倍未満を＋、2.0倍以上を＋＋と表記した。
【００３８】
【表１５】

【表１６】

【００３９】
上記により、同じ形質転換体を用いても培養する培地の組成に応じて個々の化学物質に対する形質転換体の生育状態が変動することが証明された。本発明は、実施例記載のようにして作成される上記表５のデータを、データベースの一態様として提供する。
【００４０】
実施例２
被検試料中の化学物質検出
被検試料について、実施例１と同様、各組成を有する培養培地に添加し、同形質転換体を培養し、そしてその生育状態を上記基準に従って指標化することで指標のパターンを得る。それにより、同じパターンを示す化学物質が特定でき、被検試料中に存在し得る化学物質が推定される。
被検試料中に複数の化学物質が含まれる場合、毒性の種類の組合わせによって微生物が示す応答は相加もしくは相乗されることがある。しかし、実際的には同じ影響濃度の複数の化学物質という条件は非常に稀であるため、一番毒性の強い状態の化学物質が検出されると考えられる。
被検試料中に存在する化学物質の濃度が薄いと遺伝子発現は対照区と変化無いし、濃いと細胞が死滅するので遺伝子が発現しない。よって、IC50付近が本発明にとって好適な濃度である。
【００４１】
被検試料について好適な濃度を決定する方法
１．事前に濃度を決定しておく方法
被検試料が低濃度の場合は濃縮し、希釈系列を作り、高濃度の場合は希釈系列を作り、実験を行う。
希釈系列の試料を作成し、フルグロースの細胞を最小栄養培地で200倍に希釈した溶液に負荷する。２時間置きに４８時間までOD660を測定する。このとき、細胞の生育に影響を与えるが死滅しない濃度で、細胞の生育を５０％程度阻害する濃度を選択してIC50とする。
【００４２】
２．化学物質検出と同時に濃度を決定する方法
また、以下の様にしてＣＦＵを計測することで、好適な濃度を選ぶことができる。
化学物質添加直前に培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種する。同様に、２時間後に各濃度の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定する（化学物質負荷直前の試料のCFUをCFU-before、化学物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料のCFUをCFU-contと呼ぶ）。酵母のdoubling timeは2時間程度なので、CFU-contは通常CFU-beforeの２倍程度になる。異なる濃度の化学物質負荷した場合、細胞の増殖に影響を与える程度のCFU、すなわちCFU-contの50%以上95%以下の濃度、望ましくは75.5%に近くなる濃度を化学物質の濃度として選択する（細胞が死滅する濃度ではCFUは0%であり、生育に影響を与えない濃度ではCFUは対照区と等しく100%となる）。各濃度の化学物質を添加した細胞は、化学物質添加４時間後に生食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行い冷蔵保存しておき、上記の手順で適当な濃度を選択した後にデータを収集する。CFUを測定する替わりに、生細胞のみを染色する染色法を用いて、生細胞をカウントするという方法も考えられる。
【００４３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> DAIKIN INDUSTRIES, LTD.
<120> Method for Detecting Chemical Substance with Microorganism
<130> 187131
<160> 3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcagtcaacg aggagcgaat ca 22
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggggtacccc gttaatttgt ttagtttgtt tg 32
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> Aequorea victoria
<400> 3
atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60
ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120
ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180
ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300
ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360
gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggcaacat tctgggacac 420
aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480
ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600
tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660
cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720 [0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention uses microorganismsChemistryMaterialdetectionRegarding the method.
[0002]
[Prior art]
  There are a huge number of chemical substances that human beings have created so far, and new chemical substances are being developed year by year. These chemical substances are used in all aspects of modern life and help improve human life. On the other hand, some chemical substances are released into the environment at various stages of production, distribution, use, disposal, etc., and remain in the environment, biological concentration through food chains, etc. Some have harmful effects on the ecosystem, and environmental pollution has become a social problem. Therefore, there is a request to evaluate the effects of chemical substances on the human body and ecosystem.
  As the evaluation method, conventionally, bioassays mainly using individuals such as fish, daphnia, shellfish, etc., cell growth inhibition and specific biological reactions as indicators are performed. However, these methods can only determine the presence or absence of toxicity due to chemical substances in the environment. As an approach to determine not only the presence or absence of toxicity due to chemical substances in the environment, but also the nature of the toxicity and which chemical substances in the environment are attributed, multiple types of indicator chemical substances and their existence at various concentrations A method using the relationship between the growth state of a plurality of types of indicator microorganisms has been reported (Patent Document 1: JP 2001-238694 A). There are also bioassays developed to detect specific toxicity indicators (endpoints). For example, the ames method which is a gene mutation test in which 90% or more of known carcinogens are positive (Non-patent Document 1: “Bioassay of physiologically active substances”, Kodansha, 1989, 3rd edition, p.319), and Test method for measuring gene transcriptional activity that occurs when hormones bind to receptors in order to screen for endocrine disruptors (Non-patent Document 2: Yamasaki K, Takeyoshi M, Yakabe Y, Sawaki M, Imatanaka N, Takatsuki M .: Comparison of reporter gene assay and immature rat uterotrophic assay of twenty-three chemicals. Toxicology. 2002 Jan 15; 170 (1-2): 21-30.). However, although these methods are effective for detecting a chemical substance having a specific toxicity, it is not possible to detect a chemical substance having toxicity other than the toxicity index.
[0003]
[Patent Document 1]
          JP 2001-238694 A
[Non-Patent Document 1]
          “Bioassay of bioactive substances”, Kodansha, 1989, 3rd edition, p.319
[Non-Patent Document 2]
          Yamasaki K, et al., Toxicology. 2002 Jan 15; 170 (1-2): 21-30.
[Non-Patent Document 3]
          Mao X, et al., Curr Microbiol 2002 Jul; 45 (1): 37-40
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
  The present invention is a new method for obtaining detailed information on chemical substances in the environment, that is, for determining the nature of toxicity by chemical substances in the environment and which chemical substances in the environment are caused by the toxicity. Provide a simple way.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
  The present inventor used the reporter gene assay described in Staib P, Moran GP, et al. J Bacteriol 2001 May; 183 (9): 2859-65 etc. The present inventors have found that the response of microorganisms to chemical substances varies by changing the composition of the culture medium used for the growth of microorganisms.
[0006]
  That is, the present invention provides, as one embodiment, an amino acid composition and / or a sugar composition in a culture medium for growing a microorganism.Due to the differenceMicrobesFor chemical substancesResponseDifferencesIs used as an indicator,ChemistrySubstancedetectionProvide a way to do that.
  Of the present inventionChemistrymaterialdetectionIn the method, a database that is collated against the microbial response indexed for the test sample is important. The present invention, as another aspect, provides such a database and method of use thereof.
  In Mao X, Hu Y, Liang C, Lu C. Curr Microbiol 2002 Jul; 45 (1): 37-40 (Non-patent Document 3), the concentration of methionine in the medium is related to the expression of the MET3 (YJR010w) gene. It is described that the effect was confirmed by a reporter gene assay (βgal expression) of the MET3 promoter. The MET3 gene is known to encode an enzyme that synthesizes methionine from extracellular sulfate (MIPS http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/ posted on index.html). Therefore, Non-Patent Document 3 merely confirms the influence of methionine produced from the enzyme encoded by the MET3 gene on the expression of the MET3 gene itself, and the gene expression variation here directly affects biosynthesis or degradation. This is due to the enzyme product involved.
  On the other hand, the present invention is based on the discovery that the expression state of a gene for a chemical substance varies depending on the culture environment such as the presence or absence of amino acids and sugars.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  As described above, the present inventionChemistrymaterialdetectionTo perform the method, a database is typically used that is matched against the microbial response indexed for the test sample.
I. The database
  To create the database of the present invention,
(1) Each culture medium having various amino acid compositions and various sugar compositionsspecificToxic substances are preferably supplemented with one or more amino acids and one or more sugars in a medium having the minimum amino acids necessary for growth and the resulting medium isspecificPrepare multiple culture media by adding toxic substances
(2)IndividualThe microorganism is cultured for a certain period in the obtained culture medium,
(3) Responses of microorganisms in individual culture mediaDifferencesIndex each, and
(4) Summarize the obtained indices as data.
  The database created in this way can be summarized as the formation of tables shown in the following examples, or in the form of electronic information. If an electronic information database is input to a computer or the like, it can be easily used for collation with data obtained from a test sample. In this aspect, the present invention also provides an apparatus in which the database of the present invention is input.
[0008]
  “Amino acid composition and sugar composition in culture medium” used for database creation is the composition of a general nutrient-rich medium with a fast growth rate when naturally occurring wild strains and permanent recombinants are used as microorganisms. . On the other hand, when a transient recombinant using a vector or plasmid is used as a microorganism, a minimal nutrient medium is usually used as a selective pressure for retaining the plasmid (Gupta JC, Mukherjee KJ .: Biotechnol Bioeng 2002 Jun 5; 78 (5): 475-88).
[0009]
  The following can be mentioned as a culture medium used for this invention:
1. YPD medium: Composition (in 1L) Yeast extract 10g 1% (w / v), Polypeptone 20g 2% (w / v), Glucose 20g 2% (w / v)
  This is a rich medium and is used for normal culture. Amino acids are also abundant.
2. SD medium: Composition (in 1L): yeast nitrogen base without amino acids (Difco.0919-15-3) 6.7g 0.67% (w / v), glucose 20g 2% (w / v)
  This is a synthetic selective medium and does not contain amino acids. It is used when checking the auxotrophy of a strain or selecting a transformant. In the case of an auxotrophic strain, one or more amino acids are added as necessary. Sometimes called minimal nutrient medium.
  In the present invention, amino acids having the types and concentrations shown in Table 1 are contained in the SD medium.acidOr other types of sugars such as galactose and raffinose are added in place of glucose in the SD medium, and amino acids having the types and concentrations shown in Table 1 are added.acidAdd.
[Table 1]

  OutClassic: Yeast Lab Manual Yeast Molecular Cell Biology Experiment Springer Fairlark Tokyo Co., Ltd. 1998 pp.5-6
[0010]
  In the present invention, when using a microorganism obtained by inserting the LEU2 gene into the yeast Saccharomyces cerevisiae W303 strain (American Type Culture Collection ATCC 2001239) and further transforming with a plasmid having the URA3 gene, adenine, histidine and tryptophan are added to the SD medium. It is preferable to add various amino acids to this medium.
  The specific example of the culture medium used for this invention in this aspect is shown below.
a) Example of adding an amino acid to a synthetic selective medium
-SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan)
-SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, uracil)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-arginine)
SD medium + glucose + amino acid (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-aspartic acid)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-glutamic acid)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-leucine)
SD medium + glucose + amino acid (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-lysine)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-methionine)
-SD medium + glucose + amino acid (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-phenylalanine)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-serine)
SD medium + glucose + amino acid (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-threonine)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-tryptophan)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-tyrosine)
SD medium + glucose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan, L-valine)
b) The sugar composition of SD medium with galactose or raffinose added instead of glucose
SD medium + galactose + amino acids (adenine, L-histidine, L-tryptophan)
SD medium + raffinose + amino acid (adenine, L-histidine, L-tryptophan)
[0011]
c) eutrophic medium
・ YPD medium
[0012]
  In preparing the database, preferably about 5 to 10 are selected from the media having the above composition.
[0013]
  “Toxic substances” added to the culture medium used to create the database are industrial substances such as agricultural chemicals, pharmaceuticals, dyes, paints, adhesives, etc. and are not likely to be released to the environment due to the process of disinfection and incineration. It is a chemical substance that is intentionally produced and is of concern for its toxicity. Known toxic effects of these substances include endocrine disruptor action, mutagenicity, carcinogenicity, genotoxicity, ecotoxicity, immunotoxicity, and cell dysfunction toxicity.
[0014]
  Specific “toxic substances” include those shown in Table 2.
[Table 2]

[Table 3]

[0015]
  Other specific examples include those shown in Table 3 below.
[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

[Table 7]

[Table 8]

[Table 9]

[Table 10]

[Table 11]

[Table 12]

[Table 13]

[0016]
  When creating the database, it is better to select more toxic substances when adding them, but preferably about 20 to 30 toxic substances are selected from the above toxic substances.
  The concentration of the toxic substance to be used is a concentration that inhibits the growth of the microorganism to be used but does not lead to death. Usually, the IC50 value of each toxic substance is used. The results of experiments using organisms vary. Therefore, when obtaining the IC50 value, three or more experiments are performed and the average value is calculated. Therefore, in order to eliminate experimental errors derived from organisms,LivingA method of determining a concentration condition that affects the growth can be considered.
  When the microorganism is yeast, the concentration of the toxic substance can also be determined as follows. A dilution series of toxic substances is prepared, loaded onto cells in the initial logarithmic growth phase (OD660 = 0.2 to 0.5), and further cultured at 25 ° C. for 4 hours. At this time, cells not loaded with a toxic substance are also cultured in the same manner as a control group. Two hours later, a portion of the culture solution of the control group with each concentration of the toxic substance added was inoculated on a YPD agar medium, and CFU was measured 2 days later (the CFU of the toxic substance-loaded sample was CFU-chem, And control samplesCFUCalled CFU-cont). The rest of the sample is used for measurement for database creation, and only the optimal conditions determined after the fact are used as data.
  Immediately before addition of the toxic substance, a part of the culture solution is taken and seeded on a YPD agar medium. Similarly, after 2 hours, a portion of the culture solution of each concentration added with chemical substances and the control group is taken and inoculated on a YPD agar medium, and CFU is measured 2 days later (the CFU of the sample immediately before the chemical substance loading is measured). CFU-before, CFU of toxic substance loading sample, CFU-chem, and control sampleCFUCalled CFU-cont). Since the doubling time of yeast is about 2 hours, CFU-cont is usually about twice as long as CFU-before. When loading with toxic substances at different concentrations, select CFU that affects cell growth, that is, a concentration of 50% or more of CFU-cont, preferably close to 75.5% as the concentration of toxic substances (cells CFU is 0% at the concentration that kills CFU, and at a concentration that does not affect growth, CFU is equal to 100% in the control group).
[0017]
  The preparation of “culture medium” used for database creation is well known to those skilled in the art. For example, a solution having a composition selected as described above is sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Amino acids are prepared individually by preparing a high-concentration aqueous solution and sterilized, and if necessary, added so that the final concentration is as shown in Table 1 above. Toxic substances are dissolved in water or dimethyl sulfoxide, and the final concentration is measured by making a dilution series as described above, or added to the medium so that the IC50 concentration measured in advance is obtained.
[0018]
  “Cultivation of microorganisms” used for database creation is usually performed at 25 ° C. for 4 hours.
[0019]
  “Microorganisms” used for database creation include naturally occurring wild-type or wild-type strains, such as animal cells derived from humans, mice and other mammals, and established strains of animal cells, fish and lines used in bioassays so far. Any of insect cells, insect cells, fungal cells such as yeast, and bacterial cells such as Escherichia coli may be used. Here, the wild strain is a naturally occurring microorganism that has not undergone recombination. Wild-type strains are microorganisms that have not touched the gene of interest. For example, W303 has been recombined for auxotrophy, but no further recombination has been performed. Established strains include those that can be subcultured with animal cells, such as those that have not undergone recombination, such as cancer cells.
  When a naturally occurring cell or an established cell line is used without transformation, the “response exhibited by a microorganism” used for database creation is the mRNA level of a gene that fluctuates in the presence of a toxic substance. The mRNA level was determined by Northern blot method (Nobuhiko Ogata, Hiroshi Nojima: Second edition of Genetic Engineering Keyword Book, Yodosha, 2000, pp299-301), reverse transcription PCR method (RT-PCR) (Yakusaku Nakabetsu, etc .: Cell engineering separate volume Tips series Revised PCR Tips, Shujunsha, 1999, pp25-43).
  Here, “genes that fluctuate in the presence of toxic substances” are disclosed in public databases (for example, MIPS: Munich Information Center for Protein Sequence, SGD: Saccharomyces Genome Database, USA) in the case of yeast cells. The yeast genes are appropriately selected from the existing yeast genes, and these can be known through the Internet. Preferred genes are mitochondrial protein, gene repair system protein, energy system protein, transport promoting protein, stress protein, metabolic system protein, detoxification protein and gene of unknown function. For example, YKL071W, YCR102C, YOR382W, YLL057C, YLR303W, etc.
[0020]
  The “microorganism” used for database creation can also be a recombinant of the above-mentioned naturally occurring cell, ie, a transformant. A transformant used in the present invention includes a polynucleotide construct obtained by operably linking a polynucleotide encoding a marker protein to a polynucleotide sequence of a promoter of the above-mentioned “gene that varies in the presence of a toxic substance”. It can be prepared by introducing the vector into the naturally occurring cells. Methods for operably linking a protein-encoding polynucleotide to a promoter are well known (eg, RW Old, SB Primrose, Principles of Gene Manipulation, 5th Edition, Baifukan, pp138-165, pp.234-263, 2000). reference).
[0021]
  For example, when yeast is used in relation to the promoter sequence, the entire DNA sequence of yeast has been clarified. By using a public database (SCPD: The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae), the yeast gene sequence containing the promoter Can be obtained.
  Examples of marker proteins include GFP (Green Fluorescence Protein) (Heim, R., Cubitt, AB and Tsien, RY (1995) Nature 373, 663-664; Heim, R., Prasher DC. And Tsien, RY (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504; Warg, S. and Hazerigg, T. (1994) Nature 639, 400-403; Youvan, DC and Michel-Beyerle, ME (1996) Nature Biotechnology 14 1219 -1220; Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, WW and Prasher, DC (1994) Science 263, 802-805), β-galactosidase (Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez -Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211 (3): 154-6), Luciferase (Arch Toxicol 2002 Jun; 76 (5-6): 257-61, Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.), and acetyltransferase J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb; 21 (1): 71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors. Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M.).
[0022]
  For example, in the case of yeast cells, a vector is prepared by selecting a plasmid capable of replicating in yeast, inserting a polynucleotide encoding a marker protein into this, and then inserting a polynucleotide containing a promoter sequence into the upstream part of the marker gene. Can be done.
  A transformant can be prepared by a known technique. For example, a method for transforming yeast cells is described in Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp. 133-134, 1994.
  When a transformant is used, the “response exhibited by the microorganism” used for preparing the database of the present invention is the expression level of the marker protein. The expression level of the marker protein can be obtained by pulverizing the transformant to obtain a protein extract and measuring the amount of the marker protein in this solution. For example, when the marker protein is GFP, the fluorescence amount of the protein extract is measured with a fluorescence spectrophotometer. In addition, the expression level of the marker protein can be detected directly using fluorescence microscope, laser microscope image processing, flow cytometry measurement, evanescent light measurement, colorimeter, etc. without disrupting the transformant. Cell fluorescence (GFP)AlsoIn some cases, color development (β-gal) can be measured.
[0023]
  Preferred transformants are yeast transformed with a vector comprising a polynucleotide operably linked to a yeast gene promoter to a polynucleotide encoding a marker protein, or a chromosomal ORF with a polynucleotide encoding a marker protein. Yeast that has been transformed to replace, more preferably, the yeast gene is a mitochondrial protein, gene repair system protein, energy system protein, transport promoting protein, stress protein, metabolic system protein, detoxification protein and It is selected from genes whose functions are unknown.
[0024]
  Responses indicated by microorganisms used for database creationDifferencesThe “indexation” will be described below using GFP as a marker protein as an example.
  After contact with the toxic substance, the expression level of the marker protein is measured as described above. Yeast cells are washed with physiological saline, then fixed with physiological saline containing 5% formalin, and fluorescence of 10,000 yeast cells per experiment using flow cytometry (eg, EPICS XL: Beckman Coulter). To obtain an average value of the fluorescence intensity of these cells. A ratio with the average value of the fluorescence intensity of the control group is determined. For example, if the ratio is 1.5 or less, “−”, 1.5-2.0 is “+”, and 2 or more is “++”. ”And so on.
[0025]
  As described above, the obtained data can be collected as a table or a computerized form and used as a database.
[0026]
  The present invention is a method for using the database of the present invention prepared as described above, wherein the amino acid composition and / or sugar composition in the culture medium in which the microorganism is grown.Due to the differenceMicrobesFor chemical substancesResponseDifferencesIs used as an indicatorChemistrySubstancedetectionThere is also provided a method for using the database to match against indexed responses.
[0027]
2)ChemistryMaterialdetectionMethod
  The present invention further provides amino acid composition and / or sugar composition in a culture medium for growing microorganisms.Due to the differenceMicrobesFor chemical substancesResponseDifferencesIs used as an indicator,ChemistrySubstancedetectionOn how to do. Specifically, the chemical substances in the test sampledetectionA method of using a microorganism for
(1) culturing a microorganism in the presence of the test sample in a plurality of culture media having the same composition as the amino acid composition and sugar composition in the culture medium used to create the database of the present invention;
(2) Responses of microorganisms in individual culture mediaDifferencesAre indexed,
(3) Indexed responseDifferencesAgainst the index of the database,
As a result, the chemical substances in the test sample showing the same index as the index in the database are displayed.detectionOn how to do.
[0028]
  The present invention also provides chemical substances in a test sample.detectionA method of using a microorganism for
(1) Each culture medium having various amino acid compositions and various sugar compositionsspecificAdd toxic substancesThePrepare multiple culture media,
(2)IndividualIn the obtained culture medium, the microorganisms are cultured for a certain period in the presence of the test sample,
(3) Responses of microorganisms in individual culture mediaDifferencesAre indexed,
(4) Indexed responseDifferencesThe chemical substance in the test sampledetectionTo a method characterized by
[0029]
  Of the present inventionChemistryMaterialdetectionIn the method, “amino acid composition and preparation of culture medium”, “toxic substance”, “microorganism and its culture”, “response exhibited by microorganism”Differences“And indexing” are the same as the description of the database creation of the present invention.
[0030]
  As described above, the present invention provides a composition of a culture medium used for the growth of microorganisms.Due to the differenceBased on the discovery that the response of microorganisms to chemicals is different. Of the present inventionChemistrymaterialdetectionThe method can be detected by changing the composition of the culture mediumChemistryIt is possible to increase the types of substances.
[0031]
【Example】
  EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples.
[0032]
Reference example 1
Reporter gene assay
  Yeast geneYBR072WA primer for amplifying a polynucleotide containing the promoter sequence (disclosed in SCPD: The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae) by PCR was prepared. Primer is Oligo4.0-S, Sequencher, software for primer design_IDesigned using the Macintosh version, the base sequence of the upper primer is
          GCAGTCAACGAGGAGCGAATCA (SEQ ID NO:1)
The base sequence of the lower primer is
          GGGGTACCCCGTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG (SEQ ID NO:2)
It was. For PCR, a yeast chromosome (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, Inc.) was used as a template, and a commercially available kit (KOD DNA Polymerase; code KOD-101, Toyobo) was used as a reagent.
  The vector used is pEYES2 (pYES2, Catno: V825-20, Invitrogen Corporation, USA), a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast (RW Old, SB Primrose) , Baifukan, pp.234-263, 2000)). The polynucleotide encoding the marker protein GFP is the GFP portion of the vector pQBI 63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (SEQ ID NO:3) Was used. First, a vector in which a GFP polynucleotide was inserted into a multiple cloning site of pYES2 was prepared. Subsequently, the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with a polynucleotide containing the promoter sequence of YBR072W, which is a yeast gene, to obtain the intended plasmid vector. The operation of inserting a polynucleotide containing GFP and a promoter sequence was performed by selecting an appropriate restriction enzyme.
[0033]
  Next, yeast Saccharomyces cerevisiae W303 (American Type Culture Collection ATCC 2001239) was transformed with this plasmid vector. The transformation procedure is shown below.
1) The yeast cell Saccharomyces cerevisiae W303 is cultured with shaking in 200 ml of YPD medium until OD660 becomes 0.5.
2) Collect and resuspend in 5 ml TE-buffer.
3) Add 250 μL of 2.5M lithium acetate.
4) Dispense 300 μl each, add 10 μl of the above plasmid vector, and incubate at 30 ° C. for 30 minutes.
5) Add 700 μl of 50% PEG4000 and incubate with shaking at 30 ° C. for 60 minutes.
6) After heat shock (42 ° C., 5 minutes), cool rapidly.
7) Wash twice with 1M sorbitol.
8) Seed on an agar plate made with minimal nutrient medium (SD medium plus necessary amino acids (adenine, histidine, tryptophan)).
[0034]
  The transformation was confirmed with a selective medium (SD medium (Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan). Colonies grown on the agar plate of the selective medium were further The auxotrophy of amino acids was confirmed.
  The obtained transformant was confirmed to stably hold the plasmid for up to 48 hours on a YPD medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 2%).
[0035]
Example 1
Chemical substance loading experiment
  The transformant prepared in Reference Example 1 is brought into contact with each compound at the concentration shown in Table 4 below under the following culture conditions.
[Table 14]
                        Table 4
Effect of chemical substances on the growth ability of yeast W303 (IC50)
Chemical substance concentration
(1) 2-Aminoanthracene 33.3 mM
(2) Benzo (a) pyrene 0.2 mM
(3) Bisphenol A 0.4 mM
(4) Di (2-ethylhexyl) phthalate 83.3 mM
(5) 2,4-dichlorophenol 0.3 mM
(6) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 0.3 mM
(7) Formaldehyde 0.2 mM
(8) Methylmercury chloride 0.2 μM
(9) 4-Nitroquinoline-N-oxide 0.6 μM
(10) p-nonylphenol 10 μM
(11) Pentachlorophenol 50 μM
(12) Sodium arsenite 0.3 mM
(13) Thiuram 20 μM
(14) Tributyltin chloride 0.4 μM
(15) 2,4,5-trichlorophenol 30 mM
(16) Trp-P-2 (acetate) 0.2 mM
(17) Paraquat 16.7 mM
(18) Cadmium chloride 40 μM
(19) Lindane 6.7 mM
(20) Malathion 22.2 mM
(21) Maneb 0.8 mM
(22) Nickel (II) chloride 3.3 mM
(23) Potassium dichromate (VI) 0.3 mM
(24) Triphenyltin chloride (IV) 10 μM
(25) Phenol 5.6 mM
(26) Thiobencarb 0.7 mM
(27) Hexachlorophene 30 μM
(28) Triclosan 730 μM
(29) Mercury chloride (II) 50 μM
(30) Copper (II) sulfate 3.3 mM
(31) Potassium cyanide 16.7 mM
(32) Dimethyl sulfoxide 3.7%
  IC50 was measured in YPD medium and SD medium, and it was confirmed that they were almost equal.
[0036]
Culture conditions
  Composition of culture medium
  1. SD medium (Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan);
  2. SD medium + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, uracil)
  3. SD medium + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, leucine)
  4). SD medium + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, methionine)
  5. YPD medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 2%); and
  6). SD medium + galactose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan);
[0037]
  The transformant cryopreserved in 10 ml of SD medium supplemented with the necessary amino acids is scraped with a platinum loop and cultured with shaking at 25 ° C. to give full growth (in a state where the cells grow to a steady state and the number of cells does not increase any more). Add 50 ul of cell suspension fully grown to 10 ml of each medium, culture with shaking at 25 ° C., and load the chemical when OD660 is 0.2 to 0.5. Cells are washed once with physiological saline, then fixed with physiological saline containing 5% formalin, and fluorescence of 10,000 yeast cells is measured per experiment using flow cytometry (EPICS XL: Beckman Coulter). Measurement was performed to obtain an average value of the fluorescence intensity of these cells, and a ratio with the average value of the fluorescence intensity of the control group was obtained and indexed.
  The results obtained are shown in Table 5. In the table, with respect to the control group, the fluorescence intensity was expressed as −, 1.5 times or less and less than 2.0 times as +, and 2.0 times or more as +.
[0038]
[Table 15]

[Table 16]

[0039]
  From the above, it was proved that even when the same transformant was used, the growth state of the transformant for each chemical substance varied depending on the composition of the culture medium to be cultured. The present invention provides the data in Table 5 created as described in the examples as one aspect of the database.
[0040]
Example 2
Detection of chemical substances in test samples
  As in Example 1, the test sample is added to a culture medium having each composition, the transformant is cultured, and the growth state is indexed according to the above criteria to obtain an index pattern. Thereby, the chemical substance which shows the same pattern can be specified, and the chemical substance which can exist in a test sample is estimated.
  Multiple test samplesChemistryWhen a substance is included, the response of the microorganism may be additive or synergistic depending on the combination of toxic types. In practice, however, multipleChemistrySince the condition of substance is very rare, it is considered that the most toxic chemical substance is detected.
  If the concentration of the chemical substance present in the test sample is low, the gene expression does not change from the control group, and if it is high, the cell is killed and the gene is not expressed. Therefore, the concentration around IC50 is a suitable concentration for the present invention.
[0041]
Method for determining a suitable concentration for a test sample
1. How to determine the concentration in advance
  When the test sample has a low concentration, the sample is concentrated to form a dilution series, and when the test sample has a high concentration, a dilution series is prepared and the experiment is performed.
  Make a dilution series sample and load full growth cells into a solution diluted 200-fold with minimal nutrient medium. Measure OD660 every 2 hours for up to 48 hours. At this time, the cellLivingAt a concentration that affects growth but does not dieLivingThe concentration that inhibits growth by about 50% is selected as IC50.
[0042]
2.ChemistrymaterialdetectionHow to determine concentration at the same time
  Moreover, a suitable density | concentration can be selected by measuring CFU as follows.
  Immediately before adding chemical substances, take a part of the culture solution and inoculate on YPD agar medium. Similarly, after 2 hours, a portion of the culture solution of each concentration added with the chemical substance and the control group is inoculated on a YPD agar medium, and CFU is measured after 2 days (the CFU of the sample immediately before the chemical substance loading is measured). CFU-before, CFU of chemical loading sample, CFU-chem, and control sampleCFUCalled CFU-cont). Since yeast doubling time is about 2 hours, CFU-cont is usually about twice as long as CFU-before. When loading with different concentrations of chemical substances, select a CFU that affects cell growth, that is, a concentration of 50% to 95% of CFU-cont, preferably close to 75.5%. (CFU is 0% at the concentration at which cells die, and CFU is equal to 100% at the concentration that does not affect growth). Cells to which chemical substances of various concentrations have been added are washed once with raw saline 4 hours after the addition of chemical substances, then fixed with physiological saline containing 5% formalin and stored refrigerated. Collect data after selecting concentration. Instead of measuring CFU, a method of counting live cells using a staining method that stains only live cells is also conceivable.
[0043]
[Sequence Listing]
                               SEQUENCE LISTING
<110> DAIKIN INDUSTRIES, LTD.
<120> Method for DetectingChemical Substance with Microorganism
<130> 187131
<160>Three
<210>1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>1
gcagtcaacg aggagcgaat ca 22
<210>2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>2
ggggtacccc gttaatttgt ttagtttgtt tg 32
<210>Three
<211> 720
<212> DNA
<213> Aequorea victoria
<400>Three
atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60
ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120
ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180
ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300
ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360
gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggcaacat tctgggacac 420
aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480
ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600
tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660
cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720

Claims (1)

A method for detecting 2,4-dichlorophenol, thiuram, triphenyltin chloride (IV), thiobencarb, copper (II) sulfate or dimethyl sulfoxide in a test sample,
(1)
(I) SD medium, glucose and amino acids (adenine, histidine and tryptophan)
(Ii) SD medium, glucose and amino acids (adenine, histidine, tryptophan and uracil)
(Iii) SD medium, glucose and amino acids (adenine, histidine, tryptophan and methionine)
(Iv) YPD medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 2%) and (v) SD medium, galactose and amino acids (adenine, histidine and tryptophan)
To each, add a test sample containing the chemical substance to be detected,
(2) Yeast transformed with a vector comprising a polynucleotide operably linked to the YBR072W promoter to a polynucleotide encoding a marker protein is seeded in each culture medium of (1) and cultured for a certain period of time;
(3) The difference in the expression level of the marker protein that the yeast shows with respect to the chemical substance in the test sample is indexed by the difference in the composition of each culture medium, and (4) the indexed marker A method comprising detecting a chemical substance in the test sample based on a difference in protein expression level .