JP4514163B2 - フコースα１→６特異的レクチン - Google Patents

Description

本発明は、新規なフコースα１→６特異的レクチン、その製造方法及びその用途に関し、特に担子菌又は子嚢菌由来の新規な前記レクチン、その製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖の検出及び分別方法に関する。

Ｎ結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースα１→６を転移させるフコースα１→６転移酵素（α１→６ＦｕｃＴ）の遺伝子は、肝細胞の癌化にともなって発現することが知られている。この癌化した肝細胞は、現在、フコースに親和性をもつレンズマメレクチン（ＬＣＡ）を用いたレクチン親和電気泳動によって検出されている。

抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下、ＡＤＣＣ活性という）は、ヒトが持っている免疫機能のひとつであり、ナチュラルキラー細胞、単球等の白血球が抗体を介して癌細胞等の標的細胞を殺傷する活性である。ＡＤＣＣ活性は、ヒト化抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（転移性乳癌の治療薬）、キメラ抗体であるＲｉｔｕｘａｎ（非ホジキンリンパ腫の治療薬）等の抗体医薬の抗腫瘍メカニズムと関連している（非特許文献１）。これらの抗体医薬のＡＤＣＣ活性が低いと、抗体医薬の多量投与の必要が生じ、それに起因して、コストアップ、副作用、例えば免疫低下による感染症等の問題を招く。

上記ＡＤＣＣ活性は、フコースα１→６の転移した抗体と転移していない抗体とで５０〜１００倍の差があるといわれている（非特許文献２）。フコースα１→６の転移していない抗体を取得できれば、ＡＤＣＣ活性の高い抗体医薬を提供することが可能となる。

従来、フコースα１→６と親和性を有するレクチンとして、上記ＬＣＡの他にも、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）等が知られている（特許文献１〜５）。
Ｃｌｙｎｅｓ ＲＡ等、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ． ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＤ ２０００ ＡＰＲ；６（４）：４４３−４４６ Ｔｏｙｏｈｉｄｅ Ｓｈｉｎｋａｗａ等、Ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｒ ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ｊａｎ ３１； ２７８（５）：３４６６−７３． Ｅｐｕｂ ２００２ Ｎｏｖ ８． ＷＯ２００２／０３０９５４ ＷＯ２００３／０８４５６９ 特開平０２−０８３３３７の実施例 特開２００２−１１２７８６の実施例５ 特開２００７−１６１６３３

フコースα１→６糖鎖の検出に利用されている公知のレクチンは、フコースα１→６糖鎖の他にも、α１→６結合以外のフコースを持つ糖脂質系糖鎖や、フコースを持たないハイマンノース糖鎖にも親和性を示す。具体的には、ＡＡＬやＡＯＬは、フコースα１→２、フコースα１→３等にも親和性を有する。ＬＣＡ、ＰＳＡ及びＶＦＡは、フコースα１→６をもたないＮ結合型一本及び／又は二本鎖糖鎖にも親和性を有する。フコースα１→６糖鎖とのみ特異的に結合するレクチンは知られておらず、したがって、フコースα１→６糖鎖の正確な検出やフコースα１→６糖鎖の検出を基準とするフコースα１→６糖鎖の精製や非フコースα１→６糖鎖の精製も実現できていないのが現状である。

そこで、本発明の目的は、フコースα１→６糖鎖に特異的に結合する新規レクチンを提供し、それを用いてフコースα１→６糖鎖を従来よりも正確に検出する方法、及びフコースα１→６糖鎖の検出を基準としたフコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖との分別方法を提供することにある。

本発明者等は、フコースα１→６を有する糖鎖との親和性が極めて高い新規なレクチンを発見した。それを用いればフコースα１→６糖鎖を特異的に検出し、また、このレクチンをフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖の精製に活かせることを見出し、本発明に到達した。ここで、フコースα１→６糖鎖とは、Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１→６結合でフコースが結合した構造を意味する。また、非フコースα１→６糖鎖とは、α１→６結合フコースを分子中に持たない糖鎖を意味する。

すなわち、本発明は、フコースα１→６特異的レクチンであって、（１）担子菌又は子嚢菌から抽出され、（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする、前記フコースα１→６特異的レクチンを提供する。前記結合定数とは、本明細書において、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）を用い、分析温度２５℃において測定される数値である。

前記フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有するものであってもよい。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とすることが好ましい。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（５）フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とすることが好ましい。

前記担子菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する。

前記担子菌は、例えばツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、特に（６）配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。

本発明は、また、（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンを提供する。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを意味する。

前記（ｂ）に示すタンパク質又はペプチドは、例えば配列番号６に示すアミノ酸配列を有する。

本発明は、また、配列番号２〜６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２〜６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンを提供する。

本発明は、また、担子菌及び／又は子嚢菌の水系媒体抽出物を、（i）疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー、（ii）アフィニティクロマトグラフィー、又は、（iii）イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーにかけて、（vi）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００、及び、（v）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得ることからなるフコースα１→６特異的レクチンの製造方法を提供する。

前記担子菌又は、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科及びタコウキン科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。

前記担子菌は、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ及びベニテングタケから選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。

前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法に用いる担子菌及び／又は子嚢菌は、子実体を用いることが好ましい。

本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の検出方法を提供する。

前記糖鎖は、例えば腫瘍マーカーである。

本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の分別方法を提供する。すなわち、フコースα１→６特異的レクチンをフコースα１→６糖鎖の結合媒体として用いて、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖とを分別する方法を提供する。

前記分別方法に作用させる糖鎖は、例えば抗体に結合したものである。

本発明は、また、上記フコースα１→６特異的レクチンを有効成分とする、フコースα１→６糖鎖を検出するための診断薬、及び該診断薬を含む診断薬キットを提供する。

本発明の新規なレクチンは、フコースα１→６を有する糖鎖、糖ペプチドや糖タンパク質に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上という、従来よりも極めて高い親和性を有し、すなわち、フコースα１→６糖鎖構造を有する糖鎖のみを特異的に認識することができる。この特異性を利用して、前記フコースα１→６特異的レクチンは以下のような多種の用途へ利用可能である。

本発明のフコースα１→６糖鎖の検出方法は、フコースα１→６糖鎖との親和性を有する従来のレクチンと違って、α１→６フコースの結合した糖鎖をより選択的に検出することができる。

本発明のフコースα１→６糖鎖の分別方法は、α１→６フコースの正確な識別を基準として、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖とのより厳密な分別を可能にする。これにより、フコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖を高純度に精製することができる。特に、本発明の分別方法を用いて、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖との混合物からなる抗体医薬からフコースα１→６糖鎖を取り除くことで、抗体医薬のＡＤＣＣ活性を高める。その結果、抗体医薬をより少ない用量で処方可能とし、コストダウン、副作用の低減等の効果を発揮する。また、症状や副作用に応じた抗体医薬の処方も可能になる。

本発明の実施例及び比較例に使用するα１→６フコースオリゴ糖及び非α１→６フコースオリゴ糖の構造図である。 本発明の実施例及び比較例に使用するフコースα１→６オリゴ糖及び非フコースα１→６オリゴ糖の構造図である。 実施例１のＰＴＬの精製工程を示す図である。 実施例１のＰＴＬのイオン交換クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例１のＰＴＬのアフィニティクロマトグラフィーの溶出図である。 実施例１のＰＴＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例２のＳＲＬの精製工程を示す図である。 実施例２のＳＲＬの疎水クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例２のＳＲＬの逆相クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例２のＳＲＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例１のＰＴＬのＭＳスペクトルの結果である。 実施例２のＳＲＬのＭＳスペクトルの結果である。 実施例１のＰＴＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 実施例２のＳＲＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 比較例１のＡＡＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 比較例２のＡＯＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 比較例３のＬＣＡを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 コントロールとしてＣＢＢでタンパク質のみを染色した結果（図面代用写真）である。 実施例１のＰＴＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 実施例２のＳＲＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 比較例１のＡＡＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 比較例２のＡＯＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 比較例３のＬＣＡを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 実施例１のＰＴＬを用いたＥＬＩＳＡによるα−フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 実施例２のＳＲＬを用いたＥＬＩＳＡによるα−フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 比較例１のＡＡＬを用いたＥＬＩＳＡによるα−フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 比較例２のＡＯＬを用いたＥＬＩＳＡによるα−フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 比較例３のＬＣＡを用いたＥＬＩＳＡによるα−フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 実施例３のＮＳＬの精製工程を示す図である。 実施例３のＮＳＬの疎水クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例３のＮＳＬの逆相クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例３のＮＳＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例４のＬＳＬの精製工程を示す図である。 実施例４のＬＳＬの疎水クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例４のＬＳＬの逆相クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例４のＬＳＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例３のＮＳＬのＭＳスペクトルの結果である。 実施例４のＬＳＬのＭＳスペクトルの結果である。

前記フコースα１→６特異的レクチンが結合するフコースα１→６糖鎖の例を、以下に示す。

〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースを意味する〕

フコースがα１→６結合する糖鎖は、上記以外にも、Ｎ結合型糖鎖であれば、遊離のオリゴ糖鎖、CyDye、4-アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）、アミノピリジン等で蛍光標識された糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、細胞等のすべてを含有する。Ｎ結合型糖鎖は、高マンノース型、複合型、混成型等を含む。さらに、酸、ヒドラジン等で化学的に前記糖鎖を部分的に分解したもの、シアリダーゼ、ガラクシトターゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼのいずれかの酵素で、同時にあるいは段階的に使用して、前記糖鎖を部分的に分解したものであってもよい。また、グルコースのような糖、アセチル基、硫酸基、リン酸基のような官能基等を前記糖鎖に付加したものであってもよい。

前記フコースα１→６特異的レクチンの由来となる（１）担子菌又は子嚢菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科に属する。モエギタケ科としては、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。これらの担子菌又は子嚢菌のうち、レクチンのフコースα１→６糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が特に好ましく、さらに好ましくはツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、好ましくは４，０００〜２０，０００である。ここで、ＳＤＳ電気泳動法による分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、（３）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０^４Ｍ^−１以上であり、好ましくは１．０×１０^５Ｍ^−１以上、さらに好ましくは１．０×１０^６Ｍ^−１以上である。すなわち、フコースα１→６に親和性を有することが従来知られているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡと比べて、結合定数が著しく高い。これは、前記フコースα１→６特異的レクチンが、従来のレクチンと比べて極めて高い選択性をもってフコースα１→６糖鎖と結合することを意味する。

フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有していてもよい。従来のフコースα１→６特異的レクチン（例えばＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡ）は、非還元末端にシアル酸を有するフコースα１→６糖鎖に対して親和性が低かった。一方、前記フコースα１→６特異的レクチンは、このような糖鎖に対しても高い親和性を有する点でも従来のものより優れる。

フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）による結合定数の求め方を、以下に説明する。この方法は、レクチンを固定化したカラムに、蛍光標識した糖鎖（例えば図１及び２に示すもの）の一定濃度の希釈液を流した際、レクチンと糖鎖とが相互作用がなければ糖鎖は短時間でカラムから流れ出、溶出前端（フロント）が即座に観察され、一方、レクチンとの親和性がある場合、糖鎖の溶出が遅れるという原理に基づく。

該装置に使用するレクチンカラムの調製は、以下のようにして行われる。１．精製レクチンを０．１〜０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ ８．３〜８．５）に溶解する。 ２．レクチンの一級アミノ基を介してＮＨＳ活性化セファロース等の担体に固定化する。 ３．一級アミンを含むトリス緩衝液やエタノールアミン等でブロッキングする。 ４．０．８％ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．４、ＴＢＳ）中にレクチン−セファロースを懸濁させ、レクチン固定化樹脂を、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ ｘ １０ｍｍ， ３１．４μｌ）に充填する。 ５．レクチン固定化樹脂を充填したミニチュアカラムをホルダーで保護し、レクチンカラムをＦＡＣ自動分析装置（ＦＡＣ−１、（株）島津製作所製）に接続する。

平衡化したレクチンカラムに対し、分析用緩衝液（０．８％ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４））でレクチンが持つ解離定数（Ｋ_ｄ）よりも充分低い濃度（２．５ｎＭ）に希釈したピリジルアミノ化糖鎖（ＰＡ化糖鎖）を、流速０．１２５ｍｌ／ｍｉｎで３００μｌ注入する。カラムからのＰＡ化糖鎖の溶出を、蛍光検出器（励起波長／蛍光波長：３１０ｎｍ／３８０ｎｍ）を用いて検出する。

検出データから、レクチンと相互作用しない糖鎖（ＰＡ化ラムノース）の溶出前端（Ｖ_０）を基準とし、相互作用する糖鎖の溶出前端（Ｖ）の遅れ（Ｖ−Ｖ_０）を相互作用強度として算出する。さらに、ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ_０及びＢ_ｔから糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋ_ａ）を求める。上記相互作用強度（Ｖ−Ｖ_０）や結合定数が大きいほど、レクチンとフコースα１→６糖鎖との親和性が高い。

〔式中、Ａは溶出に用いる物質、Ａ_０は物質Ａの初濃度、Ｂは固定化リガンド、Ｖは溶出容量、Ｖ_０は固定化リガンドＢと全く相互作用しない物質の溶出前端容量、Ｂ_ｔは有効リガンド量、Ｋ_ｄは解離定数（結合定数の逆数）を意味する〕。

レクチンの糖結合特異性は、当該レクチンが特異的に凝集させることができる赤血球を用いて、その赤血球の凝集反応を阻止しうる糖類の種類とその濃度を調べることにより確認することもできる。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。これにより、前記フコースα１→６特異的レクチンは、より一層高い結合特異性を有する。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、結合定数が１．０×１０^３Ｍ^−１以下、好ましくは１．０×１０^２Ｍ^−１以下、特に好ましくは０であることを意味する。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに（５）フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することが好ましく、より好ましくは結合定数１．０×１０^５Ｍ^−１以上で示される親和性を有する。

本発明のレクチンと親和性を有するフコースα１→６Ｎ結合型の二本、三本及び／又は四本糖鎖の構造の例を、以下に示す。

本発明のフコースα１→６特異的レクチンは、特に配列番号１に示すような共通のアミノ酸構造を有する。配列番号１の第４、５、６及び７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ／Ｔｈｒ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓ／Ｇｌｕを意味し、その斜線は「又は」を意味する。

本発明のフコースα１→６特異的レクチンの具体例は、配列番号１〜６に示すタンパク質又はペプチドである。

配列番号２に示すレクチンは、ツチスギタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、ＰＴＬという）である。配列番号２の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第２０、２３、２７、３３、３５及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｔｙｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ／Ａｌａ、及び、Ｔｈｒ／Ｇｌｎである。

配列番号３に示すレクチンは、サケツバタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、ＳＲＬという）である。配列番号３の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第４、７、９、１３、２０、２７、２９、３３、３４及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｐｒｏ／Ｇｌｙ、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｖａｌ／Ａｓｐ、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、及び、Ａｒｇ／Ｔｈｒである。

配列番号４に示すレクチンは、コムラサキシメジから抽
出することのできる新規なレクチン（以下、「ＬＳＬ」という）である。配列番号４の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１、４、７、８、９、１３、１６、２０、２２、２５、２７、３１及び３４番目のＸａａは、それぞれ、Ａｌａ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｌｙｓ、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｍｅｔ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｔｙｒ／Ｔｈｒ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ、Ｇｌｎ／Ａｒｇ、及び、Ｔｈｒ／Ｖａｌである。

配列番号５に示すレクチンは、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号５の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１３、１４及び１６番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。

配列番号６に示すレクチンもまた、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号６は、配列番号５のペプチド中に１個のＡｓｎが挿入された変異体である。したがって、配列番号６の第１０及び１８番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１４、１５及び１７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。

配列番号２〜６に示すタンパク質又はペプチドが新規であることから、本発明は、（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンを提供する。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上であり、好ましくは１．０×１０^５Ｍ^−１以上、さらに好ましくは１．０×１０^６Ｍ^−１以上で示される親和性を有することを意味する。（ｂ）に示す変異体の例が、配列番号６に示すタンパク質又はペプチドである。

本発明は、また、（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を提供する。ここで、「機能的に同等」とは、前記と同じ意味である。

配列番号２〜６に示すタンパク質又はペプチド間の相同性は、少なくとも３７％である(表１４参照)。したがって、本発明は、配列番号２〜６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンもまた提供する。ここで「機能的に同等」とは、前記と同じ意味である。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、担子菌及び／又は子嚢菌から、公知の抽出方法、分離方法、精製方法等を適宜組み合わせることにより、単離することができる。例えば、水系媒体を抽出溶媒として用いて、担子菌及び／又は子嚢菌の水系媒体抽出物を得る工程を含む。この前記抽出物から、（vi）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００、好ましくは４，０００〜２０，０００、及び、（v）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０^４Ｍ^−１以上、好ましくは１．０×１０^５Ｍ^−１以上、さらに好ましくは１．０×１０^６Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得る。

前記担子菌は、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。特に、ツチスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｏｖｅｒｈｏｌｔｓ）、スギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、サケツバタケ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ Ｆａｒｌｏｗ ｉｎ Ｍｕｒｒ．）、クリタケ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ （Ｆｒ．） Ｋａｒｓｔ又はＨｙｐｈｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ（Ｆｒ．）Ｑｕｅｌ）等のモエギタケ科、コムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ ｓｏｒｄｉｄａ （Ｓｃｈｕｍ． ： Ｆｒ．） Ｓｉｎｇ．）等のキシメジ科、シロハカワラタケ（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）、ツヤウチワタケ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｐｅｓ）等のタコウキン科、ベニテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｍｕｓｃａｒｉａ）等のテングタケ科に属するものが好ましい。これらの担子菌及び／又は子嚢菌の使用部位は、子実体であることが好ましい。

水系媒体と担子菌等の子実体とから、水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体と担子菌等の子実体とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中で担子菌等の子実体を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また、粉砕する方法としては、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた通常の粉砕方法を挙げることができる。

上記水系媒体としては、緩衝液、水と混合し得る有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。好ましくは、緩衝液又は有機溶媒と緩衝液との混合物を用いる。

上記緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ ３〜１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ ６〜８の範囲に緩衝能を有するものがより好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも、抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。

前記緩衝液の塩濃度は、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１〜１００ｍＭであることが好ましく、５〜２０ｍＭであることがより好ましい。

前記緩衝液は、さらに塩類を含むことができる。例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等は、本発明における水系媒体として好ましい。

前記有機溶媒としては、水と混合し得る有機溶媒であれば特に制限なく用いることができる。中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルが好ましい。有機溶媒と水又は緩衝液とを混合する場合の有機溶媒の含有量としては、１０〜４０質量％であることが好ましい。

前記抽出工程は、水系媒体と担子菌等の子実体との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。

前記抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中で、担子菌等の子実体を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。

前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法では、以下のいずれかの精製手段を採用すると、一層効率的な精製が可能となる。

（精製方法１） 上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製する。

（精製方法２） 上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、チログロブリンをアガロース等に固定した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーに供して精製する。

（精製方法３） 上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、透析凍結乾燥を行った後、粗レクチン画分をトリス緩衝液に溶解後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離する。

本発明の製造方法は、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含んでもよい。これにより、レクチンを容易に単離することができる。透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。

（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンは、天然植物からの抽出のほかに、天然由来とは異なる宿主内で人工的に発現させ、又は化学合成させてもよい。そのような物質もまた、本発明の技術的範囲に属する。宿主内での発現や化学合成は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。

本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンを用いたフコースα１→６糖鎖の検出方法を提供する。前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖を従来よりも特異的に認識して結合できることから、フコースα１→６糖鎖を含有する多糖類、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖化合物の特異的検出に好適である。

前記検出方法に用いる前記フコースα１→６特異的レクチンには、標識手段が組み込まれていることが好ましい。このようなレクチンを以下、標識レクチンということがある。本発明の標識レクチンは、フコースα１→６特異的レクチンと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。

前記標識手段としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。

前記標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、好ましくは担子菌由来のレクチンであり、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ、及び、ＡＭＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ、及び、ＳＲＬである。ＰＴＬ及びＳＲＬは、実施例に示すように、従来のフコースα１→６親和性レクチンと相違して、フコースα１→６以外のフコースや、フコースを持たない高マンノース糖鎖と結合しない点で、本発明の検出方法に使用するフコースα１→６特異的レクチンとして最適である。

フコースα１→６糖鎖の検出は、例えば固定化された前記フコースα１→６特異的レクチンを用いるレクチンクロマトグラフィーによって行うことができる。レクチンクロマトグラフィーは、レクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。ＨＰＬＣと組み合わせる（ＨＰＬＡＣ）と、ハイスループットを期待することができる。

フコースα１→６特異的レクチンを固定化
する担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミド等のゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Ｂやセファロース６Ｂ（共にＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）が挙げられる。

レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。

固定化するフコースα１→６特異的レクチンの濃度は、通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ_３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。

フコースα１→６糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭであり、ｐＨが４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０であり、ＮａＣｌ含量が０〜０．５Ｍ、好ましくは０．１〜０．２Ｍであり、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、又は、ＭｎＣｌ_２含量が０〜１０ｍＭ、好ましくは０〜５ｍＭの緩衝液である。

アフィニティカラムの洗浄後、フコースα１→６糖鎖の溶出は、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０〜２００ｍＭ濃度である。

糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、凝集法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等の表面プラズモン共鳴法、電気泳動等も、当業者に周知の方法で使用することができる。

前記糖鎖を含む検体は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。

前記検出方法の対象であるフコースα１→６糖鎖の具体例は、α１→６フコース転移酵素により合成される糖鎖である。該フコースα１→６糖鎖には、αフェトプロテイン、α５β１インテグリン、ＴＧＦβ受容体、ＥＧＦ受容体等が挙げられる。検出方法に作用させる糖鎖は、腫瘍マーカーが好ましい。

フコースα１→６の転移したαフェトプロテインの確度の高い検出は、臨床的に肝硬変に合併する肝細胞癌の早期診断、肝細胞癌の緻密な経過観察、治療効果の正確な判定、胎児性腫瘍の早期発見、劇症肝炎の肝再生の指標等として有用である。フコースα１→６の転移したα５β１インテグリンもまた、肝癌診断の指標として期待される。

本発明の検出方法の対象は、肝細胞癌以外に、前立腺癌、乳癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、軟部肉腫、骨肉腫、メラノーマ、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、急性リンパ腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等の腫瘍；アレルギー疾患；自己免疫疾患；並びに肺気腫等の循環器疾患の診断に使用することが期待される。

前記フコースα１→６特異的レクチンは、物理化学的性質、糖鎖への結合特異性等の生化学的性質が従来公知のレクチンと異なる新規のレクチンである。特にフコースα１→６結合を特異的に認識することから、診断薬・検査試薬、糖質の分離分析用特異的吸着剤、免疫調節剤等として用いることができる。したがって、本発明は、前記フコースα１→６特異的レクチンを有効成分とする、フコースα１→６転移酵素により合成されるフコースα１→６糖鎖を検出するための診断薬、及び該診断薬を含む診断薬キットを提供する。前記診断薬又は診断薬キットは、上記の肝細胞癌等を診断する。

本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンをフコースα１→６糖鎖の結合媒体として用いて、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖とを分別することからなる、フコースα１→６糖鎖の分別方法を提供する。

前記フコースα１→６糖鎖の分別方法に用いるフコースα１→６特異的レクチンは、担子菌レクチンが好ましく、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ、及び、ＡＭＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ及びＳＲＬである。

本発明の分別方法は、例えば固定化された前記フコースα１→６特異的レクチンを用いるレクチンクロマトグラフィーである。その詳細は、前記検出方法で説明したものと同様である。フコースα１→６糖鎖の精製を行なう場合、フコースα１→６特異的レクチンを、アガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、糖鎖試料を通す。通塔後、吸着したフコースα１→６糖鎖を回収する。非フコースα１→６糖鎖の精製を行う場合には、上記カラムに糖鎖試料を通塔する際、吸着しないで通過する糖鎖試料を回収する。

本発明の分別方法により精製される対象は、フコースα１→６糖鎖、非フコースα１→６糖鎖の二種類があり得る。その具体例は、抗体に結合した糖鎖、好ましくはヒトＩｇＧに結合した糖鎖である。

前記分別方法で分別された糖鎖の純度、すなわちフコースα１→６糖鎖の場合にフコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対するフコースα１→６糖鎖の比率、非フコースα１→６糖鎖の場合にフコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対する非フコースα１→６糖鎖の比率は、通常、９０〜１００％であり、好ましくは９５〜１００％、特に好ましくは９９〜１００％である。

本発明は、前記純度が通常９０〜１００％、好ましくは９５〜１００％、特に好ましくは９９〜１００％のフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖を有効成分とする医薬もまた提供する。特に、α１→６フコースの転移した抗体の除去された抗体からなる抗体医薬は、ＡＤＣＣ活性の向上が期待される。その候補として、Ｒｉｔｕｘａｎ（キメラ抗体、ＮＨリンパ腫）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ヒト化抗体、乳癌）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（キメラ抗体、大腸癌、頭頸部癌）、Ｚｅｖａｌｉｎ（マウス抗体、ＮＨリンパ腫）、Ｃａｍｐａｔｈ（ヒト化抗体、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）、Ｂｅｘｘａｒ（マウス抗体、ＮＨリンパ腫）、Ａｖａｓｔｉｎ（ヒト化抗体、転移性大腸癌）等が挙げられる。

本発明の分別方法により得られる抗体医薬の使用方法（薬理上許容される担体、助剤・添加剤、投与経路、投与形態等）は、従来のものよりも高い比活性のため用法・用量を抑えてよいこと以外は、常法と同様である。

本発明は、また、前記分別方法で分別された、純度９０〜１００％のフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖、ならびに該純度９０〜１００％のフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖を有効成分とする医薬を提供する。ここで、前記純度は、フコースα１→６糖鎖の場合、フコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対するフコースα１→６糖鎖の比率を意味し、非フコースα１→６糖鎖の場合、フコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対する非フコースα１→６糖鎖の比率を意味する。該医薬は、抗体医薬であることが好ましい。

本発明は、また、フコースα１→６糖鎖のスクリーニング方法を提供する。この方法は、前記フコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を含む流体を作用させ、該フコースα１→６特異的レクチンに吸着されたフコースα１→６糖鎖を回収することからなる。前記このスクリーニング方法は、フコースα１→６糖鎖をもつ新規な腫瘍マーカー等の探索に有用である。本発明の検出方法に使用可能なフコースα１→６特異的レクチンを利用して、フコースα１→６糖鎖を含む疾病マーカーを容易にスクリーニングすることもできる。

前記スクリーニング方法に用いるフコースα１→６特異的レクチンは、好ましくは担子菌由来のレクチンであり、特に好ましくはモエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれ、さらに好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ、及び／又は、ＡＭＬである。中でも、ＰＴＬ及びＳＲＬが最も好ましい。

本発明は、また、フコースα１→６糖鎖特異的レクチンのスクリーニング方法を提供する。この方法には、例えば固定化された前記フコースα１→６特異的レクチンを用いる。固定化された検体レクチンに、複数の糖鎖を含む流体を作用させ、該固定化レクチンに吸着された糖鎖の試験プロファイル（ゲル電気泳動等）と、固定化されたＰＴＬ又はＳＲＬに前記流体を作用させる。該レクチンに吸着される糖鎖の対照プロファイルとを比較して、対照と同じプロファイルになるフコースα１→６特異的レクチンを抽出する。検体レクチンに吸着された糖鎖の同定を区々行う必要がないので、目的のレクチンを非常に簡易な操作でスクリーニングすることができる。こうして抽出されたフコースα１→６特異的レクチンを、次回のスクリーニング方法の対照に用いてもよい。別法として、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部又は全部をコードするｃＤＮＡをプライマーに用いて、検体レクチンの中からフコースα１→６特異的レクチンのｃＤＮＡを釣り上げることも可能である。

上記糖鎖は、図１及び２に示すようなフコースα１→６糖鎖の少なくとも一種を含み、さらにα１→６結合以外のフコースの転移した非フコースα１→６糖鎖の少なくとも一種、及びフコースをもたない糖鎖（例えば高マンノース糖鎖）の少なくとも一種を含むことが好ましい。これらの添加により、フコースα１→６糖鎖以外の糖鎖とは親和性を有さないことの確認がとれる。

吸着された糖鎖のプロファイル測定には、各種のクロマトグラフィー、質量分析、ゲル電気泳動、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等の表面プラズモン共鳴法、電気泳動等も、当業者に周知の方法を使用することができる。

以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１及び２〕（ＰＴＬ及びＳＲＬの製造、物性測定、並びに特性評価）（１）ＰＴＬ（実施例１）の製造 図３に示す精製工程に従って、ツチスギタケからツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）を単離精製した。

（抽出） ツチスギタケ約７．５ｇを凍結乾燥して得られたツチスギタケ凍結乾燥粉末２．５ｇに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．２）５０ｍｌを加えて、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目の抽出液を得た。この抽出残渣に、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．２）を５０ｍｌ加えて、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせてろ紙でろ過し、ツチスギタケ抽出液とした。

（イオン交換クロマトグラフィー） 上記抽出液８７ｍｌを、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した。同緩衝液でカラムを洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．２）で溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図４の←→部）を合一し、限外ろ過で脱塩後凍結乾燥した。

（アフィニティクロマトグラフィー） 上記凍結乾燥粉末を、１０ｍ
Ｍ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ ７．４、以後、ＰＢＳと略す）で溶解し、同緩衝液で平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．２Ｍ アンモニアで溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図５の←→部）を合一し、限外ろ過で純水に置換後凍結乾燥し、ＰＴＬを１．０７ｍｇ得た。

（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動） 電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ８−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図６は、ＰＴＬのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果である。図６のレーンＭ、レーン１及び２は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー（ＡＰＲＯ社）、レーン１：ＰＴＬ 還元剤（−）、レーン２：ＰＴＬ 還元剤（＋）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ８−２５、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）

上記の８−２５％ ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、主成分がＰＴＬであることを確認した。

（２）ＳＲＬ（実施例２）の製造 図７に示す精製工程に従って、サケツバタケからサケツバダケレクチン（ＳＲＬ）を単離精製した。

（抽出） サケツバタケ約４００ｇを凍結乾燥して得られたサケツバタケ凍結乾燥粉末４０ｇに、１．６ＬのＰＢＳを加え、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳ ０．８Ｌを加え、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてサケツバタケ抽出液とした。

（硫酸アンモニウム沈殿） 上記抽出液２．４Ｌに対して、硫酸アンモニウム濃度が８０％飽和になるように硫酸アンモニウム１．３ｋｇを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、７℃下で一晩静置した。この溶液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してサケツバタケ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。

（疎水クロマトグラフィー） 上記サケツバタケ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分を、２Ｍ 硫酸アンモニウム−ＰＢＳで平衡化したブチル−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、純水溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、サケツバタケレクチン粗画分を得た（図８の←→部）。

（逆相クロマトグラフィー） 上記サケツバタケレクチン粗画分を、０．０５％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−０％ アセトニトリルで平衡化したＣ８カラム（和光純薬（株）製）に供して、逆相クロマトグラフィーで精製した。このクロマトグラフィーにおいて、０．０５％ ＴＦＡ−３０％ アセトニトリル溶出画分（図９の←→部）を合一し、常温エバポレートにより溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、ＳＲＬを７．５ｍｇ得た。

電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ８−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図１０は、ＳＲＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図１０のレーンＭ、レーン１及び２は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー（ＡＰＲＯ社製）、レーン１：ＳＲＬ 還元剤（＋）、レーン２：ＳＲＬ 還元剤（−）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ８−２５、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：ｓｉｌｖｅｒ

上記の８−２５％ ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、主成分がＳＲＬであることを確認した。

（３）ＰＴＬ及びＳＲＬの物性測定（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析） 実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬ １０μｇを、別々に、ＴＡ（０．１％ ＴＦＡとアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとレクチンのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてＡｕｔｏｆｌｅｘ（ブルカーダルトニクス社製）を用い、ＬＰモードでＰＴＬ及びＳＲＬの分子量を測定した。その結果、分子量は約４，５００であった（図１１及び１２）。

（アミノ酸配列解析） 実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬのアミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＰＰＳＱ−２１ Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した。その結果を、それぞれ、配列番号２及び３に示す。いずれの配列も新規であった。

ＰＴＬ及びＳＲＬに対して、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヒト（Ａ，Ｂ，Ｏ）、及びアクチナーゼＥ処理ウサギの赤血球凝集活性試験を行った。その結果を、赤血球凝集活性として表１に示す。

ＮＴ； ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄ

上記のアミノ酸構造解析及び赤血球凝集活性試験の結果から、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、新規なレクチンであることが確認された。

（４）ＰＴＬ及びＳＲＬの糖結合特異性の評価 表２に示す種々の単糖、オリゴ糖及び多糖、並びに表３に示す糖タンパク質を用いた赤血球凝集反応阻害試験により、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬの糖結合特異性を評価した。

９６穴Ｕ底マイクロタイタープレートに１０μｌの単糖、オリゴ糖、多糖及び糖タンパク質溶液の２倍希釈系列を作製した。力価４にあらかじめ調節しておいたレクチン溶液をそれぞれの穴に１０μｌずつ加えた。室温にて１時間静置して感作させた後、１０μｌの４％赤血球懸濁液をそれぞれの穴に加え、さらに室温にて１時間静置した。その後、赤血球の凝集を完全に阻害するサンプル溶液の希釈倍率を肉眼にて判定した。阻害を示す最低濃度を最小阻害濃度とした。この最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する特異性が高いことを示している。結果を表２及び３に示す。

比較のために、フコース特異的レクチンといわれている以下の市販のレクチン：比較例１：ＡＡＬ（生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、比較例２：ＡＯＬ（東京化成工業（株）−月桂冠（株）製）、比較例３：ＬＣＡ（生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、及び、比較例４：ＰＳＡ（生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）を用いて、上記糖結合特異性を評価した。結果を表２及び３に併記する。

表２及び３から以下のことがわかる。実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、フコースα１→６を有するチログロブリンにのみ結合した。一方、比較例１のＡＡＬは、チログロブリンのほかに、糖類ではマンノース、フコース及びフルクトースとも結合し、そして糖タンパク質ではＯ結合型糖鎖中にフコースを有するムチンとも結合した。比較例２のＡＯＬは、糖類ではマンノース、フコース及びフルクトースと結合し、そして糖タンパク質ではＯ結合型糖鎖中にフコースを有するムチンと結合した。また、比較例３のＬＣＡ及び比較例４のＰＳＡは、チログロブリンのほかに、糖類ではマンノースやメチルα−マンノシドとも結合した。実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、フコースやマンノースに結合せずに、フコースα１→６結合にのみ結合するフコースα１→６特異的レクチンであるといえる。

（５）ＰＴＬ及びＳＲＬのフコースα１→６糖鎖への結合定数の測定 実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬのフコースα１→６糖鎖への結合定数を以下の手順で測定した。

（オリゴ糖の準備） 図１及び２に示すピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖を測定試験に使用した。ＰＡ化糖鎖は、タカラバイオ（株）、生化学バイオビジネス（株）及び増田化学工業（株）から購入した。もしくは、未標識の糖鎖や糖鎖を酵素消化して得た糖鎖等をＧｌｙｃｏＴＡＧ（登録商標、タカラバイオ（株）製）でピリジルアミノ化した。

（レクチンカラムの調製） ０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ ８．３）中にレクチンを溶解し、ＮＨＳ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）の製造者マニュアルに従って結合させた。０．８％ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．４、ＴＢＳ）中にレクチン−セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ ｘ １０ｍｍ， ３１．４μｌ）に充填した。

（フロンタルアフィニティクロマトグラフィー） ＦＡＣ自動分析装置（ＦＡＣ−１、（株）島津製作所製）を用いてフロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。詳細には、上記で調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、ＦＡＣ−１装置に接続した。流速及びカラム温度を、それぞれ０．１２５ｍｌ／ｍｉｎ及び２５℃に保った。前記ＴＢＳでミニチュアカラムを平衡後、過剰容積（０．５ｍｌ〜４ｍｌ）のＰＡ化糖鎖（３．７５ｎＭ、又は、７．５ｎＭ）を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。

ＰＡ化糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍ及び蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ化ラムノース）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ_０〕を測定した。相互作用強度及び有効リガンド量から結合定数Ｋａを求めた。その結果を、表４〜９に示す。

比較のために、フコース特異的レクチンといわれているＡＡＬ（比較例１）、ＡＯＬ（比較例２）、ＬＣＡ（比較例３）及びＰＳＡ（比較例４）についても、上記と同様の手順で結合定数を求めた。その結果を、表４〜７に併記する。

表４〜７から、比較例１のＡＡＬ及び比較例２のＡＯＬでは、フコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．１５、２０１−２０３、４０１−４１８）とともに、非α１→６である糖脂質系のフコース糖鎖（糖鎖Ｎｏ．７１８、７２２、７２３、７２７、９０９、９１０、９３３）も結合してしまう。また、比較例３のＬＣＡ及び比較例４のＰＳＡでは、フコースα１→６糖鎖を持たない多くの糖鎖（糖鎖Ｎｏ．００３、００５−０１４）も結合してしまう。それに対して、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、フコースα１→６糖鎖を確実に結合し、かつ非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く結合していない。しかも、実施例１のＰＴＬの結合定数は、従来のレクチンよりも大きい（結合定数がＫａ＝１．０×１０^５Ｍ^−１以上）。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４０７−４１３）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても（糖鎖Ｎｏ．６０１、６０２）、フコースα１→６糖鎖の結合定数が下がっていないことがわかる。

（６）ＰＴＬ及びＳＲＬを用いた糖タンパク質の検出（ｉ）糖タンパク質の準備 主な糖鎖構造を下に示す糖タンパク質（１）〜（９）、及び糖を有さない（１０）ウシ血清ア
ルブミンを準備した。

（１）フコースα１→６糖鎖を有するＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：

を有するチログロブリン（ブタ）。

（２）フコースα１→６糖鎖を有するＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：

を有するラクトフェリン（ウシ）。

（３）フコースα１→６糖鎖を有するＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：

を有する免疫グロブリンＧ（ヒト）。

（４）フコースα１→６糖鎖を有さないN型糖鎖を有する糖タンパク質として、下記式：

を有するトランスフェリン（ヒト）。

（５）フコースα１→６糖鎖を有さないＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：

を有するα１−酸性糖タンパク質（ヒト）。

（６）高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質として、下記式：

を有するインベルターゼ（酵母）。

（７）フコースを有するＯ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：

を有するムチン（ブタ）。

（８）フコースを有するＯ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：

を有するムチン（ウシ）。

(ii)ウェスタンブロット法による糖タンパク質の検出 ビオチン標識化した実施例１のＰＴＬ、実施例２のＳＲＬ、比較例１のＡＡＬ、比較例２のＡＯＬ及び比較例３のＬＣＡ、並びに前記糖タンパク質試料を用いて、ウェスタンブロット法による糖タンパク質の検出をおこなった。

（レクチンのビオチン化） レクチンを量り取り、０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム溶液を加え溶解した（濃度；５ｍｇ／ｍｌ）。ビオチン化試薬をジメチルスルホキシドに溶解し、レクチン溶液に加え反応させた。反応物を透析、凍結乾燥し、ビオチン標識化レクチンとした。

（糖タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥとブロッティング） 上記糖タンパク質試料を１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７ ．４、ＰＢＳ）で２ｍｇ／ｍｌに溶解したものをマイクロチューブに１８μｌずつ分注した。ＳＤＳ処理液（Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （２ＭＥ−）；和光純薬（株）製）６μｌ、及び２−メルカプトエタノール（バイオラッドラボラトリーズ社）１．２５μｌを、各分注液に添加し、５分間煮沸した。これをポリアクリルアミドゲルに泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＩＰＶＨ ３０４ Ｆ０ ミリポア社製）に転写した。

（ビオチン標識化レクチンによる染色） 上記膜を１％ ＢＳＡを添加した０．８％ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．４、１％ ＢＳＡ ＋ ＴＢＳ）に浸し、室温で１時間振とうした。膜を０．８％ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．４、ＴＢＳ）で３回洗浄後、ビオチン標識化レクチン溶液（２μｇ／ｍｌ）に浸し、室温で１時間振とうした。膜をＴＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液１μｇ／ｍｌ（ベクター社製）に浸し、室温で３０分間振とうした。膜をＴＢＳで３回洗浄後、ＰＯＤ イムノステインセット（和光純薬（株）製）を用いて染色試験を行った。染色試験は、ビオチン標識化レクチンを用いたウェスタンブロット法による糖タンパク質を検出するものである。図１３〜１７は、下記の糖タンパク質を、ＰＴＬ（図１３）、ＳＲＬ（図１４）、ＡＡＬ（図１５）、ＡＯＬ（図１６）、又は、ＬＣＡ（図１７）で染色した写真である。

図１３〜１７中、レーン０〜６は、以下のとおりである。レーン１：チログロブリン、レーン２：ラクトフェリン、レーン３：免疫イムノグロブリン、レーン４：トランスフェリン、レーン５：α１−酸性糖タンパク質、レーン６：インベルターゼ、レーン０：血清アルブミン（コントロール）

また、コントロールとして、タンパク質のみを染色するために、ＣＢＢ染色も行なった。その染色写真を図１８に示す。図１８中、レーンＭ、１〜６は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：チログロブリン、レーン２：ラクトフェリン、レーン３：免疫イムノグロブリン、レーン４：トランスフェリン、レーン５：α１−酸性糖タンパク質、レーン６：インベルターゼ、レーン０：血清アルブミン

○・・・検出 ×・・・非検出

表８及び図１３〜１８の結果から、比較例３のＬＣＡでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質とともに、ハイマンノースを有する糖タンパク質（インベルターゼ）も検出してしまう。それに対して実施例１のＰＴＬや実施例２のＳＲＬでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していないといえる。

(iii)ＥＬＩＳＡ法による糖タンパク質の検出 ビオチン標識化した実施例１のＰＴＬ、実施例２のＳＲＬ、比較例１のＡＡＬ、比較例２のＡＯＬ及び比較例３のＬＣＡを用いて、酵素免疫測定法による糖タンパク質の検出評価をおこなった。

上記糖タンパク質と、コントロールとして糖鎖のないタンパク質であるアルブミンを０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）で１ｍｇ／ｍｌ溶解して、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ ４３９４５４）に添加した後、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで、３回洗浄後、１％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液を、ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を、ウェルに添加して３７℃で３０分間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ （ＫＰＬ社製）を添加し、遮光して室温で１０分間インキュベートした。

１Ｍ リン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４ｉ 東ソー社製）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。この値から反応値（［４５０ｎｍにおける吸光度］−［糖タンパク質をプレートに固相化せず反応させたウェルの値］）を算出した。次いで、各レクチンにおいて、糖タンパク質（チログロブリン）の値を１００％とした各糖タンパク質に対する相互作用強度（相対値）を計算した。算出結果を表９及び図１９〜２３に示す。

◎・・相対値１２０〜８０、○・・相対値８０〜５０、△・・相対値５０〜１０、×・・相対値１０以下

表９及び図１９〜２３では、比較例１のＡＡＬや比較例２のＡＯＬでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質とともに、フコースを含むＯ型糖鎖（ムチン）も検出してしまう。それに対して実施例１のＰＴＬや実施例２のＳＲＬでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を検出していない。さらに、比較例１〜３のレクチンは、ラクトフェリンや免疫グロブリンへの相互作用強度がチログロブリンより劣ってしまうのに対し、実施例１及び２のレクチンでは、ラクトフェリンや免疫グロブリンへの相互作用強度はチログロブリンと同等である。

(iv)ＥＬＩＳＡ法による腫瘍マーカー糖鎖の検出 α−フェトプロテイン（以後、ＡＦＰという）は、Ｎ結合型糖鎖を持つ血清に含まれる糖タンパク質であり、健康な成人の血清にほとんど存在しない。一方、良性の肝疾患を持つ患者血清にはαフェトプロテイン−Ｌ１型糖鎖（ＡＦＰ−Ｌ１）が増加し、肝臓ガン患者にはさらにαフェトプロテイン−Ｌ３型糖鎖（ＡＦＰ−Ｌ３）が検出される。従来、その糖鎖の違いがＬＣＡを用いて測定され、測定結果が肝疾患の診断として利用されている。

ビオチン標識化した実施例１のＰＴＬ、実施例２のＳＲＬ、比較例１のＡＡＬ、比較例２のＡＯＬ及び比較例３のＬＣＡを用いて、酵素免疫測定法によるα−フェトプロテインの結合性評価をおこなった。

０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）でα−フェトプロテイン（ヒト臍帯血清由来、主にＬ１型糖鎖）、α−フェトプロテイン−Ｌ３（ヒト肝臓ガン細胞の培養上清由来）を０．０１μｇ／ｍｌになるように希釈し、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製）に添加し、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液をウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して３７℃で３０分間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ （ＫＰＬ社製）を添加し、遮光して室温で１０分間インキュベートした。１Ｍ リン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダーＭＰＲ−Ａ４ｉ（東ソー社製）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

α−フェトプロテイン、α−フェトプロテイン−Ｌ３をレクチンと反応させたプレートの４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、この値から反応値（［４５０ｎｍにおける吸光度］−［糖タンパク質をプレートに固相化せず反応させたウェルの値］）を算出した。次いで、反応値の算出結果を表１０及び図２４〜２８に示す。

表１０から、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、腫瘍マーカーの糖鎖の変化（α−フェトプロテイン−Ｌ１型糖鎖とＬ３型糖鎖）を比較例３のＬＣＡと同等以上に検出できることがわかる。このことから、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬを糖鎖に作用させることからなる診断薬又は診断薬キットに利用できる。また、本発明のレクチンの特異性の高さから、フコース１→６糖鎖以外が混在する糖鎖化合物群から目的のフコース１→６糖鎖化合物を他のレクチンよりも正確に検出できる可能性が高い。

〔実施例３及び４〕（ＮＳＬ及びＬＳＬの製造及び物性測定）（１）ＮＳＬ（実施例３）の製造 図２９に示す精製工程に従って、クリタケからクリタケレクチン（ＮＳＬ）を単離精製した。

（抽出） クリタケ約４００ｇを凍結乾燥して得られたクリタケ凍結乾燥粉末４０ｇに、０．８ＬのＰＢＳを加え、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳを０．４Ｌ加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳを０．４Ｌ加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して３回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてクリタケ抽出液とした。

（硫酸アンモニウム沈殿） 上記抽出液１．５Ｌに対して、硫酸アンモニウム濃度が８０％飽和になるように
硫酸アンモニウム約０．８ｋｇを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、７℃下で一晩静置した。この溶液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してクリタケ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。回収したクリタケ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分を、透析膜（分画６，０００〜８，０００）を用いて純水で透析した。

（疎水クロマトグラフィー） 上記で得られたクリタケ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分の溶媒を、２Ｍ 硫酸アンモニウム−ＰＢＳに置換した後、２Ｍ 硫酸アンモニウム−ＰＢＳで平衡化したブチル−トヨパール（東ソー社製）に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、ＰＢＳ溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、クリタケレクチン粗画分を得た（図３０の←→部）。

（逆相クロマトグラフィー） 上記で得られたクリタケレクチン粗画分を、０．０５％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−０％ アセトニトリルで平衡化したＣ８カラム（和光純薬（株）製）に供して、逆相クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、０．０５％ ＴＦＡ−４０％ アセトニトリル溶出画分（図３１の←→部）を合一し、常温エバポレートにより溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、ＮＳＬを得た。

電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ１０−１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図３２は、ＮＳＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、のレーン１及び２は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：ＮＳＬ β−ＭＥ（＋）、レーン２：ＮＳＬ β−ＭＥ（−）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ１０−１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：ｓｉｌｖｅｒ

上記の１０−１５％ ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、主成分がＮＳＬであることを確認した。

（２）ＬＳＬ（実施例４）の製造 図３３に示す精製工程に従って、コムラサキシメジからコムラサキシメジレクチン（ＬＳＬ）を単離精製した。

（抽出） コムラサキシメジ約４００ｇを凍結乾燥して得られたコムラサキシメジ凍結乾燥粉末４０ｇに、０．８ＬのＰＢＳを加え、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳ ０．４Ｌを加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳ ０．４Ｌを加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して３回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてコムラサキシメジ抽出液とした。

（硫酸アンモニウム沈殿） 上記抽出液１．５Ｌに対して、硫酸アンモニウム濃度が８０％飽和になるように硫酸アンモニウム約０．８ｋｇを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、７℃下で一晩静置した。この溶液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してコムラサキシメジ８０％硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。回収したコムラサキシメジ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分を透析膜（分画６，０００〜８，０００）を用いて純水で透析した。

（疎水クロマトグラフィー） 上記で得られたコムラサキシメジ８０％ 硫酸アンモニウム沈殿画分の溶媒を２Ｍ 硫酸アンモニウム−ＰＢＳに置換した後、１Ｍ 硫酸アンモニウム−ＰＢＳで平衡化したブチル−トヨパール（東ソー社製）に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、ＰＢＳ溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、コムラサキシメジレクチン粗画分を得た（図３４の←→部）。

（逆相クロマトグラフィー） 上記で得られたコムラサキシメジレクチン粗画分を、０．０５％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−０％ アセトニトリルで平衡化したＣ８カラム（和光純薬（株）製）に供して、逆相クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、０．０５％ ＴＦＡ−３０％ アセトニトリル溶出画分（図３５の←→部）を合一し、常温エバポレートにより溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、ＬＳＬを得た。

電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ １０−１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図３６は、ＬＳＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、レーンＭ及びレーン１は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：ＬＳＬ（疎水クロマト、逆相）：β−ＭＥ（＋）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ１０−１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：ｓｉｌｖｅｒ

上記の１０−１５％ ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、主成分がＬＳＬであることを確認した。

（３）ＮＳＬ及びＬＳＬの物性測定（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析） 実施例３のＮＳＬ及び実施例４のＬＳＬを１０μｇ秤りとり、別々に、実施例１と同様の手順で、ＴＡ（０．１％ ＴＦＡとアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとレクチンのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてブルカーダルトニクス社製Ａｕｔｏｆｌｅｘを用い、ＬＰモードでＮＳＬ及びＬＳＬの分子量を測定した。その結果、分子量は約４，５００であった（図３７及び３８）。

（アミノ酸配列解析） 実施例３のＮＳＬのアミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＰＰＳＱ−２１ Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した結果、配列番号５及び６に示すアミノ酸配列の混成体であることがわかった。これらの配列は、いずれも新規であった。

同様に、実施例４のＬＳＬのアミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＰＰＳＱ−２１ Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した結果を、配列番号４に示す。この配列も新規であった。

（４）ＮＳＬ及びＬＳＬの糖結合特異性の評価 実施例３のＮＳＬ及び実施例４のＬＳＬのフコースα１→６糖鎖への特異的結合性を、実施例１と同様にして評価した。具体的には、ＮＳＬ及びＬＳＬの結合定数Ｋａを求めた。結果を表１１〜１３に示す。

ＮＴ；ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄ

実施例３のＮＳＬ及び実施例４のＬＳＬは、フコースα１→６糖鎖のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していない。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖や四本鎖にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても、フコースα１→６糖鎖に結合定数が下がらない。

最後に、配列番号２〜６に示すタンパク質又はペプチド間の相同性の計算結果を、表１４に示す。この結果から、配列２〜６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％の相同性があれば、フコースα１→６特異的レクチンになり得ることがわかる。

Claims (19)

1. フコースα１→６特異的レクチンであって、
   （１）担子菌から抽出することができ、
   （２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で約４，５００ｍ／ｚにピークを示し、及び、
   （３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする、前記フコースα１→６特異的レクチン。
2. 前記フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載の前記フコースα１→６特異的レクチン。
3. さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
4. さらに、（５）フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする、請求項１、２又は３に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
5. 前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
6. 前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
7. さらに、（６）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
8. （ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、
   （ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチン。
9. 配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
10. 担子菌の水系媒体抽出物を、
    （i）疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー、
    （ii）アフィニティクロマトグラフィー、又は、
    （iii）イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィー
    にかけて、
    （vi）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で約４，５００ｍ／ｚにピークを示し、及び、
    （v）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０^４Ｍ^−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得ることからなるフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
11. 前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科及びタコウキン科の少なくとも一種から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載のフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
12. 前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ及びベニテングタケから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
13. 前記担子菌の子実体を使用することを特徴とする、請求項１０、１１又は１２に記載のフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
14. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のフコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の検出方法。
15. 前記糖鎖が腫瘍マーカーであることを特徴とする、請求項１４に記載のフコースα１→６糖鎖の検出方法。
16. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のフコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の分別方法。
17. 前記糖鎖が抗体に結合したものであることを特徴とする、請求項１６に記載のフコースα１→６糖鎖の分別方法。
18. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のフコースα１→６特異的レクチンを有効成分とする、フコースα１→６糖鎖を検出するための診断薬又は診断薬キット。
19. 配列番号２〜６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％以上の相同性を有するタンパク質又はペプチドを取得し、配列番号２〜６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドをスクリーニングすることからなる、フコースα１→６特異的レクチンのスクリーニング方法。

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