JP4530335B2

JP4530335B2 - 膀胱に発現する上皮型ナトリウムチャネルに対する阻害薬

Info

Publication number: JP4530335B2
Application number: JP2004027008A
Authority: JP
Inventors: 勇雄荒木; 正之武田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2024-02-03
Also published as: JP2005218318A

Description

本発明は、過活動膀胱症候群治療薬をスクリーニングするために用いる標的物質、及び過活動膀胱症候群治療薬に関するものである。

過活動膀胱症候群（以下過活動膀胱とも述べる）は、最近の疫学調査の結果、非常に頻度が高い疾患であることが明らかになった。通常、頻尿、尿意切迫・切迫性尿失禁といった過活動膀胱の症状は、排尿筋機能の異常（排尿筋過活動）に基づいて出現するが、その病態生理は不明である。現在のところ効果的な治療法としては、非特許文献１において記載されたオキシブチニン、プロピベリンなどの抗ムスカリン剤を用いた薬物療法であるが、本薬剤は排尿筋収縮力の抑制により過活動膀胱の改善する作用機序を有するものの、口渇、便秘、記銘力障害などの副作用がある。

一方、過活動膀胱の病態生理のひとつとして、膀胱求心路などへの膀胱からの知覚神経入力の増大とそれに伴う膀胱の過活動性が考えられつつあり、非特許文献２において記載されたカプサイシン、あるいはレジニフェラトキシンなどのバニロイド受容体刺激薬の有効性が報告されたものの、副作用が大きいことが問題である。したがって、膀胱求心路に作用する新しい過活動膀胱治療薬の開発が待望されている。
Yoshimura N, Chancellor MB（Journal of Urology Vol 168, p1897-1913, 2002.） Geirsson G, Fall M, Sullivan L（Journal of Urology Vol 154, p1825-1829, 1995.）

従って、本発明は、膀胱求心路に作用する新しい過活動膀胱治療薬の開発において用いることができる新規な標的物質、及び新規な過活動膀胱治療薬を提供することをその課題とする。

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、膀胱における上皮型ナトリウムチャネルタンパクが膀胱の求心性神経路における機械感受性情報伝達に関与しており、下部尿路閉塞に伴う排尿筋の機能異常を引き起こして過活動膀胱を起こす可能性があることを発見し、該上皮型ナトリウムチャネルタンパクが、膀胱求心路に作用する新しい過活動膀胱治療薬の開発において標的物質として用いることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、アミロライドを有効成分とし、膀胱に発現する上皮型ナトリウムチャネルに対する阻害薬であって、膀胱容量が増加することを特徴とする膀胱容量増加薬を提供するものである。

本発明は、膀胱求心路に作用する新しい過活動膀胱治療薬の開発において用いることができる新規な標的物質、及び新規な過活動膀胱治療薬を提供することができる。

本発明に係るヒト上皮型ナトリウムチャネルタンパク質（Epithelial Sodium Channel: 以下ENaCと述べることがある）は、Wicker L, Steinkrugerら（Biochemical and Biophysical Research Communications Vol 295, p330-335, 2002）に記載される方法でcDNAを得て、それぞれ、ヒトαENaC、ヒトδENaC、ヒトβENaC及びヒトγENaCに対応する配列番号５、６、７、及び８の塩基配列のうち、配列番号５若しくは６、７及び８で表わされる塩基配列を有するそのcDNA全長を、大腸菌発現ベクターを用いて、大腸菌において発現させ、公知の方法で精製することによって所得することができる。また、組み換えタンパク質、並びにENaC及びその組み換えタンパク質の断片は、配列番号５、６、７、又は８で表わされる塩基配列を有するそのcDNAを遺伝子組み換えすることによって得られるものである。さらに、類似体としては、それぞれラット上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットα（以下、ラットαENaCとも述べる）、ラット上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットβ（以下、ラットβENaCとも述べる）及びラット上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットγ（以下、ラットγENaCとも述べる）に対応する配列番号１２、１３、及び１４で表わされる塩基配列の遺伝子を発現して得られる配列番号９、１０、及び１１のアミノ酸配列を有するラット上皮型ナトリウムチャネルタンパク質、並びにウサギ上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットα（以下、ウサギαENaCとも述べる）、ウサギ上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットβ（以下、ウサギβENaCとも述べる）及びウサギ上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットγ（以下、ウサギγENaCとも述べる）に対応する配列番号１５、１６、及び１７のアミノ酸配列を有するウサギ上皮型ナトリウムチャネルタンパク質等の哺乳動物から得られる上皮型ナトリウムチャネルタンパク質を例示することができる。配列番号１５、１６、及び１７のアミノ酸配列に対する塩基配列の内、判明している部分の配列を配列番号１８、１９及び２０として示す。ラット上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットα及びウサギ上皮型ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットαは、いずれもヒトENaCα及びヒトENaCδに対応するサブユニットである。ここで上皮型ナトリウムチャネルタンパク質の生物学的機能の１つとは、機械感受性ナトリウムイオン能動輸送機能、電位依存性ナトリウム能動輸送機能、又は受容体関連ナトリウム能動輸送機能の内いずれか１つを示すものである。

哺乳動物の上皮性ナトリウムチャネルタンパク質は、圧受容器、皮膚の感覚構造などが行う機械感受性のナトリウムイオン能動輸送に関与している。哺乳動物の上皮型ナトリウムチャネルタンパク質は、尿路上皮（腎盂、尿管、膀胱）にも発現されるが、例えば、ウサギ膀胱の上皮型ナトリウムチャネルタンパク質は、流体静力学的な圧力の変化に対応してナトリウムイオン能動輸送特性を機械感受性に変化させる。さらに、ラットの腎盂上皮の上皮型ナトリウムチャネルタンパク質が、腎盂内圧の増加に伴う腎求心性神経の活性化に関与していることが示された。従って、膀胱における上皮型ナトリウムチャネルタンパクが膀胱の求心性神経路における機械感受性情報伝達に関与しており、下部尿路閉塞に伴う排尿筋の機能異常を引き起こす可能性がある。膀胱知覚神経活動を上皮型ナトリウムチャネルタンパク質を標的物質として抑制することによって、排尿障害に伴う排尿筋機能の異常を防ぎ、過活動膀胱が治療できると考えられる。また、膀胱求心路に作用する薬剤は尿排出力に影響を与えないという利点がある。

従って、本発明に係るナトリウムチャネルタンパク質は、例えば、該タンパク質の機械感受性ナトリウムイオン能動輸送機能、電位依存性ナトリウム能動輸送機能を阻害する薬剤をスクリーニングすることにより、過活動膀胱症候群治療薬のスクリーニング用の標的物質として用いることができる。さらに、好ましくは、前立腺肥大症に伴う過活動膀胱症候群の治療薬のスクリーニング用の標的物質として用いることができる。また、本発明の過活動膀胱症候群治療薬に係るアミロライド、ベンザミル、フェナミル、ＣＤＰＣなどは、商業的に入手することができる。

本発明の過活動膀胱症候群治療薬がアジュバントを含有することも可能である。アジュバントは、それらの組成に基づいて、大まかにいくつかの群に分けられる。

これらの群としては、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント等の油アジュバント、無機塩（例えば、AlK(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)、シリカ、ミョウバン、Al(OH)₃、Ca₃(PO₄)₂、カオリンおよび炭素）、例えばポリICおよびポリAU酸等のポリヌクレオチド、ならびに、例えば、結核菌Mycobacterium tuberculosisからのロウD、ならびにCorynebacterium parvum、百日咳菌Bordetella pertussisおよびブルセラ族の成員に見出される物質等のある種の天然物質が挙げられる。本発明の過活動膀胱症候群治療薬は、ヒトの他、家畜やペットなどの動物にも用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。

＜患者から採取した膀胱粘膜標本について＞
膀胱癌あるいは前立腺肥大を伴わない前立腺癌に罹患している９人の患者から正常な膀胱の粘膜標本を採取した。閉塞膀胱の粘膜標本は、前立腺肥大症（以下BPHとも述べる）を罹患し、内視鏡による外科的治療を行った９名の患者から採取した。閉塞膀胱による排尿障害の基準としては、前立腺の容量が３０ｃｍ^３以上であり、国際前立腺症状スコアのスコア合計（以下IPSSとも言う）が１２点以上であり、且つ最大尿流率が１０ｍｌ／ｓｅｃ以下であるという基準を採用した。BPHを罹患している９名の患者のうち７名の患者に対して、膀胱の閉塞を確かめるために圧流速測定を行った。膀胱内圧測定を受けた閉塞膀胱を有する８名の患者の内７名において、排尿筋の不随意収縮（排尿筋過活動）が観察された。6 Frダブルルーメンカテーテルは、尿道から膀胱内に挿入した。５０ml/minの注入速度で、等張液である生理食塩水で膀胱を充填し、膀胱内圧測定を行った。腹圧は、直腸で気球カテーテルを用いて測定した。排尿筋圧は、膀胱内圧から腹圧を引くことにより求めた。前立腺肥大のない９名の患者に対しては排尿力学的な試験を行わなかったものの、国際前立腺症状スコアの質問に対するスコアの合計値を求めた６名の患者は、スコア合計が１２点以下であった。研究プロトコルは、山梨大学の倫理委員会によって承認されており、また、全ての標本の採取は、患者から十分なインフォームドコンセントを得た上で行った。患者ごとの前立腺容積、尿流量測定の結果、不随意収縮の有無、IPSSを表１に示す。

注）表１中、患者番号におけるNは正常膀胱を示し、Oは閉塞膀胱を示し、Fは女性を示し、NSは直腸指診及びコンピュータによる断層X線写真法において正常な大きさの前立腺であったことを示し、Qmaxは尿流量測定におけるピーク流速を示し、IPSSは、国際前立腺症状スコアのスコア合計を示し、蓄積は、蓄尿症状スコアを示す。

＜免疫蛍光法による染色＞
OCT化合物（Tissue-Tek社製）に埋めて凍らせた組織（正常膀胱を有する９名の患者及び閉塞膀胱を有する９名の患者から提供された膀胱上皮粘膜）を厚さ８μmのスライスにした。ガラススライド上の各々のスライスは、４℃で十分間アセトン中に固定し、トリス緩衝生理食塩水で洗浄した。得られたスライドは、濃度３％の過酸化水素水で処理してペルオキシダーゼを遮断し、ブロッキング試薬（DakoCytomation社製）で処理して非特異的なタンパク結合を遮断した。１：６００で希釈したラットのαENaC、βENaC、γENaCのサブユニットに対するウサギのポリクローナル抗体（Chemicon社製）を一次抗体として、室温で６０分間反応させた。人とラットとのナトリウムチャネルタンパク質の各々のサブユニット同士を比較すると、相同性が８５％以上であって、非常に相同性が高いため、前記ポリクローナル抗体は人の組織でも機能すると考えられる。二次抗体反応は、テトラメチルイソシアネートと共役した豚由来の抗ウサギ免疫グロブリン（DakoCytomation社製）を１：５０に希釈して行い、蛍光顕微鏡BX50WI（オリンパス社製）によって観察した。蛍光顕微鏡においては、励起波長、発光波長はそれぞれ５２０ｎｍ及び５５０ｎｍとした。正常膀胱を有する患者及び閉塞膀胱を有する患者の組織を蛍光顕微鏡により観察した結果を、図１（Ａ）〜（Ｆ）に示す。図１中、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ、正常膀胱を有する患者の組織におけるヒトαENaC、ヒトβENaC、及びヒトγENaCの免疫蛍光法による測定結果を示し、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）は、それぞれ、閉塞膀胱を有する患者の組織におけるヒトαENaC、ヒトβENaC、及びヒトγENaCの免疫蛍光法による測定結果を示す。

＜cDNAの調製＞
全RNAは、膀胱粘膜に対してRNeasy mini kit及びRNase-free DNase set（Qiagen社製）を用いることにより単離して、分光光度計を用いて定量した。鳥類の骨髄性白血病ウイルスの逆転写酵素を含むfirst strand cDNA synthesis kit（Roche社製）を用いて、４２℃で６０分、次いで９９℃で５分加熱する温度プログラムによって、抽出したRNAを逆転写し、cDNAを調製した。

＜定量的なリアルタイムPCR＞
蛍光を発する色素としてSYBR green I（Molecular Probes社製）を使用して、Smart Cycler System（Cephied社製）を用いて定量的なリアルタイムPCR検定を行った。RT-PCRの生成物であるcDNAに対して、Ex taq R-PCR version（Takara社製）と、下記する表２において記載されているオンラインプログラムであるPrimer3によって設計した遺伝子特異的プライマーのペア０．２μMとを含有する２５μlの混合物中で、６秒間の測定点を有する、９４℃で１０秒、６７℃で２５秒のPCRサイクルを４０回行った。プライマーの配列番号２１〜３０に対応する塩基配列を表２において記載する。非特異的なDNA産物を減らすために、測定点の温度は、標的遺伝子の特異的な溶融ピーク点より２〜３℃低くした。ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットごとの発現量は、GAPDHの発現量に対する比率を１００倍して標準化した値を患者ごとに求め、さらに、９名の正常膀胱を有する患者の平均値、及び９名の異常膀胱を有する患者の平均値を求めた。増幅したPCR産物は、エチジウムブロミドで視覚化された２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。結果を図２に示す。図２（Ａ）は、ヒトαENaCのcDNA、ヒトβENaCのcDNA、ヒトγENaC のcDNA、ヒトδENaCのcDNA、GAPDHのcDNAのPCR産物の電気泳動の結果を示す図である。また、図２（Ｂ）は、ヒトαENaC、ヒトβENaC、ヒトγENaC、ヒトδENaCの標準化された発現量を示す図である。また、図２（Ｂ）中の棒部分は、９名の患者の標本から得られた平均値の標準誤差を示し、括弧内の数字は標的遺伝子が発現された標本の数を示す。PCR産物の一部は、精製して、自動配列決定機を用いて配列決定し、標的遺伝子であることを確認した。また、患者ごとにαENaC、βENaC、γENaC、及びδENaCの発現量の数値を、上記した表１において記載し、下記する統計的な分析において用いた。

＜統計的な分析＞
ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットの発現量を統計的に分析するために両側ｔ検定を用いた。ナトリウムチャネルタンパク質サブユニットの発現量とIPSS及び蓄尿症状スコアとの相関性を統計的に分析するために、線形回帰分析法を用いた。p値が０．０５未満の水準であると、統計的に有意に相関性が認められることとなる。図２（Ｂ）中、星印はp値が０．０１未満であることを示し、この場合において正常膀胱のナトリウムチャネルタンパク質サブユニットの発現量と異常（閉塞）膀胱のナトリウムチャネルタンパク質サブユニットの発現量との間に統計学的に有意性な差異がある。

＜ラット膀胱上皮におけるENaC mRNAの発現＞
上記した＜cDNAの調製＞、＜定量的なリアルタイムPCR＞に従って、ラット正常膀胱及び閉塞モデル（尿道部分閉塞）膀胱から採取した膀胱上皮におけるαENaC、βENaC、及びγENaCの発現を検討した結果を図３に示す。

＜ラットにおける膀胱内圧測定＞
ウレタン麻酔下の雌ラットにおいて、膀胱瘻より４ml/hの速度で持続的に生理食塩水を注入することによって誘発される排尿反射を、１mMのアミロライドを膀胱内に還流する前、アミロライド還流後、及びアミロライドを流去させた後に観察した。正常膀胱を有する雌ラットについての結果を図４に示す。

図１（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の結果からヒト正常膀胱においては、αENaC及びγENaCは染色しても検出されなかったが、図１（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）の結果から、ヒト閉塞膀胱においては、αENaC、βENaC、及びγENaCの全てが染色により検出されていた。これらの結果から、閉塞膀胱において、正常膀胱よりもαENaC及びγENaCの発現が顕著であることがわかった。さらに、図１（Ａ）〜（Ｆ）の結果から、膀胱内腔を覆っている膀胱上皮細胞の免疫染色部位は細胞尖部（膀胱腔側）に存在した。

図２（Ｂ）の結果から、正常膀胱を有する９名の患者においては、ヒトαENaC、ヒトβENaC、ヒトγENaC、及びヒトδENaCのmRNAは、それぞれ、１名、６名、４名及び１名において発現が確認された。従って、ヒトαENaC及びヒトδENaCは、人の正常膀胱においてほとんど発現されていないこととなる。一方、閉塞膀胱を有する９名の患者においては、全ての患者においてヒトαENaC、ヒトβENaC、及びヒトγENaCのmRNAが発現していたが、ヒトδENaCのmRNAは実質的に発現していなかった。また、定量的なリアルタイムPCRの結果の統計的な分析結果から、ヒトδENaCを除く、全てのヒトENaCのサブユニットの発現量が閉塞膀胱において正常膀胱よりも顕著に多いことがわかった。（p値がαENaCにおいて０．００００２、βENaCにおいて０．００７、γENaCにおいて０．０００５である。）とりわけ、αENaCの発現量は閉塞膀胱において正常膀胱よりも著明に増加することがわかった。前立腺肥大症などによる下部尿路閉塞性疾患における排尿筋過活動（過活動膀胱）の発生には膀胱求心性神経の活動の亢進が関与していると考えられている。一方、上皮型ナトリウムチャネルタンパク質は、様々の求心路（知覚神経路）において機械受容分子の有力な候補であることが示唆されており、ラットなどの哺乳動物の尿路上皮にも発現している。したがって、上皮性ナトリウムチャネルが、膀胱求心性神経の活動の亢進を通じて、閉塞膀胱における過活動膀胱の発症に関与している可能性があると考えられる。以上の図２（Ｂ）の結果から、膀胱粘膜におけるENaC発現の増加が、閉塞膀胱における排尿筋過活動の発生に関与し、過活動膀胱症状を引き起こしていると考えられる。

図３の結果から、ヒト正常膀胱と異なり、ラット正常膀胱（５匹）では、膀胱上皮に局在してラットαENaC、ラットβENaC、及びラットγENaCのすべての蛋白が発現していた。

図２（Ｂ) の発現量のデータ及びIPSSの合計スコア及び蓄尿症状スコアとの相関性を統計的に分析した結果、ヒトαENaC、ヒトβENaC、及びヒトγENaCの発現量は、IPSSの合計スコア又は蓄尿症状スコアと高い相関性があることがわかった。ヒトαENaCの発現量と蓄尿症状スコアとの統計的分析結果において、r=0.58、p=0.02であり、ヒトβENaCの発現量と蓄尿症状スコアとの統計的分析結果において、r=0.68、p=0.005であり、ヒトγENaCの発現量と蓄尿症状スコアとの統計的分析結果において、r=0.81、p=0.0003であり、さらに、ヒトγENaCの発現量とIPSSとの統計的分析結果において、r=0.59、p=0.02であった。ヒトαENaCの発現量は年齢とも弱い相関性があり、r=0.50、p=0.03であった。

図４の結果から、ラット膀胱に対するアミロライドの投与により、排尿間隔が延長し、
有意な膀胱容量の増加を示したことがわかる。この変化は、アミロライドを流去した後、
元に回復した。膀胱収縮力には変化がなかったことより、アミロライドにより膀胱求心路
の活動が抑制されたと考えられる。閉塞モデル（尿道部分閉塞）のラットにおいても同様
の結果であった。

以上の図４の結果から、上皮性ナトリウムチャネルの阻害薬が過活動膀胱など排尿機能障害の治療薬として用いることができることがわかった。

以上、実施例において明らかにされた上皮型ナトリウムチャネルの膀胱求心性神経伝達への関与および過活動膀胱発症への関与の可能性は、膀胱求心路に作用する新しい過活動膀胱治療薬の開発に展望を与えるものと考えられる。現時点では、上皮性ナトリウムチャネルに作用する薬剤はアミロライドなどに限られ特異性に乏しいが、しかるべき製薬会社研究所との共同研究・開発により、臨床応用（治療薬の開発）される可能性が高い。

正常膀胱を有する患者の組織におけるヒトαENaCに対する免疫蛍光法による測定結果を示す。正常膀胱を有する患者の組織におけるヒトβENaCに対する免疫蛍光法による測定結果を示す。正常膀胱を有する患者の組織におけるヒトγENaCに対する免疫蛍光法による測定結果を示す。閉塞膀胱を有する患者の組織におけるヒトαENaCに対する免疫蛍光法による測定結果を示す。閉塞膀胱を有する患者の組織におけるヒトβENaCに対する免疫蛍光法による測定結果を示す。閉塞膀胱を有する患者の組織におけるヒトγENaCに対する免疫蛍光法による測定結果を示す。正常膀胱を有する患者及び閉塞膀胱を有する患者の膀胱粘膜から得られたヒトαENaCのcDNA、ヒトβENaCのcDNA、ヒトγENaCのcDNA、ヒトδENaCのcDNA、GAPDHのPCR産物の電気泳動の結果を示す図である。リアルタイムＰＣＲ法により測定されたGAPDH発現量により標準化されたαENaC、βENaC、γENaC、δENaC各々の正常膀胱および閉塞膀胱における発現量を示す図である。ラット正常膀胱及び閉塞膀胱から採取した膀胱上皮のラットαENaC、ラットβENaC、及びラットγENaCに対するRT-PCR法による産物のアガロースゲル電気泳動像である。ウレタン麻酔下ラットにおける膀胱内圧測定の結果を示す図である。１ｍＭアミロライド溶液の膀胱内還流により、排尿間隔が延長し、膀胱容量が増加した。この作用はアミロライドを洗い流すことにより、もとに回復した。膀胱収縮力に変化はなかった。

Claims

アミロライドを有効成分とし、膀胱に発現する上皮型ナトリウムチャネルに対する阻害薬であって、膀胱容量が増加することを特徴とする膀胱容量増加薬。
膀胱に作用することを特徴とする請求項１記載の膀胱容量増加薬。