JP4545868B2

JP4545868B2 - Novel terpenoids and pharmaceuticals utilizing their biological activity

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Publication number: JP4545868B2
Application number: JP2000043078A
Authority: JP
Inventors: 謙吾坂口; 二三男菅原; 善之水品
Original assignee: Toyo Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Toyo Suisan Kaisha Ltd
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2020-02-21
Also published as: JP2001233894A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なテルペノイドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等生物のＤＮＡ合成酵素群は、生体内の細胞分裂、分化などに根源的に関与することから、生物の恒常性維持に不可欠な要素である。高等生物が有するＤＮＡ合成酵素群には、ＤＮＡ合成酵素α、β、γ、δ、ε及びζの６種類が知られており、ここ１０年ほどで各々の酵素反応の特徴が主にイン・ビトロでの証明から明らかになっている。
【０００３】
例えば、ＤＮＡ合成酵素α及びδは、核ＤＮＡ複製に関与し、ＤＮＡ合成酵素γは、ミトコンドリアＤＮＡ複製に関与し、ＤＮＡ合成酵素ζは、修復に関与するであろうといわれている。また、ＤＮＡ合成酵素β及びεもＤＮＡ修復に関与することが示唆されているが、これらの酵素はＤＮＡ鎖の組み換え(recombination)に深く関与する酵素であるともいわれている。ここで「組み換え」とは、１つの細胞内にあるＤＮＡ同士の組み換えをいい、特定蛋白をコードするＤＮＡを大腸菌などに組み込む遺伝子工学でいう「組み換え」とは異なる。
【０００４】
これらのＤＮＡ合成酵素の生理学的活性を研究するために、各々の酵素を選択的に阻害する物質が有用である。例えば、ＤＮＡ合成酵素βを選択的に阻害する化合物としては、ジデオキシＴＴＰが知られている（テルサ(Tersa) ら、Annual Review of Biochemistry 1991 60 513-552)。しかしながら、ジデオキシＴＴＰは、生体内では毒性が強く、際立つ生理活性は観察されていない。
【０００５】
一方、ＤＮＡ合成酵素群の酵素のうちＨＩＶ由来逆転写酵素は、周知のごとくＨＩＶ感染時の中心的役割を担う酵素である。ＨＩＶ由来逆転写酵素を阻害することによりＨＩＶに対して治療効果をもたらし得ることは、例えばアジドチミジンのような既に市販の臨床薬によっても実証されている（日本医薬情報センター編、株式会社薬業時報社発行、「１９９６年度版医療薬日本医薬品集」、第５９９頁）。しかしながら、容易に変異するＨＩＶに対してはアジドチミジンなど現存の薬剤のみでは対応が難しく、新たなＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害物質の開発が望まれている。
【０００６】
また、ジデオキシＴＴＰ、アジドチミジンを含む多くのＤＮＡ合成酵素阻害物質は、その構造がＤＮＡの類似体であり、ＤＮＡ合成反応において拮抗型阻害を示す。拮抗型の阻害剤は、その阻害率は良好である反面、他の様々なＤＮＡ代謝酵素にも取り込まれてしまい生体に対する副作用を示す一因となり得る欠点を有している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ合成酵素群のうち、特にＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素に対する高い阻害作用を非拮抗的に奏する新規生理活性物質及びその活性を用いた医薬を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、担子菌類から抽出した特定のテルペノイドに、ＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素に対する強い阻害活性があることを見出し、本発明を完成した。これらのテルペノイドは、新規な物質である。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）以下に示す構造式を有する新規なテルペノイド１及び２、
【化２】

【００１０】
（２）（１）に記載のテルペノイド１及び２の少なくとも１種を有効成分とするＤＮＡ合成酵素α阻害剤、
（３）（１）に記載のテルペノイド１及び２の少なくとも１種を有効成分とするＤＮＡ合成酵素β阻害剤、並びに
（４）（１）に記載のテルペノイド１及び２の少なくとも１種を有効成分とするＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤
を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上記本発明のテルペノイド１（以下、「ルシデン酸Ｏ」ともいう。）及びテルペノイド２（以下、「ルシデン酸ラクトン」ともいう。）について詳細に説明する。
【００１２】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンは、担子菌類マンネンタケ（basidiomycete, Ganoderma lucidum）から以下のようにして抽出することができる。
【００１３】
マンネンタケ子実体を少量のアセトン中ですり潰し、その後アセトンで抽出する。続いて、アセトンを減圧下で留去することにより茶色のワックス状の濃縮物が得られる。この濃縮物を、酢酸エチル／蒸留水＝１／１（ｖ／ｖ）、ｐＨ７条件下で分配し、酢酸エチル層を得、酢酸エチルを減圧下で留去する。この画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エチル：メタノール：蒸留水＝５０：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）の混合液にて溶出する。得られた画分のうち、ＤＮＡ合成酵素、例えばＤＮＡ合成酵素βの活性を阻害する画分Ａ及びＢを集め、それぞれ減圧下で濃縮する。
【００１４】
後に得られる画分Ｂをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、イソプロピルアルコール：メタノール：蒸留水＝５：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）にて溶出することにより、本発明のルシデン酸Ｏが得られる。
【００１５】
一方、先に得られる画分Ａについては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム：メタノール：蒸留水＝５：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）の混合液にて溶出することにより、本発明のルシデン酸ラクトンが得られる。
【００１６】
原料として用いるマンネンタケは、市販されており、例えば日本微生物化学株式会社から入手することができる。
【００１７】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンの製造方法は、上記抽出方法に限定されるものではなく、使用する抽出溶媒、カラムクロマトグラフィー、溶出溶媒、その他の条件は適宜変更することができる。
【００１８】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンは、以下の実施例に示すように、ＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素に対する強い阻害活性を有する。本発明は、これらの阻害活性を利用する医薬、具体的には、ルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンの少なくとも一方を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素α阻害剤、ＤＮＡ合成酵素β阻害剤及びＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤も提供する。
【００１９】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンは、例えば、経口投与、非経口投与することができる。本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンは、これらの投与経路に応じて、適切な薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤等と組み合わせることにより薬学的製剤にすることができる。
【００２０】
経口投与に適した剤型としては、固体、半固体、液体又は気体等の状態のものが含まれ、具体的には、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤等に製剤化するためには、それ自体は既知の方法を用いて、本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンをバインダー、錠剤崩壊剤、潤滑剤等と混合し、さらに、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、浸潤剤、保存剤、フレーバー剤等と混合することにより行うことができる。一例を挙げると、上記バインダーには、結晶セルロース、セルロース誘導体、コーンスターチ、ゼラチン等が、錠剤崩壊剤には、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が、潤滑剤には、タルク、ステアリン酸マグネシウム等が含まれ、さらには、ラクトース、マンニトール等のような従来用いられている添加剤等を用いることができる。
【００２２】
また、本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンは、液体、微細粉末の形態のものを、気体又は液体の噴霧剤と共に、又は必要に応じて浸潤性付与剤のような既知の助剤と共に、エアロゾル容器、ネブライザーのような非加圧容器に充填し、エアロゾル剤又は吸入剤の形態で投与することもできる。噴霧剤としては、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧ガスを用いることができる。
【００２３】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを非経口投与する場合、例えば、直腸投与および注射等により投与することができる。
【００２４】
直腸投与には、例えば、坐薬として投与することができる。坐薬は、それ自体は既知の方法により、本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを、体温で融解するが室温では固化しているカカオバター、カーボンワックス、ポリエチレングリコールのような賦形剤と混合し、成形することにより製剤化することができる。
【００２５】
注射による投与としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内等に投与することができる。これらの注射用製剤は、それ自体は既知の方法により、本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを、植物性油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、プロピレングリコールのような水性又は非水性の溶媒中に溶解、懸濁又は乳化し、さらに、所望により、可溶化剤、浸透圧調節剤、乳化剤、安定剤および保存料のような従来用いられている添加剤と共に製剤化することができる。
【００２６】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを溶液、懸濁液、シロップ、エリキシル等の形態にするためには、注射用滅菌水や規定生理食塩水のような薬学的に許容される溶媒を用いることができる。
【００２７】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンは、薬学的に許容される他の活性を有する化合物と併用して薬学的製剤とすることもできる。
【００２８】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤は、投与形態、投与経路、対象とする疾病の程度や段階等に応じて適宜設定、調節することができる。
【００２９】
一例を挙げると、経口投与する場合は、ルシデン酸Ｏ又はルシデン酸ラクトンを１〜100mg/kg体重/日、注射剤として投与する場合は、ルシデン酸Ｏ又はルシデン酸ラクトンを1〜50mg/kg体重/日、直腸投与する場合は、ルシデン酸Ｏ又はルシデン酸ラクトンを1〜50mg/kg体重/日に設定することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明のルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンを医薬として用いる場合、これら化合物の立体異性体、多形体、塩及び溶媒和物等も、医薬としての活性を喪失しない限りにおいて本発明の医薬を構成する活性物質として含まれる。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
＜実施例１＞
マンネンタケ子実体は、日本微生物化学株式会社より購入した。購入したマンネンタケ子実体は、群馬県で採取されたものであり、Forestry & Forest Products Res. Inst. (FFPRI)により、Ganoderma lucidumに属することが確認されたものである。
【００３３】
マンネンタケ子実体（１５０ｇ）を少量のアセトン中ですり潰し、その後５リットル（以下、リットルを「Ｌ」とも表記する。）のアセトンで３日間、室温で抽出した。続いて、アセトンを減圧下で留去し、茶色のワックス状の濃縮物を得た。この濃縮物を、酢酸エチル／蒸留水＝１／１（ｖ／ｖ）、ｐＨ７条件下で分配し、酢酸エチル層を得、酢酸エチルを減圧下で留去した。
【００３４】
この画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルＣ−２００、５．０×５０ｃｍ）に供し、酢酸エチル：メタノール：蒸留水＝５０：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）の混合液を用いて３ｍＬ／分の流速で溶出し、１フラクションあたり２０ｍＬずつ分取した。
【００３５】
以下の測定例３に記載する方法に準じた方法により各フラクションのＤＮＡ合成酵素βを阻害する活性を測定し、各フラクションを、活性を有する２つの大きな画分（画分Ａ及びＢ）に分け、それぞれ減圧下で濃縮した。
【００３６】
後に溶出した画分Ｂ（フラクションＮｏ．１０５〜１３４、減圧濃縮後：０．２ｇ）を更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルＣ−３００、２．０×５０ｃｍ）に供し、イソプロピルアルコール：メタノール：蒸留水＝５：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）にて溶出することにより精製し、本発明のルシデン酸Ｏを得た。
【００３７】
ワコーゲルＣ−２００によるクロマトグラフィーで先に溶出した画分Ａ（フラクションＮｏ．５４〜６０、減圧濃縮後：０．６ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルＣ−３００、２．０×３０ｃｍ）に更に供し、クロロホルム：メタノール：蒸留水＝５：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）の混合液にて溶出し、精製した。このクロマトグラフィーで先に溶出したフラクション（フラクションＮｏ．３５〜４１、１６．４ｍｇ）に本発明のルシデン酸ラクトンが得られた。なお、後に溶出したフラクション（フラクションＮｏ．４９〜５８）には、別のテルペノイド（セレビステロール、Biol. Pharm. Bull. 1999, 22, 111-116）が溶出したことを確認した。
【００３８】
上記実施例１で得られたルシデン酸Ｏ及びルシデン酸ラクトンについて、各種の物性値を測定した。
【００３９】
＜測定例１−１＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏ（非晶質固体、白色粉末）の旋光度を測定し、旋光度［α］_D ²³＝＋７１°（ｃ＝０．２、ＭｅＯＨ）を得た。
【００４０】
＜測定例１−２＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏを高分解能高速原子衝撃質量分析（ＨＲ−ＦＡＢＭＳ）に供した。
【００４１】
得られたスペクトルより、ＨＲ−ＦＡＢＭＳｍ／ｚ４７５．２７１２（Ｍ−Ｈ）が得られた。この結果から、この物質の分子式はＣ₂₇Ｈ₄₀Ｏ₇であることが示された。
【００４２】
＜測定例１−３＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏを以下に示す薄層クロマトグラフィーに付し、Ｒf値：０．４９を得た。
【００４３】
吸着剤：シリカゲルプレート(Kieselgel 60F₂₅₄ メルク社製）
展開溶媒：イソプロパノール：メタノール：水＝５：１：０．５
＜測定例１−４＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏの紫外部吸収特性を測定し、λmax（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ε）：２５３（７４９０）を得た。
【００４４】
＜測定例１−５＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏについて、溶媒としてＣＤ₃ＯＤ、内部標準にＴＭＳを用い、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００４５】
得られたスペクトルから以下のデータを得た。
【００４６】
¹H NMR (600MHz in CD₃OD): δ 4.96 及び 4.95 (各々 1H, br. s, H-19), 4.81 (lH, dd, J=9.8, 7.3Hz, H-16), 4.62 (lH, dd, J=9.8, 7.3Hz, H-7), 3.60 (1H, dd, J=11.7, 4.9Hz, H-3α), 3.52 及び 3.31 (各々 1H, d, J=11.2Hz, H-24), 2.91 (1H, d, J=15,lHz, H-12α), 2.88 (1H, dd, J=9.3, 9.3Hz, H-14), 2.69 (lH, ddd, J= 13.7, 2.9, 2.9Hz, H-1β), 2.44 (2H, m, H-21), 2.34 (lH, m, H-15β), 2.26 (lH, d, J= 15.1 Hz, H-12β), 2.21 及び 2.31 (各々１H, m, H-20), 2.03 (lH, br. dd, J= 12.7, 7.3 Hz, H-60α), 1.70 (lH, m, H-15α), 1.69 (1H, m, H-2β), 1.62 (lH, m, H-2α), 1.57 (lH, ddd, J=12.7, 12.7, 9.8Hz, H-6β), 1.39 (lH, br． d, J= 12.7Hz, H-5), 1.31 (3H, s, H-27), 1.27 (3H, s, H-25), 0.94 (1H, m, H-1α), 0.79 (3H, s, H-26), 0.72 (3H, s, H-23)。
【００４７】
＜測定例１−６＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏについて、溶媒としてＣＤ₃ＯＤ、内部標準にＴＭＳを用い、¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００４８】
得られたスペクトルから以下のデータを得た。
【００４９】
¹³C NMR (125MHz in CD₃0D): δ 202.05 (C-1l), 177.40 (C-22), 161.32 (C-8), 148.35 (C-18), 142.89 (C-9), 111.34 (C-19), 73.63 (C-16), 72.41 (C-3), 69.75 (C-7), 66.16 (C-24), 54.95 (C-17), 52.16 (C-12), 49.3 (C-14), 48.5 (C-13), 43.40 (C-4), 42,67 (C-5), 39.58 (C-10), 35.52 (C-1), 33.69 (C-15), 34.32 (C-21), 33.55 (C-20), 27.97 (C-2), 12.91 (C-23), 28.52 (C-6), 20.18 (C-25), 20.13 (C-27), 19.37 (C-26)。
【００５０】
＜測定例２−１＞
実施例１で得られたルシデン酸ラクトン（非晶質固体、白色粉末）の旋光度を測定し、［α］_D ²⁴＝＋１３°（Ｃ＝０．１、ＭｅＯＨ）を得た。
【００５１】
＜測定例２−２＞
上記実施例１で得られたルシデン酸ラクトンを高分解能高速原子衝撃質量分析（ＨＲ−ＦＡＢＭＳ）に供した。
【００５２】
得られたスペクトルより、ＨＲ−ＦＡＢＭＳｍ／ｚ４７７．２８１０（Ｍ＋Ｈ）が得られ、この物質の分子式がＣ₂₇Ｈ₄₀Ｏ₇であることが示された。
【００５３】
＜測定例２−３＞
実施例１で得られたルシデン酸ラクトンを、以下に示す薄層クロマトグラフィーに付し、Ｒf値０．４０を得た。
【００５４】
吸着剤：シリカゲルプレート(Kieselgel 60F₂₅₄ メルク社製)
展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水＝５：１：０．５。
【００５５】
＜測定例２−４＞
実施例１で得られたルシデン酸ラクトンの紫外部吸収特性を測定し、λmax（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ε）：２５５（６０５０）を得た。
【００５６】
＜測定例２−５＞
実施例１で得られたルシデン酸ラクトンについて、溶媒としてＣＤＣｌ₃、内部標準にＴＭＳを用い、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００５７】
得られたスペクトルから以下のデータを得た。
【００５８】
¹H NMR (600MHz in CDCl₃): δ 4.87 (1H, dd, J=9.3, 7.3 Hz, H-16), 4.54 (lH, dd, 9.8, 7.3 Hz, H-7), 3.58 (2H, s, H-19), 3.15 (lH, dd, J=11.7, 4.4Hz, H-3), 2.94 (1H, d, J=15.1 Hz, H-12α), 2.74 (lH, ddd, J=18.1, 11.2, 8.8 Hz, H-21), 2.73 (1H, d, J= 15.1 Hz, H-1β), 2.64 (1H, dd, J= 11.0, 7.8 Hz, H-14), 2.55 (lH, ddd, J= 18.l, l0.7, 3.4 Hz, H-21), 2.39 (lH, d. J=15.1 Hz, H-12β), 2.34 (lH, ddd, J= 13.2, l0.7, 8.8Hz, H-20). 2.20 (lH, ddd, J= 13.2, 11.2, 3.4Hz, H-20), 2.20 (lH, ddd, J= 14.2, 9.3, 7.8 Hz, H-15β), 2.12 (lH, ddd, J= 12.7, 7.3, 1.0 Hz, H-6α), 1.77 (lH, ddd, J= 14.2, 11.0, 7.3 Hz, H-15), 1.65 (lH, m, H-2α), 1.60 (1H, dd, 12.7, 11.7, 9.8Hz, H-6β), 1.58 (1H, m, H-2β), 1.28 (3H, s, H-27), 1.24 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-24), 0.98 (3H, s, H-26), 0.96 (lH, m, H-1α), 0.94 (lH, dd, 11.7, 1.0Hz, H-5), 0.83 (3H, s, H-23)。
【００５９】
＜測定例２−６＞
実施例１で得られたルシデン酸ラクトンについて、溶媒としてＣＤ₃ＯＤ、内部標準にＴＭＳを用い、¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００６０】
得られたスペクトルから以下のデータを得た。
【００６１】
¹³C NMR (125 MHz in CD₃0D): δ 201.49 (C-11), 160.93 (C-8), 143.02 (C-9), 93.41 (C-18), 79.55 (C-22), 78.91 (C-3), 72.77 (C-16), 70.01 (C-7), 68.37 (C-19), 53.09 (C-12), 50.43 (C-5), 55.05 (C-17), 47.95 (C-13), 47.55 (C-14), 39.76 (C-10), 39.68 (C-4), 35.90 (C-1), 30.82 (C-21), 32.07 (C-15), 29.02 (C-6), 28.35 (C-2), 16.35 (C-23), 28.68 (C-24), 27.30 (C-20), 20.62 (C-27), 19.64 (C-25)。
【００６２】
＜測定例３＞
実施例１で得られたルシデン酸Ｏについて、ＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害活性を試験した。
【００６３】
ＤＮＡ合成酵素αはウシ胸腺から常法により抽出精製した標品を使用した。ＤＮＡ合成酵素βはラット由来の該当遺伝子を通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み生産させた標品を使用した。ＨＩＶ由来逆転写酵素は市販（Worthington Biochemical 社製）の標品を使用した。
【００６４】
これらのＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸ＩＶ、東京化学同人、第６３頁〜６６頁）を用いた。すなわち、ＤＭＳＯに溶解したルシデン酸、放射性同位元素で標識した［³Ｈ］−ｄＴＴＰ及びＤＮＡ鋳型分子を含む反応混液と共に、各酵素０．０５Ｕ（最終濃度）を３７℃で６０分間インキュベートした。反応後、ＤＮＡ鋳型分子に取り込まれた［³Ｈ］−ｄＴＴＰのみを液体シンチレーションカウンターで計測し、その値をＤＮＡ合成量とする。
【００６５】
阻害率は、（ａ）コントロールでの合成ＤＮＡ量、（ｂ）実施例１で調製したルシデン酸の存在下での合成ＤＮＡ量について、
｛（ａ−ｂ）／ａ｝×１００＝阻害率（％）
として評価した。
【００６６】
得られた結果を図１に示す。
【００６７】
図１に示した結果から、ルシデン酸Ｏの、ＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害には、濃度依存性があり、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は、それぞれ３５μＭ、７２μＭ及び６７μＭであった。
【００６８】
＜測定例４＞
実施例１で得られたルシデン酸ラクトンについて、上記測定例３と同様の方法でＤＮＡ合成酵素α、ＤＮＡ合成酵素β及びＨＩＶ由来逆転写酵素の阻害活性を試験した。
【００６９】
得られた結果を図２に示す。
【００７０】
図２に示した結果から、ルシデン酸ラクトンの、ＤＮＡ合成酵素α及びβ並びにＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害には、濃度依存性があり、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は、それぞれ４２μＭ、９９μＭ及び６９μＭであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のルシデン酸Ｏの酵素阻害活性を示すグラフ。
【図２】本発明のルシデン酸ラクトンの酵素阻害活性を示すグラフ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel terpenoid.
[0002]
[Prior art]
The DNA synthase group of higher organisms is an essential element for maintaining the homeostasis of organisms because it is fundamentally involved in cell division and differentiation in vivo. Six types of DNA synthases, α, β, γ, δ, ε, and ζ, are known in the group of DNA synthases possessed by higher organisms. It is clear from the proof in vitro.
[0003]
For example, it is said that DNA synthases α and δ are involved in nuclear DNA replication, DNA synthase γ is involved in mitochondrial DNA replication, and DNA synthase ζ is involved in repair. In addition, it has been suggested that the DNA synthases β and ε are also involved in DNA repair, but these enzymes are also said to be deeply involved in recombination of DNA strands. Here, “recombination” refers to recombination of DNA in one cell, and is different from “recombination” in genetic engineering in which DNA encoding a specific protein is incorporated into E. coli or the like.
[0004]
In order to study the physiological activity of these DNA synthetases, substances that selectively inhibit each enzyme are useful. For example, dideoxy TTP is known as a compound that selectively inhibits DNA synthase β (Tersa et al., Annual Review of Biochemistry 1991 60 513-552). However, dideoxy TTP is highly toxic in vivo and no marked physiological activity has been observed.
[0005]
On the other hand, HIV-derived reverse transcriptase among the enzymes of the DNA synthase group is an enzyme that plays a central role during HIV infection, as is well known. Inhibition of HIV-derived reverse transcriptase can have a therapeutic effect on HIV, for example, by already marketed clinical drugs such as azidothymidine (Nippon Pharmaceutical Information Center, Pharma Co., Ltd.) Published by Hobosha, "1996 edition of Japan Pharmaceutical Collection", page 599). However, it is difficult to cope with easily mutated HIV with only existing drugs such as azidothymidine, and development of a new inhibitor for HIV-derived reverse transcriptase is desired.
[0006]
In addition, many DNA synthase inhibitors including dideoxy TTP and azidothymidine are analogs of DNA in structure, and show antagonistic inhibition in the DNA synthesis reaction. While antagonistic inhibitors have good inhibition rates, they have the disadvantage that they can be incorporated into other various DNA metabolizing enzymes and cause side effects on living bodies.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a novel physiologically active substance that exhibits a high inhibitory action on DNA synthase α and β and HIV-derived reverse transcriptase in a non-antagonistic manner among the DNA synthase group, and a pharmaceutical using the activity. Objective.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that specific terpenoids extracted from basidiomycetes have strong inhibitory activity against DNA synthases α and β and HIV-derived reverse transcriptase, and completed the present invention. These terpenoids are novel substances.
[0009]
That is, the present invention
(1) Novel terpenoids 1 and 2 having the structural formula shown below,
[Chemical 2]

[0010]
(2) a DNA synthase α inhibitor comprising as an active ingredient at least one of the terpenoids 1 and 2 according to (1),
(3) a DNA synthase β inhibitor comprising at least one of the terpenoids 1 and 2 according to (1) as an active ingredient, and (4) at least one of the terpenoids 1 and 2 according to (1) as an active ingredient An HIV-derived reverse transcriptase inhibitor is provided.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The terpenoid 1 (hereinafter also referred to as “lucidene acid O”) and terpenoid 2 (hereinafter also referred to as “lucidic acid lactone”) of the present invention will be described in detail.
[0012]
Lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention can be extracted from the basidiomycete fungus (basidiomycete, Ganoderma lucidum) as follows.
[0013]
Mannentake fruit bodies are ground in a small amount of acetone and then extracted with acetone. Subsequently, acetone is distilled off under reduced pressure to obtain a brown waxy concentrate. The concentrate is partitioned under conditions of ethyl acetate / distilled water = 1/1 (v / v), pH 7, to obtain an ethyl acetate layer, and the ethyl acetate is distilled off under reduced pressure. This fraction is subjected to silica gel column chromatography and eluted with a mixed solution of ethyl acetate: methanol: distilled water = 50: 1: 0.1 (v / v / v). Among the obtained fractions, fractions A and B that inhibit the activity of a DNA synthase, for example, DNA synthase β, are collected and concentrated under reduced pressure.
[0014]
The fraction B obtained later is subjected to silica gel column chromatography and eluted with isopropyl alcohol: methanol: distilled water = 5: 1: 0.1 (v / v / v), whereby the lucidic acid O of the present invention is obtained. can get.
[0015]
On the other hand, the fraction A obtained earlier is subjected to silica gel column chromatography and eluted with a mixed solution of chloroform: methanol: distilled water = 5: 1: 0.1 (v / v / v). The lucidic acid lactone of the present invention is obtained.
[0016]
Mannintake used as a raw material is commercially available, and can be obtained from, for example, Nippon Microbiological Co., Ltd.
[0017]
The method for producing lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention is not limited to the above extraction method, and the extraction solvent, column chromatography, elution solvent, and other conditions to be used can be appropriately changed.
[0018]
As shown in the following examples, lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention have strong inhibitory activity against DNA synthases α and β and HIV-derived reverse transcriptase. The present invention relates to a drug utilizing these inhibitory activities, specifically, a DNA synthase α inhibitor, a DNA synthase β inhibitor, and HIV-derived containing at least one of lucidic acid O and lucidic acid lactone as an active ingredient A reverse transcriptase inhibitor is also provided.
[0019]
Lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention can be administered, for example, orally or parenterally. Lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention can be made into a pharmaceutical preparation by combining with an appropriate pharmaceutically acceptable excipient or diluent according to the administration route.
[0020]
Dosage forms suitable for oral administration include those in a solid, semi-solid, liquid or gas state. Specifically, tablets, capsules, powders, granules, solutions, suspensions, Examples include syrups and elixirs, but are not limited thereto.
[0021]
In order to formulate the lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention into tablets, capsules, powders, granules, solutions, suspensions, etc., a method known per se is used. It is performed by mixing lucidic acid O and lucidic acid lactone with a binder, tablet disintegrating agent, lubricant, etc., and further mixing with a diluent, buffering agent, wetting agent, preservative, flavoring agent, etc. as necessary. Can do. For example, the binder includes crystalline cellulose, cellulose derivatives, corn starch, gelatin, etc., the tablet disintegrating agent includes corn starch, potato starch, sodium carboxymethyl cellulose, etc., and the lubricant includes talc, magnesium stearate, etc. In addition, conventionally used additives such as lactose and mannitol can be used.
[0022]
In addition, the lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention are in the form of a liquid, fine powder, together with a gas or liquid spray, or optionally with a known auxiliary agent such as an infiltrating agent. It can also be filled in non-pressurized containers such as aerosol containers and nebulizers and administered in the form of aerosols or inhalants. As the propellant, a pressurized gas such as dichlorofluoromethane, propane, or nitrogen can be used.
[0023]
When the lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention are administered parenterally, they can be administered, for example, by rectal administration or injection.
[0024]
For rectal administration, for example, it can be administered as a suppository. The suppository is mixed in a known manner with the excipients such as cocoa butter, carbon wax, polyethylene glycol, which melts lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention at body temperature but solidifies at room temperature. And can be formulated by molding.
[0025]
Administration by injection can be administered subcutaneously, intradermally, intravenously, intramuscularly or the like. These injectable preparations are prepared in a manner known per se from lucidic acid O and lucidic acid lactone according to the present invention in an aqueous or non-aqueous form such as vegetable oils, synthetic fatty acid glycerides, esters of higher fatty acids, propylene glycol. It can be dissolved, suspended or emulsified in a solvent, and optionally formulated with conventionally used additives such as solubilizers, osmotic pressure regulators, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
[0026]
A pharmaceutically acceptable solvent such as sterilized water for injection or normal physiological saline is used to form lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention into a solution, suspension, syrup, elixir or the like. be able to.
[0027]
Lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention can be used in combination with other pharmaceutically acceptable compounds to prepare pharmaceutical preparations.
[0028]
The DNA synthase α and β and the HIV-derived reverse transcriptase inhibitor containing lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention as active ingredients depend on the dosage form, administration route, the degree and stage of the target disease, etc. It can be set and adjusted as appropriate.
[0029]
For example, lucidic acid O or lucidic acid lactone is 1 to 100 mg / kg body weight / day when administered orally, and lucidic acid O or lucidic acid lactone is 1 to 50 mg / kg body weight when administered as an injection. When administered rectally / day, lucidic acid O or lucidic acid lactone can be set to 1 to 50 mg / kg body weight / day, but is not limited thereto.
[0030]
When the lucidic acid O and lucidic acid lactone of the present invention are used as pharmaceuticals, the stereoisomers, polymorphs, salts and solvates of these compounds also constitute the pharmaceuticals of the present invention as long as they do not lose their pharmaceutical activity. Included as an active substance.
[0031]
【Example】
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
[0032]
<Example 1>
Mannentake fruiting bodies were purchased from Nippon Microbial Chemicals. The purchased fruit body of Mannentake was collected in Gunma Prefecture and confirmed to belong to Ganoderma lucidum by Forestry & Forest Products Res. Inst. (FFPRI).
[0033]
Mann bamboo fruit bodies (150 g) were ground in a small amount of acetone, and then extracted with 5 liters of acetone (hereinafter referred to as “L”) for 3 days at room temperature. Subsequently, acetone was distilled off under reduced pressure to obtain a brown waxy concentrate. This concentrate was partitioned under conditions of ethyl acetate / distilled water = 1/1 (v / v), pH 7, to obtain an ethyl acetate layer, and the ethyl acetate was distilled off under reduced pressure.
[0034]
This fraction was subjected to silica gel column chromatography (Wakogel C-200, 5.0 × 50 cm), and a mixed solution of ethyl acetate: methanol: distilled water = 50: 1: 0.1 (v / v / v) was obtained. And eluted at a flow rate of 3 mL / min, and fractioned by 20 mL per fraction.
[0035]
The activity of inhibiting DNA synthase β in each fraction was measured by a method according to the method described in Measurement Example 3 below, and each fraction was divided into two large fractions having an activity (fractions A and B). And concentrated under reduced pressure, respectively.
[0036]
The fraction B (fraction No. 105 to 134, after concentration under reduced pressure: 0.2 g) eluted later was further subjected to silica gel column chromatography (Wakogel C-300, 2.0 × 50 cm), and isopropyl alcohol: methanol: distilled. Purification was carried out by eluting with water = 5: 1: 0.1 (v / v / v) to obtain lucidene acid O of the present invention.
[0037]
Fraction A (fraction No. 54-60, after concentration under reduced pressure: 0.6 g) previously eluted by chromatography with Wakogel C-200 was further applied to silica gel column chromatography (Wakogel C-300, 2.0 × 30 cm). And purified by eluting with a mixed solution of chloroform: methanol: distilled water = 5: 1: 0.1 (v / v / v). The lucidic acid lactone of the present invention was obtained in the fractions eluted earlier in this chromatography (fractions No. 35 to 41, 16.4 mg). In addition, it was confirmed that another terpenoid (Celebisterol, Biol. Pharm. Bull. 1999, 22, 111-116) was eluted in the fraction eluted later (fraction Nos. 49 to 58).
[0038]
Various physical properties of the lucidic acid O and lucidic acid lactone obtained in Example 1 were measured.
[0039]
<Measurement Example 1-1>
The optical rotation of lucidene acid O (amorphous solid, white powder) obtained in Example 1 was measured to obtain the optical rotation [α] _D ²³ = + 71 ° (c = 0.2, MeOH).
[0040]
<Measurement Example 1-2>
Lucidic acid O obtained in Example 1 was subjected to high resolution fast atom bombardment mass spectrometry (HR-FABMS).
[0041]
From the obtained spectrum, HR-FABMS m / z 475.2712 (M-H) was obtained. This result indicated that the molecular formula of this substance was C ₂₇ H ₄₀ O ₇ .
[0042]
<Measurement Example 1-3>
The lucidene acid O obtained in Example 1 was subjected to the thin layer chromatography shown below to obtain an Rf value of 0.49.
[0043]
Adsorbent: Silica gel plate (Kieselgel 60F ₂₅₄ Merck)
Developing solvent: isopropanol: methanol: water = 5: 1: 0.5
<Measurement Example 1-4>
The ultraviolet absorption characteristics of lucidenoic acid O obtained in Example 1 were measured to obtain λmax (MeOH) nm (ε): 253 (7490).
[0044]
<Measurement Example 1-5>
About the lucidene acid O obtained in Example 1, ¹ H-NMR spectrum was measured using CD ₃ OD as a solvent and TMS as an internal standard.
[0045]
The following data was obtained from the obtained spectrum.
[0046]
¹ H NMR (600MHz in CD ₃ OD): δ 4.96 and 4.95 (1H, br.s, H-19), 4.81 (lH, dd, J = 9.8, 7.3Hz, H-16), 4.62 (lH, dd, J = 9.8, 7.3Hz, H-7), 3.60 (1H, dd, J = 11.7, 4.9Hz, H-3α), 3.52 and 3.31 (1H, d, J = 11.2Hz, H-24, respectively) , 2.91 (1H, d, J = 15, lHz, H-12α), 2.88 (1H, dd, J = 9.3, 9.3Hz, H-14), 2.69 (lH, ddd, J = 13.7, 2.9, 2.9Hz , H-1β), 2.44 (2H, m, H-21), 2.34 (lH, m, H-15β), 2.26 (lH, d, J = 15.1 Hz, H-12β), 2.21 and 2.31 (each 1H , m, H-20), 2.03 (lH, br.dd, J = 12.7, 7.3 Hz, H-60α), 1.70 (lH, m, H-15α), 1.69 (1H, m, H-2β), 1.62 (lH, m, H-2α), 1.57 (lH, ddd, J = 12.7, 12.7, 9.8Hz, H-6β), 1.39 (lH, br. D, J = 12.7Hz, H-5), 1.31 (3H, s, H-27), 1.27 (3H, s, H-25), 0.94 (1H, m, H-1α), 0.79 (3H, s, H-26), 0.72 (3H, s, H -twenty three).
[0047]
<Measurement Example 1-6>
The lucidic acid O obtained in Example 1 was measured for ¹³ C-NMR spectrum using CD ₃ OD as a solvent and TMS as an internal standard.
[0048]
The following data was obtained from the obtained spectrum.
[0049]
¹³ C NMR (125 MHz in CD ₃ 0D): δ 202.05 (C-1l), 177.40 (C-22), 161.32 (C-8), 148.35 (C-18), 142.89 (C-9), 111.34 (C -19), 73.63 (C-16), 72.41 (C-3), 69.75 (C-7), 66.16 (C-24), 54.95 (C-17), 52.16 (C-12), 49.3 (C- 14), 48.5 (C-13), 43.40 (C-4), 42,67 (C-5), 39.58 (C-10), 35.52 (C-1), 33.69 (C-15), 34.32 (C -21), 33.55 (C-20), 27.97 (C-2), 12.91 (C-23), 28.52 (C-6), 20.18 (C-25), 20.13 (C-27), 19.37 (C- 26).
[0050]
<Measurement Example 2-1>
The optical rotation of the lucidic acid lactone (amorphous solid, white powder) obtained in Example 1 was measured to obtain [α] _D ²⁴ = + 13 ° (C = 0.1, MeOH).
[0051]
<Measurement Example 2-2>
The lucidic acid lactone obtained in Example 1 was subjected to high resolution fast atom bombardment mass spectrometry (HR-FABMS).
[0052]
From the obtained spectrum, HR-FABMS m / z 477.2810 (M + H) was obtained, and it was shown that the molecular formula of this substance was C ₂₇ H ₄₀ O ₇ .
[0053]
<Measurement Example 2-3>
The lucidic acid lactone obtained in Example 1 was subjected to the following thin layer chromatography to obtain an Rf value of 0.40.
[0054]
Adsorbent: Silica gel plate (Kieselgel 60F ₂₅₄ Merck)
Developing solvent: chloroform: methanol: water = 5: 1: 0.5.
[0055]
<Measurement Example 2-4>
The ultraviolet absorption characteristics of the lucidic acid lactone obtained in Example 1 were measured to obtain λmax (MeOH) nm (ε): 255 (6050).
[0056]
<Measurement Example 2-5>
The ¹ H-NMR spectrum of the lucidic acid lactone obtained in Example 1 was measured using CDCl ₃ as a solvent and TMS as an internal standard.
[0057]
The following data was obtained from the obtained spectrum.
[0058]
¹ H NMR (600MHz in CDCl ₃ ): δ 4.87 (1H, dd, J = 9.3, 7.3 Hz, H-16), 4.54 (lH, dd, 9.8, 7.3 Hz, H-7), 3.58 (2H, s , H-19), 3.15 (lH, dd, J = 11.7, 4.4Hz, H-3), 2.94 (1H, d, J = 15.1 Hz, H-12α), 2.74 (lH, ddd, J = 18.1, 11.2, 8.8 Hz, H-21), 2.73 (1H, d, J = 15.1 Hz, H-1β), 2.64 (1H, dd, J = 11.0, 7.8 Hz, H-14), 2.55 (lH, ddd, J = 18.l, l0.7, 3.4 Hz, H-21), 2.39 (lH, d. J = 15.1 Hz, H-12β), 2.34 (lH, ddd, J = 13.2, l0.7, 8.8Hz 2.20 (lH, ddd, J = 13.2, 11.2, 3.4Hz, H-20), 2.20 (lH, ddd, J = 14.2, 9.3, 7.8 Hz, H-15β), 2.12 (lH, ddd, J = 12.7, 7.3, 1.0 Hz, H-6α), 1.77 (lH, ddd, J = 14.2, 11.0, 7.3 Hz, H-15), 1.65 (lH, m, H-2α), 1.60 (1H , dd, 12.7, 11.7, 9.8Hz, H-6β), 1.58 (1H, m, H-2β), 1.28 (3H, s, H-27), 1.24 (3H, s, H-25), 1.01 ( 3H, s, H-24), 0.98 (3H, s, H-26), 0.96 (lH, m, H-1α), 0.94 (lH, dd, 11.7, 1.0Hz, H-5), 0.83 (3H , s, H-23).
[0059]
<Measurement Example 2-6>
About the lucidene acid lactone obtained in Example 1, ¹³ C-NMR spectrum was measured using CD ₃ OD as a solvent and TMS as an internal standard.
[0060]
The following data was obtained from the obtained spectrum.
[0061]
¹³ C NMR (125 MHz in CD ₃ 0D): δ 201.49 (C-11), 160.93 (C-8), 143.02 (C-9), 93.41 (C-18), 79.55 (C-22), 78.91 ( C-3), 72.77 (C-16), 70.01 (C-7), 68.37 (C-19), 53.09 (C-12), 50.43 (C-5), 55.05 (C-17), 47.95 (C -13), 47.55 (C-14), 39.76 (C-10), 39.68 (C-4), 35.90 (C-1), 30.82 (C-21), 32.07 (C-15), 29.02 (C- 6), 28.35 (C-2), 16.35 (C-23), 28.68 (C-24), 27.30 (C-20), 20.62 (C-27), 19.64 (C-25).
[0062]
<Measurement Example 3>
The lucidic acid O obtained in Example 1 was tested for inhibitory activity against DNA synthases α and β and HIV-derived reverse transcriptase.
[0063]
For DNA synthetase α, a sample extracted and purified from bovine thymus by a conventional method was used. As the DNA synthase β, a preparation obtained by incorporating a corresponding gene derived from rat into Escherichia coli by an ordinary genetic recombination method was used. A commercially available standard (manufactured by Worthington Biochemical) was used as the HIV-derived reverse transcriptase.
[0064]
In order to measure the inhibitory action on these DNA synthases, a general DNA synthase reaction system (edited by the Japanese Biochemical Society, Shinsei Chemistry Laboratory 2, Nucleic Acid IV, Tokyo Kagaku Dojin, pages 63-66) was used. . That is, 0.05 U (final concentration) of each enzyme was incubated at 37 ° C. for 60 minutes with a reaction mixture containing lucidic acid dissolved in DMSO, [ ³ H] -dTTP labeled with a radioisotope, and a DNA template molecule. After the reaction, only [ ³ H] -dTTP incorporated into the DNA template molecule is measured with a liquid scintillation counter, and the value is taken as the amount of DNA synthesis.
[0065]
The inhibition rate is (a) the amount of synthetic DNA in the control, (b) the amount of synthetic DNA in the presence of lucidene acid prepared in Example 1.
{(Ab) / a} × 100 = Inhibition rate (%)
As evaluated.
[0066]
The obtained results are shown in FIG.
[0067]
From the results shown in FIG. 1, the inhibition of lucidic acid O on DNA synthases α and β and HIV-derived reverse transcriptase is concentration-dependent, and the 50% inhibitory concentration (IC ₅₀ ) is 35 μM and 72 μM, respectively. And 67 μM.
[0068]
<Measurement Example 4>
The inhibitory activity of DNA synthase α, DNA synthase β and HIV-derived reverse transcriptase was tested for the lucidic acid lactone obtained in Example 1 in the same manner as in Measurement Example 3 above.
[0069]
The obtained results are shown in FIG.
[0070]
From the results shown in FIG. 2, the inhibition of lucidic acid lactone against DNA synthases α and β and HIV-derived reverse transcriptase is concentration-dependent, and the 50% inhibitory concentration (IC ₅₀ ) is 42 μM and 99 μM, respectively. And 69 μM.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the enzyme inhibitory activity of lucidic acid O of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing enzyme inhibitory activity of lucidic acid lactone of the present invention.

Claims

Novel terpenoids 1 and 2 having the structural formula shown below.

A DNA synthase α inhibitor comprising at least one of the terpenoids 1 and 2 according to claim 1 as an active ingredient.

A DNA synthetase β inhibitor comprising at least one of the terpenoids 1 and 2 according to claim 1 as an active ingredient.

An HIV-derived reverse transcriptase inhibitor comprising at least one of the terpenoids 1 and 2 according to claim 1 as an active ingredient.