JP4561478B2 - 多型検出方法、多型検出用キット - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ等の核酸における多型の検出方法および検出キット等に関する。

疾患の診断や、薬物代謝に関する個人差の検出、食品や環境モニタ等の目的で、ＤＮＡの変異や多型を検出する種々の方法が開発されている。

特定の標的ＤＮＡの塩基配列を検出する方法として、標的オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを担持する感知面を有するセンサーデバイスを用いる方法が提案されている（特許文献１を参照）。

また、多型の中でも、１塩基の置換により生じるいわゆる一塩基多型（single nucleotide polymorphism(s)；ＳＮＰ(s)）を検出する方法が数多く提案されている。一塩基多型は、特定の疾患への罹りやすさや薬物の代謝に関する個人差の原因となりうるものであり、感度および精度の高い検出方法が必要とされている。
特開２００２−５３１１００号公報

しかしながら、いわゆる一塩基多型を、プローブ分子と標的分子とがハイブリダイズした際に生じるミスマッチ（塩基配列が相補的でない部分に生じる不完全な結合）をモニタすることによって検出する方法は、高い感度を得るのが困難であり、再現性の良い結果を得るのは難しい。また、プローブ分子の合成はコストが高いという問題もある。

そこで、本発明は、試料である核酸中に、特定の多型（変異を含む）が存在するか否かを簡便な方法によって精度良く検出することができる技術を提供することを目的とする。

本発明の一態様の多型検出方法は、核酸における多型を検出する方法であって、前記核酸と、一端に電極結合部位が付加され、該核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされるプライマーと、電気化学的に活性な部分が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、電気化学的測定により、前記ポリメラーゼ連鎖反応における産物の前記電極結合部位と、電極とを結合させ、前記プライマーの伸長反応の有無を検出することによって、前記核酸における前記多型の有無を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、上記課題を解決するために、本発明に係る核酸における多型検出方法の第１の態様は、前記核酸と、一端に電極結合部位を有し、該核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングするプライマーと、電気化学的に活性な部分を有するデオキシヌクレオチド三リン酸と、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の前記電極結合部位と、電極とを結合させ、電気化学的測定により、前記プライマーの伸長反応の有無を検出することによって、前記核酸における前記多型の有無を検出する工程と、を含むことを特徴とする。

このような構成によれば、例えば、多型を有する核酸に対して相補的な塩基配列を有するプライマーを用いると、当該多型を有する核酸に対しては完全なアニーリングをし、ＰＣＲ法によりプライマーが伸長される。一方、多型を有しない核酸に対してはアニーリングが不完全となって、ＰＣＲ法を行ってもプライマーが伸長されない。従って、多型を含む可能性を有する領域にアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲ法を行えば、伸長反応の有無を検出することによって、多型の有無を知ることができる。

ここで、伸長反応の有無は、予めプライマーに電極結合部位を設けておくことによって、ＰＣＲ後にプライマーを電極表面に固定し、電気化学的測定によって行うことが可能である。この際、本発明に係る多型検出方法では、電気化学的に活性な部分を有するデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でＰＣＲ法を行うため、プライマーの伸長反応が起きれば、ＰＣＲ産物に電気化学的に活性な部分も取り込まれる。従って、プライマーが伸長されていれば、プライマーと電極との間を流れる電流が増加するので、この増加量を測定することによって、プライマーの伸長を高感度に検出することができる。

なお、電気化学的測定は、上記ＰＣＲ産物の電極結合部位と電極とを結合させる前と後で行って結果を比較してもよいし、結合させる間、継続的に測定を行うこともできる。

また、上記課題を解決するために、本発明に係る多型検出方法の第２の態様は、前記核酸と、該核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基を有するデオキシヌクレオチド三リン酸と、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の前記電極結合部位と、電極とを結合させる工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応産物に取り込まれたデオキシヌクレオチド三リン酸の前記官能基に、前記電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させる工程と、電気的測定により、前記プライマーの伸長反応の有無を検出することによって、前記核酸における前記多型の有無を検出する工程と、を含むことを特徴とする。

このような構成によっても、上記第一の態様と同様に、プライマーの伸長反応の有無を検出することによって、多型の有無を知ることができる。本態様に係る多型検出方法では、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基を有するデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でＰＣＲ法を行う。プライマーの伸長反応が起きれば、ＰＣＲ産物に上記官能基も取り込まれるので、電極結合部位を介してＰＣＲ産物を電極に結合させた後、当該ＰＣＲ産物に電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることができる。従って、プライマーが伸長されていれば、プライマーと電極との間を流れる電流量が増加するので、この増加量を測定することによって、プライマーの伸長を高感度に検出することができる。

本発明に係る多型検出方法で用いられる電気化学的に活性な部分は、例えば、当該部分と電極との間を流れる電流量を変化させるのに寄与する部分が挙げられ、このような部分としてはフェロセンまたはそれらの誘導体が好ましい。フェロセンの誘導体としては、例えば、１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フェロセンカルボキシアルデヒド等が挙げられる。

本発明の一態様におけるキットは、核酸における多型を検出するためのキットであって、電極基板と、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされる、その一端に電極結合部位が付加されたプライマーと、電気化学的に活性な部分が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、を含むことを特徴とする。
また、上記の本発明に係る態様は、核酸における多型を検出するためのキットであって、電極基板と、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、電気化学的に活性な部分を有するデオキシヌクレオチド三リン酸と、を含むキットをも提供する。

本発明の別の態様におけるキットは、核酸における多型を検出するためのキットであって、電極基板と、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされる、その一端に電極結合部位が付加されたプライマーと、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、前記官能基に結合可能な、前記物質と、を含むことを特徴とする。
さらに、上記の本発明に係る態様は、核酸における多型を検出するためのキットであって、電極基板と、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基を有するデオキシヌクレオチド三リン酸と、前記官能基に結合可能な、電気化学的に活性な部分を有する物質と、を含むキットをも提供する。

このような構成によれば、ユーザにおいて、上述した本発明に係る多型検出方法を、高感度に再現性良く行うことができる。

以下に、図面を参照して本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。
（第１の実施形態）
本実施形態では、試料中のＤＮＡにおける多型としてＳＮＰｓを検出する場合について説明する。
［電気化学的に活性な部分を有するデオキシヌクレオチド三リン酸］
まず、電気化学的に活性な部分を有するデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を合成する。本実施形態では、電気化学的に活性な部分として、電圧をかけた場合に電極との間を流れる電流値を増加させるフェロセンを例に挙げて説明する。電流の変化は、蛍光検出器等を必要とせず、高感度に検出することが可能である。

フェロセンをつけたｄＮＴＰｓの例を、下記式［１］〜［５］に示す。図中、ＲはＨまたはＯＨを示し、ｎは１〜６の整数を示す。式［１］〜［４］は、ｄＮＴＰの塩基にフェロセンを結合させた例であり（式［１］および［２］はフェロセン結合型ｄＴＴＰ、式［３］はフェロセン結合型ｄＣＴＰ、式［４］はフェロセン結合型ｄＡＴＰ）、式［５］は、糖部分にフェロセンを結合させた例であるが、結合の部位、方法はこれらに限定されない。

［ＰＣＲ工程］
次に、上述の方法に従って合成したｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲを行う。

ＳＮＰｓを検出するためには、まず、ＳＮＰが存在するかどうかを検出すべきゲノムＤＮＡと、上流プライマー及び下流プライマーからなる一対のプライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと、バッファーと、フェロセンを有するｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を含む試料溶液を調製する（詳細は下記参照）。この試料溶液に含まれる上流プライマー及び下流プライマーのいずれか１種類のプライマーの末端にはチオール基（電極結合部位）が付加されている。チオール基が付されたプライマーは、公知の方法またはそれに準ずる方法によって当業者であれば容易に作製することが可能であり、市販のものも使用することができる。プライマーは５〜２０塩基長が好ましい。また、ＰＣＲを二段階に行うと、より精度良くプライマーの伸長反応をコントロールできて好ましい。また、塩基とチオール基の間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのスペーサを導入したものも利用可能であり、このような構成によれば、伸長反応後のプライマーの吸着密度をより高めることが可能である。ＰＥＧを導入したプライマーとしては例えば、ＳＨ−（ＣＨ₂）₆−（ＣＯＯ）₆〜₈−核酸塩基といった構成のものを使用することができる。

なお、電極結合部位は、チオール基に限定されず、ジスルフィド基、モノスルフィド基アミノ基、ビオチン基等、特定の電極表面に対して、親和性を有する官能基であればよい。

電極は、金、銀、銅、白金などの金属、またはカーボン等の単一の材料からなる電極であってもよいし、複数の材料の混合物も利用可能である。電極を形成する方法としては、電気めっき法、無電解めっき法、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、等により形成することができる。電極結合部位と電極の組み合わせとしては、金属表面とチオール基やジスルフィド基、モノスルフィド基の組み合わせが適している。電極結合部位としてビオチン基を用いる場合は、電極表面にストレプトアビジンなどのタンパク質の層をあらかじめ形成しておく必要性がある。

電極表面に対してプライマーの電極結合部位が安定して一定量結合するために、電極の表面は清浄である必要性がある。このため、チオール基の吸着に用いられる電極は表面を有機溶剤で洗浄し、更に必要に応じて強酸で洗浄することによる分解除去、または紫外線により発生するオゾン等による分解除去、等の方法を用いて汚染を除去することで清浄な表面を得ることができる。

合成したｄＮＴＰを用いたＰＣＲ工程において、ｄＮＴＰは、すべてに電気化学的に活性な部分が結合されている必要はなく、検出可能な程度に電気化学的に活性な部分を有するｄＮＴＰが取り込まれればよい。従って、例えば、４種類のｄＮＴＰのうち１種類〜３種類に電気化学的に活性な部分を結合させておくこともできる。本実施形態では、便宜的に、上記式［３］に示すフェロセン結合型ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン５’−酸リン酸）のみを用いた場合を例にとって説明する。

以下の説明では、下流プライマーがハイブリダイズする領域に、多型を含む可能性を有する領域が含まれ、下流プライマーは、当該領域にＳＮＰが存在しない場合に完全なアニーリングするように設計されており、その末端にはチオール基が付加されているものとする。
＜試料溶液の組成＞
フェロセン結合ｄＡＴＰ （終濃度０．２ｍＭ）
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ （各終濃度０．２ｍＭ）
上流プライマー （終濃度１．０μＭ）
下流プライマー（２０塩基） （終濃度１．０μＭ）
１０×バッファー （終濃度１×バッファー）
Ｔａｑポリメラーゼ （終濃度２ｕｎｉｔ）
ゲノムＤＮＡ （終濃度０．１〜０．２μｇ）
試料溶液を調製した後、当該試料溶液を用いてＰＣＲ反応を行う。

図１は、ゲノムＤＮＡと各プライマーが相補的な場合（即ち、部位１０にＳＮＰが存在しない場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。ＰＣＲ反応を生じさせるためには、以下に示す３段階の温度変化をｎ（例えば３０〜３５）サイクル繰り返し実行する必要がある。具体的には、まず、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、第１段階（熱変性）の温度変化（例えば９４〜９６℃）によってＳＮＰが存在する可能性のある部位１０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０を得る。ここで、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０のうち、遺伝子情報を有するものをターゲットＤＮＡ１１０と呼び、遺伝子情報を有しないものを相補鎖ＤＮＡ１２０と呼ぶ。

なお、図１には、フェロセン結合型ｄＡＴＰの結合部位を説明するために、一本鎖ＤＮＡ１２０におけるチミジン「Ｔ」および、これに相補的な位置にくる一本鎖ＤＮＡ１１０におけるアデニン「Ａ」を示す。

次に、図１（Ｃ）に示すように、第２段階（アニーリング）の温度変化（例えば５５〜６０℃）によって上流プライマー１３０をターゲットＤＮＡ１１０に、末端にチオール基１５０が付加された下流プライマー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０に、それぞれアニーリングさせる。図示されたように、ゲノムＤＮＡ１００は、ＳＮＰを有しないため、いずれのプライマーも完全なアニーリングをする。

そして、図１（Ｄ）に示すように、第３段階（伸長反応）の温度変化（例えば７２〜７４℃）によって上流プライマー１３０、下流プライマー１４０は共に伸長される。このようなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、プライマーに挟まれたターゲットＤＮＡ１１０および相補鎖ＤＮＡ１２０の領域は、共に２ⁿ倍に増幅される。

そして、図示されたように、伸長されたプライマー１４０における、一本鎖ＤＮＡ１２０のチミジン「Ｔ」に対応する部位には、それと相補的な塩基を持つｄＮＴＰとして、フェロセン結合型ｄＡＴＰ１６０が結合される。従って、本実施形態では、伸長されたプライマー１４０には、フェロセン分子が３つ取り込まれることになる。

一方、図２は、部位１０にＳＮＰが存在する場合を説明するものである。

まず、図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、上記と同様、第１段階の温度変化によってＳＮＰが存在する可能性のある部位１０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、ターゲットＤＮＡ１１０、相補鎖ＤＮＡ１２０を得る。次に、図２（Ｃ）に示すように、第２段階の温度変化によって上流プライマー１２０はターゲットＤＮＡ１１０に、下流プライマー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０にそれぞれアニーリングさせる。しかしながら、下流プライマーと相補鎖ＤＮＡ１２０では、端部においてミスマッチ（具体的には、図２（Ｃ）に示す下流プライマー１４０の塩基「Ｇ」と相補鎖ＤＮＡ１２０の塩基「Ｔ」）が生じるため、アニーリングが不完全となる。

この結果、図２（Ｄ）に示すように、第３段階の温度変化によって上流プライマー１３０は伸長されるものの、下流プライマー１４０は伸長されない。このようなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０は２ⁿ倍に増幅される一方、相補鎖ＤＮＡ１２０は増幅されない。

以上の説明から明らかなように、試料となるゲノムＤＮＡにＳＮＰが存在する場合は、チオール基を有する下流プライマー１４０は伸長されず、ＳＮＰが存在しない場合は、下流プライマー１４０が伸長され、フェロセンが取り込まれる。従って、フェロセンの有無を検出することによって、チオール基を有するプライマーの鎖長を検出することができれば、ＳＮＰの有無を知ることができる。
［測定工程］
そこで、次に、下流プライマーのチオール基を、電極表面に結合させ、電気化学的測定を行う。以下図３は、図１に対応するＳＮＰが存在しない場合、図４は図２に対応するＳＮＰが存在する場合を示すものとする。

まず、ＳＮＰが存在しない場合について説明する。図３（Ａ）に示すように、下記組成の測定溶液１０ｍｌを調製した後、測定溶液に電極基板Ａ（本実施形態では、電極面積３ｍｍ程度の金電極基板）を５分程度浸漬させる。そして、図３（Ｂ）に示すように、測定溶液にＰＣＲ反応終了後の溶液を投入する。溶液中には、伸長された上流プライマー１３０と下流プライマー１４０が略同数含まれている。
＜測定溶液の組成＞
ＰＢＳ（ｐＨ７．０） （０．１Ｍ）
ＫＣｌ （０．１Ｍ）
そして、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように、電気化学的測定装置５０によりディファレンシャルパルスボルタンメトリー法またはサイクリックボルタンメトリー法等公知の電気化学的測定方法により、電極とプライマー間に印加し、プライマーと電極との間を流れる電流量を測定する。

図３（Ｃ）に示すように、電極Ａ表面には、チオール基１５０を介して伸長され、フェロセン結合型ｄＡＴＰ１６０を取り込んだプライマー１４０が結合するため、上記電流量は、顕著に増大する。この増大を検出することによって、プライマー１４０が伸長されたこと、およびＳＮＰが存在しなかったことが確認される。

一方、図４（Ｂ）に示すように、ＳＮＰが存在する場合、下流プライマー１４０は伸長されず、従ってフェロセン結合型ｄＡＴＰも取り込まれていない。上流プライマー１３０には、フェロセン結合型ｄＡＴＰが取り込まれる可能性はあるが、上流プライマー１３０は電極結合部位を有しないため、電極Ａ表面に捕捉されない。

このような核酸を含むＰＣＲ反応後の試料溶液を測定溶液に投入すると、図４（Ｃ）に示すように、伸長されていない下流プライマー１３０のみが電極Ａ表面にチオール基を介して結合する。ここで、電気化学的測定装置５０によりディファレンシャルパルスボルタンメトリー法またはサイクリックボルタンメトリー法等公知の電気化学的測定方法により、プライマー−電極間に印加し、プライマーと電極との間を流れる電流量を測定する。しかし、フェロセン分子が電極Ａ表面に存在しないため、電流量の増大はほとんど見られない。従って、この結果から、下流プライマー１３０が伸長されていないこと、およびＳＮＰが存在したことが確認される。

以上説明したように、上記方法によれば、電気化学的方法によって、フェロセン分子間を流れる電流量を測定することにより、プライマーが伸長されたかどうか、即ち、プライマーが試料ＤＮＡに完全なアニーリングをしたかどうかを検出することが可能となり、プライマーの配列から当該試料ＤＮＡにおけるＳＮＰの存否を確認することができる。

上述した第１の実施形態では、予め電気化学的に活性な部分としてフェロセンを結合したｄＮＴＰを用いてＰＣＲを行うことにより、伸長されたプライマーに当該フェロセンを取り込み、これを検出したが、電気化学的に活性な部分は、プライマー伸長反応後にプライマーに結合させてもよい。この場合は、ｄＮＴＰに、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基をつけておくことが好ましい。このような官能基としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基等が挙げられる。例えば、ｄＮＴＰにアミノアリル基を結合させておけば、ＰＣＲ産物であるＤＮＡにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を備える電気化学的に活性な分子を容易に結合させることが可能である。また、グルタルアルデヒド基をリンカーとして用いることで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、ＰＣＲ産物であるＤＮＡに結合させることができ、これによっても電気化学的に検出することが可能である。
（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態は、上述した本発明に係る多型検出方法に用いられるキットである。かかるキットには、例えば、電極基板と、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、電気化学的に活性な部分を有するデオキシヌクレオチド三リン酸と、が含まれる。あるいは、電極基板と、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基を有するデオキシヌクレオチド三リン酸と、前記官能基に結合可能な、電気化学的に活性な部分を有する物質と、を含むものであってもよい。

さらに、上記キットは、ＰＣＲ反応溶液に添加される試薬や、電気化学的測定に用いられる溶液を構成する試薬等を含んでいてもよい。

また、上記キットは、それぞれの構成要素がユーザにおいて使用しやすい量に分離されていることが好ましく、必要に応じて取扱説明書等が添付される。このようなキットによれば、ユーザにおいて、上述した本方法に係る多型検出方法を、簡易かつ好適に行うことができる。

本発明に係る多型検出法のためのＰＣＲ反応を説明する図である。 本発明に係る多型検出法のためのＰＣＲ反応を説明する図である。 本発明に係る多型検出法の電気化学的測定を示す説明図である。 本発明に係る多型検出法の電気化学的測定を示す説明図である。

符号の説明

１０…ＳＮＰ部位、１００…ゲノムＤＮＡ、１１０…ターゲットＤＮＡ、１２０…相補鎖ＤＮＡ、１３０，１４０…プライマー、１５０…電極結合部位、１６０…フェロセン結合型ｄＡＴＰ、５０…電気化学的測定装置

Claims (10)

1. 核酸における多型を検出する方法であって、
   前記核酸と、一端に電極結合部位が付加され、該核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされるプライマーと、電気化学的に活性な部分が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、
   電気化学的測定により、前記ポリメラーゼ連鎖反応における産物の前記電極結合部位と、電極とを結合させ、前記プライマーの伸長反応の有無を検出することによって、前記核酸における前記多型の有無を検出する工程と、を含む多型検出方法。
2. 核酸における多型を検出する方法であって、
   前記核酸と、該核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされ、その一端に電極結合部位が付加されたプライマーと、電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、
   前記ポリメラーゼ連鎖反応における産物に取り込まれたデオキシヌクレオチド三リン酸の前記官能基に、前記電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させる工程と、
   電気化学的測定により、前記ポリメラーゼ連鎖反応における産物の前記電極結合部位と、電極とを結合させ、前記プライマーの伸長反応の有無を検出することによって、前記核酸における前記多型の有無を検出する工程と、を含む多型検出方法。
3. 前記電気化学的に活性な部分が、フェロセンまたはその誘導体である、請求項１または２に記載の多型検出方法。
4. 前記電気化学的に活性な部分が、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド基を含む、請求項１または２に記載の多型検出方法。
5. 前記電気化学的に活性な部分が、西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、請求項１または２に記載の多型検出方法。
6. 前記電極結合部位が、チオール基またはジスルフィド基またはモノスルフィド基である、請求項１乃至５のいずれかに記載の多型検出方法。
7. 前記電極結合部位が、アミノ基またはビオチン基である、請求項１乃至５のいずれかに記載の多型検出方法。
8. 前記電気化学的測定が、サイクリックボルタンメトリー法またはディファレンシャルパルスボルタンメトリー法である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多型検出方法。
9. 核酸における多型を検出するためのキットであって、
   電極基板と、
   前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされる、その一端に電極結合部位が付加されたプライマーと、
   電気化学的に活性な部分が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、を含むキット。
10. 核酸における多型を検出するためのキットであって、
    電極基板と、
    前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングされる、その一端に電極結合部位が付加されたプライマーと、
    電気化学的に活性な部分を有する物質を結合させることが可能な官能基が結合したデオキシヌクレオチド三リン酸と、
    前記官能基に結合可能な、前記物質と、を含むキット。

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