JP4565702B2

JP4565702B2 - Detection kit for detecting nucleic acid sequences whose expression is enhanced in human neuroblastoma with good prognosis in comparison with human neuroblastoma with good prognosis and poor prognosis

Info

Publication number: JP4565702B2
Application number: JP2000140387A
Authority: JP
Inventors: 章中川原
Original assignee: Chiba Prefectural Government; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Current assignee: Chiba Prefectural Government; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: JP2001321175A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト神経芽細胞腫において発現する遺伝子に由来する核酸類に関する。さらに詳しくは、本発明は、予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されている遺伝子に由来する核酸およびその断片、並びにヒト神経芽細胞腫の予後の診断への用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
個々の腫瘍にはそれぞれの個性があり、発癌の基本的な原理は同じであっても、その生物学的特性は必ずしも同じではない。近年、癌の分子生物学や分子遺伝学が急速に進歩し、発癌やいわゆる腫瘍細胞のバイオロジーが遺伝子レベルで説明できるようになってきた。
【０００３】
（神経芽細胞腫）
神経芽細胞腫は、末梢交感神経系細胞に由来する交感神経節細胞と副腎髄質細胞に発生する小児癌である。この交感神経系細胞は、発生初期の神経堤細胞が腹側へ遊走し、いわいる交感神経節が形成される場所で分化成熟したものである。その一部の細胞は、さらに副腎部へ遊走し、先に形成されつつある副腎皮質を貫通して髄質部に達し、そこで髄質を形成する。神経堤細胞は、ほかの末梢神経細胞の起源ともなっており、後根神経節（知覚神経）、皮膚の色素細胞、甲状腺Ｃ細胞、肺細胞の一部、腸管神経節細胞などへ分化する。
【０００４】
（神経芽細胞腫の予後）
神経芽細胞腫は多彩な臨床像を示すことが特徴である（中川原：神経芽腫の発生とその分子機構小児内科３０，１４３，１９９８）。例えば、１歳未満で発症する神経芽細胞腫は、非常に予後が良く、大部分が分化や細胞死を起こして自然退縮する。現在、広く実施されている生後６か月時の尿のマススクリーニングで陽性となる神経芽細胞腫の多くは、この自然退縮を起こしやすいものに属する。一方、１歳以上で発症する神経芽細胞腫は、悪性度が高く、多くの場合、患児を死に至らしめる。１歳以上の悪性度の高い神経芽細胞腫は、体細胞突然変異（Ｓｏｍａｔｉｃｍｕｔａｔｉｏｎ）が起こり、モノクローナルであるのに対し、自然退縮する神経芽細胞腫では、生殖細胞突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ）のみの遺伝子変異でとどまっているとの仮説もある。ＫｎｕｄｓｏｎＡＧ等：ＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａＩＶ-Ｓ：Ａｇｅｎｅｔｉｃｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３０２，１２５４（１９８０）を参照。
【０００５】
（神経芽細胞腫の予後診断を可能にする腫瘍マーカー）
最近の分子生物学的研究の進展により、神経成長因子（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の高親和性レセプターであるＴｒｋＡの発現が分化と細胞死の制御に深くかかわっていることが明らかとなってきた。ＮａｋａｇａｗａｒａＡ．，ＴｈｅＮＧＦｓｔｏｒｙａｎｄｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ＭｅｄＰｅｄｉａｔｒＯｎｃｏｌ，３１，１１３（１９９８）を参照。Ｔｒｋは膜貫通型レセプターでもあり、Ｔｒｋ−Ａ、Ｂ、Ｃの３つが主なものである。これらＴｒｋファミリー・レセプターは、中枢神経および末梢神経系において、特異的な神経細胞の分化と生存維持に重要な役割を果たしている。中川原等：神経芽細胞腫におけるニューロトロフィン受容体の発現と予後小児外科２９：４２５−４３２，１９９７を参照。ところで、腫瘍細胞の生存や分化は、ＴｒｋチロシンキナーゼやＲｅｔチロシンキナーゼからのシグナルで制御されている。なかでも、ＴｒｋＡレセプターの役割は最も重要で、予後良好な神経芽細胞腫ではＴｒｋＡの発現が著しく高く、これからのシグナルが腫瘍細胞の生存・分化、または細胞死（アポトーシス）を強く制御している。一方、予後不良な神経芽細胞腫では、ＴｒｋＡの発現が著しく抑えられており、これに代わってＴｒｋＢ或いはＲｅｔからのシグナルが生存の促進という形で腫瘍の進展を助長している。
【０００６】
また、神経の癌遺伝子であるＮ-ｍｙｃの増幅が神経芽細胞腫の予後に関連していることも明らかになってきた。中川原：脳・神経腫瘍の多段階発癌，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，３６４，３６６（１９９９）を参照。この遺伝子は神経芽細胞腫で初めてクローニングされたが、正常細胞や予後良好な神経芽細胞腫では通常１倍体当たり１つしか存在しないのに対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅されているのが見つかった。このようにＮ−ｍｙｃの増幅は、腫瘍の進行度に深く関係している。
【０００７】
しかしながら、現在までに、神経芽細胞腫に発現されている癌遺伝子は、Ｎ−ｍｙｃ以外知られておらず、その予後の良不良に関する遺伝子情報に関しても、Ｎ−ｍｙｃとＴｒＫＡ以外はほとんど知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、神経芽細胞腫において発現する遺伝子の情報を明らかにし、さらに予後の良不良に関係する前記遺伝子の情報をも明らかにし、それらの遺伝子情報に基づいて、神経芽細胞腫の予後の良不良に関する診断を可能とすることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記目的に従い、鋭意研究を重ねた結果、ヒト神経芽細胞腫の予後を検定し、予後良好および予後不良の臨床組織の各々からｃＤＮＡライブラリーを作製することに成功した。これらの２種類のｃＤＮＡライブラリーから各々約２４００クローンをクローニングし、神経芽細胞腫の予後の良悪によって分類した。
【００１０】
また、本発明者は、前記クローニングされた遺伝子の部分または全長をシークエンシングし、さらにホモロジー検索を行って、適当な遺伝子を選出した。
【００１１】
さらに、本発明者は、上記のように分類した遺伝子群を前記選出した遺伝子に着目して比較すると、かなりの数の遺伝子において、神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強していることを見いだした。
【００１２】
かかる知見に基づき、本発明者は、ヒト神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強している遺伝子を検出およびクローニングするための遺伝子情報（核酸配列情報等）を提供することを可能とした。さらに、前記核酸配列情報に基づき、予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカーを設計することを可能とし、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、下記１〜８に記載の核酸または核酸断片を提供する。さらに、本発明は、下記９〜１１に記載の該核酸または核酸断片の用途を提供する。
【００１４】
１．ヒト神経芽細胞腫において発現する遺伝子に由来する核酸であって、配列表の配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列からなる群より選ばれる１つの配列からなることを特徴とする核酸、またはそれに相補的な核酸。
【００１５】
２．前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記１に記載の核酸。
【００１６】
３．予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されている遺伝子に由来し、配列表の配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列からなる群より選ばれる１つの配列からなることを特徴とする核酸、またはそれに相補的な核酸。
【００１７】
４．前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記３に記載の核酸。
【００１８】
５．上記１〜４のいずれか１つに記載の核酸の断片。
【００１９】
６．上記１〜４のいずれか１つに記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、単離された核酸。
【００２０】
７．前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記６に記載の単離された核酸。
【００２１】
８．上記７に記載の核酸からなることを特徴とするＰＣＲプライマー。
【００２２】
９．上記３に記載の核酸をヒト神経芽細胞腫の臨床組織から検出することを特徴とする、ヒト神経芽細胞腫の予後の診断方法。
【００２３】
１０．上記８に記載のＰＣＲプライマーの一組を含むことを特徴とするヒト神経芽細胞腫の予後の診断用キット。
【００２４】
従って、上記の好ましい核酸は、予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫でのみ発現が増強されている遺伝子に由来するものであり、該核酸の配列に関する情報はヒト神経芽細胞腫の予後の診断を可能にすることを特徴とする。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るヒト神経芽細胞腫に発現する遺伝子（以下、「本発明に係る遺伝子」という）に由来する核酸およびそれに関連する核酸断片について（以下、「本発明の核酸」および「本発明の核酸断片」というが、特に核酸とその断片を区別して、記載する必要のないとき、それらを集合的に「本発明の核酸」ともいう）、本発明の好適な実施の形態を参照して、詳細に説明する。
【００２６】
本発明の核酸は、上述のごとく本発明に係る遺伝子に由来するものであり、該遺伝子を構成するか或いは該遺伝子からインビボまたはインビトロの過程によって得られる。そこで、本明細書で使用する「核酸」という用語は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、或いはそれから誘導された活性なＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチドを指し、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。特に好ましい核酸は、本明細書中に開示されるヒトｃＤＮＡ配列と同一か、または相補的な配列を有する。
【００２７】
また、本明細書で使用する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸（または断片）が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ）」、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２および１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００２８】
より具体的には、前記「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃において６．０ｘＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃において２．０ｘＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２ｘＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることもできる。
【００２９】
また、本明細書で使用する「単離された核酸」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリヌクレオチドを指す。
【００３０】
また、本明細書で使用する「予後良好」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、これはＮ−ｍｙｃその他の腫瘍マーカー（ＴｒｋＡ、染色体異常等）から判断して、悪性度が低いと医師によって判断される。本発明の好適な実施の形態では、病期１または２、発症年齢が１歳未満、手術後５年以上再発なく生存し、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められない症例を予後良好としたが、このような特定の例には限定されない。また、本明細書で使用する「予後不良」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められる状態を指し、これはＮ−ｍｙｃその他の腫瘍マーカーから判断して、悪性度が高いと医師によって判断される。本発明の好適な実施の形態では、病期４、発症年齢が１歳以上、手術後３年以内に死亡、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められた症例を予後不良としたが、このような特定の例には限定されない。
【００３１】
神経芽細胞腫は、ヒトでは２種類しか知られていない神経細胞そのものの腫瘍の１つであり、そこで発現している遺伝子を解析することは、神経細胞のバイオロジーを理解する上で非常に有用な知見をもたらすものと考えられる。すなわち、脳や末梢神経から、部位特異的な均質な組織を得ることは極めて困難で、事実上不可能である。一方、神経芽細胞腫は、末梢交感神経細胞に由来するほぼ均一な神経細胞集団（腫瘍化してはいるが）から成り、均質に発現している神経関連遺伝子が得られる可能性が高い。また、神経芽細胞腫は癌であるため、神経発生の未熟な段階で発現している重要な遺伝子が多いことも特徴として挙げられる。
【００３２】
さらに、神経芽細胞腫は、予後の良好なものと予後の不良なものとが臨床的、生物学的にはっきり区別される。予後良好な神経芽細胞腫の癌細胞は、増殖速度が極めて遅く、ある時点から自然退縮を始めることが特徴である。これまでの知見から、この自然退縮では、神経細胞の分化およびアポトーシス（神経細胞死）が起こっており、正常神経細胞の成熟段階で起こる分化とプログラム細胞死と非常によく似た現象であることが分かってきた。従って、この腫瘍で発現している遺伝子を解析することによって、神経の分化やアポトーシスに関連した重要な遺伝子情報を入手できる可能性が極めて高い。
【００３３】
予後不良な神経芽細胞腫は、明らかに悪性増殖を続ける癌細胞からなる腫瘍である。従って、神経細胞の増殖に関連した重要な遺伝子や、未分化な神経細胞で発現している遺伝子が多数存在する可能性が高い。すなわち、予後良好な神経芽細胞腫で発現している遺伝子のプロファイルとは全く異なる遺伝子情報を入手できる可能性が極めて高い。
【００３４】
一般的に神経細胞は、他の臓器由来の細胞と比較して、発現している遺伝子の種類が多いと言われている。神経芽細胞腫の細胞株（セルライン）は、予後不良の臨床組織由来であり、腫瘍化に伴い遺伝子発現のプロファイルが正常神経細胞と大きく変化しているものと考えられる。
【００３５】
また、神経芽細胞腫は小児由来の腫瘍であることが１つの特徴であり、後天的な因子の影響が非常に少ない可能性が高く、癌発生のメカニズムの解析とともに発生学的な情報を入手できる可能性が高いことも予想される。さらに驚くべきことには、本発明の核酸の中に、ある特定の細胞周期にのみ発現が増強する遺伝子に由来する核酸が含まれており、このことからも癌発生のメカニズムの解析および発生、分化に関する非常に有用な遺伝子情報を入手できる可能性が高いことが予想される。
【００３６】
上記のような特徴を有し、有用な遺伝子情報を入手できる遺伝子に由来する核酸である本発明の核酸は、ヒト神経芽細胞腫の臨床組織より得られ、配列表の配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列のうちのいずれか１つ、またはその核酸配列の一部を有する。
【００３７】
さらに、ヒト神経芽細胞腫の予後良好なものと、不良なものとの臨床組織における本発明に係る遺伝子の発現量を比較した結果、配列番号１ないし１０４に記載の各核酸配列に対応する遺伝子の全てにおいて非常に顕著な差が認められた。すなわち、これらの遺伝子は、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されていた。従って、配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列は、上記の有用な遺伝子情報以外に、それらの核酸配列のいずれかを有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出することによって神経芽細胞腫の良不良を診断する腫瘍マーカーの情報としても利用可能である。
【００３８】
すなわち、本発明は、ヒト神経芽細胞腫およびそれに関連する様々な遺伝子情報を以下の手段によりうることを可能とする。
【００３９】
（１）ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明の１つの実施の形態に従えば、本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用することによって、ヒト神経芽細胞腫で発現している遺伝子を検出することが可能である。さらに、本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用し、様々な腫瘍、正常組織における遺伝子発現を調べることによって、該遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
【００４０】
本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション法自身については、特に限定はない。好適な方法として、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレイ法、等が挙げられる。
【００４１】
前記ハイブリダイゼーションの１つの応用例として、本発明の核酸またはその断片をノザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い、検定したい試料中においてｍＲＮＡの長さを測定することや、遺伝子発現を定量的に検出することが可能である。
【００４２】
また別の応用例として、本発明の核酸またはその断片をサザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い、検定したい試料のゲノムＤＮＡ中、該ＤＮＡ配列の有無を検出することが可能である。
【００４３】
さらに別の応用例として、本発明の核酸またはその断片をＦＩＳＨ法のプローブとして用い、遺伝子の染色体上の位置を同定することも可能である。
【００４４】
さらに別の応用例として、本発明の核酸またはその断片をＩＳＨ法のプローブとして用い、遺伝子の発現の組織分布を同定することも可能である。
【００４５】
本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する場合、少なくとも４０個の核酸残基長が必要であり、本発明の核酸またはその断片のうち、４０個以上の連続した残基があるものが好ましく用いられる。さらに好ましくは、６０個以上の残基を有するものが用いられる。
【００４６】
当業者にとって、上記各種のハイブリダイゼーションにおける核酸プローブ技法は周知であり、例えば、個々の長さの本発明に係る核酸プローブと、目的とするポリヌクレオチドとの適当なハイブリダイズ条件は容易に決定することができる。種々の長さを含むプローブに対し至適なハイブリダイズ条件を得るためのかかる操作は、当業者では周知であり、例えばサンブルックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（前掲）を参照して、行えばよい。
【００４７】
好ましくは、本発明に係るプローブは、容易に検出されるように標識される。
検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによって検出され得るいかなる種類、元素または化合物であってもよい。通常使用される検出可能な標識としては、放射性同位元素、アビジンまたはビオチン、蛍光物質（ＦＩＴＣまたはローダミン等）が挙げられる。前記放射性同位元素は、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、³Ｈ、³⁵Ｓ等である。また、ビオチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、化学的または酵素的手段によって、核酸に組み込むことができる。ビオチン標識されたプローブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光標識、酵素、金コロイド複合体等などの標識手段を使用したハイブリダイゼーションの後検出される。また、本発明に係るプローブは、タンパク質と結合させることによって標識されてもよい。その目的で、例えば放射性または蛍光ヒストン一本鎖結合タンパク質が使用される。
【００４８】
（２）ＰＣＲに用いるプライマー
目的遺伝子（例えば、本発明に係る遺伝子）を検出するには上記のハイブリダイゼーション法の他に、本発明の核酸またはその断片に含まれる任意の核酸（ＤＮＡ）配列をプライマーとして、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を用いることにより可能である。例えば、検定したい臨床組織試料からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は、当業者にとって周知の方法に従って行われるが、例えば、サンブルックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（前掲）、および遺伝子病入門（高久史麿著：南江堂）が参照される。
【００４９】
本発明の核酸またはその断片をＰＣＲ用プライマーとして使用する場合、１０ないし６０個の核酸残基長が必要であり、本発明の核酸またはその断片のうち、１０ないし６０個の連続した残基があるものが好ましく用いられる。さらに好ましくは、１５ないし３０個の残基を有するものが用いられる。また一般的には、プライマー配列中のＧＣ含量が４０ないし６０％のものが好ましい。さらに、増幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差がないことが望まれる。また、プライマーの３’末端でアニールせず、プライマー内で２次構造をとらないことも望ましい。
【００５０】
（３）遺伝子のスクリーニング
本発明の核酸またはその断片を使用することによって、様々な組織や細胞で発現している目的遺伝子の発現分布を検出することが可能である。これは例えば、本発明の核酸またはその断片を上記のようにハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用することによって、可能となる。
【００５１】
また、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を用いても目的遺伝子の発現分布を検出することが可能である。すなわち、本発明の核酸またはその断片を直接、前記チップ、アレイ上に張り付けことが出来る。そこに被検体試料から抽出したｍＲＮＡを蛍光物質などで標識し、ハイブリダイズさせ、遺伝子がどの様な組織の細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは、本発明の核酸またはその断片をプローブとして用いたＰＣＲの反応産物であってもよい。
【００５２】
（４）遺伝子のクローニング
本発明の核酸またはその断片を使用することによってヒト神経芽細胞腫において発現している遺伝子をクローニングすることが可能である。例えば、本発明の核酸またはその断片をノザンハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションのプローブ、或いはＰＣＲのプライマーとして使用し、本発明の核酸またはその断片を含む遺伝子をクローニングすることが可能である。このようなクローニングの対象となる遺伝子としては、特に予後良好な神経芽細胞腫と予後不良な神経芽細胞腫との間で発現量に差がある遺伝子、他の組織や癌細胞での発現様式とは異なって発現している遺伝子、細胞周期依存的に発現している遺伝子、神経分化に伴って誘導される遺伝子、癌遺伝子または癌抑制遺伝子によって発現が制御される遺伝子等が挙げられる。クローニングは、通常の遺伝子組換え技術に従い、本発明の核酸（ＤＮＡ）またはその断片を適当なプラスミド、バクテリオファージに組み込み、発現ベクターを構築し、これを宿主細胞に導入して形質転換（導入）し、形質転換体を培養することによって行われる。かかる個々の操作は、例えば、サンブルックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（前掲）その他、周知の文献に詳述されている。
【００５３】
（５）腫瘍の予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカー
上述のように本発明の核酸に関連する遺伝子は、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されていた。そこで、本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブ或いはＰＣＲのプライマーとして使用し、被験者から採取した、臨床組織を含む試料中で、前記遺伝子の発現の増強の有無を調べることにより予後の同定が行える。遺伝子の検出方法としては、前述のノーザンブロットハイブリダイゼーション法、インサイチュハイブリダイゼーション法、およびＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。
【００５４】
ハイブリダイゼーション法を用いるとき、試料中で前記プローブとハイブリダイズする核酸の量が増強する場合、予後が良好であると診断できる。また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いるとき、試料からｍＲＮＡを抽出し、これをＤＮＡに逆転写して、前記プライマーにより増幅し、遺伝子発現を半定量的に測定する。このようにして遺伝子発現の増強が認められる場合、予後が良好であると診断できる。この特定の診断目的のためには、該プライマーを必須成分として一組含有する診断用キットを用いることが好ましい。該診断用キットは、プライマー成分以外に、ＰＣＲ用の緩衝液、洗浄液、および酵素等の公知の成分を含む。
【００５５】
（６）アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の別の実施の形態に従えば、本発明の核酸に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の核酸にハイブリダイズすることが可能であり、アンチセンスＤＮＡとアンチセンスＲＮＡとを含む。アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を阻害し、アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然型であれば自動合成機を使用して、または本発明の核酸を鋳型とするＰＣＲ法により合成できる。さらに、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的ＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性が高められたアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体をも包含する。このような誘導体は、公知のアンチセンス技術を用いて、合成することができる。
【００５６】
ｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、該ＲＮＡの合成を阻止することができ、特に遺伝子の発現抑制効果が高い。従って、本発明は、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを好適に包含する。
【００５７】
（７）遺伝子治療
本発明の別の実施の形態に従えば、遺伝子治療に用いられる治療用遺伝子をコードする核酸配列が提供される。そこで、本発明の核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子（本発明に係る遺伝子）を発現させ、例えば癌の遺伝子治療に用いることができる。
【００５８】
１．ベクター
導入されうるウイルスベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであってもよい。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウイルスの核酸配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（ＶｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる［ＮａｌｄｉｎｉＬ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２２６３−（１９９６）］。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。さらに遺伝子導入系としてはエレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能である。
【００５９】
２．発現プロモーター
さらに、治療用遺伝子に用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなくいかなるものでも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【００６０】
以下、本発明により見いだされた予後良好なヒト神経芽細胞腫において発現が増強する遺伝子群について、実施例に即してさらに詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例に限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】
（製造例１）ヒト神経芽細胞腫からのｃＤＮＡライブラリーの構築
１．試料入手
ヒト神経芽細胞腫の臨床組織試料を手術摘出直後に準無菌的に凍結し、その後−８０℃に保存した。
【００６２】
２．予後良好な試料の選別
１で得られた試料について予後の検定を以下の指標をもとに行った。
予後良好：予後不良：
・病期１または２・病期４
・発症年齢が１歳未満・発症年齢が１歳以上・手術後５年以上再発なく生存・手術後３年以内に死亡
・Ｎ-ｍｙｃの増幅なし・Ｎ-ｍｙｃ増幅あり
上記２つの試料において、Ｎ-ｍｙｃ増幅は下記のようにして確認した。
【００６３】
上記１で得られた試料を剃刀で細かく切断し、５ｍｌのＴＥＮバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣＬ（ｐＨ＝８．０）／１ｍＭＥＤＴＡ／１００ｍＭＮａＣｌ）を加えよくホモジナイズした。この混合液に７５０μｌのＳＤＳ（１０％）、１２５μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、軽く混和し、５０℃で８時間放置した。その後、フェノール・クロロホルム処理を行い、最後にエタノール沈殿により、ゲノムＤＮＡを精製した。５μｇの得られたゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社製）で完全に消化し、Ｎ-ｍｙｃのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションによりＮ-ｍｙｃ増幅を調べた。
【００６４】
３．予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織からｍＲＮＡの調製
上記２において予後良好であると判定されたヒト神経芽細胞腫の臨床組織２〜３ｇをＴｏｔａｌＲＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＧＥＮ社製）用いて処理し、トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースカラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社製）を用いて、ｐｏｌｙＡ構造を有するｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６５】
４．ｍＲＮＡの脱リン酸化
上記３において調製した１００〜２００μｇのｍＲＮＡのプールを６７．３μｌの０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を含む蒸留滅菌水に溶解させ、２０μｌの５＊ＢＡＰバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５００ｍＭ、ｐＨ＝７．０）／メルカプトエタノール（５０ｍＭ）］、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、１０μｌのＢＡＰ（０．２５ｕｎｉｔ／μｌ、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を３７℃で１時間反応させ、ｍＲＮＡの５’末端の脱リン酸化処理を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理を２回行い、最後にエタノール沈殿により、脱リン酸化ｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６６】
５．脱リン酸化ｍＲＮＡの脱キャップ処理
上記４において調製した脱リン酸化ｍＲＮＡのプールの全量を７５．３μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に溶解させ、２０μｌの５＊ＴＡＰバッファー［酢酸ナトリウム（２５０ｍＭ、ｐＨ＝５．５）／メルカプトエタノール（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ、ｐＨ＝８．０））、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏａｃｉｄｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：２０ｕｎｉｔ／μｌ）］を加えた。この混合液を３７℃で１時間反応させ、脱リン酸化ｍＲＮＡの５’末端の脱キャップ処理を行った。この際、キャップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化ｍＲＮＡは脱キャップ処理されず５’末端は脱リン酸化された状態に留まる。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により、脱キャップｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６７】
６．オリゴキャップｍＲＮＡの調製
上記５において調製した脱キャップｍＲＮＡのプールの全量を１１μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に溶解させ、４μｌの５’−オリゴＲＮＡ（５’−ＡＧＣＡＵＣＧＡＧＵＣＧＧＣＣＵＵＧＧＣＣＵＡＣＵＧＧ−３’：１００ｎｇ／μｌ）、１０μｌの１０＊ｌｉｇａｔｉｏｎバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５００ｍＭ、ｐＨ＝７．０）／メルカプトエタノール（１００ｍＭ）］、１０μｌの塩化マグネシウム（５０ｍＭ）、２．５μｌのＡＴＰ（２４ｍＭ）、２．５μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、１０μｌのＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔ／μｌ：宝酒造社製）、５０μｌのポリエチレングリコール（５０％ｗ／ｖ、ＰＥＧ８０００：シグマ社製）を加えた。この混合液を２０℃で３時間反応させ、脱キャップｍＲＮＡの５’末端に５’−オリゴＲＮＡを連結した。この際、キャップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化ｍＲＮＡは、５’−オリゴＲＮＡが連結されない。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により、オリゴキャップｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６８】
７．オリゴキャップｍＲＮＡからのＤＮＡ除去
上記６において調製したオリゴキャップｍＲＮＡのプールを７０．３μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に溶解させ、４μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ＝７．０）、５．０μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１６μｌの塩化マグネシウム（５０ｍＭ）、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＤＮａｓｅＩ（５ｕｎｉｔ／μｌ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を３７℃で１０分間反応させ、余分なＤＮＡを分解した。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿、カラム精製（Ｓ−４００ＨＲ：ファルマシアバイオテック社製）により、ＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６９】
８．１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの調製
上記７において調製したＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテックオリエンタル社製キット）を用いて逆転写し、１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのプールを得た。ＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールを２１μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、１０μｌの１０＊ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄバッファー（キット付属品）、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ（５ｍＭ、キット付属品）、６μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ、キット付属品）、２．５μｌのオリゴーｄＴアダプタープライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ、５’−ＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＧＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）、２．０μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴａｓｅ（キット付属品）を加えた。この混合液を４２℃で３時間反応させ、逆転写反応を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理、アルカリ処理、中和処理にて全てのＲＮＡを分解し、エタノール沈殿で精製した。
【００７０】
９．２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの調製
上記８において調製した１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのプールをＧｅｎｅＡｍｐ（パーキンエルマー社製キット）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのプールを５２．４μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、３０μｌの３．３＊Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー（キット付属品）、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ（２．５ｍＭ、キット付属品）、４．４μｌの酢酸マグネシウム（２５ｍＭ、キット付属品）、１．６μｌのプライマーＦ（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５’−ＡＧＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧ−３’）、１．６μｌのプライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５’−ＧＣＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＧＴ−３’）、２μｌのｒＴｔｈ（キット付属品）を加えた。この混合液に、１００μｌのミネラルオイルを静かに加え重層した。この反応液を９４℃で５分間変性させた後、９４℃、１分間・５２℃、１分間・７２℃、１０分間を１サイクルとして１２サイクル繰り返し、さらに７２℃で１０分間放置しＰＣＲ反応を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製し、２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのプールを得た。
【００７１】
１０．２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのＳｆｉＩ処理
上記９において調製した２ｎｄｓｔｒａｎｄｃＤＮＡのプールを８７μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、１０×ＮＥＢバッファー（ＮＥＢ社製）、１００＊ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＮＥＢ社製）、２μｌのＳｆｉＩ（制限酵素、２０ｕｎｉｔ／μｌ、ＮＥＢ社製）を加えた。この混合液を５０℃で一晩反応させ、ＳｆｉＩによる制限酵素処理を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製し、両末端がＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのプールを得た。
【００７２】
１１．ＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのサイズ分画
上記１０において調製したＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのプールを１％のアガロースゲルで電気泳動し、２ｋｂ以上の分画をＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて精製した。精製したｃＤＮＡのプールは１００μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、３７℃で６時間放置した。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製し、長鎖ｃＤＮＡのプールを得た。
【００７３】
１２．ｃＤＮＡライブラリー
上記１１において調製した長鎖ｃＤＮＡのプールをＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．１（宝酒造社製キット）を用いてクローニングベクターであるｐＭＥ１８Ｓ―ＦＬ３（東京大学医科学研究所菅野純夫教授より供与）にライゲーションを行った。長鎖ｃＤＮＡのプールを８μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、あらかじめ制限酵素ＤｒａＩＩＩで処理された１μｌのｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３、８０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＡ（キット付属品）、１０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（キット付属品）を加え、１６℃で３時間反応させた。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製しｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００７４】
（実施例２）大腸菌へのトランスフォーメーション
１．クローニング
実施例１の１２で調製したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＴＯＰ−１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトランスフォーメーションした。ｃＤＮＡライブラリーを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解し、ＴＯＰ−１０に混合した。その後、氷上にて３０分間、４０℃で１分間、氷上で５分間インキュベートした。５００μｌのＳＯＢ培地を加え、３７℃で６０分間振盪培養した。アンピシリンを含む寒天培地上に適量づつ播種し、３７℃で一昼夜培養して、大腸菌クローンを得た。
【００７５】
２．大腸菌クローンの保存（グリセロールストックの調製）
上記１において得られた寒天培地上の大腸菌クローンを、爪楊枝にて拾い上げ、９６穴プレートに準備した１２０μｌのＬＢ培地中に懸濁させた。この９６穴プレートを３７℃で一晩静置し大腸菌の培養を行った。その後６０％グリセロール溶液を７２μｌ加え、−２０℃で保存した（グリセロールストック）。
【００７６】
（実施例３）核酸配列決定
１．プラスミドの調製
実施例２の２で調製した１０μｌのグリセロールストックを１５ｍｌの遠心チューブに移し、３ｍｌのＬＢ培地、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加え、３７℃で一晩振盪し、大腸菌の培養を行った。その後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出、精製した。
【００７７】
２．両末端シークエンスの解析
上記１において調製したプラスミドＤＮＡをＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡＢＩ社製キット）を用いて両末端のシークエンスを決定した。６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、８μｌのプレミックス（キット付属品）、３．２ｐｍｏｌのプライマーを混合し、滅菌蒸留水で合計２０μｌになるように調製した。この混合液を９６℃で２分間変性させた後、９６℃、１０秒間・５０℃、５秒間・６０℃、４分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返し反応を行った。その後エタノール沈殿で精製した。変性条件下でポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用いて配列決定を行った。
【００７８】
（実施例４）データベースを用いたホモロジー検索
実施例３において両末端シークエンスを解析して得られた試料の核酸配列情報についてインターネットを介したＤＮＡ配列のホモロジー検索を行った。検索にはＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）のＢＬＡＳＴを用いた。
【００７９】
（実施例５）半定量的ＰＣＲによる予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の比較
実施例４において得られた、遺伝子群の一部から得られた核酸の配列に基づき、ＰＣＲプライマーを合成し、ヒト神経芽細胞腫の予後良好・不良の臨床組織で発現量を比較定量した。実施例１〜３に示した方法（ＲＴ−ＰＣＲ）で前記ヒト神経芽細胞腫の臨床組織からｍＲＮＡを抽出し、ｒＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的には、５μｌの滅菌蒸留水、２μｌのｍＲＮＡ、１μｌの１０＊ｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間・５５℃、１５秒間・７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で６分間放置し、ＰＣＲ反応を行った。この反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、配列表の配列番号１〜１０４に記載する核酸配列に基づくＰＣＲプライマーにより増幅すると、予後良好なヒト神経芽細胞腫でのみ発現量が増強する遺伝子が確認された。実施例４に示すホモロジー検索の結果（１０４個の核酸配列のうち７３個がホモロジー無しであった。）を含め、配列番号１〜１０４に記載する核酸配列および核酸の情報を表１〜２に示す。
【００８０】
また、半定量的ＰＣＲによる予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の測定結果の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１０６、ｎｂｌａ−００２１９、ｎｂｌａ−０３１４５について）を図１〜３に示す。
【００８１】
【表１】

【表２】

【００８２】
（実施例６）半定量的ＰＣＲによる細胞周期依存的遺伝子発現量の測定
実施例４において得られた、遺伝子群の一部から得られた核酸の配列に基づき、ＰＣＲプライマーを合成し、ＨｅＬａ細胞を用いて、細胞周期特異的な遺伝子発現量を比較定量した。ＨｅＬａ細胞はそれぞれ以下のように処理を行った。
【００８３】
（１）無処理
（２）４００μＭのｍｉｍｏｓｉｎｅで１８時間処理し、６５％の細胞がＧ１期の状態
（３）２ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅで２０時間処理し、１００％の細胞がＳ期の状態
（４）０．６μｇ／ｍｌのＮｏｃｏｄａｚｏｌｅで１８時間処理し、８５％の細胞がＧ２／Ｍ期の状態
以上４種類のＨｅＬａ細胞から実施例１〜３に示した方法でｍＲＮＡを抽出し、ｒＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。５μｌの滅菌蒸留水、２μｌのｍＲＮＡ、１μｌの１０×ｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間・５５℃、１５秒間・７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で６分間放置しＰＣＲ反応を行った。この反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、配列表の配列番号１〜１０４に記載する核酸配列に基づくＰＣＲプライマーにより増幅すると、そのうち３１の核酸配列において遺伝子発現が細胞周期に特異的であることを見い出した。電気泳動の結果の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１００について）を図４に示す。また、このようにして見出された細胞周期特異性と個別の核酸配列の一覧を表１〜２に示した。
【００８４】
【発明の効果】
本発明の核酸は、神経芽細胞腫において発現する遺伝子の情報を明らかにする。
【００８５】
本発明の核酸またはその断片は、プローブ或いはプライマーとして、各種ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法に使用でき、前記遺伝子の他組織、細胞での発現の検出や、その構造および機能の解析を可能とする。また、該遺伝子がコードするヒト蛋白の遺伝子工学的製造も可能となる。
【００８６】
また、本発明の核酸は、予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫とを比較したとき、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されている遺伝子に由来する核酸であり、従って、これらの核酸に基づく遺伝子情報により神経芽細胞腫の予後の診断が可能となる。該遺伝子は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子が予後不良因子であるのに対して、ＴｒｋＡ遺伝子と同様に予後良好因子と見なされるので、神経芽細胞腫の悪性度および抗癌剤に対しての感受性の指標（腫瘍マーカー）となり得る。
【００８７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量を半定量的ＰＣＲで調べた結果、予後良好なヒト神経芽細胞腫での発現の増強が認められた遺伝子の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１０６からの結果）を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜１６は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。一方、レーン１７〜３２は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。
【図２】予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量を半定量的ＰＣＲで調べた結果、予後良好なヒト神経芽細胞腫での発現の増強が認められた遺伝子の別の例（核酸配列ｎｂｌａ−００２１９からの結果）を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜１６は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。一方、レーン１７〜３２は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。
【図３】予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量を半定量的ＰＣＲで調べた結果、予後良好なヒト神経芽細胞腫での発現の増強が認められた遺伝子のさらに別の例（核酸配列ｎｂｌａ−０３１４５からの結果）を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜１６は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。一方、レーン１７〜３２は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。
【図４】細胞周期特異的な遺伝子発現を半定量的ＰＣＲで調べた結果、該発現が認められた遺伝子の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１００からの結果）を示す電気泳動写真である。
図中、レーン１は、無処理ＨｅＬａ細胞（６０〜７０％コンフルエント）である。レーン２は、４００μＭのｍｉｍｏｓｉｎｅで１８時間処理し、６５％がＧ１期の状態のＨｅＬａ細胞である。レーン３は、２ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅで２０時間処理し、１００％がＳ期の状態のＨｅＬａ細胞である。レーン４は、０．６μｇ／ｍｌのＮｏｃｏｄａｚｏｌｅで１８時間処理し、８５％がＧ２／Ｍ期の状態のＨｅＬａ細胞である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to nucleic acids derived from genes expressed in human neuroblastoma. More specifically, the present invention is derived from a gene whose expression is enhanced in a human neuroblastoma with a good prognosis in comparison with a human neuroblastoma with a good prognosis and a human neuroblastoma with a poor prognosis. The present invention relates to nucleic acids and fragments thereof, and uses for prognosis diagnosis of human neuroblastoma.
[0002]
[Prior art]
Each tumor has its own personality, and even though the basic principles of carcinogenesis are the same, their biological properties are not necessarily the same. In recent years, molecular biology and molecular genetics of cancer have progressed rapidly, and the biology of carcinogenesis and so-called tumor cells can be explained at the gene level.
[0003]
(Neuroblastoma)
Neuroblastoma is a childhood cancer that develops in sympathetic ganglion cells and adrenal medullary cells derived from peripheral sympathetic nervous system cells. The sympathetic nervous system cells are differentiated and matured at the place where the so-called neural crest cells migrate to the ventral side and so-called sympathetic ganglia are formed. Some of the cells migrate to the adrenal gland, penetrate the adrenal cortex that is being formed, and reach the medulla where it forms the medulla. Neural crest cells are the origin of other peripheral nerve cells, and differentiate into dorsal root ganglia (sensory nerves), skin pigment cells, thyroid C cells, part of lung cells, intestinal ganglion cells, and the like.
[0004]
(Prognosis of neuroblastoma)
Neuroblastoma is characterized by a variety of clinical features (Nakagawara: Neuroblastoma development and its molecular mechanism, Pediatric Internal Medicine 30, 143, 1998). For example, neuroblastoma that develops before the age of 1 year has a very good prognosis, and most of them undergo spontaneous regression due to differentiation and cell death. Currently, many neuroblastomas that are positive in mass screening of urine at the age of 6 months, which are widely practiced, belong to those that are prone to spontaneous regression. On the other hand, neuroblastoma that develops at the age of 1 year or older is highly malignant and often causes the child to die. High-grade neuroblastoma of 1 year or older has somatic mutation and is monoclonal, whereas in spontaneously regressing neuroblastoma, only germline mutation There is also a hypothesis that it remains in the gene mutation. Knudson AG et al .: Regression of neuroblastoma IV-S: A genetic hypothesis. See N Engl JMed 302, 1254 (1980).
[0005]
(Tumor marker that enables prognosis of neuroblastoma)
Recent progress in molecular biological research has revealed that the expression of TrkA, a high affinity receptor for nerve growth factor (NGF), is deeply involved in the regulation of differentiation and cell death. . Nakagawara A.I. , The NGF story and neuroblastoma, Med Pediatr Oncol, 31, 113 (1998). Trk is also a transmembrane receptor, and Trk-A, B, and C are mainly three. These Trk family receptors play an important role in specific neuronal differentiation and survival in the central and peripheral nervous systems. Nakagawara et al .: Neurotrophin receptor expression and prognosis in neuroblastoma. See Pediatric Surgery 29: 425-432, 1997. By the way, the survival and differentiation of tumor cells are controlled by signals from Trk tyrosine kinase and Ret tyrosine kinase. Among them, the role of the TrkA receptor is the most important, and the expression of TrkA is remarkably high in neuroblastoma with good prognosis, and the signal from this strongly controls the survival / differentiation of tumor cells or cell death (apoptosis) . On the other hand, in neuroblastoma with a poor prognosis, the expression of TrkA is remarkably suppressed, and instead, signals from TrkB or Ret promote tumor progression in the form of promoting survival.
[0006]
It has also been clarified that the amplification of N-myc, a neuronal oncogene, is associated with the prognosis of neuroblastoma. Nakagawara: See Multistage Carcinogenesis of Brain and Neuronal Tumors, Molecular Medicine, 364, 366 (1999). This gene was first cloned in neuroblastoma, but usually only one per haploid in normal cells and neuroblastomas with good prognosis, whereas dozens of neuroblastomas with poor prognosis. It was found that it was doubled. Thus, N-myc amplification is closely related to tumor progression.
[0007]
However, to date, no oncogenes expressed in neuroblastoma are known except for N-myc, and the genetic information regarding the prognosis is poor except for N-myc and TrKA. It wasn't.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such circumstances, reveals information on genes expressed in neuroblastoma, further reveals information on the genes related to prognostic good / bad, and information on those genes Based on the above, it is an object to enable diagnosis of neuroblastoma prognosis.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in accordance with the above-mentioned objectives, the present inventors have succeeded in examining the prognosis of human neuroblastoma and producing a cDNA library from each of clinical tissues with good prognosis and poor prognosis. About 2400 clones were cloned from each of these two cDNA libraries and classified according to the prognostic quality of neuroblastoma.
[0010]
In addition, the present inventor sequenced a part or the entire length of the cloned gene, and further performed a homology search to select an appropriate gene.
[0011]
Furthermore, when comparing the gene groups classified as described above, focusing on the selected genes, the present inventors increased the expression of only a significant number of genes only in clinical tissues with good prognosis of neuroblastoma. I found out.
[0012]
Based on this finding, the present inventor provides gene information (such as nucleic acid sequence information) for detecting and cloning a gene whose expression is enhanced only in a clinical tissue with a favorable prognosis of human neuroblastoma. It was possible. Furthermore, based on the nucleic acid sequence information, it became possible to design a prognostic identification method and a tumor marker that can be used therefor, thereby completing the present invention.
[0013]
That is, the present invention provides the nucleic acid or nucleic acid fragment described in 1 to 8 below. Furthermore, this invention provides the use of this nucleic acid or nucleic acid fragment as described in the following 9-11.
[0014]
1. A nucleic acid derived from a gene expressed in a human neuroblastoma, wherein the nucleic acid comprises one sequence selected from the group consisting of the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 104 in the sequence listing; or Complementary nucleic acid.
[0015]
2. 2. The nucleic acid according to 1 above, wherein the nucleic acid is DNA.
[0016]
3. In comparison between human neuroblastoma with good prognosis and human neuroblastoma with poor prognosis, it is derived from a gene whose expression is enhanced in human neuroblastoma with good prognosis. 104. A nucleic acid comprising one sequence selected from the group consisting of the nucleic acid sequence according to 104, or a nucleic acid complementary thereto.
[0017]
4). 4. The nucleic acid according to 3 above, wherein the nucleic acid is DNA.
[0018]
5). 5. The nucleic acid fragment according to any one of 1 to 4 above.
[0019]
6). An isolated nucleic acid, which hybridizes with the nucleic acid according to any one of 1 to 4 under stringent conditions.
[0020]
7). 7. The isolated nucleic acid according to 6 above, wherein the nucleic acid is DNA.
[0021]
8). 8. A PCR primer comprising the nucleic acid according to 7 above.
[0022]
9. 4. A method for diagnosing the prognosis of human neuroblastoma, comprising detecting the nucleic acid according to 3 above from clinical tissue of human neuroblastoma.
[0023]
10. 9. A diagnostic kit for prognosis of human neuroblastoma comprising the PCR primer set according to 8 above.
[0024]
Therefore, the above preferred nucleic acid is derived from a gene whose expression is enhanced only in human neuroblastoma with good prognosis in comparison with human neuroblastoma with good prognosis and human neuroblastoma with poor prognosis. The information regarding the sequence of the nucleic acid is characterized by enabling prognosis of human neuroblastoma.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, a nucleic acid derived from a gene expressed in a human neuroblastoma according to the present invention (hereinafter referred to as “the gene according to the present invention”) and a nucleic acid fragment related thereto (hereinafter referred to as “the nucleic acid of the present invention” and “the present invention”). The nucleic acid fragment of the invention "is referred to as the" nucleic acid of the present invention "when it is not particularly necessary to distinguish between the nucleic acid and the fragment thereof, and refer to the preferred embodiment of the present invention. This will be described in detail.
[0026]
The nucleic acid of the present invention is derived from the gene according to the present invention as described above, and is obtained from the gene by the in vivo or in vitro process. Thus, the term “nucleic acid” as used herein refers to a polynucleotide that is, for example, DNA or RNA, or active DNA or RNA derived therefrom, and preferably means DNA or RNA. Particularly preferred nucleic acids have sequences that are identical or complementary to the human cDNA sequences disclosed herein.
[0027]
As used herein, the term “hybridizes under stringent conditions” refers to the expression of two nucleic acids (or fragments) by Sambrook et al. (Sambrook, J.) “Clone gene expression in E. coli ( Expression of cloned genes in E. coli), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.1.4-9. It means to hybridize with each other under hybridization conditions.
[0028]
More specifically, the “stringent conditions” refer to hybridization with 6.0 × SSC at about 45 ° C., followed by washing with 2.0 × SSC at 50 ° C. For the selection of stringency, the salt concentration in the washing step can be selected, for example, from about 2.0 × SSC, 50 ° C. as low stringency to about 0.2 × SSC, 50 ° C. as high stringency. Further, the temperature of the washing step can be increased from a low stringency condition of room temperature, about 22 ° C., to a high stringency condition of about 65 ° C.
[0029]
In addition, the term “isolated nucleic acid” as used herein is substantially free of cellular material and culture medium when prepared by recombinant DNA technology, and is precursor when chemically synthesized. A nucleic acid or polynucleotide that is substantially free of somatic or other chemicals.
[0030]
Also, as used herein, “good prognosis” refers to a condition in which a tumor exists locally or has become a regressed or benign sympathetic ganglion cell tumor among human neuroblastomas. Judging from N-myc and other tumor markers (TrkA, chromosomal abnormalities, etc.), the doctor determines that the malignancy is low. In a preferred embodiment of the present invention, patients with

stage

1 or 2, onset age less than 1 year, surviving without recurrence for more than 5 years after surgery, and no N-myc amplification in clinical tissues are observed. However, the present invention is not limited to such a specific example. As used herein, “poor prognosis” refers to a state in which progression of a tumor is observed among human neuroblastomas, which is judged by N-myc and other tumor markers and has a malignancy. It is judged by a doctor to be high. In a preferred embodiment of the present invention, the stage 4; the onset age is 1 year or older; the death occurred within 3 years after the operation; and the N-myc amplification was observed in the clinical tissue, the prognosis was poor. It is not limited to such a specific example.
[0031]
Neuroblastoma is one of the tumors of nerve cells that are known only in humans. Analyzing the genes expressed in them is very important for understanding the biology of neurons. It is thought to bring useful knowledge. That is, it is extremely difficult and practically impossible to obtain a site-specific homogeneous tissue from the brain or peripheral nerve. On the other hand, a neuroblastoma is composed of a substantially uniform population of nerve cells derived from peripheral sympathetic neurons (although it is tumorized), and there is a high possibility that a nerve-related gene that is expressed uniformly is obtained. In addition, since neuroblastoma is a cancer, there are many important genes expressed at an immature stage of neurogenesis.
[0032]
Furthermore, neuroblastoma is clearly distinguished clinically and biologically from a good prognosis to a poor prognosis. Neuroblastoma cancer cells with a good prognosis are characterized by a very slow growth rate and spontaneous regression starting at a certain point. Based on the findings so far, this spontaneous regression involves neuronal differentiation and apoptosis (neuronal cell death), a phenomenon very similar to the differentiation and programmed cell death that occurs during normal neuronal maturation. I understand. Therefore, it is highly possible that important gene information related to neural differentiation and apoptosis can be obtained by analyzing genes expressed in this tumor.
[0033]
Neuroblastoma with a poor prognosis is a tumor composed of cancer cells that clearly continue to grow malignantly. Therefore, there is a high possibility that there are many important genes related to proliferation of nerve cells and genes expressed in undifferentiated nerve cells. That is, it is very likely that gene information that is completely different from the profile of the gene expressed in neuroblastoma with a good prognosis can be obtained.
[0034]
In general, nerve cells are said to have more types of genes expressed than cells derived from other organs. A neuroblastoma cell line (cell line) is derived from a clinical tissue with a poor prognosis, and it is considered that the profile of gene expression is greatly changed from that of normal neurons with tumorigenesis.
[0035]
One of the characteristics of neuroblastoma is that it is a child-derived tumor. It is highly likely that the influence of acquired factors is very small, and we obtain developmental information along with analysis of the mechanism of cancer development. It is also expected that there is a high possibility of being able to do it. More surprisingly, the nucleic acids of the present invention include nucleic acids derived from genes whose expression is enhanced only in a specific cell cycle, and from this, analysis and development of the mechanism of cancer development, It is expected that very useful genetic information regarding differentiation is likely to be available.
[0036]
The nucleic acid of the present invention, which is a nucleic acid derived from a gene having the above-described characteristics and from which useful genetic information can be obtained, is obtained from clinical tissue of human neuroblastoma, and is represented by SEQ ID NOs: 1 to 104 in the Sequence Listing. It has any one of the described nucleic acid sequences or part of the nucleic acid sequence.
[0037]
Furthermore, as a result of comparing the expression levels of the gene according to the present invention in clinical tissues with good and poor prognosis of human neuroblastoma, the genes corresponding to the nucleic acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 104 There was a very significant difference in all of the above. That is, the expression of these genes was enhanced in human neuroblastoma with a good prognosis. Therefore, the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 104 can be used to detect neuroblastoma by detecting a nucleic acid (DNA or RNA) having any one of those nucleic acid sequences in addition to the useful gene information described above. It can also be used as information on tumor markers for diagnosing cancer.
[0038]
That is, the present invention makes it possible to obtain human neuroblastoma and various gene information related thereto by the following means.
[0039]
(1) Probe used for hybridization
According to one embodiment of the present invention, a gene expressed in human neuroblastoma can be detected by using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof as a hybridization probe. Further, the distribution of the gene expression can be identified by examining the gene expression in various tumors and normal tissues using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof as a hybridization probe.
[0040]
When the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof is used as a hybridization probe, the hybridization method itself is not particularly limited. Suitable methods include, for example, Northern hybridization, Southern hybridization, colony hybridization, dot hybridization, Fluorescence in situ hybridization (FISH), in situ hybridization (ISH), DNA chip method, microarray method, and the like.
[0041]
As one application example of the hybridization, using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof as a probe for Northern hybridization, measuring the length of mRNA in a sample to be assayed, or detecting gene expression quantitatively Is possible.
[0042]
As another application example, the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be used as a probe for Southern hybridization, and the presence or absence of the DNA sequence can be detected in the genomic DNA of a sample to be assayed.
[0043]
As yet another application example, the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be used as a probe for the FISH method to identify the position of the gene on the chromosome.
[0044]
As yet another application example, the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be used as a probe for the ISH method to identify the tissue distribution of gene expression.
[0045]
When the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof is used as a probe for hybridization, at least 40 nucleic acid residues are required, and there are 40 or more consecutive residues in the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof. Those are preferably used. More preferably, those having 60 or more residues are used.
[0046]
For those skilled in the art, the nucleic acid probe technique in the above-mentioned various hybridizations is well-known. For example, appropriate hybridization conditions for the nucleic acid probe of the present invention having an individual length and the polynucleotide of interest are easily determined. be able to. Such procedures for obtaining optimal hybridization conditions for probes of various lengths are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Sunbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (supra). Just do it.
[0047]
Preferably, the probe according to the present invention is labeled so that it can be easily detected.
The detectable label may be any kind, element or compound that can be detected either visually or by using an instrument. Commonly used detectable labels include radioisotopes, avidin or biotin, fluorescent materials (such as FITC or rhodamine). The radioisotope is ³² P, ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ^Three H, ³⁵ S etc. Biotin-labeled nucleotides can also be incorporated into nucleic acids by nick translation, chemical or enzymatic means. The biotin-labeled probe is detected after hybridization using a labeling means such as avidin / streptavidin, fluorescent label, enzyme, colloidal gold complex and the like. The probe according to the present invention may be labeled by binding to a protein. To that end, for example, radioactive or fluorescent histone single chain binding proteins are used.
[0048]
(2) Primers used for PCR
In order to detect a target gene (for example, a gene according to the present invention), in addition to the hybridization method described above, an arbitrary nucleic acid (DNA) sequence contained in the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof is used as a primer, Polymerase Chain Reaction ( This is possible by using the PCR method. For example, mRNA can be extracted from a clinical tissue sample to be assayed, and gene expression can be measured semi-quantitatively by RT-PCR. Such methods are performed according to methods well known to those skilled in the art, and reference is made, for example, to Sanbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (supra), and Introduction to Genetic Diseases (Fumiaki Takahisa: Nanedo).
[0049]
When the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof is used as a primer for PCR, a length of 10 to 60 nucleic acid residues is required, and 10 to 60 consecutive residues of the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof are present. Some are preferably used. More preferably, those having 15 to 30 residues are used. Generally, a primer sequence having a GC content of 40 to 60% is preferred. Furthermore, it is desirable that there is no difference in Tm value between two primers used for amplification. It is also desirable not to anneal at the 3 ′ end of the primer and to take secondary structure within the primer.
[0050]
(3) Gene screening
By using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof, it is possible to detect the expression distribution of the target gene expressed in various tissues and cells. This can be achieved, for example, by using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof as a hybridization probe or PCR primer as described above.
[0051]
Also, the expression distribution of the target gene can be detected using a DNA chip, a microarray, or the like. That is, the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be directly pasted on the chip or array. The mRNA extracted from the specimen sample is labeled with a fluorescent substance or the like, hybridized, and it is possible to analyze in which tissue cell the gene is highly expressed. The DNA attached on the chip or the array may be a PCR reaction product using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof as a probe.
[0052]
(4) Gene cloning
It is possible to clone a gene expressed in human neuroblastoma by using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof. For example, the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be used as a probe for Northern hybridization or colony hybridization, or a primer for PCR, and a gene containing the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be cloned. Such genes for cloning include genes that differ in expression levels between neuroblastoma with a particularly good prognosis and neuroblastoma with a poor prognosis, and expression patterns in other tissues and cancer cells. Genes that are expressed differently, genes that are expressed in a cell cycle-dependent manner, genes induced by neural differentiation, genes whose expression is controlled by oncogenes or tumor suppressor genes, and the like. For cloning, the nucleic acid (DNA) of the present invention or a fragment thereof is incorporated into an appropriate plasmid or bacteriophage in accordance with ordinary gene recombination techniques, an expression vector is constructed, and this is introduced into a host cell for transformation (introduction). And culturing the transformant. Such individual operations are described in detail in, for example, well-known literature such as Sunbrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (supra).
[0053]
(5) Tumor prognostic identification method and tumor marker usable therefor
As described above, the expression of the gene related to the nucleic acid of the present invention was enhanced in human neuroblastoma with a good prognosis. Therefore, the prognosis is identified by examining the presence or absence of enhanced expression of the gene in a sample containing clinical tissue collected from a subject using the nucleic acid of the present invention or a fragment thereof as a hybridization probe or PCR primer. Can be done. Examples of the gene detection method include the aforementioned Northern blot hybridization method, in situ hybridization method, and RT-PCR method.
[0054]
When the hybridization method is used, it can be diagnosed that the prognosis is good when the amount of the nucleic acid hybridized with the probe in the sample is enhanced. When RT-PCR is used, mRNA is extracted from a sample, reverse transcribed into DNA, amplified with the primers, and gene expression is measured semi-quantitatively. When gene expression is enhanced in this way, it can be diagnosed that the prognosis is good. For this specific diagnostic purpose, it is preferable to use a diagnostic kit containing a set of the primers as essential components. In addition to the primer components, the diagnostic kit includes known components such as a buffer solution for PCR, a washing solution, and an enzyme.
[0055]
(6) Antisense oligonucleotide
According to another embodiment of the invention, antisense oligonucleotides to the nucleic acids of the invention are provided. The antisense oligonucleotide can hybridize to the nucleic acid of the present invention, and includes antisense DNA and antisense RNA. Antisense DNA inhibits transcription from DNA to mRNA, and antisense RNA inhibits translation of mRNA. Such an antisense oligonucleotide can be synthesized using an automatic synthesizer if it is a natural type or by a PCR method using the nucleic acid of the present invention as a template. Furthermore, the antisense oligonucleotide also includes an antisense oligonucleotide derivative with enhanced binding power to target DNA or mRNA, tissue selectivity, cell permeability, nuclease resistance, and intracellular stability. Such derivatives can be synthesized using known antisense techniques.
[0056]
Antisense oligonucleotides that have sequences complementary to the mRNA translation initiation codon, ribosome binding site, capping site, and splice site can block the synthesis of the RNA, and are particularly effective in suppressing gene expression. . Therefore, the present invention suitably includes such an antisense oligonucleotide.
[0057]
(7) Gene therapy
According to another embodiment of the present invention, a nucleic acid sequence encoding a therapeutic gene used for gene therapy is provided. Therefore, the nucleic acid of the present invention can be introduced into a vector used for gene delivery, and the transgene (the gene according to the present invention) can be expressed by any expression promoter, and used for, for example, cancer gene therapy.
[0058]
1. vector
Viral vectors that can be introduced can be made based on DNA or RNA viruses. Any viral vector such as a MoMLV vector, herpes virus vector, adenovirus vector, AAV vector, HIV vector, SIV vector, Sendai virus vector and the like may be used. Also, a pseudo-type type in which one or more of the constituent proteins of the viral vector are replaced with the constituent proteins of the heterologous virus, or a part of the nucleic acid sequence constituting the genetic information is replaced with the nucleic acid sequence of the heterologous virus. These viral vectors can also be used in the present invention. For example, a pseudo-type virus vector in which the Env protein, which is the coat protein of HIV, is replaced with the VSV-G protein, which is the coat protein of the vesicular stomatitis virus (VSV) [Naldini L et al .: Science 272]. 263- (1996)]. Furthermore, viruses having a host range other than humans can be used as virus vectors as long as they have a therapeutic effect. As vectors other than viruses, complexes of calcium phosphate and nucleic acid, liposomes, cationic lipid complexes, Sendai virus liposomes, polymer carriers having polycations as the main chain, and the like can be used. Furthermore, electroporation, a gene gun, etc. can be used as a gene introduction system.
[0059]
2. Expression promoter
Furthermore, the expression cassette used for the therapeutic gene is not particularly limited as long as it can express the gene in the target cell, and any expression cassette can be used. One skilled in the art can readily select such an expression cassette. Preferably, it is an expression cassette capable of gene expression in cells derived from animals, more preferably an expression cassette capable of gene expression in cells derived from mammals, particularly preferably genes in cells derived from humans. An expression cassette capable of expression. The gene promoter used for the expression cassette is, for example, adenovirus, cytomegalovirus, human immunodeficiency virus, simian virus 40, rous sarcoma virus, herpes simplex virus, murine leukemia virus, simbis virus, hepatitis A virus, hepatitis B Virus, hepatitis C virus, papilloma virus, human T cell leukemia virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, JC virus, parvovirus B19, poliovirus and other promoters derived from viruses, albumin, SRα, heat shock protein, elongation factor Such as a promoter derived from a mammal such as CAG promoter, a chimeric promoter such as CAG promoter, a promoter whose expression is induced by tetracycline, steroid and the like.
[0060]
Hereinafter, the gene group whose expression is enhanced in human neuroblastoma with good prognosis found by the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is limited to these examples. It is not something.
[0061]
【Example】
(Production Example 1) Construction of cDNA library from human neuroblastoma
1. Obtain samples
A clinical tissue sample of human neuroblastoma was frozen semi-aseptically immediately after surgical removal and then stored at -80 ° C.
[0062]
2. Selection of samples with good prognosis
The prognostic test of the sample obtained in 1 was performed based on the following indices.
Good prognosis: Poor prognosis:
・

Stage

1 or 2 ・ Stage 4
-Age of onset is less than 1 year-Age of onset is 1 year or older-Survival without recurrence for more than 5 years after surgery-Death within 3 years after surgery
・ No amplification of N-myc ・ With amplification of N-myc
In the above two samples, N-myc amplification was confirmed as follows.
[0063]
The sample obtained in 1 above was finely cut with a razor, and 5 ml of TEN buffer (50 mM Tris-HCL (pH = 8.0) / 1 mM EDTA / 100 mM NaCl) was added and homogenized well. 750 μl of SDS (10%) and 125 μl of proteinase K (20 mg / ml) were added to this mixed solution, mixed gently, and left at 50 ° C. for 8 hours. Thereafter, phenol / chloroform treatment was performed, and finally genomic DNA was purified by ethanol precipitation. 5 μg of the obtained genomic DNA was completely digested with restriction enzyme EcoRI (manufactured by NEB), and N-myc amplification was examined by Southern hybridization using an N-myc probe.
[0064]
3. Preparation of mRNA from clinical tissue of human neuroblastoma with good prognosis
In 2 above, 2 to 3 g of clinical tissue of human neuroblastoma determined to have a good prognosis was treated with Total RNA Extraction Kit (manufactured by QIGEN), and total RNA was extracted. From the extracted total RNA, an oligo dT cellulose column (manufactured by Collaborative) was used to purify a pool of mRNA having a polyA structure.
[0065]
4). mRNA dephosphorylation
The pool of 100-200 μg mRNA prepared in 3 above was dissolved in 67.3 μl of distilled sterilized water containing 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) and 20 μl of 5 * BAP buffer [Tris-HCl (500 mM, pH = 7.0) / mercaptoethanol (50 mM)], 2.7 μl of RNasin (40 unit / μl: manufactured by Promega), 10 μl of BAP (0.25 unit / μl, bacterial alkaline phosphatase: manufactured by Takara Shuzo) were added. . This mixed solution was reacted at 37 ° C. for 1 hour to dephosphorylate the 5 ′ end of mRNA. Thereafter, phenol / chloroform treatment was performed twice, and finally the pool of dephosphorylated mRNA was purified by ethanol precipitation.
[0066]
5). Decap treatment of dephosphorylated mRNA
The total amount of the pool of dephosphorylated mRNA prepared in 4 above was dissolved in 75.3 μl of distilled sterilized water containing 0.1% DEPC, and 20 μl of 5 * TAP buffer [sodium acetate (250 mM, pH = 5.5). / Mercaptoethanol (50 mM), EDTA (5 mM, pH = 8.0)), 2.7 μl of RNasin (40 units / μl), 2 μl of TAP (Tobacco acid pyrophosphatase: 20 units / μl)] were added. This mixed solution was reacted at 37 ° C. for 1 hour to decap the 5 ′ end of dephosphorylated mRNA. At this time, the incompletely dephosphorylated mRNA having no cap structure is not decapped and the 5 ′ end remains dephosphorylated. Thereafter, the uncapped mRNA pool was purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation.
[0067]
6). Preparation of oligocap mRNA
The total amount of the uncapped mRNA pool prepared in 5 above was dissolved in 11 μl of distilled sterilized water containing 0.1% DEPC, and 4 μl of 5′-oligo RNA (5′-AGCAUCGAGUCGGCCUUGGCCUACUGG-3 ′: 100 ng / μl), 10 μl of 10 * ligation buffer [Tris-HCl (500 mM, pH = 7.0) / mercaptoethanol (100 mM)], 10 μl of magnesium chloride (50 mM), 2.5 μl of ATP (24 mM), 2.5 μl of RNasin ( 40 units / μl), 10 μl of T4 RNA ligase (25 units / μl: manufactured by Takara Shuzo), and 50 μl of polyethylene glycol (50% w / v, PEG 8000: manufactured by Sigma) were added. This mixture was reacted at 20 ° C. for 3 hours, and 5′-oligo RNA was ligated to the 5 ′ end of uncapped mRNA. At this time, 5′-oligo RNA is not linked to incompletely dephosphorylated mRNA having no cap structure. Thereafter, the oligocap mRNA pool was purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation.
[0068]
7). DNA removal from oligocap mRNA
The oligo cap mRNA pool prepared in 6 above was dissolved in 70.3 μl of distilled sterilized water containing 0.1% DEPC, 4 μl of Tris-HCl (1M, pH = 7.0), 5.0 μl of DTT ( 0.1M), 16 μl of magnesium chloride (50 mM), 2.7 μl of RNasin (40 units / μl), 2 μl of DNase I (5 units / μl: manufactured by Takara Shuzo) were added. This mixture was reacted at 37 ° C. for 10 minutes to decompose excess DNA. Thereafter, the pool of DNA (−) oligocap mRNA was purified by phenol / chloroform treatment, ethanol precipitation, and column purification (S-400HR: manufactured by Pharmacia Biotech).
[0069]
8.1 Preparation of 1st strand cDNA
The DNA (-) oligocap mRNA pool prepared in 7 above was reverse transcribed using Super Script II (Lifetech Oriental Kit) to obtain a 1st strand cDNA pool. Dissolve the DNA (-) oligocap mRNA pool in 21 μl of sterile distilled water, 10 μl of 10 * First Strand buffer (kit accessory), 8 μl dNTPmix (5 mM, kit accessory), 6 μl DTT (0.1 M , Kit accessory), 2.5 μl oligo dT adapter primer (5 pmol / μl, 5′-GCGGCTGAAGACGGCCTATGTGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ′), 2.0 μl RNasin (40 unit / μl), 2 μl Super Script kit Was added. This mixture was reacted at 42 ° C. for 3 hours to carry out a reverse transcription reaction. Thereafter, all RNAs were decomposed by phenol / chloroform treatment, alkali treatment, and neutralization treatment, and purified by ethanol precipitation.
[0070]
9.2 Preparation of second strand cDNA
The 1st strand cDNA pool prepared in 8 above was subjected to PCR amplification using GeneAmp (Perkin Elmer kit). The 1st strand cDNA pool is dissolved in 52.4 μl of sterile distilled water, 30 μl of 3.3 * Reaction buffer (kit accessory), 8 μl dNTP mix (2.5 mM, kit accessory), 4.4 μl acetic acid. Magnesium (25 mM, kit accessory), 1.6 μl primer F (10 pmol / μl, 5′-AGCATCGAGTCCGCCCTTGTTG-3 ′), 1.6 μl primer R (10 pmol / μl, 5′-GCCGCTGAAGACGGCCCTATGT-3 ′), 2 μl Of rTth (kit accessory) was added. To this mixture, 100 μl of mineral oil was gently added and overlaid. This reaction solution was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, and then it was repeated for 12 cycles at 94 ° C., 1 minute, 52 ° C., 1 minute, 72 ° C., and 10 minutes as one cycle, and then left at 72 ° C. for 10 minutes to carry out the PCR reaction. went. Thereafter, the product was purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation to obtain a pool of 2nd strand cDNA.
[0071]
10.2nd strand cDNA SfiI treatment
The pool of 2nd strand cDNA prepared in 9 above was dissolved in 87 μl of sterile distilled water, 10 × NEB buffer (NEB), 100 * BSA (bovine serum albumin, NEB), 2 μl of SfiI (restriction enzyme, 20 unit / μl, manufactured by NEB) was added. This mixture was reacted at 50 ° C. overnight and subjected to restriction enzyme treatment with SfiI. Thereafter, the product was purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation to obtain a pool of cDNAs having both ends treated with SfiI.
[0072]
11. Size fractionation of SfiI treated cDNA
The SfiI-treated cDNA pool prepared in 10 above was electrophoresed on a 1% agarose gel, and fractions of 2 kb or more were purified using Gene clean II (Bio 101). The purified cDNA pool was dissolved in 100 μl of sterile distilled water and left at 37 ° C. for 6 hours. Thereafter, the product was purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation to obtain a pool of long-chain cDNAs.
[0073]
12 cDNA library
The long-chain cDNA pool prepared in the above 11 was added to DNA Ligation kit ver. Using 1 (Takara Shuzo Co., Ltd. kit), a cloning vector pME18S-FL3 (provided by Professor Juno Kanno, Institute of Medical Science, University of Tokyo) was ligated. Dissolve the pool of long cDNAs in 8 μl of sterile distilled water and add 1 μl of pME18S-FL3 previously treated with restriction enzyme DraIII, 80 μl of Solution A (kit accessory), 10 μl of Solution B (kit accessory) And reacted at 16 ° C. for 3 hours. Thereafter, the product was purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation to obtain a cDNA library.
[0074]
(Example 2) Transformation into E. coli
1. Cloning
The cDNA library prepared in 12 of Example 1 was transformed into E. coli (TOP-10, manufactured by Invitrogen). The cDNA library was dissolved in 10 µl of sterile distilled water and mixed with TOP-10. Then, it incubated on ice for 30 minutes, 40 degreeC for 1 minute, and ice for 5 minutes. 500 μl of SOB medium was added, and cultured with shaking at 37 ° C. for 60 minutes. An appropriate amount was seeded on an agar medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli clone.
[0075]
2. Storage of E. coli clones (preparation of glycerol stock)
The E. coli clone on the agar medium obtained in 1 above was picked up with a toothpick and suspended in 120 μl of LB medium prepared in a 96-well plate. The 96-well plate was allowed to stand overnight at 37 ° C. to culture E. coli. Thereafter, 72 μl of a 60% glycerol solution was added and stored at −20 ° C. (glycerol stock).
[0076]
Example 3 Nucleic Acid Sequencing
1. Preparation of plasmid
10 μl of the glycerol stock prepared in 2 of Example 2 was transferred to a 15 ml centrifuge tube, 3 ml of LB medium and 50 μg / ml of ampicillin were added, and the mixture was shaken at 37 ° C. overnight to culture Escherichia coli. Thereafter, plasmid DNA was extracted and purified from E. coli using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN).
[0077]
2. Analysis of both end sequences
The sequence of both ends of the plasmid DNA prepared in 1 above was determined using a DNA Sequencing Kit (ABI kit). 600 ng of plasmid DNA, 8 μl of premix (supplied with the kit) and 3.2 pmol of primer were mixed and prepared with sterilized distilled water to a total of 20 μl. The mixture was denatured at 96 ° C. for 2 minutes, and the reaction was repeated 25 cycles with 96 ° C., 10 seconds / 50 ° C., 5 seconds / 60 ° C., 4 minutes as one cycle. Thereafter, it was purified by ethanol precipitation. Electrophoresis was performed on a polyacrylamide gel under denaturing conditions, and sequencing was performed using ABI377 (manufactured by ABI).
[0078]
(Example 4) Homology search using database
DNA sequence homology was searched via the Internet for the nucleic acid sequence information of the sample obtained by analyzing the sequence at both ends in Example 3. BLAST of NCBI (National Center of Biotechnology Information USA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) was used for the search.
[0079]
(Example 5) Comparison of gene expression in human neuroblastoma with good / bad prognosis by semi-quantitative PCR
PCR primers were synthesized based on the nucleic acid sequences obtained from part of the gene group obtained in Example 4, and the expression levels were compared and quantified in clinical tissues with good and poor prognosis of human neuroblastoma. MRNA was extracted from the clinical tissue of the human neuroblastoma by the method shown in Examples 1 to 3 (RT-PCR), and PCR was performed using rTaq (Takara Shuzo). Specifically, 5 μl of sterile distilled water, 2 μl of mRNA, 1 μl of 10 * rTaq buffer, 1 μl of 2 mM dNTPs, 0.5 μl of each synthetic primer set, and 0.5 μl of rTaq were mixed. This mixture was denatured at 95 ° C. for 2 minutes, then repeated 35 cycles with 95 ° C. for 15 seconds / 55 ° C., 15 seconds / 72 ° C., 20 seconds as one cycle, and allowed to stand at 72 ° C. for 6 minutes. Went. This reaction solution was electrophoresed on a 1% agarose gel. As a result, when amplified with PCR primers based on the nucleic acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 104 in the sequence listing, genes whose expression levels were enhanced only in human neuroblastoma with a good prognosis were confirmed. Including the results of the homology search shown in Example 4 (73 of 104 nucleic acid sequences had no homology), the nucleic acid sequences and nucleic acid information described in SEQ ID NOs: 1 to 104 are shown in Tables 1-2. Show.
[0080]
Moreover, an example of the measurement result of gene expression level in human neuroblastoma with good / bad prognosis by semi-quantitative PCR (for the nucleic acid sequences nbla-00106, nbla-00219, nbla-03145) is shown in FIGS.
[0081]
[Table 1]

[Table 2]

[0082]
(Example 6) Measurement of cell cycle-dependent gene expression level by semi-quantitative PCR
PCR primers were synthesized based on the nucleic acid sequences obtained from a part of the gene group obtained in Example 4, and the cell cycle-specific gene expression level was comparatively quantified using HeLa cells. Each HeLa cell was treated as follows.
[0083]
(1) No processing
(2) Treatment with 400 μM mimosine for 18 hours, 65% of cells are in G1 phase
(3) Treated with 2 mM thymidine for 20 hours, 100% of cells are in S phase
(4) Treated with 0.6 μg / ml of Nocodazole for 18 hours, 85% of cells are in G2 / M phase
MRNA was extracted from the above four types of HeLa cells by the method shown in Examples 1 to 3, and PCR was performed using rTaq (Takara Shuzo). 5 μl of sterile distilled water, 2 μl of mRNA, 1 μl of 10 × rTaq buffer, 1 μl of 2 mM dNTPs, 0.5 μl of each synthetic primer set and 0.5 μl of rTaq were mixed. This mixture was denatured at 95 ° C. for 2 minutes, then repeated 35 cycles with 95 ° C., 15 seconds / 55 ° C., 15 seconds / 72 ° C., 20 seconds as one cycle, and then left at 72 ° C. for 6 minutes to perform the PCR reaction went. This reaction solution was electrophoresed on a 1% agarose gel. As a result, when amplified by PCR primers based on the nucleic acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 104 in the sequence listing, it was found that gene expression was specific to the cell cycle in 31 nucleic acid sequences. An example of the result of electrophoresis (for the nucleic acid sequence nbla-0100) is shown in FIG. In addition, Tables 1 and 2 show a list of cell cycle specificities and individual nucleic acid sequences thus found.
[0084]
【The invention's effect】
The nucleic acid of the present invention reveals information on genes expressed in neuroblastoma.
[0085]
The nucleic acid of the present invention or a fragment thereof can be used as a probe or primer for various hybridizations or PCR methods, and can detect the expression of the gene in other tissues and cells and analyze its structure and function. Moreover, the genetic engineering production of the human protein encoded by the gene is also possible.
[0086]
The nucleic acid of the present invention is derived from a gene whose expression is enhanced in a human neuroblastoma with a good prognosis when compared with a human neuroblastoma with a good prognosis and a human neuroblastoma with a poor prognosis. Accordingly, genetic information based on these nucleic acids enables prognosis of neuroblastoma. Since the N-myc gene is a poor prognostic factor, the gene is considered to be a good prognostic factor like the TrkA gene, and therefore, the malignancy of neuroblastoma and an index of susceptibility to anticancer agents (tumor) Marker).
[0087]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an example of a gene (nucleic acid) in which expression of human neuroblastoma with good / bad prognosis was examined by semiquantitative PCR and expression of human neuroblastoma with good prognosis was enhanced. It is an electrophoretic photograph showing the result from the sequence nbla-00106). In the figure, lanes 1 to 16 are clinical tissue samples of human neuroblastoma with good prognosis. On the other hand, lanes 17 to 32 are samples of clinical tissues of human neuroblastoma with poor prognosis.
[Fig. 2] Another example of a gene with enhanced expression in human neuroblastoma with good prognosis, as a result of semi-quantitative PCR study of gene expression in human neuroblastoma with good / bad prognosis It is an electrophoresis photograph which shows (result from nucleic acid sequence nbla-00219). In the figure, lanes 1 to 16 are clinical tissue samples of human neuroblastoma with good prognosis. On the other hand, lanes 17 to 32 are samples of clinical tissues of human neuroblastoma with poor prognosis.
FIG. 3 shows that the gene expression level in human neuroblastoma with good / poor prognosis was examined by semi-quantitative PCR, and as a result, another gene with enhanced expression in human neuroblastoma with good prognosis It is an electrophoresis photograph which shows an example (result from nucleic acid sequence nbla-03145). In the figure, lanes 1 to 16 are clinical tissue samples of human neuroblastoma with good prognosis. On the other hand, lanes 17 to 32 are samples of clinical tissues of human neuroblastoma with poor prognosis.
FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing an example of a gene in which expression was observed as a result of examining cell cycle-specific gene expression by semi-quantitative PCR (results from nucleic acid sequence nbla-100100).
In the figure, lane 1 is untreated HeLa cells (60-70% confluent). Lane 2 is HeLa cells treated with 400 μM mimosine for 18 hours and 65% in G1 phase. Lane 3 is a HeLa cell treated with 2 mM thymidine for 20 hours, and 100% is in S phase. Lane 4 is HeLa cells treated with 0.6 μg / ml of Nocodeazole for 18 hours and 85% in G2 / M phase.

Claims

A detection kit for detecting nucleic acid whose expression is enhanced in human neuroblastoma with a good prognosis compared to human neuroblastoma with a poor prognosis from clinical tissues of human neuroblastoma A detection kit comprising a set of PCR primers for amplifying a nucleic acid comprising the sequence of SEQ ID NO: 38 in the column table.