JP4581838B2 - Ｄｎａ断片連結方法及びキット - Google Patents

Description

本発明は、目的のＤＮＡ断片を制限酵素認識部位によって連結するのではなく、遺伝子の方向性を維持しながら複数のＤＮＡ断片を無制限に連結することを可能にし、これによって遺伝子の構築を正確に行うことを可能にする方法に関する。

本発明はまた、上記方法に使用するためのＤＮＡ断片連結キットに関する。

遺伝子組換え技術の成熟化に伴い、遺伝子組換えによる生物の改変に関わる遺伝子が多数単離されている。また、これらの単一遺伝子を導入することによって育種できる場合もあるが、複数形質に関わる複数の有用遺伝子を同時に導入することによって育種効率を高めようとする研究も行われている。また、分岐する代謝系を複雑に制御するためには、複数遺伝子の導入による遺伝子発現制御が必須である（非特許文献１）。

複数の目的ＤＮＡ断片を連結する場合、制限酵素によってベクターの一部を切断し、ここに目的ＤＮＡ断片を挿入して構築するのが一般的である。その際、目的ＤＮＡ断片が方向性をもつように適当な制限酵素認識部位をもたせ、ライゲーションする方法が行われてきた。この方法では、一つの目的ＤＮＡ断片を連結する度に適切な制限酵素認識部位を見つける必要があり、手間と時間がかかる作業であった。

さらに、複数の目的ＤＮＡ断片を制限酵素認識部位を用いて連結する場合、目的ＤＮＡ断片の片方の末端が制限酵素で認識できないような配列にすることができる性質を利用することがある。例えば、制限酵素ＳａｌＩとＸｈｏＩで切断した末端同士を連結させて、得られた配列がどちらの制限酵素の認識配列とも異なり切断することができないことから、両末端にＳａｌＩとＸｈｏＩ制限酵素認識部位を有する目的ＤＮＡ断片をＳａｌＩあるいはＸｈｏＩ制限酵素認識部位に連続して連結することが可能である（非特許文献２）。しかし、この方法では、目的ＤＮＡ断片内にＳａｌＩあるいはＸｈｏＩ制限酵素認識部位が存在する場合は利用できない欠点を有する。

さらにまた、目的ＤＮＡ断片に相補的な配列の先に制限酵素の認識配列を含む相補鎖合成反応開始プライマーで目的とする遺伝子を増幅することで増幅後のＤＮＡ断片の端に制限酵素の認識配列を保持することを可能とする目的ＤＮＡ断片の作製方法が開示されている（非特許文献３）。しかし、この方法は、上記の方法と同様に、ベクター上に存在する連結に使用する制限酵素認識部位による制限を受ける。

これに対して、目的ＤＮＡ断片内に制限酵素認識部位が出現する頻度を低下させ、かつＤＮＡ断片の連結方向を規制するために、ベクター内に非回文配列を生じさせる制限酵素であるＳｆｉＩで切断される制限酵素認識部位をアダプター等で挿入して一定方向でクローニングできるベクターを作製する方法が開示されている（特許文献１）。しかし、複数の目的ＤＮＡ断片を連結させる場合には、連結方向を規制するために、多くのアダプターを作製する必要があることに加えて、連結工程が多い欠点がある。

また、固相系において非回文配列を利用して目的ＤＮＡ断片を連結させることにより、目的ＤＮＡ断片をクローニングすることなく、連結方向を規定しながら目的ＤＮＡ断片を順次連結させる方法が開示されている（特許文献２）。しかし、連結工程が進み連結されたＤＮＡ断片が長くなるに従い、連結効率が低下することが欠点として挙げられる。

一方、ラムダファージの部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換え酵素を利用して、最高３個の目的ＤＮＡ断片をひとつのベクターに移すことができるキット（ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｈｒｅｅ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）がインビトロジェン社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿ｂｉｏｌｏｇｙ／１２５３７００１．ｓｈｔｍｌ）。しかし、このキットで導入できる目的ＤＮＡ断片の数は部位特異的組換えＤＮＡ配列の数に制限されることから、４個以上の目的ＤＮＡ断片を連結することが不可能であった。
米国特許５，５９５，８９５ 特開２００２−２６２８７０ 植物代謝工学ハンドブック：新名惇彦及び吉田和哉監修， ８５４頁， （株）エヌ・ティー・エス， ２００２年６月 Ｎ．Ｋｉｔａｍｏｔｏら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５０：５５８，１９９８ ピーシーアール・テクノロジー，６１〜６３頁，ストックトン・プレス，ニューヨーク，１９８９年

本発明の目的は、多数の目的ＤＮＡ断片を連結方向を規定しながら、目的ＤＮＡ断片の長さによる制限を受けずに無制限に連結する方法、及びそのためのキット、を提供することである。

本発明者等は、特定位置に配置した複数組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を含む供与ベクター、受容ベクター及び変換ベクターを設計し、これらのベクターと部位特異的組換え酵素を利用することによって、従来の方法とは異なる方法によって複数の目的ＤＮＡ断片を連結させることに成功した。この新規の方法によると、多数の目的ＤＮＡ断片を連結方向を規定しながら、目的ＤＮＡ断片の長さによる制限を受けずに無制限に連結することが可能である。

発明の概要
本発明を以下に要約する。
本発明は、第１の態様において、目的ＤＮＡ断片を２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の間に含む供与ベクターと、該供与ベクターの該２種各２組のうち外側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換えを起こすことができる１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を含む受容ベクターとの間で部位特異的組換え反応を行う工程、並びにその結果得られた組換えベクターと、該ベクター中の該供与ベクター由来の残りの１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換えを起こすことができる外側に配置された１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列と内側に配置された該受容ベクター由来の該１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列とを含む変換ベクターとの間で部位特異的組換え反応を行い、該受容ベクター由来の再生された該１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作製する工程を含む、１又は複数の目的ＤＮＡ断片を連結する方法を提供する。

本発明はまた、第２の態様において、２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ１，Ｒ４，Ｒ３，Ｌ２をこの順序で含みかつ該ＤＮＡ配列の間に目的ＤＮＡ断片を挿入することができる供与ベクターと、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１，Ｒ２を含む受容ベクターと、２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ４，Ｒ１，Ｒ２，Ｌ３をこの順序で含む変換ベクターと、部位特異的組換え酵素とを使用して１又は複数のＤＮＡ断片を連結する方法であって、該供与ベクターに該目的ＤＮＡ断片を挿入する工程、該ＤＮＡ断片挿入供与ベクターと該受容ベクターとを部位特異的組換え酵素の存在下で部位特異的組換え反応を行って、Ｌ１とＲ１との間で及びＬ２とＲ２との間でそれぞれ部位特異的組換えを起こして第１組換えベクターを作製する工程、並びに該第１組換えベクターと該変換ベクターとを部位特異的組換え酵素の存在下で部位特異的組換え反応を行って、Ｒ３とＬ３との間で及びＲ４とＬ４との間でそれぞれ部位特異的組換えを起こして、再生されたＲ１及びＲ２を含む第２組換えベクターを作製する工程からなるサイクルを含む上記方法を提供する。

第１の実施形態において、上記方法はさらに、前記供与ベクターに別の目的ＤＮＡ断片を挿入して得られるベクターと前記サイクルの最終工程からの組換えベクターとの間で部位特異的組換え反応を行って組換えベクターを作製する工程を含む前記サイクルの全工程を、目的ＤＮＡ断片の種類を変えながら複数サイクル繰り返して複数の異なる目的ＤＮＡ断片を順次連結することを含む。

第２の実施形態において、上記組換えベクターは選択マーカー配列を含む。
第３の実施形態において、上記方法はさらに、上記組換えベクターを微生物細胞中に形質転換し、選択培地にて培養し、目的ＤＮＡ断片が連結されている細胞を選択し、及び必要により、該細胞から該目的ＤＮＡ断片を含む核酸を回収することを含む。
第４の実施形態において、上記供与ベクターは、その内側にある部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ３とＲ４の間に、ベクター上でユニークに存在する制限酵素認識部位を含む。
第５の実施形態において、上記変換ベクターは、その内側にある部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１とＲ２の間に、ベクター上でユニークに存在する制限酵素認識部位を含む。

第６の実施形態において、上記部位特異的組換え反応に際して、上記受容ベクターがリニアー化される。
第７の実施形態において、上記部位特異的組換え反応に際して、上記組換えベクターがリニアー化される。
第８の実施形態において、４種以上の目的ＤＮＡ断片を連結することができる。

本発明はさらに、第３の態様において、外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）と内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ３，Ｒ４）を含み、かつ該外側のＤＮＡ配列と該内側のＤＮＡ配列との間に目的ＤＮＡ断片を挿入することを可能にする制限酵素認識部位あるいは部位特異的組換えＤＮＡ配列を含むことを特徴とする供与ベクターを提供する。

本発明はさらに、第４の態様において、外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ３，Ｌ４）と内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１，Ｒ２）とを含む変換ベクターであって、該ＤＮＡ配列Ｌ３，Ｌ４が、上記供与ベクターと受容ベクターとの部位特異的組換えによって得られた組換えベクターの最も内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ３，Ｒ４とそれぞれ部位特異的組換えをすることが可能であり、ここで受容ベクターが、該ＤＮＡ配列Ｒ１，Ｒ２を含みかつ該ＤＮＡ配列が請求項１２記載の供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことを可能にする、変換ベクターを提供する。

本発明はさらに、第５の態様において、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１，Ｒ２）を含みかつ該ＤＮＡ配列が請求項１２記載の供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことが可能である受容ベクターに、目的ＤＮＡ断片を含む上記供与ベクターを部位特異的組換えし、ついで該供与ベクターの最も内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ３，Ｒ４）の内側に存在する制限酵素認識部位を用いて制限酵素反応を行い直鎖状ＤＮＡとし、得られた組換えベクターを、上記変換ベクターと部位特異的組換えを行い、これによって目的ＤＮＡ断片を受容ベクター中に連結することを含む、ＤＮＡ断片の連結方法を提供する。

本発明はさらに、その実施形態において、上記ＤＮＡ断片の連結方法を繰り返すことにより、複数の目的ＤＮＡ断片を受容ベクターに連結することを特徴とする複数のＤＮＡ断片の連結方法を提供する。

本発明はさらに、第６の態様において、上記供与ベクター、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１，Ｒ２）を含みかつ該ＤＮＡ配列が上記供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことを可能にする受容ベクター、及び上記変換ベクターをそれぞれ別個の容器に含む、ＤＮＡ断片連結用キットを提供する。
その実施形態により、上記キットはさらに、少なくとも１種の部位特異的組換え酵素を含む。

用語の説明
本明細書中で使用する用語について以下に説明する。
「目的ＤＮＡ断片」とは、連結される個々のＤＮＡ断片を意味する。使用目的に応じて、その種類及び大きさは適宜選択できる。例えば、ＤＮＡ断片の種類は、動物、植物、酵母、真菌、細菌などの生物、あるいはウイルス、に由来することができる。また、ＤＮＡ断片の大きさは、通常１Ｍｂ未満、好ましくは数百ｋｂ未満、さらに好ましくは２００ｋｂ未満である。

「部位特異的組換え」とは、各種の部位特異的組換え酵素が、所望の特異的な塩基配列を識別して組換えが起こることを意味する。この組換えは、保存型部位特異的組換えと、トランスポゾンによる転移型部位特異的組換えとに分けられる。保存型部位特異的組換えは、染色体にファージ・ゲノムの組み込み、切り出しに関与する組換えで、ファージと宿主染色体の特定の短い相同な塩基配列の所で起こる。例えば、ラムダファージがａｔｔＰ部位を利用してファージゲノムを大腸菌のａｔｔＢサイトに部位特異的組換えすること、バクテリオファージ P1 のＣｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え等が知られている。これらの部位特異的組換えを利用することにより、ＤＮＡ間の相同性のない遺伝子領域をゲノム内あるいはゲノム間で移動させる事ができる。

「２種各２組」とは、供与ベクター又は変換ベクター上の４つの部位特異的組換えＤＮＡ配列を指す。供与ベクターの場合、受容ベクター上の２つの部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換えを起こすことが可能である外側に配置される２つ（すなわち、１種２組）の部位特異的組換えＤＮＡ配列と、変換ベクター上の外側配置の２つの部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換えを起こすことが可能である内側に配置された別の２つ（すなわち、別の１種２組）の部位特異的組換えＤＮＡ配列とからなる４つのＤＮＡ配列を意味する。また、変換ベクターの場合、供与ベクターの内側由来の２つの部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換えを起こすことが可能である外側に配置される２つ（すなわち、１種２組）の部位特異的組換えＤＮＡ配列と、上記受容ベクター上の２つの部位特異的組換えＤＮＡ配列と同じである内側に配置される２つ（すなわち、別の１種２組）の部位特異的組換えＤＮＡ配列とからなる４つのＤＮＡ配列を意味する。

「供与ベクター」とは、外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（図１及び図２のＬ１， Ｌ２）と内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（図１及び図２のＲ３， Ｒ４）を含み、かつ該外側のＤＮＡ配列と該内側のＤＮＡ配列との間に目的ＤＮＡ断片を挿入することを可能にする制限酵素認識部位あるいは部位特異的組換えＤＮＡ配列を含むベクターを意味する。

「受容ベクター」とは、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（図１及び図２のＲ１，Ｒ２）を含み、かつ該ＤＮＡ配列が上記供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（図１及び図２のＬ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことを可能にするベクターを意味する。

「変換ベクター」とは、外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（図１及び図２のＬ３，Ｌ４）と内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（図１及び図２のＲ１，Ｒ２）とを含み、かつ該ＤＮＡ配列Ｌ３，Ｌ４が上記供与ベクターと上記受容ベクターとの部位特異的組換えによって得られた組換えベクターの最も内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ３，Ｒ４とそれぞれ部位特異的組換えをすることを可能にするベクターを意味する。このベクターは、上記受容ベクター上の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１，Ｒ２を再生又は復活させるためのものである。

「再生された」又は「再生」とは、上記変換ベクターによって、上記受容ベクターにおけるものと同じ１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を組換えベクター上に復活させることを意味する。

「部位特異的組換え酵素」とは、供与ベクターと受容ベクターとの間、あるいは組換えベクターと変換ベクターとの間で部位特異的組換え反応を触媒する酵素又は酵素混合物を意味する。

「選択マーカー」とは、単一の目的ＤＮＡ断片又は連結された複数の目的ＤＮＡ断片を含む形質転換宿主微生物を選択するために導入ベクター中に組み込まれた薬剤耐性マーカー、栄養要求性を相補するマーカーなどのマーカーを意味する。

「形質転換」とは、異種ＤＮＡが生物細胞に取り込まれて新しい形質が表現される方法又はそのプロセスを意味する。

「選択培地」とは、目的のＤＮＡ断片が組み込まれた微生物細胞を選択するための培地であり、培地中に抗生物質などの薬剤を添加した、あるいは培地から特定の栄養素を欠乏させた、培地を意味する。

「レアカッターサイト」とは、８塩基以上を認識する制限酵素認識部位を意味する。
「マルチプルクローニングサイト」とは、複数の制限酵素認識部位から構成される制限的切断のための部位を意味する。
「リニアー化」とは、ベクターを特異的制限酵素で切断して線状化することを意味する。

「回文配列」とは、そのヌクレオチド配列が相補鎖のヌクレオチド配列と同一である配列を意味する。一方、そのヌクレオチド配列が相補鎖のヌクレオチド配列と異なる配列となる場合、「非回文配列」という。

本発明は、特定位置に配置した複数組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を含む供与ベクター、受容ベクター及び変換ベクター、並びに部位特異的組換え酵素を利用することによって、従来の方法とは異なる方法によって複数の目的ＤＮＡ断片を連結させる方法を提供し、これによって、多数の目的ＤＮＡ断片を連結方向を規定しながら、目的ＤＮＡ断片の長さによる制限を受けずに（又はより長いＤＮＡ断片を）無制限に連結することを可能にする、という利点を付与する。

本発明を、さらに具体的に説明する。
本発明は、簡単に言えば、２種各４組の部位特異的組換えＤＮＡ配列と部位特異的組換え酵素を使用して複数の目的ＤＮＡ断片を連結する方法を提供することである。その際、目的ＤＮＡ断片を２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を有する供与ベクターに乗せ、部位特異的組換え反応を利用して、受容ベクターに目的遺伝子と１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列を移行させて、第１番目の目的ＤＮＡ断片を連結した組換えベクターを作製する。次いで、変換ベクターを用いて第１番目の目的ＤＮＡ断片を連結した組換えベクターに１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列で部位特異的組換えする。これによって得られたベクターには受容ベクターと同じ１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列が存在するため、さらに別の供与ベクターに挿入した第２番目の目的ＤＮＡ断片を第１番目の目的ＤＮＡ断片に連結することができる。上記反応をｎ回繰り返すことにより、ｎ個の目的ＤＮＡ断片を受容ベクターに連結することができる。

本発明の複数の目的ＤＮＡ断片を無制限に連結することを可能にするリサイクルベクターの概念を図１に示す。一つのＤＮＡ断片のベクターへの導入手順は、供与ベクターに目的ＤＮＡ断片を挿入する工程と、その結果得られた供与ベクター及び受容ベクターから第１組み換えベクターを作製する工程と、該第１組換えベクターと変換ベクターから第２組換えベクターを作製する工程との３工程で構成され、この３工程１サイクルを繰り返すことによって、複数の目的ＤＮＡ断片を一つずつ無制限に付加又は連結することができる。

各工程で使用するベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられ、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターなどを用いることもできる。

供与ベクターにはベクター上に存在する適当な制限酵素認識部位等を利用して図１に示す順番で２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ１，Ｒ４，Ｒ３，Ｌ２が配置される。すなわち、１種２組のＤＮＡ配列Ｌ１，Ｌ２は外側に配置され、このＤＮＡ配列は受容ベクター中の部位特異的組換えＤＮＡ配列との組換えに使用される。別の１種２組のＤＮＡ配列Ｒ４，Ｒ３は内側に配置され、このＤＮＡ配列は第１の組換えベクター中に保持されたあと、変換ベクター中の部位特異的組換えＤＮＡ配列との組換えに使用される。

供与ベクターの１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の外側で１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の内側に、目的ＤＮＡ断片を挿入するのに適する制限酵素部位又はマルチクローニングサイト又はＣｒｅ−ｌｏｘ（またはＦＬＰ−ｆｒｔ）（コスモバイオ社）などの部位特異的組換えＤＮＡ配列を配置することができる。また、８塩基以上を認識する複数の制限酵素認識部位（レアカッターサイト）を有するマルチプルクローニングサイトを供与ベクターの内側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ４とＲ３）の間に配置することが好ましい。

目的ＤＮＡ断片は、動物、植物、微生物及びウイルスのいずれの起源のものでもよい。またその大きさ（すなわち、サイズ）は、通常１Ｍｂ未満、好ましくは数百ｋｂ未満、例えば８００ｋｂ、７００ｋｂ、６００ｋｂ、５００ｋｂ、４００ｋｂ又は３００ｋｂ未満、さらに好ましくは２００ｋｂ未満、例えば１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、又はそれ以下である。目的ＤＮＡ断片を、クローニングベクター中に挿入したのち、このベクターを適当な細胞、大腸菌や枯草菌などの細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は動物細胞中に周知の技術で導入してクローン化することができる。クローン化に際して、該ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の各末端に相補的な配列を含むプライマーを用い、該ベクターＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を増幅することができる。

クローニングベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなど、例えばｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，酵母染色体ベクターＹＡＣ，Ｔｉプラスミド，コスミドベクターｐＪＢＢなどが含まれる。目的ＤＮＡ断片は、ベクターＤＮＡ中の適当なユニーク制限部位にリガーゼを用いて挿入することができる。ベクターＤＮＡには、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位（例えばＳＤ配列又はＫｏｚａｋ配列）、薬剤耐性遺伝子又は栄養要求性を相補する遺伝子などの選択マーカー、転写開始部位、ターミネータ、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどのエレメントを含むことができる。

プロモーターには、例えばアデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰ_Ｌプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター、植物細胞用としてのＣａＭＶプロモーターなどが含まれる。

薬剤耐性遺伝子には、例えばアンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが含まれる。

栄養要求性を相補する遺伝子には、例えばチミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子などが含まれる。

ＰＣＲは、例えば、変性９４℃，約３０秒〜２分；アニーリング５７℃，約１〜３分；伸長７０℃，約１〜１０分を１サイクルとして２０〜４０サイクルの条件で行うことができる。プライマーのサイズは少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは約２０〜約３０塩基である。

受容ベクターには、ベクター上に存在する適当な制限酵素認識部位等を利用して図１に示す順番で１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１及びＲ２が配置される。受容ベクターの１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列は、供与ベクターの２種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の外側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ１，Ｌ２と部位特異的組換え反応ができるように配置される。さらに、受容ベクターは、目的ＤＮＡ断片を連結したベクターとして使用するために、例えば植物細胞を宿主とする場合には、バイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１等を好適に用いることができる。動物細胞を宿主とする場合には、例えばレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社）等を好適に用いることができる。

変換ベクターにはベクター上に存在する適当な制限酵素認識部位等を利用して図１に示す順番で２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ４，Ｒ１，Ｒ２，Ｌ３が配置される。変換ベクターの２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の外側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ４，Ｌ３は供与ベクターの２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の内側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ４，Ｒ３と部位特異的組換え反応ができるように配置される。また、レアカッターサイトを有するマルチプルクローニングサイトなどのユニーク制限酵素認識部位を変換ベクターの内側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１とＲ２の間に配置する。

本発明において使用する「部位特異的組換えＤＮＡ配列」は、特定の部位特異的組換えＤＮＡ配列に限定されるものではないが、例えば大腸菌でのラムダファージの部位特異的組換え反応をもとに開発された４組のａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位を使用することができ、またこのとき使用し得る「部位特異的組換え酵素」としてはＩｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）、ＩＨＦ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｔ Ｆａｃｔｏｒ）及びＸｉｓ（Ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）を含むＬＲクロナーゼ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することができる。あるいは、別の「部位特異的組換えＤＮＡ配列」として４組のａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位、「部位特異的組換え酵素」としてＩｎｔとＩＨＦを含むＢＰクロナーゼ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することもできる。

本発明の方法において、供与ベクターに目的ＤＮＡ断片を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位にリガーゼ反応によって連結するか、又はＣｒｅ−ｌｏｘ（またはＦＬＰ−ｆｒｔ）等の部位特異的組換え反応を利用してベクターに連結する方法などが採用される（図１の工程（ａ））。リガーゼ反応に用いる酵素としては、ＤＮＡ分子同士を連結させることができるものであれば特に制限はなく、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを好適に用いることができる。大腸菌リガーゼや耐熱性酵素であるＴａｇやＰｆｕのリガーゼを用いることも可能である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを利用したリガーゼ反応は、通常、緩衝液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を用い、Ｍｇ、ＤＴＴ、ＡＴＰの存在下で行う。さらに、ＰＥＧを添加することにより反応効率を高めることもできる。反応は、通常、１６℃程度で２時間以上行なう。リガーゼ反応の試薬としては、市販品（例えば、タカラバイオ社のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いることも可能である。二本鎖ＤＮＡ分子同士の連結においては、リガーゼ以外にも、例えば、リコンビナーゼ（ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）やＴＯＰＯイソメラーゼＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することもできる。

次いで、工程（ａ）で得られた目的ＤＮＡ断片を有する供与ベクターとレアカッターサイト等での適当な制限酵素による切断によってリニアー化した受容ベクターを混合し、部位特異的組換え反応、例えば、クロナーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＬＲ反応により目的ＤＮＡ断片を供与ベクターに挿入した後、組換えによって得られる受容ベクターの選抜を行う（図１の工程（ｂ））。目的ＤＮＡ断片が挿入された上記受容ベクターを構築するための宿主としては、大腸菌等を用いることができ、形質転換後に受容ベクターを有する大腸菌等が選択的に生育できる抗生物質等を添加した選択培地で目的ＤＮＡ断片を有する組換えベクター１の選抜を行う。選択培地には、ベクターに導入された薬剤耐性マーカーの種類に応じて、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、又はテトラサイクリンなどの抗生物質を加える。

本発明の方法においては、次の目的ＤＮＡ断片を挿入するために、工程（ｂ）で得られる目的ＤＮＡ断片を有する組換えベクター１に受容ベクターにある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１， Ｒ２を再生又は復活させる。そのために、変換ベクターと工程（ｂ）で得られた組換えベクター１をレアカッターサイト等のユニークな制限酵素認識部位で制限酵素によって切断して得られるリニアー化組換えベクター１を混合し、部位特異的組換え反応、例えばクロナーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の部位特異的組換え酵素を用いてＬＲ反応により目的ＤＮＡ断片を供与ベクターに挿入し、組換えによって得られる組換えベクター２の選抜を行う（図１の工程（ｃ））。受容ベクターにある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列が復活する上記組換えベクター２を構築する宿主としては、大腸菌等を用いることができ、形質転換後に受容ベクターを有する大腸菌等が選択的に生育できる抗生物質等を添加した選択培地で組換えベクター２の選抜を行う。

本発明においては、連結させたい目的ＤＮＡ断片の数に応じて、上記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことができる（図１の工程（ｄ））。これにより多数の目的ＤＮＡ断片を順次連結させることができる。

本発明の方法によって連結することができる目的ＤＮＡ断片の数は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上である。

さらに必要に応じて、最終的に得られた組換えベクターから、特異的制限酵素を用いて多重連結された目的ＤＮＡ断片を切り出し回収することができる。

本発明の方法により得られた多重連結された目的ＤＮＡ断片は、それが由来する複数の目的ＤＮＡ断片がコードするポリペプチドが融合された融合ポリペプチドの製造、トランスジェニック生物の作製、遺伝性疾患治療用ベクターの製造、遺伝子の機能解析などに利用することができる。

融合ポリペプチドの製造においては、本発明の方法によって作製された少なくとも２個の異なるＤＮＡ断片が連結された核酸を、プロモーターなどの調節配列を含む発現ベクターに組み込んだのち、該ベクターを真核又は原核生物細胞に導入し、該細胞内にて該核酸を発現させ、得られた融合ポリペプチドを回収する。このときシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を該核酸に連結することによって、細胞外に融合ポリペプチドを分泌させることができる。この目的のためには、市販又は文献記載のいずれのベクターも使用することができる。例えば、細菌用ベクターには、例えばｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）が含まれる。また、真核用のベクターには、例えばｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などが含まれる。さらに産生された融合ポリペプチドの回収を容易にするために、Ｈｉｓ−ｔａｇが挿入されたｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いることもできる。あるいは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を目的ＤＮＡ断片に対し融合させるために、例えばｐＱＢＩ２５（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＱＢＩ６３（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＧＬベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）などのベクターを利用することによって、融合ポリペプチドの回収を容易にすることもできる。

トランスジェニック生物の作製においては、例えばトランスジェニック植物の場合、微生物、ウイルスなどによる植物病に対する抵抗性、昆虫などの害虫に対する抵抗性又は殺虫性、雑草を駆除するための農薬に対する抵抗性などの性質が付与された植物の作製に、本発明の方法を利用することができる。また、トランスジェニック動物の場合、例えば遺伝性疾患を含む疾患の原因又はその治療法の検討のために、本発明の方法によって作製された多重連結されたＤＮＡ断片を動物の染色体に導入することができる。このようなＤＮＡ断片は、遺伝子破壊するためのＤＮＡ配列、あるいは欠陥遺伝子を正常に戻すためのＤＮＡ配列を有することができる。

トランスジェニック動物又は植物の作製には、公知の一般的な手法を使用することができる。トランスジェニック植物の場合、例えばＴｉプラスミド／アグロバクテリウム法を使用することができる。例えば、多重連結されたＤＮＡ断片を含むベクターによって形質転換された大腸菌をアグロバクテリウムと接触させ、接合を介して該ベクターをアグロバクテリウムに移入させて組換えアグロバクテリウムを作製し、これを植物細胞に接種し形質転換し、植物体を再生することができる。トランスジェニック動物の場合、受精卵の核内に目的ＤＮＡ断片を顕微注入する方法、ＹＡＣ、ＨＡＣなどの人工染色体に目的ＤＮＡ断片を組み込んだのち、例えばミクロセル法などの手法を用いて胚性幹細胞に外来遺伝子を導入する方法などを利用して、トランスジェニック動物を作製することができる。例えば、松橋通生ら監修、ワトソン・組換えＤＮＡの分子生物学第２版、丸善、１９９５年、特開２００２−０１７１８６、特開２００１−３５２８５１、特開２００１−３０９７３６、特開平１１−２３９４３０号公報、特開平１１−２２０９７５号公報、特開平１１−１９２０３６号公報、特開平１１−１５５４２０号公報、特開平１０−３０４７９０号公報、特開平１０−１５０９８３号公報、特表２００４−５２００４８、特表２００３−５３０８８８などに、トランスジェニック動物又は植物を作製する方法が記載されており、本発明においてその開示を利用することができる。

遺伝性疾患治療用ベクターの製造においては、遺伝子導入のためのベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ，ＨＭＳ，ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及びポックスウイルスなどのウイルスベクターに、本発明の方法で作製される多重連結されたＤＮＡ断片を組み込むことによって治療用ベクターを製造することができる。あるいは、該ＤＮＡ断片をリポソームベクターに封入することもできる。そのようなベクター及びその製造に関しては、例えば特開２００４−１８０６８９、特開２００１−２９２７７０、特開１０−１２７２８８号公報、特開平０８−２３８０９２号公報、特開平０７−０６９９３３号公報、特表２００４−５３３８２７、特表２００２−５２９０９７、再表９８／０２７２１７号公報などに記載されており、その開示を本発明において利用することができる。

遺伝子の機能解析においては、上記のようにトランスジェニック植物又は動物を作製し、導入したＤＮＡ断片の機能を、該ＤＮＡ断片を導入しない対照植物又は動物と、例えば生物学的、生理学的、生化学的、形態学的に比較し、遺伝子の機能を決定することができる。導入されるＤＮＡ断片は、例えば高発現可能なように導入されてもよいし、又はノックアウトもしくはノックインの形態で染色体に導入されてもよい。

本発明はさらに、上記の供与ベクター、上記の受容ベクター、及び上記の変換ベクターをそれぞれ別個の容器に含む、ＤＮＡ断片連結用キットを提供する。

供与ベクターは、２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ１，Ｒ４，Ｒ３，Ｌ２を含む。１種２組のＤＮＡ配列Ｌ１，Ｌ２は外側に配置され、このＤＮＡ配列は受容ベクター中の部位特異的組換えＤＮＡ配列との組換えに使用される。別の１種２組のＤＮＡ配列Ｒ４，Ｒ３は内側に配置され、このＤＮＡ配列は第１の組換えベクター中に保持されたあと、変換ベクター中の部位特異的組換えＤＮＡ配列との組換えに使用される。内側の１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列と外側の１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列との間には、目的ＤＮＡ断片を挿入するのに適する制限酵素部位又はマルチクローニングサイト又はＣｒｅ−ｌｏｘ（またはＦＬＰ−ｆｒｔ）（コスモバイオ社）などの部位特異的組換えＤＮＡ配列を配置することができる。また、レアカッターサイトを有するマルチプルクローニングサイトなどのユニーク制限酵素認識部位を供与ベクターの内側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ４とＲ３との間に配置することができる。

受容ベクターは、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１及びＲ２を含む。これらの部位特異的組換えＤＮＡ配列は、供与ベクターの２種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の外側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ１，Ｌ２と部位特異的組換え反応ができるように配置される。

変換ベクターは、２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ４，Ｒ１，Ｒ２，Ｌ３を含む。これらの部位特異的組換えＤＮＡ配列の外側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ４，Ｌ３は供与ベクターの２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列の内側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ４，Ｒ３と部位特異的組換え反応ができるように配置される。また、ユニークな制限酵素認識部位、例えばレアカッターサイトを有するマルチプルクローニングサイト、を変換ベクターの内側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１とＲ２の間に配置することができる。

本発明のキットには、少なくとも１種の部位特異的組換え酵素をさらに含むことができる。この酵素の例は、クロナーゼである。別の酵素の例は、インテグラーゼ、Cre-lox系酵素などである。

部位特異的組換えＤＮＡ配列が、例えば大腸菌でのラムダファージの部位特異的組換え反応用の４組のａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位を使用する場合、ａｔｔＬ×ａｔｔＲ→ａｔｔＢ×ａｔｔＰの部位特異的組換え反応を行う、Ｉｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）、ＩＨＦ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｔ Ｆａｃｔｏｒ）及びＸｉｓ（Ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）を含むＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することができる。あるいは、部位特異的組換えＤＮＡ配列として４組のａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位を使用する場合、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ→ａｔｔＬ×ａｔｔＰの部位特異的組換え反応を行う、Ｉｎｔ及びＩＨＦを含むＢＰクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

連結された４種類の異なる遺伝子を含む組み換えベクターの構築
（１）第１ＤＮＡ断片の連結
大腸菌のβグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）をＰＣＲ法で増幅し、Ｎ、Ｃ末側のプライマー部分に導入したＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素認識部位を制限酵素により切断した後、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとｎｏｓターミネータ（ｎｏｓＴ）をもつｐＵＣ１９ベクターのＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素認識部位に連結し、ＣａＭＶ３５プロモーター：ＧＵＳ：ｎｏｓターミネータカセットを構築した。そのＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｎｏｓＴカセットＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位でｐＵＣ１９ベクターから切り出して、供与ベクターｐＲＥＤ４１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位にサブクローニングした（第１ＤＮＡ断片の工程（ａ））。得られたプラスミドｐＲＥＤ４１９−ＧＵＳと受容ベクターｐＧＷＢ１をＸｈｏＩ制限酵素認識部位で切断したプラスミドと混合し、インビトロジェン社のクロナーゼを用いてＬＲ反応をさせた後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）とハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）入りＬＢ培地で選択した（第１ＤＮＡ断片の工程（ｂ））（図２）。得られたプラスミドｐＧＷＢ１−ＧＵＳを制限酵素ＳｗａＩとＡｓｃＩ制限酵素認識部位で切断した後に、変換ベクターｐＣＯＮとクロナーゼによってＬＲ反応をして、上記同様に大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンとハイグロマイシン入り培地で選択した。一連の操作により、ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｎｏｓＴカセットＤＮＡ断片を受容ベクターｐＧＷＢ１へ導入し、さらに、部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１−Ｒ２領域を再生したベクターｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＣＯＮが完成した（第１ＤＮＡ断片の工程（ｃ））（図３）。

（２）第２ＤＮＡ断片の連結
オワンクラゲ蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、両端に導入されたＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素認識部位でｐＵＣ１９ベクター上にあるＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｎｏｓＴの間にサブクローニングした（第２ＤＮＡ断片の工程（ａ））。できあがったＣａＭＶ３５Ｓ：ＧＦＰ：ｎｏｓＴ カセットＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位で切り出し、供与ベクターｐＲＥＤ４１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ 制限酵素認識部位に連結しｐＲＥＤ４１９−ＧＦＰを得た。ｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＣＯＮベクターをＳｗａＩ、ＡｓｃＩ制限酵素認識部位で切断後、ｐＲＥＤ４１９−ＧＦＰとＬＲ反応をして、大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、ハイグロマイシンとカナマイシンで選抜を行った（第２ＤＮＡ断片の工程（ｂ））。得られたベクターｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰをＳｗａＩとＡｓｃＩ制限酵素認識部位で切断し、ｐＣＯＮベクターとクロナーゼによるＬＲ反応を行い、大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、ハイグロマイシンとカナマイシンで選抜して、プラスミドｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ＣＯＮを作成した（第２ＤＮＡ断片の工程（ｃ））。

（３）第３ＤＮＡ断片の連結
ＰＣＲ法によって合成したホタルルシフェラーゼ遺伝子を、両端に導入したＢａｍＨＩとＳａｃＩ制限酵素認識部位で切断し、ｐＵＣ１９ベクター上のＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｎｏｓＴの間にサブクローニングした。得られたプラスミドから、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位でＣａＭＶ３５Ｓ：ｌｕｃ：ｎｏｓＴカセットＤＮＡ断片を切り出して、供与ベクターｐＲＥＤ４１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位に連結をし、ベクターｐＲＥＤ４１９−ｌｕｃを得た（第３ＤＮＡ断片の工程（ａ））。ＳｗａＩとＡｓｃＩ制限酵素認識部位で切断したｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ＣＯＮとｐＲＥＤ４１９−ｌｕｃをクロナーゼによってＬＲ反応を行い、大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、ハイグロマシンとカナマイシン入りの培地で選抜を行った（第３ＤＮＡ断片の工程（ｂ））。得られたプラスミドｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ｌｕｃをＳｗａＩ、ＡｓｃＩ制限酵素認識部位で切断して、ｐＣＯＮベクターとクロナーゼによってＬＲ反応をおこなってＤＨ５αに形質転換を行い、ハイグロマイシンとカナマイシンで選抜して、ｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ｌｕｃ−ＣＯＮを得た（第３ＤＮＡ断片の工程（ｃ））。

（４）第４ＤＮＡ断片の連結
ＰＣＲ法でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍキシラナーゼＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０１０９５８）の活性部位６２７ｂｐ（アミノ酸２９番目アスパラギンから２３７番目セリンまで）を増幅し、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素認識部位で切断して、ｐＵＣ１９ベクター上のＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｎｏｓＴの間にサブクローニングした。得られたプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位でＣａＭＶ３５Ｓ：ＸＹＬ：ｎｏｓＴカセットＤＮＡ断片を切り出し、供与ベクターｐＲＥＤ４１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位に連結してｐＲＥＤ４１９−ＸＹＬを得た（第４ＤＮＡ断片の工程（ａ））。ｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ｌｕｃ−ＣＯＮをＳｗａＩ、ＡｓｃＩ制限酵素認識部位で切断して、ｐＲＥＤ４１９−ＸＹＬとクロナーゼでＬＲ反応を行い、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシンとハイグロマイシンで選抜を行った（第４ＤＮＡ断片の工程（ｂ））。得られたプラスミドｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ｌｕｃ−ＸＹＬをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ １０１株へ電気穿孔法で導入し、ハイグロマイシンで選抜して形質転換体を得た。

（５）連結ＤＮＡ生成物の分析
上記（４）で得られたプラスミドｐＧＷＢ１−ＧＵＳ−ＧＦＰ−ｌｕｃ−ＸＹＬをＳｗａＩ、ＳａｃＩ制限酵素認識部位で切断して、電気泳動を行い遺伝子が連結されていることを確認した（図４）。

本発明により、目的ＤＮＡ断片の方向性を規定して、複数の目的ＤＮＡ断片を無制限に連結することが可能となり、これにより多数の目的ＤＮＡ断片の連結を特別な装置を用いることなく、確実に連結することができるようになった。本発明の方法は、分子生物学の手法において多用される多数の目的ＤＮＡ断片の連結において有効である。また、本発明の方法を使用することによって、例えば遺伝子の機能解析等のためにトランスジェニック生物の作製等に利用することができる。

リサイクルベクターの概念を示す図である。図中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４とＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ部位特異的組換えを起こすＤＮＡ配列である。また、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４はＬ１とＲ１、Ｌ２とＲ２、Ｌ３とＲ３、Ｌ４とＲ４の部位特異的組換えによって生じるＤＮＡ配列である。 リサイクルベクターを用いた第１ＤＮＡ断片の工程（ａ）、工程（ｂ）を示す図である。 リサイクルベクターを用いた第１ＤＮＡ断片の工程（ｃ）を示す図である。 リサイクルベクターを用いて４つのＤＮＡ断片の連結の結果を示す電気泳動写真である。Ｍ：ＮＥＢ社の２−ＬＯＧ ＤＮＡラダーマーカー、サンプル（１〜５）のバンドは上からベクターと第１ＤＮＡ断片（ＧＵＳ）（１０ｋｂ以上）、次は第３ＤＮＡ断片（ＬＵＣ）（４ｋｂ程度）、３番目は第２ＤＮＡ断片（ＧＦＰ）と第４ＤＮＡ断片（ＸＹＬ）（共に３ｋｂｐ程度で重なっている）、４番目はベクターの残りの断片（１２８７ｂｐ）、サンプルの１，２，３，４が正しく構築できたものである。

Claims (16)

1. 目的ＤＮＡ断片を２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（順番にＬ１，Ｒ４，Ｒ３，Ｌ２）のＬ１とＲ４との間、またはＲ３とＬ２との間、に含む供与ベクターと、該供与ベクターの該２種各２組のうち外側にある１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１,Ｌ２）と部位特異的組換えを起こすことができる１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１,Ｒ２）を含む受容ベクターとの間で部位特異的組換え反応を行う工程、並びにその結果得られた組換えベクターと、該ベクター中の該供与ベクター由来の残りの１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ４,Ｒ３）と部位特異的組換えを起こすことができる外側に配置された１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ４,Ｌ３）と内側に配置された該受容ベクター由来の該１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１,Ｒ２）とを含む変換ベクターとの間で部位特異的組換え反応を行い、該受容ベクター由来の再生された該１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１,Ｒ２）を含む組換えベクターを作製する工程を含む、目的ＤＮＡ断片を連結する方法。
2. ２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ１，Ｒ４，Ｒ３，Ｌ２をこの順序で含みかつ該ＤＮＡ配列のＬ１とＲ４との間、またはＲ３とＬ２との間、に目的ＤＮＡ断片を挿入することができる供与ベクターと、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１，Ｒ２を含む受容ベクターと、２種各２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｌ４，Ｒ１，Ｒ２，Ｌ３をこの順序で含む変換ベクターと、部位特異的組換え酵素とを使用して１又は複数のＤＮＡ断片を連結する方法であって、該供与ベクターに該目的ＤＮＡ断片を挿入する工程、該ＤＮＡ断片挿入供与ベクターと該受容ベクターとを部位特異的組換え酵素の存在下で部位特異的組換え反応を行って、Ｌ１とＲ１との間で及びＬ２とＲ２との間でそれぞれ部位特異的組換えを起こして第１組換えベクターを作製する工程、並びに該第１組換えベクターと該変換ベクターとを部位特異的組換え酵素の存在下で部位特異的組換え反応を行って、Ｒ３とＬ３との間で及びＲ４とＬ４との間でそれぞれ部位特異的組換えを起こして、再生されたＲ１及びＲ２を含む第２組換えベクターを作製する工程からなるサイクルを含む前記方法。
3. 前記供与ベクターに別の目的ＤＮＡ断片を挿入して得られるベクターと前記サイクルの最終工程からの組換えベクターとの間で部位特異的組換え反応を行って組換えベクターを作製する工程を含む前記サイクルの全工程を、目的ＤＮＡ断片の種類を変えながら複数サイクル繰り返して複数の異なる目的ＤＮＡ断片を順次連結することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記組換えベクターが選択マーカー配列を含む、請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記組換えベクターを微生物細胞中に形質転換し、選択培地にて培養し、目的ＤＮＡ断片が連結されている細胞を選択し、及び必要により、該細胞から該目的ＤＮＡ断片を含む核酸を回収することをさらに含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記供与ベクターが、その内側にある部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ３とＲ４の間に、ベクター上でユニークに存在する制限酵素認識部位を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記変換ベクターが、その内側にある部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ１とＲ２の間に、ベクター上でユニークに存在する制限酵素認識部位を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記部位特異的組換え反応に際して、前記受容ベクターがリニアー化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記部位特異的組換え反応に際して、前記組換えベクターがリニアー化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ４種以上の目的ＤＮＡ断片を連結することができる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）と内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ３，Ｒ４）を含み、かつ該外側のＤＮＡ配列と該内側のＤＮＡ配列との間に目的ＤＮＡ断片を挿入することを可能にする制限酵素認識部位あるいは部位特異的組換えＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法で使用するための供与ベクター。
12. 外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ３，Ｌ４）と内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１，Ｒ２）とを含む変換ベクターであって、該ＤＮＡ配列Ｌ３，Ｌ４が、請求項１１記載の供与ベクターと受容ベクターとの部位特異的組換えによって得られた組換えベクターの最も内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列Ｒ３，Ｒ４とそれぞれ部位特異的組換えをすることが可能であり、ここで受容ベクターが、該ＤＮＡ配列Ｒ１，Ｒ２を含みかつ該ＤＮＡ配列が請求項１１記載の供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことを可能にする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法で使用するための変換ベクター。
13. １種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１，Ｒ２）を含みかつ該ＤＮＡ配列が請求項１１記載の供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことが可能である受容ベクターに、目的ＤＮＡ断片を含む請求項１１記載の供与ベクターを部位特異的組換えし、ついで該供与ベクターの最も内側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ３，Ｒ４）の内側に存在する制限酵素認識部位を用いて制限酵素反応を行い直鎖状ＤＮＡとすることによって得られた組換えベクターを、請求項１２記載の変換ベクターと部位特異的組換えを行い、これによって目的ＤＮＡ断片を受容ベクター中に連結することを含む、ＤＮＡ断片の連結方法。
14. 請求項１３記載のＤＮＡ断片の連結方法を繰り返すことにより、複数の目的ＤＮＡ断片を受容ベクターに連結することを特徴とする複数のＤＮＡ断片の連結方法。
15. 請求項１１記載の供与ベクター、１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｒ１，Ｒ２）を含みかつ該ＤＮＡ配列が請求項１１記載の供与ベクターの外側に配置した１種２組の部位特異的組換えＤＮＡ配列（Ｌ１，Ｌ２）とそれぞれ部位特異的組換えを起こすことを可能にする受容ベクター、及び請求項１２記載の変換ベクターをそれぞれ別個の容器に含む、ＤＮＡ断片連結用キット。
16. 少なくとも１種の部位特異的組換え酵素をさらに含む、請求項１５に記載のキット。

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