JP4592131B2 - シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター及びその遺伝子 - Google Patents
シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター及びその遺伝子 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質の輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸は小腸上皮から吸収、あるいは腎近位尿細管上皮から再吸収され、体内に補給あるいは保持されるが、この機能は吸収上皮細胞に存在する膜タンパク質であるアミノ酸トランスポーターによって担われている。特に腎近位尿細管のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を輸送するアミノ酸輸送系ｂ０，＋は、その遺伝的欠損によって重篤な臨床症状を伴う遺伝的疾患シスチン尿症を引き起こすため、その分子的実体の解明が待たれていた。
【０００３】
アミノ酸輸送系は、中性アミノ酸輸送系、塩基性アミノ酸輸送系及び酸性アミノ酸輸送系に分類されており、アルファベット又はその組み合わせにより命名される。一般にＮａ＋依存性輸送系はアルファベットの大文字で、Ｎａ＋非依存性輸送系はアルファベットの小文字で命名される。文字の右肩に付される＋は塩基性アミノ酸系を示し、−は酸性アミノ酸系を示し、無印又は０は中性アミノ酸系であることを示す。したがって、前記した係るアミノ酸輸送系ｂ０，＋は、ｂという名のアミノ酸輸送系であって、Ｎａ＋非依存性輸送系で（小文字のアルファベット）、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸（右肩の０及び＋）を輸送するものである。
アミノ酸輸送系ｂ０，＋は、もともとは、マウス胞胚で始めて記載され、その後、腎刷子縁膜小胞標本、腎上皮由来細胞株においてもその機能が存在するとされていた [Palacin, et al., Physiol. Rev.,第78巻、969-1054頁、1998年]。アミノ酸輸送系ｂ０，＋の機能は、ナトリウム非依存的な、すなわちその機能にナトリウムイオンを必要としないトランスポーターである。また、その輸送形態はアミノ酸の交換輸送であるとされている。
【０００４】
一方、腎臓及び小腸に発現する、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質ｒＢＡＴ(related to ｂ０，＋ amino acid transporter) のｃＤＮＡがクローニングされ、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させるとアミノ酸輸送系ｂ０，＋の特性を示すアミノ酸の取り込み活性が出現することが報告された[Palacin、J. Exp. Biol.、第196巻、123-137頁、1994年]。しかし、これはｒＢＡＴによりアフリカツメガエル卵母細胞の内因性トランスポーターが活性化されたためであり、腎尿細管のアミノ酸輸送系ｂ０，＋が発現したものではない。
【０００５】
以上のように、従来の方法では、輸送基質の詳細や、アミノ酸上皮輸送におけるアミノ酸輸送系ｂ０，＋の役割を解析することは困難であり、アミノ酸輸送系ｂ０，＋の機能を担うシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を輸送基質とするトランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析をすることが望まれていた。
【０００６】
アミノ酸トランスポーターとしては種々のものが既にクローニングされており、例えば、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸をともに基質とするトランスポーターとしては、アミノ酸輸送系ｙ＋Ｌに相当する、ｙ＋ＬＡＴ１およびｙ＋ＬＡＴ２がクローニングされている[Torrents et al.、J. Biol. Chem. 第273巻、32437-32445頁、1998年]。しかし、これらは、シスチンは輸送基質とせず、アミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
塩基性アミノ酸のみを基質とするトランスポーターとして、アミノ酸輸送系ｙ＋に相当する塩基性アミノ酸トランスポーター（ＣＡＴ１〜４）がクローニングされた。しかし、これもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【０００７】
中性アミノ酸を選択的に輸送するトランスポーターとして、輸送系Ｌに相当する中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１[Kanai et al., J. Biol. Chem., 第273巻、23629-23632頁、1998年]、及びＬＡＴ２[Segawa et al., J. Biol. Chem., 第274巻、19745-19751頁、1999年]がクローニングされた。また、ＬＡＴ１及びＬＡＴ２は、補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。両者はＮａ＋に依存せず、ＬＡＴ１はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジンなど大型の中性アミノ酸を輸送する交換輸送活性を示し、ＬＡＴ２は、大型の中性アミノ酸に加えグリシン、アラニン、セリン、システイン、スレオニンなどの小型の中性アミノ酸も輸送する広い基質選択性を有する。しかし、これらもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【０００８】
中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質として、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を輸送する輸送系ｙ＋Ｌの機能を有する前記ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２がクローニングされた[Torrents et al., J. Biol. Chem., 第273巻、32437-32445頁、1998年]。また、ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２共に補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２は、中性アミノ酸としてはグルタミン、ロイシン、イソロイシンを主に輸送し、アミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【０００９】
シスチンを輸送するトランスポーターとして、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質であるｘＣＴがクローニングされた [Sato et al., J. Biol. Chem. 274: 11455-11458, 1999]。ｘＣＴも補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。しかし、ｘＣＴもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【００１０】
トランスポーター自体ではないが、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質である４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡがクローニングされており、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させるとアミノ酸輸送系ｙ＋Ｌに相当する塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸の取り込みを活性化することが知られている[Palacin、J. Exp. Biol.、第196巻、123-137頁、1994年]が、これもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【００１１】
以上のように、４Ｆ２ｈｃと連結することによって機能するトランスポーターの分子的実体が明かにされ、類似の構造を持つｒＢＡＴも特定のトランスポーターと連結し、輸送機能のある分子複合体を形成すると考えられた。しかし、ｒＢＡＴと連結するトランスポーターの実体は明かにされていなかった。
ｒＢＡＴの遺伝的変異は、Ｉ型シスチン尿症を惹起することがすでに示されている[Palacin、J. Exp. Biol.、第196巻、123-137頁、1994年]。しかし、非 I 型シスチン尿症においては、ｒＢＡＴに変異が検出されないため、非Ｉ型シスチン尿症はｒＢＡＴと連結するトランスポーターの異常でると考えられ、その分子的実体解明が待たれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋の機能を担い、ｒＢＡＴと連結するトランスポーターの遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドであるアミノ酸トランスポーターを提供することにある。その他の目的については、以下の記載より明らかである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＬＡＴ１のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を用いてＥＳＴ（expressed sequence tag ) データベースを検索し、ＬＡＴ１と類似の塩基配列を同定した。それに相当するプローブを作製してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、新規タンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。さらに、この遺伝子の産物をＣＯＳ−７細胞に発現させて、この遺伝子の産物が機能を発揮するためにはｒＢＡＴが必須であること、及び発現する機能は、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋に相当することを確認し、本発明を完成するにいたった。
【００１４】
すなわち、本発明は、アミノ酸トランスポーターであって、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送活性化因子ｒＢＡＴにより活性化されるタンパク質に関し、より詳細には、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質に関する。
（Ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号５又は６で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質あるいは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と共存したとき、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋に相当する輸送能力を有するタンパク質。
本発明のタンパク質は、天然のものから抽出されるものであってもよいが、遺伝子組換え技術により得られる組換えタンパク質であってもよい。
【００１５】
本発明の中性アミノ酸を輸送する能力を有する新規タンパク質、すなわちシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１（ｂ０，＋ type amino acid transporter １）は、アミノ酸輸送活性化因子ｒＢＡＴと共存することにより、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を輸送する（取り込む）能力を有する。
また、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１は、生体内においては小腸及び腎に主に発現している。腎においては、ＢＡＴ１、ｒＢＡＴともに管腔側膜に存在し、尿細管内のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸の再吸収を担当していると考えられる。
【００１６】
また、本発明は、前記したタンパク質をコードする遺伝子に関し、より詳細には、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子に関する。
（ａ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号５又は６で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質あるいは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と共存したとき、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋に相当する輸送能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
本発明の遺伝子はＤＮＡに限定されるものではなく、遺伝情報を担うものであればＤＮＡでもＲＮＡであってもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、前記した本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミド、当該プラスミドで形質転換された宿主細胞に関する。
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子、好ましくは前記した（ａ）又は（ｂ）で示される遺伝子の塩基配列中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドに関し、当該ヌクレオチドは本発明のタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして、また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することができる。
また、本発明は、前記した本発明のタンパク質又はその断片に対する抗体に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記した本発明のタンパク質又は当該タンパク質を含有する細胞を用いて、好ましくは輸送活性化因子ｒＢＡＴを併用する、当該タンパク質の有するシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を測定する方法、及び、被検物質の生体内におけるシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する体内動態を測定するための方法に関する。
また、本発明は、前記した方法により、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターにより細胞に取り込まれ易い又は細胞に取り込まれにくい物質をスクリーニングする方法に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
後記配列表の配列番号１は、ラット腎由来のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１（ラットＢＡＴ１）のアミノ酸配列（４８７アミノ酸）を表わし、配列番号２はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約１．７ｋｂｐ）をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものである。
後記配列表の配列番号３は、ヒト腎由来のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１（ヒトＢＡＴ１）のアミノ酸配列（４８７アミノ酸）を示し、配列番号４はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約１．７ｋｂｐ）をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものである。
また、後記配列表の配列番号５は、ラットの輸送活性化因子ｒＢＡＴの遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものであり、配列番号６は、ヒトの輸送活性化因子ｒＢＡＴの遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものである。
【００２０】
前記配列番号１〜４に示される塩基配列もしくはアミノ酸配列について、既知ＤＮＡデータベース（GenBankおよびEMBL）及びプロテインデータベース（NBRF及びSWISS-PROT）に含まれるすべての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、これらの配列は、新規なものであると考えられる。
【００２１】
本発明のタンパク質としては、配列番号１又は３で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１又は３で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、中性アミノ酸輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約９７個、好ましくは１〜約４８個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００２２】
また、本発明の遺伝子としては、配列番号２又は４で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２又は４で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質がシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋ に相当する輸送能力を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１又は３で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００２３】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００２４】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
【００２５】
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、ラットあるいはヒト腎臓を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これから ｃＤＮＡ ライブラリーを構築し、ＥＳＴ（expressed sequence tag）データベースの検索によって得られるＬＡＴ１類似配列（例えば、GenBanskTM/EBI/DDBJ accession No. AA162896) に相当するプローブを用いて ｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングすることによって ＢＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、ＢＡＴ１のアミノ酸配列を決定することができる
【００２６】
得られたｃＤＮＡが、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、すなわちはｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物がシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られたＢＡＴ１ｃＤＮＡを哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、同じく哺乳動物細胞発現ベクターに挿入したｒＢＡＴとともにＣＯＳ−７細胞に導入して発現させ、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を細胞内へ輸送する（取り込む）能力を、前記と同様、シスチンあるいは適当な塩基性又は中性アミノ酸を基質とする取り込み試験（Kanai et al.、J. Clin. Invest. 第93巻、397-404貢、1994年)により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認できる。
また、得られたＢＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡから調整した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法[Hedigerら、Biochim. Biophys. Acta、第1064巻、360頁、1991年]により、ＢＡＴ１タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２７】
一方、ｒＢＡＴの遺伝子のｃＤＮＡはすでに報告されている[Wells and Hediger、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第89巻、5596-5600頁、1992年]ので、この配列情報から、ＰＣＲ法などを用いて、容易にｒＢＡＴの遺伝子を得ることが可能である。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、ＢＡＴ１の特性、例えば、ＢＡＴ１がアミノ酸の交換輸送を行っているという特性や、ＢＡＴ１の基質選択性、イオン依存性などを調べることができる。
【００２８】
得られたＢＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２又は４に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManitis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊] に記載の方法により調整することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２９】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター（ＢＡＴ１）は、例えば、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＢＡＴ１ をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いることが好ましい。
例えば、ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、広い基質選択性を有する中性アミノ酸トランスポーターＢＡＴ１をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０ プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１ａ プロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、又はヒトＨｅＬａ細胞などの細胞株などが挙げられる。
【００３０】
シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２又は４で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）[Mark, D.F. et al.、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662頁（1984年）] 等によって実施できる。
【００３１】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターの検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
【００３２】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１、その遺伝子およびその発現細胞は、ＢＡＴ１により輸送されるアミノ酸類似薬物（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡ等）の、細胞膜通過や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）での透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。また、ＢＡＴ１を発現する細胞膜や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）を効率良く透過する薬物の開発に使用できる。さらに、ＢＡＴ１を発現する細胞膜や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）での薬物間相互作用のインビトロでの試験に使用できる。
【００３３】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１、その遺伝子およびその発現細胞は、ＢＡＴ１により輸送される毒物（例えば、メチル水銀のシステイン抱合体等）や外来性異物の、細胞膜通過や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）での透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。
また、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１を抑制することにより、ＢＡＴ１を発現する細胞膜や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）の毒物（例えば、メチル水銀のシステイン抱合体等）や外来性異物の透過を制限することができる。また、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１、その遺伝子およびその発現細胞は、ＢＡＴ１により輸送される毒物（例えば、メチル水銀のシステイン抱合体等）や外来性異物の、細胞膜通過や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）の透過を制限する薬物（ＢＡＴ１の特異的なインヒビター等）の開発に使用できる。
【００３４】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１は、その遺伝的欠損が非Ｉ型シスチン尿症を惹起すると考えられるため、ＢＡＴ１ｃＤＮＡあるいは、ゲノミックＤＮＡを適当なプロモーターに接続し、遺伝子治療ベクターを作製することが可能である。ここで言う適当なプロモーターとは、腎近位尿細管での発現を可能とするプロモーターのことである。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManitis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより１９８９年に発刊］ に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００３６】
実施例１ シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターのラット及びヒトｃＤＮＡ のクローニング
（１）ヒトｒＢＡＴのｃＤＮＡの単離と哺乳類発現細胞へのサブクローン化
ｃＤＮＡライブラリーはヒト腎臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（クロンテク社から購入）から、ｃＤＮＡ合成用キット（商品名：Superscript Choice System、ギブコ社製）を使用して作製し、ファージベクターλＺｉｐＬｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。ラットｒＢＡＴ遺伝子（後記配列表の配列番号５）[Wells and Hediger、Proc. Natl. Acad. Sci. 第89巻、5596-5600頁、1992年]の全長配列を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いて、ヒト腎ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中一晩行い、フィルター膜は、３７℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション用溶液としては、５ｘＳＳＣ、３ｘデンハード液（Denhard's液）０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、０．０１％Ａｂｔｉｆｏｒｍ Ｂ（商品名、シグマ社）（消泡剤）、０．２ｍｇ／ｍｌサーモン精子変性ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳを含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。ｃＤＮＡを組み込んだλＺｉｐＬｏｘファージのｃＤＮＡ部分を、プラスミドｐＺＬ１に組み込み、さらにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ−（Stratagene社製）へサブクローン化した。
【００３７】
得られたクローンすなわち、ヒトｒＢＡＴのｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Applied Biosystems社）により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これにより、クローニングしたｃＤＮＡがヒトｒＢＡＴ遺伝子のものであることが確認できた。得られたヒトｒＢＡＴの塩基配列を後記配列表の配列番号６に示した。
ラット及びヒトｒＢＡＴのｃＤＮＡを含むプラスミドから、挿入ｃＤＮＡ断片を切りだし、哺乳類細胞発現ベクター ｐｃＤＮＡ３．１ （インビトロゲン社製）にサブクローン化した。
【００３８】
（２）ラット及びヒトシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１ｃＤＮＡの単離と哺乳類発現細胞へのサブクローン化
ＬＡＴ１の翻訳領域の塩基配列を用いたＥＳＴ（expressed sequence tag) データベースの検索によって得られたＬＡＴ１類似配列 GenBanskTM/EBI/DDBJ accession No. AA162896 に相当するＩＭＡＧＥ（Integrated and Molecular Analysis of Genoms and their Expression) ｃＤＮＡクローンＮｏ．５７８５０２のＥｃｏＲＩ切断断片を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いて、ラット及びヒト腎ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００３９】
ｃＤＮＡライブラリーはラット腎から調整したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ及びヒト腎由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（クロンテク社から購入）から、ｃＤＮＡ合成用キット（商品名：Superscript Choice System、ギブコ社製）を使用して作製し、ファージベクターλＺｉｐＬｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブによるハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中一晩行い、フィルター膜は、３７℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション用溶液としては、５ｘＳＳＣ、３ｘデンハード液（Denhard's液）０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、０．０１％ＡｂｔｉｆｏｒｍＢ（商品名、シグマ社）（消泡剤）、０．２ｍｇ／ｍｌサーモン精子変性ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳを含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。ｃＤＮＡを組み込んだλＺｉｐＬｏｘファージのｃＤＮＡ部分を、プラスミドｐＺＬ１に組み込み込んだ。
得られたクローンすなわち、ラットＢＡＴ１ あるいはヒトＢＡＴ１ のｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Applied Biosystems社）により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
これにより、ラット及びヒトＢＡＴ１ 遺伝子の塩基配列が得られた。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるＢＡＴ１のアミノ酸配列を決定した。
【００４０】
これらの配列を、後記配列表の配列番号１及び３にそのアミノ酸配列を、配列番号２及び４にその塩基配列を示した。ヒト及びラットＢＡＴ１の配列の比較を図１に示した（相互の相同性８７％）。
ＢＡＴ１はラットＬＡＴ１及びＬＡＴ２と４３％のアミノ酸配列の相同性を有していた。また、中性および塩基性アミノ酸輸送系ｙ＋Ｌに相当するヒトトランスポーターｙ＋ＬＡＴ１と４２％、ｙ＋ＬＡＴ２と４４％の相同性を有していた。さらに、シスチン／グルタミン酸交換輸送体ｘＣＴと４３％の相同性を有していた。
ラットＢＡＴ１とヒトｙ＋ＬＡＴ１、ラットＬＡＴ１、およびマウスｘＣＴのアミノ酸配列の比較を図２に示した。
【００４１】
ＳＯＳＵＩアルゴリズム[Hirokawa, T. et al.、Bioinformatics、第14巻、第378頁（1998年)]により、ＢＡＴ１のアミノ酸配列を解析した結果、図２に示したように、１２個の膜貫通領域（membrane-spanning domain）が予想された。また、第２の親水性ループにチロシンリン酸化部位、Ｎ−末端細胞内領域、及び第８の親水性ループにプロテインキナーゼＣ依存性のリン酸化部位と考えられる部位があった。
【００４２】
（３）ラットの種々の組織におけるＢＡＴ１遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
ＢＡＴ１ 遺伝子の第１−７９３番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、３２Ｐ−ｄＣＴＰ でラベルしてプローブとして用いて、ラットの種々の組織及びラット由来の培養腫瘍細胞株Ｃ６グリオーマ細胞から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＢＡＴ１ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果を図３に示す。小腸及び腎において１．９ｋｂ付近にバンドが検出された。
【００４３】
（４）ラット腎におけるＢＡＴ１及びｒＢＡＴ蛋白の発現（免疫組織化学による解析）
ラットＢＡＴ１の４７４−４８７に相当する合成オリゴペプチド［ＱＭＬＭＥＶＶＰＰＥＫＤＰＥＣ］、及びラットｒＢＡＴの６２９−６４２に相当する合成オリゴペプチド［ＳＤＶＤＴＨＡＶＳＬＥＫＧＥＣ］（両者のＣ−末端のシステン残基はＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanine) とのコンジュゲーションのために導入）に対する特異抗体をアルトマン（Altman）らの方法に準じて作製した[Altman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第81巻、2176-2180頁、1984年]。得られた抗血清は、抗原ペプチドを用いてアフィニティ精製し免疫組織化学に用いた。ヒサノ（Hisano）らの方法[Hisano et al., Brain Res. 第710巻、299-302頁、1996年]に準じて、精製抗ＢＡＴ１抗体（希釈率１：５，０００）及び精製抗ｒＢＡＴ抗体（希釈率１：５，０００）を用いて、ラット腎連続切片（３μｍ）を用いた免疫組織化学を行った。
図４に示すように、ＢＡＴ１及びｒＢＡＴともに腎近位尿細管の管腔側膜に存在することが示された。特に近位曲尿細管において、管腔側膜上でＢＡＴ１とｒＢＡＴが共存することが示された（例えば図４の矢尻）。
【００４４】
（５）ラット腎におけるＢＡＴ１及びｒＢＡＴ蛋白の発現（ウェスタンブロットによる解析）
ラット腎膜画分をトレンス（Thorens）らの方法[Thorens et al. Cell 第55巻、281-290頁、1988]に従って調整した。タンパク試料は、５％の２−メルカプトエタノール存在下（還元条件下）あるいは非存在下（非還元条件下）で１００℃で５分間処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＶトランスファー膜にブロッティングし、抗ＢＡＴ１抗血清（１：４，０００）あるいは抗ｒＢＡＴ抗血清（１：４０，０００）で処理した。
抗ＢＡＴ１抗血清では、図５に示すように、非還元条件下において観察される２５１ＫＤａと１２５ｋＤａのバンドは還元条件下では消失し、４１ｋＤａのバンドが出現した。抗ｒＢＡＴ抗血清では、非還元条件下において観察される２３１ＫＤａと１２５ｋＤａのバンドは還元条件下では消失し、９０ｋＤａのバンドが出現した。これらの結果は、ＢＡＴ１とｒＢＡＴがジスルフィド結合により連結し、ヘテロダイマーを形成することを示唆する。
【００４５】
実施例２ シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターのＢＡＴ１の機能的特徴づけ
（１）ＢＡＴ１の輸送活性におけるｒＢＡＴの役割
ラットＢＡＴ１遺伝子を単独でＣＯＳ−７細胞に発現させた場合と、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に卵母細胞に発現させた場合、ラットＢＡＴ１遺伝子とラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子を共に卵母細胞に発現させた場合のシスチンの取り込みを比較した。
ＣＯＳ−７細胞浮遊液（８００μｌ、１．２５ｘ１０７細胞／ｍｌ、各１０μｇのｃＤＮＡをサブクローン化したプラスミドを含有）を、ジーンパルサー（Bio-Rad社製）に装着した０．４ｃｍのキュベット内で２００Ｖ、９６０μＦで処理し、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞は２４穴プレートで３日間培養し、１４Ｃ−シスチン（１００μＭ）の取り込みを測定した。 取り込み測定は、培養液を取り除き、１４Ｃ−シスチンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（Gibco 社製）を添加することにより開始し、それを取り除き氷冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳにより洗浄することにより終了した。洗浄後、０．１ Ｎ ＮａＯＨで溶解し、液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
【００４６】
その結果を図６に示す。シスチンの取り込みは、ＢＡＴ１のみ、ｒＢＡＴのみ、４Ｆ２ｈｃのみを発現させたもの、そしてＢＡＴ１と４Ｆ２ｈｃの共発現させたＣＯＳ−７細胞では、対照としてｃＤＮＡを含まないプラスミドを導入したＣＯＳ−７細胞と同レベルであった。これに対して、ＢＡＴ１とｒＢＡＴを共発現させたＣＯＳ−７細胞では、有意なシスチン取り込みが観察された。これにより、ＢＡＴ１とｒＢＡＴが連結することが、機能的にも示された。
【００４７】
（２）ＬＡＴ２の輸送活性の塩依存性
ラットＢＡＴ１遺伝子とｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。
シスチンの取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。但し、取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳにかえて、コリン取り込み溶液（uptake solution）（塩化ナトリウムを塩化コリンで置換したもの）を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、グルコン酸取り込み溶液（uptake solution）（塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムに変えたもの）を用いた。
その結果を図７に示す。細胞外のコリンをナトリウムに変えても、細胞外の塩素イオンをグルコン酸イオンに変えても、シスチン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、ＢＡＴ１はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
【００４８】
（３）ＢＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験
シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験を行った。基質シスチンの濃度の違いによるシスチン取り込み率の変化を調べることにより、ＢＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験を行った。シスチンの取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。
その結果、Ｋｍ値は３０５±４３．４μＭ、Ｖｍａｘ値は１９７０±３８０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ（平均±標準誤差、ｎ＝３）であった。
【００４９】
シスチン以外のＢＡＴ１の基質となるアミノ酸においても同様にミカエリス−メンテン動力学試験を行い、Ｋｍ値とＶｍａｘ値を算出した。
その結果、Ｋｍ値とＶｍａｘ値は、リジン、アルギニン、オルニチン、ロイシン、フェニルアラニンに対して、それぞれ４６３μＭ；２，９９０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、２０３μＭ；２，５７０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、３８７μＭ；２，５３０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、２６９μＭ；１，３３０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、１９０μＭ；１，７３０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎであった。
【００５０】
（４）ＢＡＴ１の基質選択性（アミノ酸及びその類似物質添加による阻害実験）
ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞よるシスチンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
シスチンの取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。但し、５ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、１４Ｃ−シスチン（５０μＭ）の取り込みを測定した。
その結果を図８に示す。シスチン、塩基性アミノ酸および中性アミノ酸で、ｃｉｓ−阻害効果が観察された。アミノ酸輸送系Ｌ特異的阻害薬ＢＣＨ、アミノ酸輸送系Ａ特異的阻害薬ＭｅＡＩＢ、及びＤ−アミノ酸は、シスチン取り込みを全く阻害しないか、あるいは弱い阻害効果を示したのみであった。
【００５１】
（５）ＢＡＴ１の基質選択性（各種アミノ酸及びその類似物質を基質とする取り込み試験）
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、ＢＡＴ１による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、１４Ｃ−シスチンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
【００５２】
その結果を図９に示す。Ｌ−シスチン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−リジン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アルギニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−オルニチン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−ロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−イソロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−バリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−フェニルアラニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−チロシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−トリプトファン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−ヒスチジン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−メチオニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−グルタミン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アスパラギン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−スレオニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−システイン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−セリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アラニン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合に、ＣＯＳ−７細胞への取り込みが認められた。グリシン（１４Ｃ化合物）に関しては、極めて低い取り込みが見られた。Ｌ−プロリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−グルタミン酸（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アスパラギン酸（１４Ｃ化合物）に関しては、有意な取り込みは認められなかった。
【００５３】
ヒトＢＡＴ１遺伝子、あるいはヒトｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞、及びヒトＢＡＴ１遺伝子とヒトｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞について、基質としてシスチンを用い、基質の取り込み実験を実施例２（１）に準じて行った。
その結果、シスチンの取り込みは、ラットと同様、ＢＡＴ１のみを導入したＣＯＳ−７細胞では、対照としてｃＤＮＡを含まないプラスミドを導入したＣＯＳ−７細胞と同レベルであったが、ＢＡＴ１とｒＢＡＴを共に発現させたＣＯＳ−７細胞では大きなシスチンの取り込みが観察された。よって、ヒトＢＡＴ１もラットＢＡＴ１と同様、ｒＢＡＴと共存することにより始めて機能を発揮することが示された。
【００５４】
【発明の効果】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１およびその遺伝子は、アミノ酸類似化合物、薬物及び毒物の小腸上皮や腎尿細管上皮からの吸収のインビトロでの解析など、アミノ酸類似化合物、薬物及び毒物の動態の分子レベルでの解明、および小腸や腎尿細管での吸収効率の良いアミノ酸類似化合物、薬物の開発、透過するアミノ酸類似化合物、薬物及び毒物の透過を抑制する薬物の開発に有用と考えられる。さらに、ＢＡＴ１遺伝子は、シスチン尿症治療を目的とした遺伝子治療ベクターの作製に使用し得る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットＢＡＴ１とヒトＢＡＴ１のアミノ酸配列の比較を示す図。
【図２】ラットＢＡＴ１、ヒトｙ＋ＬＡＴ１、ラットＬＡＴ１、およびマウスｘＣＴのアミノ酸配列の比較を示す図。予想される膜貫通部位を付線で示した。
【図３】ラットの各臓器組織におけるＢＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した写真。
【図４】ラット腎の免疫組織化学的解析の結果を示した写真。抗ＢＡＴ１抗体（左）と抗ｒＢＡＴ抗体（右）を用いた。
【図５】ラット腎膜標本を用いたウェスタンブロット解析の結果を示した写真。抗ＢＡＴ１抗体（左）と抗ｒＢＡＴ抗体（右）を用い、非還元条件下（−）及び還元条件下（＋）で行った。
【図６】ラットＢＡＴ１遺伝子、ラットｒＢＡＴ遺伝子、あるいはラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞、及びラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞、ラットＢＡＴ１遺伝子とラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験の結果を示す図。
【図７】ラットＢＡＴ１遺伝子及びラットｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験において添加する塩の影響を調べた結果を示す図。
【図８】ラットＢＡＴ１遺伝子の及びラットｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験において、系への各種アミノ酸もしくはその類似化合物添加の影響を調べた結果を示す図。
【図９】ラットＢＡＴ１遺伝子及びラットｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞による放射能標識アミノ酸の取り込みを調べた結果を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明はシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質の輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸は小腸上皮から吸収、あるいは腎近位尿細管上皮から再吸収され、体内に補給あるいは保持されるが、この機能は吸収上皮細胞に存在する膜タンパク質であるアミノ酸トランスポーターによって担われている。特に腎近位尿細管のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を輸送するアミノ酸輸送系ｂ０，＋は、その遺伝的欠損によって重篤な臨床症状を伴う遺伝的疾患シスチン尿症を引き起こすため、その分子的実体の解明が待たれていた。
【０００３】
アミノ酸輸送系は、中性アミノ酸輸送系、塩基性アミノ酸輸送系及び酸性アミノ酸輸送系に分類されており、アルファベット又はその組み合わせにより命名される。一般にＮａ＋依存性輸送系はアルファベットの大文字で、Ｎａ＋非依存性輸送系はアルファベットの小文字で命名される。文字の右肩に付される＋は塩基性アミノ酸系を示し、−は酸性アミノ酸系を示し、無印又は０は中性アミノ酸系であることを示す。したがって、前記した係るアミノ酸輸送系ｂ０，＋は、ｂという名のアミノ酸輸送系であって、Ｎａ＋非依存性輸送系で（小文字のアルファベット）、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸（右肩の０及び＋）を輸送するものである。
アミノ酸輸送系ｂ０，＋は、もともとは、マウス胞胚で始めて記載され、その後、腎刷子縁膜小胞標本、腎上皮由来細胞株においてもその機能が存在するとされていた [Palacin, et al., Physiol. Rev.,第78巻、969-1054頁、1998年]。アミノ酸輸送系ｂ０，＋の機能は、ナトリウム非依存的な、すなわちその機能にナトリウムイオンを必要としないトランスポーターである。また、その輸送形態はアミノ酸の交換輸送であるとされている。
【０００４】
一方、腎臓及び小腸に発現する、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質ｒＢＡＴ(related to ｂ０，＋ amino acid transporter) のｃＤＮＡがクローニングされ、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させるとアミノ酸輸送系ｂ０，＋の特性を示すアミノ酸の取り込み活性が出現することが報告された[Palacin、J. Exp. Biol.、第196巻、123-137頁、1994年]。しかし、これはｒＢＡＴによりアフリカツメガエル卵母細胞の内因性トランスポーターが活性化されたためであり、腎尿細管のアミノ酸輸送系ｂ０，＋が発現したものではない。
【０００５】
以上のように、従来の方法では、輸送基質の詳細や、アミノ酸上皮輸送におけるアミノ酸輸送系ｂ０，＋の役割を解析することは困難であり、アミノ酸輸送系ｂ０，＋の機能を担うシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を輸送基質とするトランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析をすることが望まれていた。
【０００６】
アミノ酸トランスポーターとしては種々のものが既にクローニングされており、例えば、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸をともに基質とするトランスポーターとしては、アミノ酸輸送系ｙ＋Ｌに相当する、ｙ＋ＬＡＴ１およびｙ＋ＬＡＴ２がクローニングされている[Torrents et al.、J. Biol. Chem. 第273巻、32437-32445頁、1998年]。しかし、これらは、シスチンは輸送基質とせず、アミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
塩基性アミノ酸のみを基質とするトランスポーターとして、アミノ酸輸送系ｙ＋に相当する塩基性アミノ酸トランスポーター（ＣＡＴ１〜４）がクローニングされた。しかし、これもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【０００７】
中性アミノ酸を選択的に輸送するトランスポーターとして、輸送系Ｌに相当する中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１[Kanai et al., J. Biol. Chem., 第273巻、23629-23632頁、1998年]、及びＬＡＴ２[Segawa et al., J. Biol. Chem., 第274巻、19745-19751頁、1999年]がクローニングされた。また、ＬＡＴ１及びＬＡＴ２は、補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。両者はＮａ＋に依存せず、ＬＡＴ１はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジンなど大型の中性アミノ酸を輸送する交換輸送活性を示し、ＬＡＴ２は、大型の中性アミノ酸に加えグリシン、アラニン、セリン、システイン、スレオニンなどの小型の中性アミノ酸も輸送する広い基質選択性を有する。しかし、これらもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【０００８】
中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質として、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を輸送する輸送系ｙ＋Ｌの機能を有する前記ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２がクローニングされた[Torrents et al., J. Biol. Chem., 第273巻、32437-32445頁、1998年]。また、ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２共に補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２は、中性アミノ酸としてはグルタミン、ロイシン、イソロイシンを主に輸送し、アミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【０００９】
シスチンを輸送するトランスポーターとして、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２の類似蛋白質であるｘＣＴがクローニングされた [Sato et al., J. Biol. Chem. 274: 11455-11458, 1999]。ｘＣＴも補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。しかし、ｘＣＴもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【００１０】
トランスポーター自体ではないが、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質である４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡがクローニングされており、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させるとアミノ酸輸送系ｙ＋Ｌに相当する塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸の取り込みを活性化することが知られている[Palacin、J. Exp. Biol.、第196巻、123-137頁、1994年]が、これもアミノ酸輸送系ｂ０，＋とは基質選択性が異なっている。
【００１１】
以上のように、４Ｆ２ｈｃと連結することによって機能するトランスポーターの分子的実体が明かにされ、類似の構造を持つｒＢＡＴも特定のトランスポーターと連結し、輸送機能のある分子複合体を形成すると考えられた。しかし、ｒＢＡＴと連結するトランスポーターの実体は明かにされていなかった。
ｒＢＡＴの遺伝的変異は、Ｉ型シスチン尿症を惹起することがすでに示されている[Palacin、J. Exp. Biol.、第196巻、123-137頁、1994年]。しかし、非 I 型シスチン尿症においては、ｒＢＡＴに変異が検出されないため、非Ｉ型シスチン尿症はｒＢＡＴと連結するトランスポーターの異常でると考えられ、その分子的実体解明が待たれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋の機能を担い、ｒＢＡＴと連結するトランスポーターの遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドであるアミノ酸トランスポーターを提供することにある。その他の目的については、以下の記載より明らかである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＬＡＴ１のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を用いてＥＳＴ（expressed sequence tag ) データベースを検索し、ＬＡＴ１と類似の塩基配列を同定した。それに相当するプローブを作製してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、新規タンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。さらに、この遺伝子の産物をＣＯＳ−７細胞に発現させて、この遺伝子の産物が機能を発揮するためにはｒＢＡＴが必須であること、及び発現する機能は、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋に相当することを確認し、本発明を完成するにいたった。
【００１４】
すなわち、本発明は、アミノ酸トランスポーターであって、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送活性化因子ｒＢＡＴにより活性化されるタンパク質に関し、より詳細には、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質に関する。
（Ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号５又は６で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質あるいは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と共存したとき、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋に相当する輸送能力を有するタンパク質。
本発明のタンパク質は、天然のものから抽出されるものであってもよいが、遺伝子組換え技術により得られる組換えタンパク質であってもよい。
【００１５】
本発明の中性アミノ酸を輸送する能力を有する新規タンパク質、すなわちシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１（ｂ０，＋ type amino acid transporter １）は、アミノ酸輸送活性化因子ｒＢＡＴと共存することにより、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を輸送する（取り込む）能力を有する。
また、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１は、生体内においては小腸及び腎に主に発現している。腎においては、ＢＡＴ１、ｒＢＡＴともに管腔側膜に存在し、尿細管内のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸の再吸収を担当していると考えられる。
【００１６】
また、本発明は、前記したタンパク質をコードする遺伝子に関し、より詳細には、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子に関する。
（ａ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号５又は６で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質あるいは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と共存したとき、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋に相当する輸送能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
本発明の遺伝子はＤＮＡに限定されるものではなく、遺伝情報を担うものであればＤＮＡでもＲＮＡであってもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、前記した本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミド、当該プラスミドで形質転換された宿主細胞に関する。
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子、好ましくは前記した（ａ）又は（ｂ）で示される遺伝子の塩基配列中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドに関し、当該ヌクレオチドは本発明のタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして、また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することができる。
また、本発明は、前記した本発明のタンパク質又はその断片に対する抗体に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記した本発明のタンパク質又は当該タンパク質を含有する細胞を用いて、好ましくは輸送活性化因子ｒＢＡＴを併用する、当該タンパク質の有するシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を測定する方法、及び、被検物質の生体内におけるシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する体内動態を測定するための方法に関する。
また、本発明は、前記した方法により、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターにより細胞に取り込まれ易い又は細胞に取り込まれにくい物質をスクリーニングする方法に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
後記配列表の配列番号１は、ラット腎由来のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１（ラットＢＡＴ１）のアミノ酸配列（４８７アミノ酸）を表わし、配列番号２はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約１．７ｋｂｐ）をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものである。
後記配列表の配列番号３は、ヒト腎由来のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１（ヒトＢＡＴ１）のアミノ酸配列（４８７アミノ酸）を示し、配列番号４はその遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約１．７ｋｂｐ）をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものである。
また、後記配列表の配列番号５は、ラットの輸送活性化因子ｒＢＡＴの遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものであり、配列番号６は、ヒトの輸送活性化因子ｒＢＡＴの遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列をその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列と共に示したものである。
【００２０】
前記配列番号１〜４に示される塩基配列もしくはアミノ酸配列について、既知ＤＮＡデータベース（GenBankおよびEMBL）及びプロテインデータベース（NBRF及びSWISS-PROT）に含まれるすべての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、これらの配列は、新規なものであると考えられる。
【００２１】
本発明のタンパク質としては、配列番号１又は３で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１又は３で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、中性アミノ酸輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約９７個、好ましくは１〜約４８個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００２２】
また、本発明の遺伝子としては、配列番号２又は４で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２又は４で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質がシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送系ｂ０，＋ に相当する輸送能力を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１又は３で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００２３】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００２４】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
【００２５】
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、ラットあるいはヒト腎臓を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これから ｃＤＮＡ ライブラリーを構築し、ＥＳＴ（expressed sequence tag）データベースの検索によって得られるＬＡＴ１類似配列（例えば、GenBanskTM/EBI/DDBJ accession No. AA162896) に相当するプローブを用いて ｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングすることによって ＢＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、ＢＡＴ１のアミノ酸配列を決定することができる
【００２６】
得られたｃＤＮＡが、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、すなわちはｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物がシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られたＢＡＴ１ｃＤＮＡを哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、同じく哺乳動物細胞発現ベクターに挿入したｒＢＡＴとともにＣＯＳ−７細胞に導入して発現させ、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を細胞内へ輸送する（取り込む）能力を、前記と同様、シスチンあるいは適当な塩基性又は中性アミノ酸を基質とする取り込み試験（Kanai et al.、J. Clin. Invest. 第93巻、397-404貢、1994年)により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認できる。
また、得られたＢＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡから調整した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法[Hedigerら、Biochim. Biophys. Acta、第1064巻、360頁、1991年]により、ＢＡＴ１タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２７】
一方、ｒＢＡＴの遺伝子のｃＤＮＡはすでに報告されている[Wells and Hediger、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第89巻、5596-5600頁、1992年]ので、この配列情報から、ＰＣＲ法などを用いて、容易にｒＢＡＴの遺伝子を得ることが可能である。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、ＢＡＴ１の特性、例えば、ＢＡＴ１がアミノ酸の交換輸送を行っているという特性や、ＢＡＴ１の基質選択性、イオン依存性などを調べることができる。
【００２８】
得られたＢＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２又は４に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManitis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊] に記載の方法により調整することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２９】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター（ＢＡＴ１）は、例えば、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＢＡＴ１ をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いることが好ましい。
例えば、ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、広い基質選択性を有する中性アミノ酸トランスポーターＢＡＴ１をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０ プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１ａ プロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、又はヒトＨｅＬａ細胞などの細胞株などが挙げられる。
【００３０】
シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２又は４で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）[Mark, D.F. et al.、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662頁（1984年）] 等によって実施できる。
【００３１】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターの検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
【００３２】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１、その遺伝子およびその発現細胞は、ＢＡＴ１により輸送されるアミノ酸類似薬物（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡ等）の、細胞膜通過や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）での透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。また、ＢＡＴ１を発現する細胞膜や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）を効率良く透過する薬物の開発に使用できる。さらに、ＢＡＴ１を発現する細胞膜や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）での薬物間相互作用のインビトロでの試験に使用できる。
【００３３】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１、その遺伝子およびその発現細胞は、ＢＡＴ１により輸送される毒物（例えば、メチル水銀のシステイン抱合体等）や外来性異物の、細胞膜通過や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）での透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。
また、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１を抑制することにより、ＢＡＴ１を発現する細胞膜や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）の毒物（例えば、メチル水銀のシステイン抱合体等）や外来性異物の透過を制限することができる。また、本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１、その遺伝子およびその発現細胞は、ＢＡＴ１により輸送される毒物（例えば、メチル水銀のシステイン抱合体等）や外来性異物の、細胞膜通過や、ＢＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば小腸上皮、腎尿細管上皮など）の透過を制限する薬物（ＢＡＴ１の特異的なインヒビター等）の開発に使用できる。
【００３４】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１は、その遺伝的欠損が非Ｉ型シスチン尿症を惹起すると考えられるため、ＢＡＴ１ｃＤＮＡあるいは、ゲノミックＤＮＡを適当なプロモーターに接続し、遺伝子治療ベクターを作製することが可能である。ここで言う適当なプロモーターとは、腎近位尿細管での発現を可能とするプロモーターのことである。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManitis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより１９８９年に発刊］ に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００３６】
実施例１ シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターのラット及びヒトｃＤＮＡ のクローニング
（１）ヒトｒＢＡＴのｃＤＮＡの単離と哺乳類発現細胞へのサブクローン化
ｃＤＮＡライブラリーはヒト腎臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（クロンテク社から購入）から、ｃＤＮＡ合成用キット（商品名：Superscript Choice System、ギブコ社製）を使用して作製し、ファージベクターλＺｉｐＬｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。ラットｒＢＡＴ遺伝子（後記配列表の配列番号５）[Wells and Hediger、Proc. Natl. Acad. Sci. 第89巻、5596-5600頁、1992年]の全長配列を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いて、ヒト腎ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中一晩行い、フィルター膜は、３７℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション用溶液としては、５ｘＳＳＣ、３ｘデンハード液（Denhard's液）０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、０．０１％Ａｂｔｉｆｏｒｍ Ｂ（商品名、シグマ社）（消泡剤）、０．２ｍｇ／ｍｌサーモン精子変性ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳを含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。ｃＤＮＡを組み込んだλＺｉｐＬｏｘファージのｃＤＮＡ部分を、プラスミドｐＺＬ１に組み込み、さらにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ−（Stratagene社製）へサブクローン化した。
【００３７】
得られたクローンすなわち、ヒトｒＢＡＴのｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Applied Biosystems社）により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これにより、クローニングしたｃＤＮＡがヒトｒＢＡＴ遺伝子のものであることが確認できた。得られたヒトｒＢＡＴの塩基配列を後記配列表の配列番号６に示した。
ラット及びヒトｒＢＡＴのｃＤＮＡを含むプラスミドから、挿入ｃＤＮＡ断片を切りだし、哺乳類細胞発現ベクター ｐｃＤＮＡ３．１ （インビトロゲン社製）にサブクローン化した。
【００３８】
（２）ラット及びヒトシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１ｃＤＮＡの単離と哺乳類発現細胞へのサブクローン化
ＬＡＴ１の翻訳領域の塩基配列を用いたＥＳＴ（expressed sequence tag) データベースの検索によって得られたＬＡＴ１類似配列 GenBanskTM/EBI/DDBJ accession No. AA162896 に相当するＩＭＡＧＥ（Integrated and Molecular Analysis of Genoms and their Expression) ｃＤＮＡクローンＮｏ．５７８５０２のＥｃｏＲＩ切断断片を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いて、ラット及びヒト腎ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００３９】
ｃＤＮＡライブラリーはラット腎から調整したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ及びヒト腎由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（クロンテク社から購入）から、ｃＤＮＡ合成用キット（商品名：Superscript Choice System、ギブコ社製）を使用して作製し、ファージベクターλＺｉｐＬｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブによるハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中一晩行い、フィルター膜は、３７℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション用溶液としては、５ｘＳＳＣ、３ｘデンハード液（Denhard's液）０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、０．０１％ＡｂｔｉｆｏｒｍＢ（商品名、シグマ社）（消泡剤）、０．２ｍｇ／ｍｌサーモン精子変性ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳを含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。ｃＤＮＡを組み込んだλＺｉｐＬｏｘファージのｃＤＮＡ部分を、プラスミドｐＺＬ１に組み込み込んだ。
得られたクローンすなわち、ラットＢＡＴ１ あるいはヒトＢＡＴ１ のｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Applied Biosystems社）により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
これにより、ラット及びヒトＢＡＴ１ 遺伝子の塩基配列が得られた。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるＢＡＴ１のアミノ酸配列を決定した。
【００４０】
これらの配列を、後記配列表の配列番号１及び３にそのアミノ酸配列を、配列番号２及び４にその塩基配列を示した。ヒト及びラットＢＡＴ１の配列の比較を図１に示した（相互の相同性８７％）。
ＢＡＴ１はラットＬＡＴ１及びＬＡＴ２と４３％のアミノ酸配列の相同性を有していた。また、中性および塩基性アミノ酸輸送系ｙ＋Ｌに相当するヒトトランスポーターｙ＋ＬＡＴ１と４２％、ｙ＋ＬＡＴ２と４４％の相同性を有していた。さらに、シスチン／グルタミン酸交換輸送体ｘＣＴと４３％の相同性を有していた。
ラットＢＡＴ１とヒトｙ＋ＬＡＴ１、ラットＬＡＴ１、およびマウスｘＣＴのアミノ酸配列の比較を図２に示した。
【００４１】
ＳＯＳＵＩアルゴリズム[Hirokawa, T. et al.、Bioinformatics、第14巻、第378頁（1998年)]により、ＢＡＴ１のアミノ酸配列を解析した結果、図２に示したように、１２個の膜貫通領域（membrane-spanning domain）が予想された。また、第２の親水性ループにチロシンリン酸化部位、Ｎ−末端細胞内領域、及び第８の親水性ループにプロテインキナーゼＣ依存性のリン酸化部位と考えられる部位があった。
【００４２】
（３）ラットの種々の組織におけるＢＡＴ１遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
ＢＡＴ１ 遺伝子の第１−７９３番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、３２Ｐ−ｄＣＴＰ でラベルしてプローブとして用いて、ラットの種々の組織及びラット由来の培養腫瘍細胞株Ｃ６グリオーマ細胞から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＢＡＴ１ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果を図３に示す。小腸及び腎において１．９ｋｂ付近にバンドが検出された。
【００４３】
（４）ラット腎におけるＢＡＴ１及びｒＢＡＴ蛋白の発現（免疫組織化学による解析）
ラットＢＡＴ１の４７４−４８７に相当する合成オリゴペプチド［ＱＭＬＭＥＶＶＰＰＥＫＤＰＥＣ］、及びラットｒＢＡＴの６２９−６４２に相当する合成オリゴペプチド［ＳＤＶＤＴＨＡＶＳＬＥＫＧＥＣ］（両者のＣ−末端のシステン残基はＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanine) とのコンジュゲーションのために導入）に対する特異抗体をアルトマン（Altman）らの方法に準じて作製した[Altman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第81巻、2176-2180頁、1984年]。得られた抗血清は、抗原ペプチドを用いてアフィニティ精製し免疫組織化学に用いた。ヒサノ（Hisano）らの方法[Hisano et al., Brain Res. 第710巻、299-302頁、1996年]に準じて、精製抗ＢＡＴ１抗体（希釈率１：５，０００）及び精製抗ｒＢＡＴ抗体（希釈率１：５，０００）を用いて、ラット腎連続切片（３μｍ）を用いた免疫組織化学を行った。
図４に示すように、ＢＡＴ１及びｒＢＡＴともに腎近位尿細管の管腔側膜に存在することが示された。特に近位曲尿細管において、管腔側膜上でＢＡＴ１とｒＢＡＴが共存することが示された（例えば図４の矢尻）。
【００４４】
（５）ラット腎におけるＢＡＴ１及びｒＢＡＴ蛋白の発現（ウェスタンブロットによる解析）
ラット腎膜画分をトレンス（Thorens）らの方法[Thorens et al. Cell 第55巻、281-290頁、1988]に従って調整した。タンパク試料は、５％の２−メルカプトエタノール存在下（還元条件下）あるいは非存在下（非還元条件下）で１００℃で５分間処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＶトランスファー膜にブロッティングし、抗ＢＡＴ１抗血清（１：４，０００）あるいは抗ｒＢＡＴ抗血清（１：４０，０００）で処理した。
抗ＢＡＴ１抗血清では、図５に示すように、非還元条件下において観察される２５１ＫＤａと１２５ｋＤａのバンドは還元条件下では消失し、４１ｋＤａのバンドが出現した。抗ｒＢＡＴ抗血清では、非還元条件下において観察される２３１ＫＤａと１２５ｋＤａのバンドは還元条件下では消失し、９０ｋＤａのバンドが出現した。これらの結果は、ＢＡＴ１とｒＢＡＴがジスルフィド結合により連結し、ヘテロダイマーを形成することを示唆する。
【００４５】
実施例２ シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターのＢＡＴ１の機能的特徴づけ
（１）ＢＡＴ１の輸送活性におけるｒＢＡＴの役割
ラットＢＡＴ１遺伝子を単独でＣＯＳ−７細胞に発現させた場合と、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に卵母細胞に発現させた場合、ラットＢＡＴ１遺伝子とラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子を共に卵母細胞に発現させた場合のシスチンの取り込みを比較した。
ＣＯＳ−７細胞浮遊液（８００μｌ、１．２５ｘ１０７細胞／ｍｌ、各１０μｇのｃＤＮＡをサブクローン化したプラスミドを含有）を、ジーンパルサー（Bio-Rad社製）に装着した０．４ｃｍのキュベット内で２００Ｖ、９６０μＦで処理し、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞は２４穴プレートで３日間培養し、１４Ｃ−シスチン（１００μＭ）の取り込みを測定した。 取り込み測定は、培養液を取り除き、１４Ｃ−シスチンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（Gibco 社製）を添加することにより開始し、それを取り除き氷冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳにより洗浄することにより終了した。洗浄後、０．１ Ｎ ＮａＯＨで溶解し、液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
【００４６】
その結果を図６に示す。シスチンの取り込みは、ＢＡＴ１のみ、ｒＢＡＴのみ、４Ｆ２ｈｃのみを発現させたもの、そしてＢＡＴ１と４Ｆ２ｈｃの共発現させたＣＯＳ−７細胞では、対照としてｃＤＮＡを含まないプラスミドを導入したＣＯＳ−７細胞と同レベルであった。これに対して、ＢＡＴ１とｒＢＡＴを共発現させたＣＯＳ−７細胞では、有意なシスチン取り込みが観察された。これにより、ＢＡＴ１とｒＢＡＴが連結することが、機能的にも示された。
【００４７】
（２）ＬＡＴ２の輸送活性の塩依存性
ラットＢＡＴ１遺伝子とｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。
シスチンの取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。但し、取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳにかえて、コリン取り込み溶液（uptake solution）（塩化ナトリウムを塩化コリンで置換したもの）を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、グルコン酸取り込み溶液（uptake solution）（塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムに変えたもの）を用いた。
その結果を図７に示す。細胞外のコリンをナトリウムに変えても、細胞外の塩素イオンをグルコン酸イオンに変えても、シスチン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、ＢＡＴ１はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
【００４８】
（３）ＢＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験
シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験を行った。基質シスチンの濃度の違いによるシスチン取り込み率の変化を調べることにより、ＢＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験を行った。シスチンの取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。
その結果、Ｋｍ値は３０５±４３．４μＭ、Ｖｍａｘ値は１９７０±３８０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ（平均±標準誤差、ｎ＝３）であった。
【００４９】
シスチン以外のＢＡＴ１の基質となるアミノ酸においても同様にミカエリス−メンテン動力学試験を行い、Ｋｍ値とＶｍａｘ値を算出した。
その結果、Ｋｍ値とＶｍａｘ値は、リジン、アルギニン、オルニチン、ロイシン、フェニルアラニンに対して、それぞれ４６３μＭ；２，９９０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、２０３μＭ；２，５７０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、３８７μＭ；２，５３０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、２６９μＭ；１，３３０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ、１９０μＭ；１，７３０ｐｍｏｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎであった。
【００５０】
（４）ＢＡＴ１の基質選択性（アミノ酸及びその類似物質添加による阻害実験）
ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞よるシスチンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
シスチンの取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。但し、５ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、１４Ｃ−シスチン（５０μＭ）の取り込みを測定した。
その結果を図８に示す。シスチン、塩基性アミノ酸および中性アミノ酸で、ｃｉｓ−阻害効果が観察された。アミノ酸輸送系Ｌ特異的阻害薬ＢＣＨ、アミノ酸輸送系Ａ特異的阻害薬ＭｅＡＩＢ、及びＤ−アミノ酸は、シスチン取り込みを全く阻害しないか、あるいは弱い阻害効果を示したのみであった。
【００５１】
（５）ＢＡＴ１の基質選択性（各種アミノ酸及びその類似物質を基質とする取り込み試験）
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、ＢＡＴ１による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、ラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞を用い、前記実施例２（１）記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、１４Ｃ−シスチンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
【００５２】
その結果を図９に示す。Ｌ−シスチン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−リジン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アルギニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−オルニチン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−ロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−イソロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−バリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−フェニルアラニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−チロシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−トリプトファン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−ヒスチジン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−メチオニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−グルタミン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アスパラギン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−スレオニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−システイン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−セリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アラニン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合に、ＣＯＳ−７細胞への取り込みが認められた。グリシン（１４Ｃ化合物）に関しては、極めて低い取り込みが見られた。Ｌ−プロリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−グルタミン酸（１４Ｃ化合物）、Ｌ−アスパラギン酸（１４Ｃ化合物）に関しては、有意な取り込みは認められなかった。
【００５３】
ヒトＢＡＴ１遺伝子、あるいはヒトｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞、及びヒトＢＡＴ１遺伝子とヒトｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞について、基質としてシスチンを用い、基質の取り込み実験を実施例２（１）に準じて行った。
その結果、シスチンの取り込みは、ラットと同様、ＢＡＴ１のみを導入したＣＯＳ−７細胞では、対照としてｃＤＮＡを含まないプラスミドを導入したＣＯＳ−７細胞と同レベルであったが、ＢＡＴ１とｒＢＡＴを共に発現させたＣＯＳ−７細胞では大きなシスチンの取り込みが観察された。よって、ヒトＢＡＴ１もラットＢＡＴ１と同様、ｒＢＡＴと共存することにより始めて機能を発揮することが示された。
【００５４】
【発明の効果】
本発明のシスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターＢＡＴ１およびその遺伝子は、アミノ酸類似化合物、薬物及び毒物の小腸上皮や腎尿細管上皮からの吸収のインビトロでの解析など、アミノ酸類似化合物、薬物及び毒物の動態の分子レベルでの解明、および小腸や腎尿細管での吸収効率の良いアミノ酸類似化合物、薬物の開発、透過するアミノ酸類似化合物、薬物及び毒物の透過を抑制する薬物の開発に有用と考えられる。さらに、ＢＡＴ１遺伝子は、シスチン尿症治療を目的とした遺伝子治療ベクターの作製に使用し得る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットＢＡＴ１とヒトＢＡＴ１のアミノ酸配列の比較を示す図。
【図２】ラットＢＡＴ１、ヒトｙ＋ＬＡＴ１、ラットＬＡＴ１、およびマウスｘＣＴのアミノ酸配列の比較を示す図。予想される膜貫通部位を付線で示した。
【図３】ラットの各臓器組織におけるＢＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した写真。
【図４】ラット腎の免疫組織化学的解析の結果を示した写真。抗ＢＡＴ１抗体（左）と抗ｒＢＡＴ抗体（右）を用いた。
【図５】ラット腎膜標本を用いたウェスタンブロット解析の結果を示した写真。抗ＢＡＴ１抗体（左）と抗ｒＢＡＴ抗体（右）を用い、非還元条件下（−）及び還元条件下（＋）で行った。
【図６】ラットＢＡＴ１遺伝子、ラットｒＢＡＴ遺伝子、あるいはラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞、及びラットＢＡＴ１遺伝子とラットｒＢＡＴ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞、ラットＢＡＴ１遺伝子とラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子を共に導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験の結果を示す図。
【図７】ラットＢＡＴ１遺伝子及びラットｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験において添加する塩の影響を調べた結果を示す図。
【図８】ラットＢＡＴ１遺伝子の及びラットｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞によるシスチン取り込み実験において、系への各種アミノ酸もしくはその類似化合物添加の影響を調べた結果を示す図。
【図９】ラットＢＡＴ１遺伝子及びラットｒＢＡＴ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞による放射能標識アミノ酸の取り込みを調べた結果を示す図。
Claims (18)
- 配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸トランスポーターであって、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とし、アミノ酸輸送活性化因子ｒＢＡＴにより活性化されるタンパク質。
- 組換えタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。
- ヒト又はラット由来である請求項１又は２に記載のタンパク質。
- 臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号２又は４で示される塩基配列、又は、配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなる遺伝子である請求項５に記載の遺伝子。
- ヒト又はラット由来である請求項５又は６に記載の遺伝子。
- 臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求項７に記載の遺伝子。
- 請求項５〜８のいずれかに記載の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド。
- プラスミドが、発現プラスミドである請求項９に記載のプラスミド。
- 請求項９又は１０記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
- 請求項１〜４のいずれかに記載するタンパク質に対する抗体。
- 請求項１〜４にいずれかに記載のタンパク質又は当該タンパク質を含有する細胞を用いて、該タンパク質の有するシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を測定する方法。
- 請求項１〜４にいずれかに記載のタンパク質又は当該タンパク質を含有する細胞を用いて、被検物質の生体内におけるシスチン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する体内動態を測定するための方法。
- 輸送活性化因子ｒＢＡＴを併用する請求項１３又は１４に記載の方法。
- 被検物質が薬物又は毒物若しくは外来性異物である請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
- 請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法により、シスチン、塩基性アミノ酸及び中性アミノ酸を基質とするトランスポーターにより細胞に取り込まれ易い又は細胞に取り込まれにくい物質をスクリーニングする方法。
- 腎尿細管上皮もしくは小腸上皮におけるスクリーニングである請求項１７に記載の方法。
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