JP4612971B2

JP4612971B2 - Lactococcus lactic acid bacteria isolated from kefir grains and food production method using the same

Info

Publication number: JP4612971B2
Application number: JP2001238579A
Authority: JP
Inventors: 英雅元島; 健治内田
Original assignee: Yotsuba Milk Products Co Ltd
Current assignee: Yotsuba Milk Products Co Ltd
Priority date: 2001-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2021-08-07
Also published as: JP2003047462A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケフィア粒から分離したラクトコッカス属乳酸菌とそれを用いた食品の製造法に関する。詳しくは、伝統的な発酵乳の１種であるケフィア（あるいはケフィールとも呼ばれる）から分離された乳酸菌とその利用に関するもので、より詳しくは免疫賦活効果を有する乳酸菌並びにこの乳酸菌を用いて、人において免疫賦活作用及び抗腫瘍効果を期待できる発酵乳等の食品を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ケフィア(Kefir) は、ロシアのコーカサス地方を起源とする発酵乳の１種である。これは、クリーム状でやや泡立ち、乳酸と微量のアルコール及び炭酸ガスを含み、爽快な風味を有している。
今日ロシアや東欧諸国を中心に生産されており、これらの国ではヨーグルトと同様に知られている。ケフィアの製造にはケフィア粒（ケフィール粒、ケフィールグレインとも呼ばれる。）と称される天然の発酵種がスターターとして用いられる。
【０００３】
ケフィア粒は、乳酸菌と酵母等の微生物が共生しており、白色から乳白色、半透明で、粒状の菌塊をなしたもので、数ミリから数センチの大きさがあり、弾力がある。外観はカリフラワー状を呈している。牛乳中であたかも１種類の菌のように増殖し、その性質を伝える。
このケフィア粒は、代々牛乳に植え継がれることで今日まで伝えられてきている。このケフィア粒の起源が何に由来するのかは知られていない。ケフィアに関する最も古い報告の一つは1881年発行の文献（Kern, E., Bull. de la societe naturalistes de Moscou LVI, 141-177, 1881)である。
【０００４】
この文献によると、ケフィアはコーカサスの北方の山岳民族であるオセット族などが愛飲していた発酵乳で、ケフィア粒は村の秘密とされていたらしい。今日のケフィア粒もこの文献の記載と基本的な性質に変化がないことが分かる。今日でもケフィアの製造には、代々植え継がれてきたケフィア粒を用いて製造される。ロシアで行われている典型的な製造方法は次のようなものである。まず、ケフィア粒を殺菌済みの脱脂乳などで一昼夜培養し、そのケフィア粒は金網等で漉しとる。
この漉しとった濾液をバルクスターターとする。漉しとったケフィア粒は次の製造に用いるために植え継がれる。牛乳を十分に殺菌した後（９０℃で１０分間程度）、２２℃まで冷却し、これにバルクスターターを２％から５％程度接種する。一昼夜２２℃で培養すると凝固するので、これを撹拌後、冷却して容器に充填する。これが典型的なケフィアである。これをヨーグルトのように食べる。
【０００５】
ヨーグルトなどが純粋な菌株を用いて製造されるのと違い、ケフィアは伝統的に植え継がれている天然の粒を製造に用いる点が大きな特徴である。
しかし、ケフィア粒がこのように継代培養によって維持されているために、例えば、大腸菌群に汚染されたり、菌叢が変化したり、本来ケフィアに特有でない酵母に汚染されたりした場合に、一定の品質を維持するということが困難であるという大きな欠点があった。
【０００６】
ところで、このケフィア及びケフィア粒の抽出物には従来から、数々の生理活性があることが報告されている。総説として、谷、大石らの文献（月刊フードケミカル、2001年3 月号、51-55 ページ）などがある。また、宮内らはケフィア粒より抽出した多糖類(KGP) がマクロファージを活性化させることにより抗血栓作用を示すことを報告している（宮内他、第80回、日本畜産学会大会要旨集、78（1987））。塩見らはケフィア粒から抽出した水溶性の多糖類を腫瘍細胞を移植されたマウスに接種させたところ、ザルコーマ180(SR180)で81％、エールリヒ腹水癌では59％の腫瘍増殖抑制効果を示し、その効果は生体の免疫機能を賦活化することに起因していると報告している（塩見ら、Jpn. J. Med. Sci. Biol., 35, 75 （1982））。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらはケフィア粒そのものから抽出した物質に関するものである。ケフィア粒を接種して、発酵するケフィアにおいては、ケフィア粒自体は、金網で漉し取るため、飲用に供するケフィア自体にはあまり含まれていない。
それ故、このような効果がケフィアの飲用においても、ケフィア粒抽出物と同様な効果を示すかどうかが問題である。
そのため、ケフィア粒から特定の菌株を分離して培養しても、ケフィア粒から製造したケフィアそのもののように免疫賦活作用及び抗腫瘍効果などの保健効果を期待できるかどうか分からないという問題があった。
本発明の目的は、ケフィアが有している免疫賦活作用や抗腫瘍作用に関与している菌株を探索し、これを発酵乳などの食品の製造に利用する方法を確立することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ケフィアは、上述のように、酵母と乳酸菌叢が複雑に共生しているため、均質な製品を製造することは困難である。しかも、製品中の酵母が低温下でも発酵を継続することによって、保存中に次第に品質が変化するため、安定した品質保持期限を設定することが困難である。
それ故、ケフィアが持つ免疫賦活効果等を有する菌株を特定できれば、ケフィアと同等の活性が期待できる安定な発酵乳製品等を製造できる。
そこで、出願人が維持、管理しているケフィア粒（以下、TCHRと略称することがある。) からケフィア粒を構成する乳酸菌を分離し、当該乳酸菌を用いて発酵乳を製造し、次いでこれを常法によって凍結乾燥したものを用いて、マウスにおける免疫賦活効果等を調べた。
その結果、ケフィア粒に由来する特定の菌株、特にラクトコッカス（Lactococcus)属に属する乳酸菌の中にケフィアと同等の免疫賦活効果と腫瘍増殖抑制効果を持つものがあることを見出した。この菌株を用いれば、免疫賦活効果と腫瘍増殖抑制効果がケフィアと同等であることを期待できる発酵乳などの食品を容易に製造できるようになる。
しかも、この乳酸菌はケフィア粒のような複雑な菌叢を有していないために、ケフィア以外の各種の発酵乳及び発酵乳製品のスターターとしても使用できる。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
請求項１記載の本発明は、ケフィア粒より分離した免疫賦活活性を有するラクトコッカス（Lactococcus)ＹＲＣ３７８０株（ＦＥＲＭＰ−１８３２０）に関する。
請求項２記載の本発明は、請求項１記載のラクトコッカスＹＲＣ３７８０株を用いることを特徴とする食品の製造法である。
請求項３記載の本発明は、食品が、発酵乳製品であることを特徴とする請求項２記載の食品の製造法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳しく説明する。
１）ケフィア粒からのラクトコッカス属乳酸菌の分離と同定
ケフィア粒から分離される代表的な乳酸菌は、ラクトバチルス・ケフィールアノファシェンス（Lactobacillus kefiranofaciens)、ラクトバチルス・ケフィールグラナム（Lactobacillus kefirgranum)、ラクトバチルス・ケフィール（Lactobacillus kefir)、ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis) 、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis) などである。
【００１１】
このうち、ラクトバチルス・ケフィールアノファシェンスは、特にケフィア粒中で多糖類を生産する菌株として特徴づけられる。一般にラクトバチルス属乳酸菌は、ＭＲＳ寒天培地、ＬＢＳ寒天培地、トマトジュース寒天培地等を用いることによって分離できる。しかし、ケフィア分離株のうち、特に多糖類を産出して粘稠性を示すラクトバチルス・ケフィールアノファシェンスは、特殊な培地でなければ増殖しない（Takizawaら、Int. J. Sys. Bacteriol., 435-439, 1994）。
これに対して、ラクトコッカス属乳酸菌はケフィアやケフィア粒からでも、通常用いられるＭ１７寒天培地を用いて容易に分離できる。すなわち、ケフィアあるいはケフィア粒を適当な方法で無菌的に分散、希釈してＭ１７寒天培地に塗沫し、３０℃で２〜７日間培養すると、コロニーを生じる。コロニーの形態、菌形態等から、ラクトコッカス属乳酸菌を容易に分離することができる。
ラクトコッカス属乳酸菌の分離及び同定は、既知の方法によって容易に実施することが可能である。例えば、Skinner, F. A. and Lovelock, D. W., Identification Methods for Microbiologists ( 2^nd ed.), Academic Press, 1979 あるいは小崎道雄監修、内村、岡田著、乳酸菌実験マニュアル（朝倉書店、1992年）に記載の方法に従えばよい。
【００１２】
このようにして、我々は長年に渡って継代培養しているケフィア粒からラクトコッカス・ラクティスＭ１７−１株を分離した。なお、分離源であるケフィア粒は、インターネット等を介して容易に購入することが可能であるので、出願人が維持、管理していたケフィア粒以外のものも、分離源とすることができる。
上記Ｍ１７−１株は、その後の同定によってラクトコッカス・ラクティスサブスピーシーズクレモリスであることが判明した。本発明者らは本菌をラクトコッカスＹＲＣ３７８０株と命名した。本菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭＰ−１８３２０である。
【００１３】
２）本発明に係るＹＲＣ３７８０株の菌学的性質
本菌の菌学的性質を調べるため、乳酸菌実験マニュアル（朝倉書店、1992年) に従って、以下の生化学的性状試験を行った。グラム染色、カタラーゼ試験、発酵形式、乳酸旋光性、生育温度試験、初発ｐＨ試験、アルギニンからのアンモニアの生成試験。また、16SrRNA 遺伝子配列による同定試験も行った。
その結果、本菌はグラム染色性が陽性の球菌で、カタラーゼ反応陰性、ホモ発酵性、Ｌ型乳酸を生産することが分かった。また、初発ｐＨ試験では、ｐＨ９．２、９．６共に生育しなかった。アルギニンからアンモニアを生産しなかった。
【００１４】
次に、耐塩性試験では４％、６．５％共に生育しなかった。生育温度試験では１０、１５、２５、３２℃では生育し、４０、４５℃は生育しなかった。
一方、API50 ＣＨ（日本ビオメリュー・バイテック製）を用いた糖発酵性試験では、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、セロビオース、ラクトースを発酵した。16S 同定では、ラクトコッカス・ラクティスサブスピーシーズクレモリスと配列が一致した。ラクトコッカス・ラクティスには、ラクティス（lactis）、ジアセチラクティス（diacetylactis)及びクレモリス（cremoris）の３種類の亜種が存在するが、今回行った16SrDNA の塩基配列、糖発酵性及びその他の性状すべてにおいて、ラクトコッカス・ラクティスサブスピーシーズクレモリスと一致した。
【００１５】
３）ＹＲＣ３７８０株の免疫賦活作用
本菌は、実施例に示したように、腫瘍増殖抑制作用を有しており、この効果は生体の免疫機能を賦活化することに起因している。
【００１６】
４）ＹＲＣ３７８０株を用いる発酵乳製品の製造
本菌は、常法に従ってチーズや発酵バターなどの発酵乳製品を製造する際に、スターターとして用いることができる。また、その他の発酵食品の製造に際し、単独で、もしくは他の菌株と組み合わせて用いることができる。
【００１７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
ケフィア粒からのラクトコッカス属乳酸菌の分離と同定
ケフィア粒からの特定の菌種の分離は常法により比較的容易に実施できる。この例では、Skinner, F. A. and Lovelock, D. W., Identification Methods for Microbiologists (2^nd ed.), Academic Press, 1979 あるいは小崎道雄監、内村、岡田著、乳酸菌実験マニュアル（朝倉書店、1992年）に従って行った。
ケフィア粒を無菌的に水に分散、希釈し、Ｍ１７寒天培地に塗抹し、３０℃で５日間培養した。生じたコロニーの中から形態の異なる数種のものを選択し、常法に従って分離し、これら菌株の性状を分析して同定した。
【００１８】
分離株の１種、Ｍ１７−１株は下記の性質を有していた。
(a) グラム染色性が陽性の球菌で、カタラーゼ陰性、ホモ発酵性、Ｌ型乳酸を生産する。
(b) 初発pH試験ではｐＨ９．２及び９．６で生育しない。耐塩性試験では４％及び６．５％共に生育しなかった。生育温度試験では、１０、１５、２５及び３２℃では生育したが、４０℃と４５℃では生育しなかった。
(c) アルギニンからアンモニアを生産しなかった。
(d) API50 ＣＨ（日本ビオメリュー・バイテック製）を用いた糖発酵性試験では、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、セロビオース、ラクトースを発酵した。
(e) 16S 同定では、ラクトコッカス・ラクティスサブスピーシーズクレモリスと配列が一致した。
以上のことから、本菌はラクトコッカス・ラクティスサブスピーシーズクレモリスであることが判明した。本発明者らは本菌をラクトコッカスＹＲＣ３７８０株と命名した。
【００１９】
実施例２
ＹＲＣ３７８０株によるマウスにおける腫瘍増殖抑制効果
供試動物として６週齢雄（入荷時指定週齢) のSPF 、BALB/cマウス（日本クレア製）を使用した。マウス結腸癌細胞株Colon26 （以下、Colon26 と略記することがある。）は、BALB/Cマウス直腸内にN-methyl-N-nitroso-urethanを繰り返し投与することにより発生した癌細胞株である。
これらを用いてマウスにおける腫瘍増殖抑制効果を調べた。なお、試験対象物質と投与量は以下の通りである。
(1)TCHR: 脱脂乳ケフィア凍結乾燥物（ケフィア粒TCHRで培養した脱脂発酵乳の凍結乾燥物 200mg/kg 投与）
(2)YCHR2: 脱脂乳ケフィア凍結乾燥物（ケフィア粒YCHR2 で培養した脱脂発酵乳の凍結乾燥物 200mg/kg 投与）
(3) M17-1: YRC3780株で培養した脱脂発酵乳の凍結乾燥物 200mg/kg投与
【００２０】
ここで使用した試験対象物の由来について説明する。TCHRは、典型的なケフィア粒で、出願人が長年にわたり継代培養しているものである。 YCHR2は、TCHRを改良して乳酸非発酵性酵母のみを含む改良ケフィア粒である。 YCHR2は、TCHRに比べてアルコール発酵が抑制されている。 YRC3780株は、ケフィア粒TCHRから分離し、保存している菌株である(FERM P-18320)。
【００２１】
試験対象物質の調製は以下の通りに行った。
TCHR, YCHR2 ：発酵したそれぞれのケフィア粒の濾液をスターターとして１０％(w/w) 還元脱脂乳８００ｍｌに３％接種し、２２℃で一昼夜培養した。
M17-1 ： YRC3780株（本菌株の１０％グリセロール凍結物をＭ１７ブロスに接種し、３０℃で１日間培養した。その培養液を１０％(w/w) 還元脱脂乳１０ｍｌに５％接種し、３０℃で２日間培養した。この培養液１０ｍｌをさらに２００ｍｌの還元脱脂乳に接種し、３０℃で２日間培養した。この培養液を８００ｍｌの還元脱脂乳に５％接種し、３０℃で２日間培養した。
【００２２】
培養物は、最終的に凍結乾燥実験装置(ULVAC製、DF-03H型) でフリーズドライして供試凍結乾燥物とした。対照として脱脂粉乳（商品名：脱脂粉乳、よつ葉乳業（株）製）を用いた。
試験の設定は以下の通りに実施した。

【００２３】
Colon26 担癌マウスの作製方法
in vivo で継代移植を継続しているColon26 担癌マウスより、腫瘍を摘出して癌細胞分離後使用した。皮下移植２１日目の担癌マウスより腫瘍部を摘出し、滅菌生理食塩水２０ｍｌを加えたシャーレ上に金属メッシュをのせ、メッシュ上で注射筒の内筒ゴム部を用いてすりつぶした。
すりつぶし分離させた細胞は、シャーレ内でピペットを用いて懸濁し、７００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた沈渣に再度滅菌生理食塩水を５ｍｌ加えて再浮遊し、０．０４％トリパンブルーを用いて細胞総数を測定した。
さらに７００ｒｐｍで５分間遠心後、滅菌生理食塩水を加え、癌細胞数１×１０⁵ ／１００μｌ／匹を腹部皮下に移植し、Colon26 担癌マウスを作製した。
【００２４】
試験項目及び試験方法
各試験対象物質及び脱脂粉乳は、蒸留水で溶解し濃度を調整した。マウスへの投与は、Colon26 担癌マウスを作製した翌日より、胃ゾンデを用いた強制経口投与にて２１日間連続して摂取を行った。
症状観察及び体重測定は、午前１０〜１１時に毎日実施した。皮下腫瘍体積の測定はノギスを用いて７、１４及び２１日目に測定し、下記の式に従って体積を求めた。
【００２５】
【数１】

【００２６】
本飼育終了後、頸椎脱臼にて動物屠殺した後に脾臓を摘出した。
【００２７】
ＮＫ活性の測定
摘出した脾臓は、５ｍｌの１０％FCS 加RPMI-1640 培地ペトリ皿中で、スライドグラス２枚の磨りガラス部分で挟み込みすりつぶし、更に金属メッシュを通し浮遊細胞液とした。１６００ｒｐｍ、５℃で２分間遠心後、１０％FCS 加RPMI-1640 培地中に浮遊させた。
その後、１０％FCS 加RPMI-1640 培地で細胞数を調製し、⁵¹Crをラベルした標的細胞YAC-1 とＥ：Ｔ比５０：１で４時間培養し、上清中に遊離した⁵¹CrからＮＫ活性を測定した。
【００２８】
サイトカイン産生能の測定
摘出した脾臓は、５ｍｌの１０％FCS 加RPMI-1640 培地ペトリ皿中で、スライドグラス２枚の磨りガラス部分で挟み込みすりつぶし、更に金属メッシュを通し浮遊細胞液とした。１６００ｒｐｍ、５℃で２分間遠心後、１０％FCS 加RPMI-1640 培地中に浮遊させた。浮遊させた脾臓細胞は、１０％FCS 加RPMI-1640 培地で細胞数を２×１０⁶ 個／ｍｌに調製し、２４孔のプレートに１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。更に、conA１０μｇ／ｍｌ、LPS10 μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂ インキュベータ中で４８時間培養し、その培養上清中のIL-2、IFN-γ及びTNF-αの濃度を測定した。
【００２９】
抗腫瘍効果
Colon26 結腸癌担癌マウスにTCHR、YCHR2 及びM17-1 を経口投与し、その抗腫瘍効果について腫瘍体積、ＮＫ活性並びにサイトカイン産生能を測定し、検討を行った。試験結果は、平均値±標準誤差で表し、有意差検定はStudent's t-Testを用いた。
癌細胞を移植した動物は、移植後から４日目までは各群において移植部位の肉眼及び触診による変化は見られなかったが、１０日目以降からは癌細胞の増殖に伴う腹部皮の隆起が確認されるようになった。１４日目以降では、対照群において顕著な体毛の立毛、腫瘍の大きな担癌マウスでは行動も不活発になり、うずくまりが観察された。体毛の立毛は、TCHR群及びM17-1 群においても軽度に観察された。
Colon26 担癌マウスの腫瘍体積の変化を第１表に、脾臓細胞のＮＫ活性を第２表に、脾臓細胞の各種サイトカイン産生量を第３表に示す。
【００３０】
【表１】
第１表 Colon26 担癌マウスの腫瘍体積（単位：ｍｍ³)の変化

平均値±ＳＥＭ
【００３１】
【表２】
第２表 Colon26 担癌マウスの脾臓細胞のＮＫ活性

平均値±ＳＥＭ * は有意差 p ＜0.01
【００３２】
【表３】
第３表 Colon26 担癌マウスの脾臓細胞の各種サイトカイン（濃度：pg/ml)

平均値±ＳＥＭ * は有意差 p ＜0.05
【００３３】
剖検時の観察では、TCHR群に大腸内容物の停滞が確認された。腫瘍体積（第１表）、７日目において対照群7.01±1.37mm³ 、TCHR群6.46±0.86mm³ 、YCHR2 群4.68±1.03mm³ 、M17-1 群6.81±1.03mm³ と癌の生着時期においては各群に差は観察されなかった。１４日目では対照群73.76 ± 16.31mm³ 、TCHR群56.12 ±10.94mm³、YCHR2 群47.70 ±6.70mm³ 、M17-1 群54.52 ±8.27mm³ と対照群に比較し各試験対象物質において低い値を示した。
更に、２１日目においても同様に、対照群127.46±28.18mm³、TCHR群88.89±17.32mm³、YCHR2群75.56±10.61mm³、M17-1 群86.36±13.10mm³と対照群に比較し腫瘍体積は増加抑制を示した。
【００３４】
ＮＫ活性（第２表）では、対照群0.97±0.17％に対しTCHR群2.60±0.20％、YCHR2 群2.17±0.21％、M17-1 群3.03±0.33％と有意（p<0.01）に上昇を示した。また、サイトカイン産生能（第３表）は、IL-2が対照群7.7 ±1.95pg/ml に対しTCHR群11.4±1.01pg/ml 、YCHR2 群15.1±1.61pg/ml 、M17-1 群13.6±1.56pg/ml とYCHR2 群が有意（p<0.05）に上昇した。
一方、 IFN- γについては対照群130.5 ±18.70pg/mlに対しTCHR群139.1 ±17.82pg/ml、YCHR2 群134.8 ±33.95pg/ml、M17-1 群197.8 ±25.46pg/ml、TNF-αについても同様に、対照群779.2 ±89.10pg/mlに対しTCHR群792.0 ±62.75pg/ml、YCHR2 群787.8 ±152.10pg/ml 、M17-1 群963.8 ±93.92pg/mlと、有意差は認められないもののM17-1 群において産生能が上昇した。
【００３５】
この結果から、試験対象物質３種のいずれにも腫瘍増殖抑制作用が確認され、その主な作用としてIL-2産生能の促進によるＮＫ活性の上昇作用と考えられた。
さらに、M17-1 群については、活性化されたＮＫ細胞からIFN-γを産生させると共に、炎症性のサイトカインであるTNF-αの産生効果作用も持つものと推測された。
以上より、TCHR、YCHR2 及びM17-1 は、Colon26 結腸癌担癌マウスに対し、経口投与において腫瘍増殖抑制効果を示すことが確認され、その作用としてはＮＫ活性の上昇並びにサイトカイン産生能を促進させることに起因するものと示唆された。
ＮＫ活性の有意の上昇と、各種サイトカインの指標から、特に本発明に係るＹＲＣ３７８０株は、単独でケフィア粒と同等の免疫賦活作用を有している上に、腫瘍増殖抑制活性を有しているものと期待できる。
【００３６】
実施例４
ＹＲＣ３７８０株を用いた発酵乳の製造
ＹＲＣ３７８０株（ＦＥＲＭＰ−１８３２０）を UHT牛乳に接種し、２２℃で一昼夜培養したところ、比較的柔らかいゲルを形成し、乳酸菌数が１０⁸ ／ｍｌ以上存在した。
また、得られた発酵乳は官能的にも清潔で新鮮な風味があり、良質であった。しかも、ラクトバチルス・カゼイなどの中温性の乳酸菌と一緒に３０℃で培養した場合も、良質な発酵乳を製造することができた。
このように、本発明のＹＲＣ３７８０株を用いることによって、容易にケフィアと同等の免疫賦活作用が期待できる発酵乳を製造することができる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により提供されるラクトコッカス属乳酸菌ＹＲＣ３７８０株は、免疫賦活活性を有している。ケフィア粒から分離されたラクトコッカス属乳酸菌が、このような作用を有していることはこれまで報告されていない。
しかも、ケフィアからの分離株である他のラクトバチルスケフィールアノファシェンスやラクトバチルスケフィールグラナムが単独では牛乳中で増殖し難いのに対して、本菌は牛乳中で良好に増殖できるため、発酵乳を初めとする様々な乳製品の製造に用いることができる。得られた乳製品は、実施例４で示したように、良好な風味を有している。
【００３８】
そのため、本発明によれば、ＹＲＣ３７８０株を用いて発酵乳などの各種食品を製造することにより、経口摂取で免疫賦活作用及び腫瘍増殖抑制作用を期待できる食品を製造することが可能である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a Lactococcus lactic acid bacterium isolated from kefir grains and a method for producing a food using the same. Specifically, it relates to lactic acid bacteria isolated from kefir (also called kefir), which is a kind of traditional fermented milk, and its use. More specifically, lactic acid bacteria having an immunostimulatory effect and these lactic acid bacteria are used in humans. The present invention relates to a method for producing a food such as fermented milk that can be expected to have an immunostimulatory action and an antitumor effect.
[0002]
[Prior art]
Kefir is a type of fermented milk originating from the Caucasus region of Russia. It is creamy and slightly foamed, contains lactic acid, a small amount of alcohol and carbon dioxide, and has a refreshing flavor.
Today it is produced mainly in Russia and Eastern European countries, where they are known as well as yogurt. For the production of kefir, natural fermented species called kefir grains (also called kefir grains or kefir grains) are used as starters.
[0003]
Kefir grains are symbiotic with microorganisms such as lactic acid bacteria and yeast, are white to milky white, translucent, and have a granular bacterial mass. They have a size of several millimeters to several centimeters and are elastic. The appearance is cauliflower-like. It grows in milk as if it were one type of fungus and conveys its properties.
This kefir grain has been handed down to date by being planted in milk for generations. It is not known what the origin of these kefir grains is from. One of the oldest reports on kefir is the 1881 publication (Kern, E., Bull. De la societe naturalistes de Moscou LVI, 141-177, 1881).
[0004]
According to this document, kefir is fermented milk that was loved by the Osset, a hill tribe in the north of the Caucasus, and kefir grains seemed to be the secret of the village. It can be seen that today's kefir grains have no change in the description and basic properties of this document. Even today, kefir is produced using kefir grains that have been planted for generations. A typical manufacturing method in Russia is as follows. First, kefir grains are cultured overnight in sterilized skim milk, and the kefir grains are strained with a wire mesh or the like.
This filtered filtrate is used as a bulk starter. The kefir grains that have been drenched are planted for use in subsequent production. After the milk is fully sterilized (at 90 ° C. for about 10 minutes), it is cooled to 22 ° C., and this is inoculated with a bulk starter of about 2% to 5%. When it is cultured all day and night at 22 ° C., it solidifies, and after stirring, it is cooled and filled into a container. This is a typical kefir. Eat this like yogurt.
[0005]
Unlike yogurt, which is produced using pure strains, kefir is characterized by the use of natural grains traditionally planted.
However, because the kefir grains are maintained by subculture in this way, for example, when they are contaminated by coliforms, the bacterial flora changes, or they are contaminated by yeast that is not inherently kefir, There was a major drawback that it was difficult to maintain the quality of the.
[0006]
By the way, it has been reported that the kefir and kefir granule extract have many physiological activities. For reviews, see Tani, Oishi et al. (Monthly Food Chemical, March 2001, pages 51-55). Miyauchi et al. Also reported that polysaccharides (KGP) extracted from kefir grains show antithrombotic action by activating macrophages (Miyauchi et al., 80th Annual Meeting of the Animal Husbandry Society of Japan, 78 (1987)). Shiomi et al. Inoculated mice transplanted with tumor cells with water-soluble polysaccharide extracted from kefir grains, showing 81% tumor growth suppression effect in Sarcoma 180 (SR180), 59% in Ehrlich ascites tumor, It has been reported that the effect is due to the activation of the immune function of the living body (Shiomi et al., Jpn. J. Med. Sci. Biol., 35, 75 (1982)).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, these relate to substances extracted from the kefir grains themselves. In a kefir that is inoculated with kefir grains and fermented, the kefir grains themselves are sown with a wire mesh, so that they are not so much contained in the kefir used for drinking.
Therefore, it is a problem whether such an effect is similar to that of kefir grain extract even when drinking kefir.
Therefore, even if a specific strain is isolated and cultured from kefir grains, there is a problem that it is not known whether health effects such as immunostimulatory effect and antitumor effect can be expected like kefir itself produced from kefir grains. .
An object of the present invention is to search for a strain involved in the immunostimulatory action and antitumor action possessed by kefir, and to establish a method for utilizing this for the production of foods such as fermented milk.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As described above, kefir has a complicated symbiosis of yeast and lactic acid bacterial flora, so it is difficult to produce a homogeneous product. In addition, since the yeast in the product continues fermentation even at low temperatures, the quality gradually changes during storage, so it is difficult to set a stable quality retention period.
Therefore, if a strain having an immunostimulatory effect or the like possessed by kefir can be identified, a stable fermented milk product or the like that can be expected to have the same activity as kefir can be produced.
Therefore, lactic acid bacteria constituting kefir grains are separated from kefir grains maintained and managed by the applicant (hereinafter sometimes abbreviated as TCHR), fermented milk is produced using the lactic acid bacteria, and then this is used. The immunostimulatory effect in mice was examined using a product freeze-dried by a conventional method.
As a result, it has been found that certain strains derived from kefir grains, particularly lactic acid bacteria belonging to the genus Lactococcus, have an immunostimulatory effect and tumor growth inhibitory effect equivalent to those of kefir. If this strain is used, foods such as fermented milk that can be expected to have an immunostimulatory effect and a tumor growth inhibitory effect equivalent to those of kefir can be easily produced.
Moreover, since this lactic acid bacterium does not have a complex bacterial flora such as kefir grains, it can also be used as a starter for various fermented milk and fermented milk products other than kefir. The present invention has been completed based on such findings.
[0009]
The present invention according to claim 1 relates to a Lactococcus YRC3780 strain (FERM P-18320) having immunostimulatory activity isolated from kefir grains.
The present invention according to claim 2 is a method for producing a food, characterized in that the Lactococcus YRC3780 strain according to claim 1 is used.
According to a third aspect of the invention, the food is a method for producing food according to claim 2, characterized in that it is a fermented dairy product.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the following, the present invention will be described in detail.
1) Isolation and identification of Lactococcus lactic acid bacteria from kefir grains Representative lactic acid bacteria isolated from kefir grains are Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kefir, Leuconostoc lactis, Lactococcus lactis, and the like.
[0011]
Among these, Lactobacillus kefir anofasis is particularly characterized as a strain that produces polysaccharides in kefir grains. In general, Lactobacillus lactic acid bacteria can be separated by using MRS agar medium, LBS agar medium, tomato juice agar medium, or the like. However, among kefir isolates, Lactobacillus kefir anofaciens, which produces polysaccharides and exhibits consistency, does not grow unless it is a special medium (Takizawa et al., Int. J. Sys. Bacteriol. , 435-439, 1994).
In contrast, Lactococcus lactic acid bacteria can be easily separated from kefir and kefir grains using a commonly used M17 agar medium. That is, when kefir or kefir grains are aseptically dispersed and diluted by an appropriate method, smeared on an M17 agar medium, and cultured at 30 ° C. for 2 to 7 days, colonies are formed. Lactococcus lactic acid bacteria can be easily separated from colony morphology, fungal morphology, and the like.
Isolation and identification of Lactococcus lactic acid bacteria can be easily performed by a known method. For example, Skinner, FA and Lovelock, DW , Identification Methods for Microbiologists (2 nd ed.), Academic Press, 1979 or Michio Ozaki supervision, Uchimura, Okada al., Lactic acid bacteria A Laboratory Manual (Asakura Shoten, 1992) to the method described in Just follow.
[0012]
In this way, we isolated Lactococcus lactis strain M17-1 from kefir grains that have been subcultured for many years. In addition, since the kefir grains which are separation sources can be easily purchased via the Internet or the like, those other than the kefir grains maintained and managed by the applicant can also be used as the separation sources.
The M17-1 strain was found to be Lactococcus lactis subspecies cremolith by subsequent identification. The present inventors named this bacterium Lactococcus YRC3780 strain. This bacterium is deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and its deposit number is FERM P-18320.
[0013]
2) Mycological properties of the YRC3780 strain according to the present invention In order to examine the mycological properties of this strain, the following biochemical property tests were conducted according to the lactic acid bacteria experiment manual (Asakura Shoten, 1992). Gram staining, catalase test, fermentation mode, lactate optical rotation, growth temperature test, initial pH test, ammonia production test from arginine. In addition, an identification test using a 16S rRNA gene sequence was also conducted.
As a result, it was found that this bacterium is a cocci with positive Gram stainability, negative catalase reaction, homofermentability, and L-type lactic acid. In the initial pH test, neither pH 9.2 nor 9.6 grew. No ammonia was produced from arginine.
[0014]
Next, in the salt tolerance test, neither 4% nor 6.5% grew. In the growth temperature test, it grew at 10, 15, 25, and 32 ° C, and did not grow at 40 and 45 ° C.
On the other hand, in the sugar fermentability test using API50 CH (manufactured by Biomeryu Bitech), galactose, glucose, fructose, mannose, N-acetylglucosamine, cellobiose, and lactose were fermented. 16S identification matched the sequence with Lactococcus lactis subspecies cremolith. Lactococcus lactis has three subspecies: lactis, diacetylactis and cremoris. All of the 16S rDNA nucleotide sequence, sugar fermentability, and other properties we performed this time. In Lactococcus lactis sub-species Cremolis.
[0015]
3) Immunostimulatory Action of YRC3780 Strain This bacterium has a tumor growth inhibitory action as shown in the Examples, and this effect is due to the activation of the immune function of the living body.
[0016]
4) Production of fermented dairy product using YRC3780 strain The present bacterium can be used as a starter when producing fermented dairy products such as cheese and fermented butter according to a conventional method. Moreover, in manufacturing other fermented foods, they can be used alone or in combination with other strains.
[0017]
【Example】
Next, the present invention will be described in detail with reference to examples.
Example 1
Isolation and Identification of Lactococcus Lactic Acid Bacteria from Kefir Grains Separation of specific bacterial species from kefir grains can be performed relatively easily by conventional methods. In this example, Skinner, FA and Lovelock, DW , Identification Methods for Microbiologists (2 nd ed.), Academic Press, 1979 or Michio Ozaki audit, Uchimura, Okada al., Lactic acid bacteria A Laboratory Manual (Asakura Shoten, 1992) was conducted according to .
Kefir grains were aseptically dispersed and diluted in water, smeared on M17 agar medium, and cultured at 30 ° C. for 5 days. Several types of colonies with different morphologies were selected from the resulting colonies, isolated according to a conventional method, and the properties of these strains were analyzed and identified.
[0018]
One of the isolates, the M17-1 strain, had the following properties.
(a) It is a cocci with positive Gram staining and produces catalase negative, homofermentative, L-type lactic acid.
(b) In the initial pH test, it does not grow at pH 9.2 or 9.6. In the salt tolerance test, neither 4% nor 6.5% grew. In the growth temperature test, it grew at 10, 15, 25 and 32 ° C, but did not grow at 40 ° C and 45 ° C.
(c) No ammonia was produced from arginine.
(d) In a sugar fermentability test using API50 CH (manufactured by Nihon Biomeryu Vitec), galactose, glucose, fructose, mannose, N-acetylglucosamine, cellobiose, and lactose were fermented.
(e) The 16S identification matched the sequence with Lactococcus lactis subspecies cremolith.
From the above, it was found that this bacterium is Lactococcus lactis subspecies cremolith. The present inventors named this bacterium Lactococcus YRC3780 strain.
[0019]
Example 2
Tumor growth inhibitory effect in mice by YRC3780 strain As test animals, 6-week-old male (designated age at arrival) SPF, BALB / c mice (manufactured by CLEA Japan) were used. The mouse colon cancer cell line Colon26 (hereinafter sometimes abbreviated as Colon26) is a cancer cell line generated by repeated administration of N-methyl-N-nitroso-urethan into the rectum of BALB / C mice.
These were used to examine the tumor growth inhibitory effect in mice. The test substances and doses are as follows.
(1) TCHR: lyophilized skim milk kefir lyophilized (administered 200 mg / kg lyophilized skim fermented milk cultured with kefir grains TCHR)
(2) YCHR2: lyophilized skim milk kefir freeze-dried (administered 200 mg / kg lyophilized fermented skim milk cultured with kefir grains YCHR2)
(3) M17-1: 200 mg / kg of lyophilized fermented milk cultivated with YRC3780 strain [0020]
The origin of the test object used here is demonstrated. TCHR is a typical kefir grain that the applicant has been subcultured for many years. YCHR2 is an improved kefir grain that contains only non-lactic fermentable yeast by improving TCHR. YCHR2 has suppressed alcohol fermentation compared to TCHR. The YRC3780 strain is a strain isolated from the kefir grain TCHR and stored (FERM P-18320).
[0021]
The test substance was prepared as follows.
TCHR, YCHR2: Each fermented kefir grain filtrate was inoculated as a starter with 10% (w / w) of reduced skim milk 3% and cultured at 22 ° C. overnight.
M17-1: YRC3780 strain (10% glycerol frozen product of this strain was inoculated into M17 broth and cultured for 1 day at 30 ° C. The culture was inoculated into 10% (w / w) reduced skim milk at 5%. Cultivated for 2 days at 30 ° C. 10 ml of this culture was further inoculated into 200 ml of reduced skim milk and cultured for 2 days at 30 ° C. This culture was inoculated with 5% of 800 ml of reduced skim milk at 30 ° C. Cultured for 2 days.
[0022]
The culture was finally freeze-dried with a freeze-drying experimental apparatus (ULVAC, model DF-03H) to obtain a test freeze-dried product. As a control, skim milk powder (trade name: skim milk powder, manufactured by Yotsuba Milk Industry Co., Ltd.) was used.
The test was set up as follows.

[0023]
Colon26 Method for producing tumor-bearing mice
Tumors were extracted from Colon26 tumor-bearing mice that have been continuously transplanted in vivo and used after isolation of cancer cells. A tumor part was extracted from a tumor-bearing mouse on the 21st day of subcutaneous transplantation, and a metal mesh was placed on a petri dish to which 20 ml of sterile physiological saline was added, and ground on the mesh using the inner cylinder rubber part of the syringe.
The ground and separated cells were suspended in a petri dish using a pipette and centrifuged at 700 rpm for 5 minutes. 5 ml of sterilized physiological saline was again added to the obtained sediment and resuspended, and the total number of cells was measured using 0.04% trypan blue.
After another centrifugation for 5 min at 700 rpm, a sterile physiological saline was added, the number 1 × 10 ⁵ / 100μl / mouse cancer cells transplanted into the abdominal subcutaneous, to prepare a Colon26 bearing mice.
[0024]
Test items and test methods Each test substance and skim milk powder were dissolved in distilled water to adjust the concentration. The administration to the mice was ingested continuously for 21 days by forced oral administration using a gastric sonde from the day after the production of Colon26 tumor-bearing mice.
Symptom observation and body weight measurement were performed every day from 10 to 11 am. Subcutaneous tumor volume was measured on the 7th, 14th and 21st days using calipers, and the volume was determined according to the following formula.
[0025]
[Expression 1]

[0026]
After the completion of this breeding, the animals were sacrificed by cervical dislocation and the spleen was removed.
[0027]
Measurement of NK activity The excised spleen was sandwiched and ground in 5 ml of a 10% FCS-added RPMI-1640 medium Petri dish with two glass slides and further passed through a metal mesh to obtain a floating cell solution. After centrifugation at 1600 rpm and 5 ° C. for 2 minutes, the suspension was suspended in a 10% FCS-added RPMI-1640 medium.
Thereafter, the number of cells was prepared in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, cultured with target cells YAC-1 labeled with ⁵¹ Cr at an E: T ratio of 50: 1 for 4 hours, and released from ⁵¹ Cr in the supernatant. NK activity was measured.
[0028]
Measurement of cytokine production ability The removed spleen was sandwiched and ground in 5 ml of a 10% FCS-added RPMI-1640 medium Petri dish with two glass slides and further passed through a metal mesh to obtain a floating cell solution. After centrifugation at 1600 rpm and 5 ° C. for 2 minutes, the suspension was suspended in a 10% FCS-added RPMI-1640 medium. The suspended spleen cells were adjusted to 2 × 10 ⁶ cells / ml with 10% FCS-added RPMI-1640 medium, and dispensed at 1 ml / well into a 24-well plate. Furthermore, conA 10 μg / ml and LPS 10 μg / ml were added, cultured in a 37 ° C., 5% CO ₂ incubator for 48 hours, and the concentrations of IL-2, IFN-γ and TNF-α in the culture supernatant were measured. did.
[0029]
Anti-tumor effect
Colon26 TCHR, YCHR2 and M17-1 were orally administered to colon cancer-bearing mice, and their antitumor effects were determined by measuring tumor volume, NK activity and cytokine production ability. Test results are expressed as mean ± standard error, and Student's t-Test was used for the significance test.
The animals transplanted with cancer cells did not show changes in the transplantation site with the naked eye or palpation in each group until the 4th day after the transplantation, but from the 10th day onward, the abdominal skin was raised with the proliferation of the cancer cells. Has been confirmed. From day 14 onwards, in the control group, remarkable hair growth of the hair, tumor-bearing mice with large tumors became inactive, and tingling was observed. Napped hair was slightly observed in the TCHR group and the M17-1 group.
Table 1 shows changes in tumor volume of colon26-bearing mice, Table 2 shows NK activity of spleen cells, and Table 3 shows production amounts of various cytokines of spleen cells.
[0030]
[Table 1]
Table 1 Changes in tumor volume (unit: mm ³ ) of Colon26 tumor-bearing mice

Mean value ± SEM
[0031]
[Table 2]
Table 2. NK activity of spleen cells of Colon26 tumor-bearing mice

Mean ± SEM * is significant difference p <0.01
[0032]
[Table 3]
Table 3. Various cytokines in spleen cells of colon26 tumor-bearing mice (concentration: pg / ml)

Mean ± SEM * is significant difference p <0.05
[0033]
At the time of necropsy, stagnation of colon contents was confirmed in the TCHR group. Tumor volume (Table 1), control engraftment on day 7 with control group 7.01 ± 1.37mm ³ , TCHR group 6.46 ± 0.86mm ³ , YCHR2 group 4.68 ± 1.03mm ³ , M17-1 group 6.81 ± 1.03mm ³ No difference was observed in each group in terms of time. On the 14th day, control group 73.76 ± 16.31 mm ³ , TCHR group 56.12 ± 10.94 mm ³ , YCHR2 group 47.70 ± 6.70 mm ³ , M17-1 group 54.52 ± 8.27 mm ³ showed that.
Furthermore, on the 21st day as well, the control group 127.46 ± 28.18 mm ³ , the TRTR group 88.89 ± 17.32 mm ³ , the YCHR2 group 75.56 ± 10.61 mm ³ , and the M17-1 group 86.36 ± 13.10 mm ³ compared with the control group. The volume showed an increase suppression.
[0034]
In NK activity (Table 2), the control group 0.97 ± 0.17% showed a significant increase (p <0.01) with 2.60 ± 0.20% in the TRTR group, 2.17 ± 0.21% in the YCHR2 group, and 3.03 ± 0.33% in the M17-1 group. It was. Cytokine production capacity (Table 3) is as follows: IL-2 is 17.7 ± 1.61 pg / ml in the CHTR group, 15.1 ± 1.61 pg / ml in the YCHR2 group, and 13.6 ± 1 in the M17-1 group compared to 7.7 ± 1.95 pg / ml in the control group. 1.56pg / ml and YCHR2 group were significantly increased (p <0.05).
On the other hand, for IFN-γ, control group 130.5 ± 18.70 pg / ml, TCHR group 139.1 ± 17.82 pg / ml, YCHR2 group 134.8 ± 33.95 pg / ml, M17-1 group 197.8 ± 25.46 pg / ml, TNF-α Similarly, the control group 779.2 ± 89.10 pg / ml was not significantly different from the TCHR group 792.0 ± 62.75 pg / ml, the YCHR2 group 787.8 ± 152.10 pg / ml, and the M17-1 group 963.8 ± 93.92 pg / ml. However, productivity increased in the M17-1 group.
[0035]
From these results, the tumor growth inhibitory action was confirmed in all of the three test substances, and the main action was considered to be the action of increasing NK activity by promoting the ability to produce IL-2.
Furthermore, it was speculated that the M17-1 group had IFN-γ production from activated NK cells and also had an effect of producing TNF-α, an inflammatory cytokine.
Based on the above, it was confirmed that TCHR, YCHR2 and M17-1 show tumor growth inhibitory effects in oral administration to colon26 colon cancer-bearing mice, and the effects thereof are increased NK activity and cytokine production ability. It was suggested that it was caused by this.
From the significant increase in NK activity and various cytokine indices, the YRC3780 strain in particular according to the present invention has an immunostimulatory action equivalent to that of kefir grains alone and also has a tumor growth inhibitory activity. I can expect it.
[0036]
Example 4
Production of fermented milk using YRC3780 strain YRC3780 strain (FERM P-18320) was inoculated into UHT milk and cultured all day and night at 22 ° C. As a result, a relatively soft gel was formed and the number of lactic acid bacteria was 10 ⁸ / ml or more. .
The obtained fermented milk was sensuously clean and fresh and had a good quality. Moreover, even when cultured at 30 ° C. with mesophilic lactic acid bacteria such as Lactobacillus casei, it was possible to produce high-quality fermented milk.
Thus, by using the YRC3780 strain of the present invention, fermented milk that can easily be expected to have an immunostimulatory effect equivalent to that of kefir can be produced.
[0037]
【The invention's effect】
The Lactococcus lactic acid bacterium YRC3780 strain provided by the present invention has immunostimulatory activity. It has not been reported so far that Lactococcus lactic acid bacteria isolated from kefir grains have such an action.
Moreover, while other Lactobacillus kefir anophagens and Lactobacillus kefir granum isolates from kefir are difficult to grow in milk alone, this bacteria can grow well in milk, It can be used for the production of various dairy products including fermented milk. The obtained dairy product has a good flavor as shown in Example 4.
[0038]
Therefore, according to the present invention, by producing various foods such as fermented milk using the YRC3780 strain, it is possible to produce foods that can be expected to have an immunostimulatory effect and a tumor growth inhibitory effect when taken orally.

Claims

Lactococcus YRC3780 strain (FERM P-18320) having immunostimulatory activity isolated from kefir grains.

A method for producing a food comprising using the Lactococcus YRC3780 strain according to claim 1.

The method for producing a food according to claim 2 , wherein the food is a fermented milk product.