JP4629993B2

JP4629993B2 - ピラゾロン誘導体及びテロメラーゼ阻害剤

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Inventors: きみ子室伏; 千寿子古関; 高小野; 康孝垣内
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Description

本発明は、テロメラーゼ阻害活性及び抗腫瘍活性を有するピラゾロン誘導体に関する。

染色体の末端部位（テロメア）の伸長を担う逆転写酵素、テロメラーゼを標的とした新薬の開発は、主に抗がん剤及び再生医療への応用に向けて盛んにおこなわれている。特に制がん剤について、(1)テロメラーゼ活性は生殖細胞や幹細胞にのみ見られ体細胞では見られない、(2)ヒトがん組織の多くはテロメラーゼ活性を持ち、一方、不死化したがん細胞のテロメラーゼ活性を阻害するとテロメア短縮、老化、細胞死が起こる、などのことから、正常細胞にたいする副作用が少なく、一方で広範な種類のがんに対する効果が発揮されるものとして期待されている。

テロメラーゼ酵素活性を阻害するために様々な試みがなされている。これまで研究されてきたテロメラーゼ酵素の活性を抑制・阻害する薬剤としては大きく分けて(1)テロメラーゼに対するアンチセンス、(2)リボザイム、(3)G-quadruplex安定化剤、(4)その他の阻害剤の４つが挙げられる。これらのテロメラーゼ阻害剤について以下に簡単に説明する。

（１）テロメラーゼに対するアンチセンス
テロメラーゼ酵素複合体中のhTRに相補的な配列を持つ一本鎖DNAもしくはRNAを導入することにより、テロメラーゼ酵素の活性を抑える方法である。RNAの場合は内在的に発現させたものを、DNAの場合は合成オリゴDNA を用いることが多い。合成オリゴDNAの場合は、酵素による分解を防ぐ目的で化学修飾を導入することが多い。ヒトではhTR中の最初の185塩基に対するアンチセンスが有効である。合成オリゴDNAのうち、バックボーンがグリシンから成るペプチド核酸はプロテアーゼやヌクレアーゼによる分解に対して極めて強いという利点を持つ。

（２）リボザイム
trans位のRNAを分解（開裂）する活性をもつRNA酵素（リボザイム）がテロメラーゼ阻害剤として用いられる。hTRの鋳型配列をリボザイムのターゲットにする点はアンチセンス技術の応用である。ハンマーヘッド型のリボザイムが用いられる。

（３）G-quadruplex構造の安定化剤
G-quadruplex構造はテロメア部を特徴づける構造として提案されている。ヒトテロメア配列ではd(AG3(T2AG3)3)が同一分子内で折りたたまれ、4つの同じ配列が平行して縄状の構造が形成される。テロメアが伸長する際にはこの構造が解離される必要があるため、G-quadruplex構造を安定化させる薬剤はテロメラーゼ活性を阻害する。G-quadruplex構造にはいくつかの型があり、薬剤により異なる親和性を示すものもある。

（４）その他
テロメラーゼ酵素タンパク質に対する阻害剤（catalytic inhibitor）、酵素複合体を構成するサブユニットの結合サイトに干渉して複合体形成を阻害するもの、dNTP基質の酵素への結合を競争的に阻害する不活化したヌクレオチド（nucleoside analog）、dominant-negative型のhTERTまたはその発現ベクターを導入する、などがある。

これらのうち、G-quadruplex構造の安定化に基づくテロメラーゼ阻害剤として主に以下のような化合物が知られている。

ペリレン誘導体
例えば、ペリレンジイミド及び3,4,9,10-ペリレンテトラカルボン酸ジイミド等が挙げられる。

キノリン及びキノリン関連物質
例えば、2,4,6-トリアミノ-1,3,5-トリアジン、12459（の一種）、10H-インドロ[3,2-b]キノリン、フルオロキノフェノキサジン及びアントラキノン等が挙げられる。

ポルフィリン関連物質
例えば、TMPyPが挙げられる。

テロメスタチン
代表的なG-quadruplex構造をターゲットとした阻害剤（ＷＯ００／２４７４７号パンフレット）。

このように、テロメラーゼ酵素によるテロメア反復配列の付加において異なるステップをターゲットとした種々のテロメラーゼ阻害剤が開発されている。これらを組み合わることでより効果的ながん治療が期待できることから、新しい阻害様式又は新規な構造をもつ薬剤の開発は重要である。

国際公開第00/24747号パンフレット

本発明は新規なテロメラーゼ阻害剤又は抗腫瘍剤を提供することを目的とする。

本発明者らはテロメラーゼ酵素阻害剤としてまだ報告のないピラゾロン系の化合物について研究したところ、ある種のピラゾロン誘導体がテロメラーゼ酵素阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（１）：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子である。］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含むテロメラーゼ阻害剤。

（２）Ｘ_３およびＸ_５がハロゲン原子である前記（１）記載のテロメラーゼ阻害剤。

（３）Ｘ_３およびＸ_５が塩素である前記（２）記載のテロメラーゼ阻害剤。

（４）下記式（１）：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子である。］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍剤。

（５）Ｘ_３およびＸ_５がハロゲン原子である前記（４）記載の抗腫瘍剤。

（６）Ｘ_３およびＸ_５が塩素である前記（５）記載の抗腫瘍剤。

（７）下記式（１）：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子である。但し、Ｘ_１〜Ｘ_５のうち少なくとも１つはハロゲン原子である。］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。

（８）Ｘ_３およびＸ_５がハロゲン原子である前記（７）記載の化合物。

（９）Ｘ_３およびＸ_５が塩素である前記（８）記載の化合物。

（１０）
下記式(i)：

［式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。］
の化合物と、下記式(ii)：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子である。］
の化合物とを反応させて、下記式(iii)：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は上記定義のとおりである。］
の化合物を得て、次いで化合物(iii)を塩素化剤で塩素化して下記式（１）：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は上記定義のとおりである。］
の化合物を得ることを含む式（１）の化合物の製造方法。

本発明で用いられる式（１）のピラゾロン誘導体は顕著なテロメラーゼ阻害活性を有し、本発明により新しいクラスのテロメラーゼ阻害剤及び抗腫瘍剤が提供される。

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明のテロメラーゼ阻害剤及び抗腫瘍剤は有効成分として以下の式（１）：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子である。］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する。

式（１）の化合物において、Ｘ_１〜Ｘ_５は互いに独立して水素原子又はハロゲン原子であり、ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素等が挙げられる。好ましくはＸ_１〜Ｘ_５のうち少なくとも１つがハロゲン原子であり、さらに好ましくはＸ_３およびＸ_５がともにハロゲン原子であり、最も好ましくはＸ_１およびＸ_５が、又はＸ_３およびＸ_５がともに塩素原子である。

なお、Ｘ_１〜Ｘ_５がいずれも水素原子である式（１）の化合物は公知であるが、Ｘ_１〜Ｘ_５のうち少なくとも１つがハロゲン原子である式（１）の化合物は本発明者らが見出した新規なピラゾロン誘導体である。

式（１）の化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩が挙げられる。

次に、一般式（１）で表されるピラゾロン誘導体の製造方法について説明する。

フェニル基を有するピラゾロン骨格の合成方法としては以下に示すようなジケテンとフェニルヒドラジンとの反応による方法が知られている。

この方法はフェニル基が無置換の場合には良好な収率で目的とするフェニルピラゾロン化合物２が得られる。しかしながら、下記のように原料としてハロゲン化フェニルヒドラジンを用いると目的とするハロゲン化フェニルピラゾロン化合物４を得ることはできず、主にジケテンに２分子のハロゲン化フェニルヒドラジンが導入された化合物５が生成することがわかった。

従って、本発明の化合物を製造するための新たな合成経路を探索しなければならない。本発明者らはフェニルピラゾロン化合物の新規な製造方法について鋭意検討した結果、β-ケトエステル（又はβ-ケト酸）と（ハロゲン化）フェニルヒドラジンとを反応させることにより収率よく（ハロゲン化）フェニルピラゾロン化合物を合成できることを見出した。即ち、本発明の製造方法は、下記式(i)：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は上記定義のとおりである。］
の化合物を得ることを含む式（１）の化合物の製造方法である。

上記製造方法において、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であるが、好ましくはメチル基、エチル基又はプロピル基である。また、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子であるが、好ましくはＸ_１〜Ｘ_５のうち少なくとも１つはハロゲン原子であり、さらに好ましくはＸ_１〜Ｘ_５のうち少なくとも１つは塩素原子である。

式(i)の化合物と式(ii)の化合物との反応は、例えば、酢酸、プロピオン酸、アセトニトリル、トルエン、等の溶媒中で７０℃〜還流温度で行なわれる。反応時間は反応温度等に応じて適宜設定すればよいが、通常２〜２０時間である。反応終了後、生成した化合物(iii)は通常の精製手段（例えば、濾過、有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等）により精製してもよいが、反応溶液から単離精製せずに次の反応に用いてもよい。

次いで、化合物(iii)を塩素化剤で塩素化して化合物（１）を得ることができる。

塩素化剤としては、例えば、1,3-ジクロロ-4,4-ジメチルヒダントイン：

やN-クロロスクシンイミド、塩素等が挙げられる。塩素化反応は溶媒として、例えば、酢酸、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等を用いて、０〜１００℃で１０〜６０分行なう。反応終了後、粗生成物を通常の精製手段（例えば、濾過、有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等）、好ましくは酢酸からの再結晶により化合物（１）を得る。

本発明で用いられるピラゾロン誘導体は、テロメア部のG-quadruplex構造を強く安定化し、これによりテロメラーゼ活性が阻害される。本発明のテロメラーゼ阻害剤はテロメラーゼの活性を阻害することにより広いスペクトルを有する抗腫瘍剤としても有用である。テロメラーゼは広範な悪性腫瘍に存在し（例えば、皮膚、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、頸部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系（CNS）、網膜及び血液の腫瘍細胞系を含めた全ての悪性腫瘍のうち85％以上でテロメラーゼが見出されている。）、正常体細胞にはほとんど存在しないため、腫瘍細胞に対してのみ作用する。

本発明のテロメラーゼ阻害剤又は抗腫瘍剤を使用する際の薬学的投与形態としては、目的に応じて各種の薬学的投与形態を採用でき、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、液剤、丸剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、エアゾール剤、点眼剤等の非経口剤のいずれでもよく、これら投与形態は、それぞれ当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。

経口用固形製剤を調製する場合には、有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等を製造することができる。賦形剤としては、例えば乳糖、蔗糖、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シェラック、白糖等が、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が使用できる。その他、着色剤、矯臭剤等は通常公知のものを用いることができる。なお、錠剤は、必要に応じ周知の方法により通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、その他、二重錠、多層錠とすることができる。

経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が使用できる。

注射剤を調製する場合には、有効成分に、希釈剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により静脈内、筋肉内、皮下、皮内並びに腹腔内用注射剤を製造できる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。ｐＨ調製剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸等が使用できる。等張化剤としては塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が使用できる。

坐剤を調製する場合には、有効成分に基剤、さらに必要に応じて界面活性剤等を加えた後、常法により坐剤を製造することができる。基剤としては、例えばマクロゴール、ラノリン、カカオ油、脂肪酸トリグリセライド、ウィテップゾール（ダイナマイトノーベルズ社製）等の油性基剤を用いることができる。

軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定化剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が、保存剤としてはパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が使用できる。

貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に有効成分と前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが使用できる。

更に、上記各製剤には、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。

本発明の製剤に含有されるべき有効成分（即ち、式（１）のピラゾロン誘導体）の量は特に限定されるものではなく、投与形態に応じて適宜選択されるが、通常それらの製剤中１〜７０重量％とするのがよい。

かくして得られる本発明の製剤の投与方法は、特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて適宜決定される。例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより投与され得る。これは必要に応じてブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することもできる。錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明の抗腫瘍剤は、経口投与又は経腸投与され得る。坐剤は直腸内投与できる。

上記の各投与単位形態中に配合されるべき有効成分の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により適宜設定できるが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約1〜1000mg、注射剤では約0.1〜500mg、坐剤では約5〜1000mgとするのが望ましい。

また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別、その他の条件等に応じて適宜選択されるが、例えば、通常成人１日あたり約0.1〜1000mg/kg、好ましくは約1〜100mg/kgとすれば良く、これを１日１回又は2〜4回程度に分けて投与することができる。

本発明の製剤を投与することにより治療できる腫瘍としては、特に制限されるものではなく、例えば、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、胆嚢・胆管がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、子宮頸がん、皮膚がん、脳腫瘍等の固形の悪性腫瘍、悪性リンパ腫、白血病などが挙げられ、好ましくは固形の悪性腫瘍である。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）4,4-ジクロロ-1-(2,4-ジクロロフェニル)-3-メチル-5-ピラゾロンの製造

アセト酢酸エチル22.9ｇ(176mmol)と2,4-ジクロロフェニルヒドラジン31.1g(176mmol)とを酢酸に溶解し、110〜111℃で16時間反応させた。反応終了後、反応溶液を室温に冷却し、水及び飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を留去して1-(2,4-ジクロロフェニル)-3-メチル-5-ピラゾロン（30.25g，71％）を得た。次に、1-(2,4-ジクロロフェニル)-3-メチル-5-ピラゾロン15.0g(61.7mmol)と塩素化剤として1,3-ジクロロ-4,4-ジメチルヒダントイン12.2g(61.7mmol)とを酢酸に溶解し、15〜20℃で30分間反応させた。反応終了後、反応溶液を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去して粗生成物を得た。粗生成物は黄褐色に着色していたので酢酸から再結晶した。析出した結晶を濾取して標題の化合物を白色固体として得た(14.53g，76％、融点91.6℃)。

（実施例２）
4,4-ジクロロ-1-(2,6-ジクロロフェニル)-3-メチル-5-ピラゾロン(＃17341)の合成

フェニルヒドラジン化合物として2,6-ジクロロフェニルヒドラジンを用いる以外は実施例１と同様にして標題の化合物を合成した。

♯17341によるテロメラーゼ阻害の反応速度論的解析（TRAP _EZE アッセイ）
テロメラーゼ酵素活性の測定はIntergen社のTRAP_EZE telomerase detection kitを用いた。このキットはTRAP法に基づいている。すなわち、テロメラーゼ酵素活性により鋳型DNA配列にテロメア反復配列が付加され、次いで伸長したテロメア配列がPCR反応により増幅される。TRAP_EZEキットはPCR反応に内部標準を含んでおり、これにより広い濃度範囲にわたり高精度の定量性が実現されていることからテロメラーゼ酵素活性の検出に広く用いられている。

まずアッセイに用いるテロメラーゼ酵素を、数種の培養がん細胞より抽出した。T 細胞由来のがん細胞株であるNamalwa細胞株が高いテロメラーゼ活性を示すことがすでに確認されていたことから、細胞抽出液はこの細胞株より得た。細胞抽出液は次のようにして得た。対数増殖期の細胞(3×10⁷cell)をPBSで2回洗浄後、50μLのlysisバッファ(8.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.85mM MgCl₂, 0.85mM EGTA(pH 7.5)、4.25mM β-ME、0.425％ CHAPS、8.5％グリセロール、1mM PMSF、 10μg/mL leupepsin、25μg/mL pepstatin、1mM DTT、10mM NaF、100μMNa₃VO₄、50μg/mL Bowman-Birk)中で氷温にて破砕した。30分間氷温で静置後、55000rpm、4℃で30分間遠心して上清を回収して細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液はBradford法でタンパク質濃度を測定後、分注して-80℃で保存した。

アッセイ系の検討
反応速度論的解析をおこなうため、適切なテロメラーゼ酵素の反応速度を決定した。このため、アッセイ系について以下のチェックをおこなった。3種類の濃度の酵素溶液を用意し(50μL当たり0.04、0.1及び0.25μgの総タンパク質量)、30℃でテロメラーゼ伸長反応をおこなった。反応開始後0、5、10、15、20、30、40及び60分経過したサンプルをそれぞれPCR増幅した。検討した範囲において、いずれのタンパク質濃度においてもTRAP_EZEキットによる最終生成物量は時間の経過とともに線形的に増加することが示された。反応速度のタンパク質濃度依存性は、検討した範囲内で線形性を示し、すなわち、検討した条件において最終生成物量は反応速度に比例した。この結果に基づき、アッセイは50μL当たりの総タンパク質量が0.1μgである濃度のタンパク質溶液を用い、反応開始30分後の生成物について測定することとした。

アッセイ
アッセイはマニュアルで指定されたスケールの4分の1でおこなった(12.5μL/reaction)。細胞抽出液は反応時の総タンパク質濃度が0.025μg/12.5μLとなるように蒸留水で希釈した。10×TRAP reaction Buffer 1.25Μl、50×dNTP Mix 0.25μL、TS primer 0.25μL、TRAP Primer Mix 0.25μL、Taq polymerase 0.1μL、蒸留水7.9μLを氷温で混合した(TRAP反応液)。ただしTS primer は指示通りの濃度(1×TS)のほか、適切な濃度に蒸留水で希釈したものを用いた。阻害剤(反応時濃度の50倍)2.5μL、細胞抽出液22.5μLを混合し、このうちの2.5μLを上記のTRAP反応液と混合した。サーマルサイクラーで30℃/30分処理をおこなった後、94℃/30秒-59℃/30秒を34サイクルおこなった。PCRを終えたサンプル12.5μLに泳動バッファ1.25μLを加えた。

PCRを終えたサンプル50μLに泳動バッファ5μLを加えて10％アクリルアミドゲルで電気泳動した(15mA)。SYBER Green 5μLを100mLの0.5×TBEバッファに希釈し、ゲルを浸して30分間振とうした。蒸留水で10分間リンスした後、FLA-2000により蛍光強度を測定した。結果は統計ソフトKYplotを用いて解析した。

反応速度論的解析に際しては、解析対象となる基質（TSプライマー、dATP、dGTP、あるいはTTPのうちのひとつ）の濃度が段階的に異なる反応液を調製し、サーマルサイクラーで30℃/30分をおこなった。95℃/2分処理によりテロメラーゼ酵素を失活させた後、各サンプルにそれぞれ対象基質を加え、最終濃度が同一となるようにした（最終濃度はTSプライマーで375nM、dNTPで75μM）。添加する液量は1.5μLとし（最終液量が14μL）、TRAP反応バッファ及び対象外の基質も加えてこれらの最終濃度が影響されないようにした。以降のPCR増幅反応は通常どおりおこなった。

♯17341によるテロメラーゼの阻害様式
ｉ）TSプライマー基質の場合
反応速度に及ぼすTSプライマー濃度の影響を、#17341が0、0.2、0.5、1μMの条件下で測定した。なお、伸長反応の終了後はPCR反応時のTSプライマー濃度が均一となるよう補正を行った。#17341の存在下におけるTSプライマー濃度と反応速度との関係についてプロットすると双曲線型のTSプライマー濃度-反応速度応答曲線が得られた（図１）。最大の反応速度(Vmax)はTSプライマー濃度がおよそ50nMより高い範囲で得られ、#17341の濃度が増すにしたがってVmaxは明らかに減少した。このことから非拮抗タイプの阻害であることが示唆された。このデータをもとにLineweaver-Burk両逆数プロットをおこない（図２）、この結果をもとに#17341阻害剤が存在しない場合、存在する場合のそれぞれについてTSプライマーのMichaelis-Menten定数(それぞれKm及びαKm)、並びにTSプライマーが存在しない場合、する場合のそれぞれについて#17341の結合定数(それぞれKi及びαKi)を決定したところ、αKmはKmのおよそ2倍程度であることが分かった。すなわち、#17341はTSプライマーのテロメラーゼ酵素への結合を阻害することが示された。一方、αKiもKiよりやや高く、#17341は酵素-DNA複合体より酵素単体により結合しやすいことが示された。

ｉｉ）dNTP基質の場合
TSプライマーと同じくテロメラーゼ酵素の基質であるdNTPsについても同様の解析をおこなった。テロメラーゼ酵素によりテロメアに付加される配列は(TTAGGG)nであるから、dATP、dGTP及びTTPが酵素の基質となる。これら3つの基質について、#17341が0、0.1及び1.0μMの条件下でテロメラーゼ酵素反応速度の濃度依存性を解析した。TSプライマーの場合と同様、双曲線型のdNTPs濃度-反応速度応答曲線が得られた（図３）。いずれの基質についても約5μM程度で反応の最大速度(Vmax)に達し、#17341の濃度が増すにしたがいVmaxは減少した。このデータをもとに、Line-weaverプロットを行なったところ（図４）、dATP、dGTP、TTPのMichaelis-Menten定数はそれぞれ340nM、980nM、530nMとなった。一方、#17341濃度が増加するに伴いプロットは平行に移動した。これは不拮抗型の阻害様式に見られる特徴である。すなわち#17341はdNTPsの酵素への結合は阻害しないが、酵素-基質複合体には結合して反応を阻害する。

テロメラーゼ阻害の作用モデル
テロメラーゼ酵素によるテロメア伸長反応は、TSプライマーとdNTPによる2基質-1生成物反応と考えることができる。テロメラーゼ酵素はテロメア末端部（TSプライマーに相当）に結合し、さらにdATP、dGTP及びTTPを基質としてテロメア反復配列を付加する。上述した反応速度論的解析により、TSプライマーを基質とした反応に対して#17341は拮抗・非拮抗の混合型の阻害様式を示した。すなわち、この基質に関して#17341は酵素単体に作用してテロメア配列への結合を阻害し、またテロメア配列に結合した酵素の活性も阻害する。一方、dNTPを基質とした反応に対して#17341は不拮抗型の阻害様式を示した。すなわち#17341はdNTPのテロメラーゼ酵素への結合は阻害しないが、dNTPが結合したテロメラーゼ酵素に対して阻害を示した。TSプライマーの結合定数が約5nMであるのに対してdNTPのそれは約300-1000nMであり、TSプライマーへの結合がはるかに起こりやすいことが示された。またTSプライマーを対象とした解析で酵素単体に対する阻害が示されたこと、及び酵素-DNA複合体より酵素単体への親和性がより高いことから、#17341はテロメラーゼ酵素タンパク質に対する阻害作用を有すると考えられる。

（実施例３）培養がん細胞に対する効果
細胞の培養方法
実験に用いた細胞は以下のようにして培養した。
T細胞由来のがん細胞株であるNamalwa、MOLT-4、Bリンパ球由来のがん細胞株であるREH細胞株、テロメラーゼ酵素活性を持たない細胞として繊維芽細胞であるTIG-3細胞を用いた。Namalwa、MOLT-4及びREH細胞株（いずれも浮遊細胞）はRPMI1640培地/10％FBSで10cmプラスチック培養皿（コーティング無し）を、TIG-3細胞株（接着細胞）はMEM培地/10％FBSで10cmプラスチック培養皿（コーティング有り）を用い、37℃/5％CO₂の恒温インキューベータ中で培養した。Namalwa、MOLT-4及びREH細胞は4日に一度、TIG-3細胞は7日に一度の継代をおこなった。

#17341による細胞増殖の阻害効果を検討する際は、いずれの細胞も6cmプラスチック培養皿を用いた。添加する#17341はメタノール中に50mMで調製し、-20℃で保存した。使用する直前に50％メタノールで2mM溶液を調製し、RPMI1640培地(浮遊がん細胞)、もしくはMEM培地(TIG-3細胞)に加えて所定の濃度とした。培地中のメタノール濃度はすべて0.5％とした。4種類の浮遊がん細胞群は4日に一度、TIG-3細胞は7日に一度、その都度新しく調製した#17341を含む培地に継代した。その際、細胞数を計測するとともに顕微鏡撮影をおこなった。

細胞増殖阻害活性
T細胞由来のがん細胞株であるNamalwa、MOLT-4、及びBリンパ球由来のがん細胞株であるREHについて#17341存在下で約5週間の継代培養をおこない、細胞の増殖や形態におよぼず影響を検討した。#17341は1μM、5μM、7.5μM、10μM、15μM、及び20μMで添加した。またテロメラーゼ酵素活性を示さないTIG-3細胞をコントロールとした。

がん細胞について得られた細胞増殖曲線を図５に示す。1μM及び5μM添加では細胞増殖の阻害は確認できなかったが、7.5μMから15μMの範囲では#17341の濃度と細胞の増殖率の間に相関が見られた。7.5μMでは5μMよりも増殖率が低下し、15μMではREH及びMOLT-4細胞で増殖がほぼ停止した。一方、増殖阻害効果の現れる時期は濃度に関わらず、細胞株によりほぼ同じであった（Namalwa、REH、及びMOLT-4細胞株でそれぞれ8（細胞数倍加（PD）=5）、8（PD=4）、及び12日目（PD=10））。ただし細胞数の確認は4-5日毎の継代作業の際におこなったため、これよりも短い時間のずれは検出していない。したがって#17341の濃度により阻害効果の出現に数日の差が生じていた可能性は残されている。また、阻害効果が現れるまでの時間の差は細胞株によるテロメア長の違いを反映していると考えられるが、細胞株により#17341に対する感受性が異なる可能性もある。

テロメラーゼ酵素活性を示さないTIG-3繊維芽細胞の増殖曲線を図６に示す。20μMの#17341存在下で培養した場合、細胞増殖に対する阻害効果が見られた。しかし10μM以下の濃度で添加した場合は無添加の場合と変わらない増殖曲線が得られた。

図５及び図６をもとに、各細胞の増殖阻害に対する#17341の濃度依存性を定量的に評価した。このための方法として、培養後半の約20日間について細胞数倍加（PD）を決定し、1日当たりのPDを計算した（表１）。

表１に基づき、#17341を含まないコントロール培地での1日当たりPDを基準にして各濃度における相対PDを計算した。この結果を図７に示す。#17341の濃度が7.5μMまでは相対PDに変化はみられないが、10μM以上になると濃度依存的に相対PDが低下した。相対PDの濃度依存性曲線は各細胞で違っているが、曲線の傾きは3つの細胞株でほぼ同程度にみえる。このことは、増殖阻害の機構が3つの細胞で同じ（すなわち、テロメラーゼ酵素の阻害）であることを示唆している。一方、TIG-3細胞のPDは20μMの#17341存在下でコントロールの約80％である。阻害がまったく見られない訳ではないものの、3つのがん細胞株と比較すると阻害の程度がはるかに低い。すなわち、#17341は、
(1)15μM前後の濃度ではがん細胞特異的に増殖阻害効果を発揮し、
(2)この濃度依存性は細胞種により大きく異なる、
ことが示された。

細胞形態の変化
5週間の培養をおこなった後のNamalwa及びREH細胞株の顕微鏡像を観察したところ、#17341を20μMで添加した培地中で培養した細胞は対象区の細胞に比べて明瞭に細胞体積が小さくなっており、細胞がアポトーシスを起こしたことが示唆された。

TIG-3細胞についても同様に顕微鏡像を観察したところ、#17341を20μMで添加した場合でもコントロールと変わりない細胞形態が観察された。一部のTIG-3細胞は正常な細胞に比べて微小突起が短くなり、数も減少した。微小突起を全く形成していない細胞や培養基質に接着せずに浮遊したままの細胞も観察された。つまり、#17341によりTIG-3細胞の接着が阻害されたと考えられる。このような接着阻害は浮遊がん細胞の培養でも示唆された。REH株は細胞凝集塊を比較的形成しやすいが、20μM添加では凝集塊の形成が抑制された。TIG-3細胞株のような接着性の細胞は、接着が阻害されると増殖も抑制されることが知られている。#17341を20μM濃度で添加した場合にTIG-3株の増殖阻害がみられたが、これはTIG-3細胞の接着が#17341により阻害されたためであると考えられる。なお、TIG-3細胞の培養実験では、細胞を継代した直後から#17341を投与した。一部の阻害剤は浮遊した細胞が接着するプロセスは阻害するがすでに接着した細胞の増殖は阻害しないということが知られている。このことを鑑みると、生体に投与した場合はすでに接着している正常細胞に対しては阻害効果を示さないという可能性が期待できる。

本発明の新規なピラゾロン誘導体は優れたテロメラーゼ阻害活性を有し、抗腫瘍剤等として有用である。

#17341存在下における反応速度とTSプライマー濃度との関係を示す図である。反応速度は0.1μg 総タンパク質/50μLで30分反応により得られた生成物量による。#17341の濃度はそれぞれ0μM (○)、0.2μM(●)、0.5μM(□)、及び1.0μM(■)である。バーは標準偏差（n=2-3）である。図１の結果から導いたLineweaver-Burk両逆数プロットである。#17341の濃度は0μM(○)、0.2μM(●)、0.5μM(□)、および1.0μM(■)。バーは標準偏差（n=2-3）である。 #17341存在下における反応速度とdATP、dGTP及びTTP濃度との関係を示す図である。反応速度は0.1μg総タンパク質/50μLで30分反応後に得られた生成物量による。#17341の濃度は0μM(○)、0.1μM(●)、および1.0μM(□)。バーは標準偏差（n=4-5）である。図３の結果から導いたLineweaver-Burk両逆数プロットである。#17341の濃度は0μM(○)、0.1μM(●)、及び1.0μM(□)。バーは標準偏差（n=4-5）である。 #17341存在下におけるがん細胞株の増殖曲線を示す図である。#17341を様々な濃度で添加した培地中におけるNamalwa、REHおよびMOLT-4細胞の細胞数倍加を培養日数に対してプロットしてある。#17341の濃度は0μM(○)、1μM(□)、5μM(■)、7.5μM(△)、10μM(▲)、及び15μM(▽)。プロットは独立した2つの培養実験により求めた値の平均である。バーは標準偏差を示す。 #17341存在下におけるTIG-3細胞株の増殖曲線を示す図である。#17341の濃度は0μM(○)、1μM(●)、5μM(□)、及び20μM(■)。各種がん細胞株及びTIG-3細胞株における細胞数倍加指数の#17341濃度依存性を示す図である。 5週間培養後のがん細胞株群の顕微鏡観察図である。上段からNamalwa細胞、REH細胞、及びMOLT-4細胞である。左列及び右列は#17341を培地中にそれぞれ0μM及び20μMで添加したものである。バーは50μm。

Claims

下記式（１）：

［式中、Ｘ_１〜Ｘ_５は、互いに独立して、水素原子又はハロゲン原子である。］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含むテロメラーゼ阻害剤。
Ｘ_３およびＸ_５がハロゲン原子である請求項１記載のテロメラーゼ阻害剤。
Ｘ_３およびＸ_５が塩素である請求項２記載のテロメラーゼ阻害剤。